新的应激蛋白 本发明涉及氧-调节蛋白150(ORP150)。具体地说，本发明涉及人ORP150的氨基酸序列、编码人ORP150的多核苷酸、人ORP150基因的启动子以及特异于人ORP150的抗体。
自从脑缺血损伤中70KDa热激蛋白(HSP70)的表达被首次报道以来，以HSP70为代表的多种应激蛋白已被报道在心肌缺血和动脉粥样硬化损伤以及脑缺血损伤中有所表达。在缺血损伤中发现了HSP的诱导，即针对热应激的防御机制，这一事实暗示机体对缺血性低氧的应激反应是涉及蛋白质再生的主动现象。至于经培养的细胞，可导致体内缺血症的应激状态如低血糖和缺氧显示出可诱导一组非-HSP应激蛋白，如葡萄糖-调节蛋白(GRP)和氧-调节蛋白(ORP)。
因此期望ORP可在诊断和治疗缺血性疾病中起作用。
Hori等人最近报道将经培养的大鼠星形细胞暴露于低氧环境可诱导150、94、78、33和28KDa蛋白[J.Neurochem.、66。973-979(1996)]。将除150KDa蛋白以外地这些蛋白质分别鉴定为GRP94、GRP78、血加氧酶1和HSP28，而150KDa蛋白(大鼠ORP150)仍未被鉴定。另外，人ORP150蛋白仍未见有报道。
因此，本发明的目的是提供人和大鼠的ORP150蛋白及其氨基酸序列以及编码所述蛋白质的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供可用作人ORP150基因启动子的核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供抗人ORP150蛋白的抗体或其片段，它们可用于诊断和治疗缺血性疾病。
在一个实施方案中，本发明涉及一种通过在低氧状况下诱导即可得到的多肽，其序列包含：
(a)SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列或其片段；
(b)由SEQ ID NO：2或4的核苷酸序列编码的氨基酸序列或其片段；或
(c)通过在SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列中缺失、增加、插入或取代一个或多个氨基酸得到的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码上述实施方案之多肽的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及能与上述多核苷酸或其片段杂交并具有启动子活性的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有本发明之核苷酸序列的重组DNA。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有本发明之重组DNA的表达载体。
在另一个实施方案中，本发明涉及与本发明之多肽特异性结合的抗体或其片段。
图1表示人ORP基因外显子-内含子结构图，黑方块表示外显子。
图2表示将人星形细胞瘤U373细胞暴露于多种类型的应激条件下之后，从中提取的ORP150 mRNA的Northern印迹的分析结果。
图3表示成人组织的ORP150 mRNA的Northern印迹分析结果。
本发明多肽的一个实施方案是含有序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽，该多肽构成了通过在低氧状态下诱导即可得到的人氧-调节蛋白ORP150。本发明多肽的另一个实施方案是含有序列表中SEQID NO：3所示氨基酸序列的多肽，该多肽组成了通过在低氧状态下诱导即可得到的大鼠氧-调节蛋白ORP150。本发明的多肽还包括各含有上述多肽之一部分的多肽，以及含有全部或部分上述多肽的多肽。众所周知突变会自然发生；ORP150蛋白的一些氨基酸可被替换或缺失，而其他氨基酸可被加入或插入。突变也可通过基因工程技术来诱导，因此应理解由这种一个或多个氨基酸残基的突变得到的基本上同源的多肽也包括在本发明的范围之内，只要它们通过在低氧状态下的诱导是可以得到的话。
本发明多核苷酸的一个实施方案是编码上述多肽中任一个的多核苷酸。具体地说，所说多核苷酸的例子是含有序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的多核苷酸，即，人ORP150 cDNA。含有序列表中SEQID NO：4所示核苷酸序列的多核苷酸也包括在本发明范围之内，此多核苷酸是大鼠ORP150 cDNA。含有这些多核苷酸的一部分的多核苷酸，以及含有这些多核苷酸之全部或部分的多核苷酸也包括在本发明的范围之内。如上文所提及，通过突变ORP150基因的一些碱基可以被替换、缺失、加入或插入，所得的具有部分不同之核苷酸序列的多核苷酸也包括在本发明的范围之内，只要它们是基本上同源的，并编码通过在低氧状态下诱导即可得到的多肽。
本发明多核苷酸的另一个实施方案是包含或含有序列表中SEQ IDNO：12所示核苷酸序列的全部或部分的多核苷酸，它是含有人ORP150基因启动子区的多核苷酸。能与此多核苷酸在常规杂交条件(如在含有0.1％SDS的0.1×SSC中，65℃)下杂交并具有启动子活性的多核苷酸也包括在本发明的范围之内。所说启动子区的成功克隆会显著推动人ORP150基因的功能性分析，并促进其用于治疗缺血性疾病。
本文所用术语“启动子”的定义为：含通过位于所需基因的上游或下游来激活或抑制所说基因转录的核苷酸序列的多核苷酸。
本文所用术语“重组DNA”的定义为：含有上述多核苷酸的任何DNA。
本文所用术语“表达载体”的定义为：含有本发明的重组DNA并通过导入适当宿主表达所需蛋白质的任何载体。
本文所用术语“克隆”不仅仅指其中已导入所感兴趣的多核苷酸的细胞，也指所感兴趣的多核苷酸本身。
本文所用术语“在低氧状态下诱导”是指通过将细胞暴露于氧-耗尽的大气中来增加蛋白质的合成。
本发明的氨基酸序列和核苷酸序列例如可按下述方法被确定：首先，从暴露于低氧状态下的大鼠星形细胞中制备poly(A)+RNA，使用随机的六聚体引物由所说的poly(A)+RNA合成cDNA之后，使用pSPORT1载体(由Life Technology制备)或类似物制备cDNA文库。
接着，使用根据上文用于制备cDNA文库的pSPORT1载体的核苷酸序列合成的寡核苷酸引物以及由纯化的大鼠ORP150的N-末端氨基酸序列推导出的简并核苷酸序列进行PCR，从而产生大量扩增的DNA片段。然后将这些DNA片段插入到PT7 Blue载体(由Novagen生产)或类似载体中用于克隆以得到其所具有的核苷酸序列可精确编码N-末端氨基酸序列的克隆。通过使用常规的蛋白质纯化法，如柱层析和电泳法及适当将其联合使用即可纯化ORP150。
另外，通过使用上述克隆中的插入片段为探针进行集落杂交以筛选上述大鼠星形细胞cDNA文库，即可得到其所具有的插入片段据认为可编码大鼠ORP150的克隆。从此克隆的5’和3’末端使其分段缺失，使用从已测定的核苷酸序列制备的寡核苷酸引物来按序测定核苷酸序列。如果由此得到的克隆不编码大鼠全长ORP150，则可以插入片段5’或3’区域的核苷酸序列为基础合成寡核苷酸探针，然后筛选含有在5’或3’方向进一步延伸之核苷酸序列的克隆，例如可使用基于使用磁性小珠之杂交的GeneTrapper cDNA Positive SelectionSystem试剂盒(由Life Technology制备)。由此可得到大鼠ORP150基因的全长cDNA。
单独进行下列步骤以得到大鼠ORP150 cDNA的人相应物。由暴露于低氧状态下的人星形细胞瘤U373制备Poly(A)+RNA，使用随机六聚体引物和一种寡(dT)引物由所说的Poly(A)+RNA合成了cDNA之后，将所说的cDNA插入pSPORT1载体的EcoRI位点以制备cDNA文库，然后使用Gene Trapper试剂盒得到人ORP150 cDNA，按与上述大鼠ORP150相同的方法测定其核苷酸序列。
由此测定的人ORP150 cDNA的核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO：2，根据此序列可测定人ORP150的氨基酸序列。
使用例如Ogawa等人的方法[Ogawa、S.、Gerlach、H.、Esposito、C.、Mucaulay、A.P.、Brett、J.、and Stern、D.、J.Clin.Invest.、85、1090-1098(1990)]可将星形细胞暴露于低氧状态下。
接着进行下列步骤以得到人ORP150基因组的DNA。使用购自Clontech的基因组文库(得自人体胎盘、Cat.#HL1067J])。通过使用得自大鼠cDNA克隆的由5′非翻译区的202bp和编码区的369bp组成的DNA片段以及得自人cDNA的含有终止密码子的1351bp DNA片段为探针的杂交进行筛选。分离含有ORP150基因的两个克隆，一个含有外显子1至24，另一个含有外显子16至26；完整的ORP150基因由这两个克隆联合组成。测定15851bP的人ORP150基因组DNA的核苷酸序列；从其5′末端至外显子2中的翻译起始密码子ATG之前的核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO：12。
如上文所提及，本发明包括含有全部或部分具有序列表中SEQ IDNO：1所示氨基酸序列之多肽(人ORP150)的多肽。本发明还包括具有序列表中SEQ ID NO：1所示氨基酸序列之多肽的全部或部分；例如，含有序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的全部或部分的多核苷酸也包括在本发明的范围内。本发明还包括抗本发明这些多肽的特异性抗体及其片段。本发明的多肽、编码它们的多核苷酸、抗这些多肽的特异性抗体或其片段在诊断和治疗缺血性疾病中有用，可用于开发缺血性疾病的治疗药物。
使用常规方法[Current Protocols inImmunology、Coligan、J.E.et al.eds.、2.4.1.-2.4.7、John Wiley & Sons.NewYork(1991)]可制备抗本发明多肽的抗体，所述多肽含有人或大鼠ORP150的全部或部分。具体地说，切下通过例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的大鼠ORP150带，并施予家兔等用于免疫接种，然后从经免疫接种的动物中收集血液以得到抗血清。如有必要可通过使用固定化蛋白质A的亲和层析等技术得到IgG级分。与ORP150的部分氨基酸序列相同的肽可被化学合成为多抗原肽(MAP)[Tam.J.P、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85、5409-5413(1988)]，并可按与上相同的方法用于免疫接种。
也可以通过常规方法[Cell和Tissue Culture；Laboratory Procedure(Doyle、A.etal.、eds.)25A：1-25C：4.John Wiley &Sons.New York(1994)]，使用含有人或大鼠ORP150之全部或部分的多肽为抗原制备单克隆抗体。具体地说，通过将经所说抗原免疫接种的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系统相融合可制备杂交瘤，所得杂交瘤经培养或腹膜内移植到小鼠体内产生单克隆抗体。
将经纯化的这些抗体通过蛋白酶消化得到的片段也可用作本发明的抗体。
实施例
下述实施例阐明了本发明，但不会以任何方式限制本发明。实施例1细胞培养和低氧状态的获得
通过修改已述的方法[Maeda、Y.、Matsumoto、M.、Ohtsuki、T.、Kuwabara、K.、Ogawa、S.、Hori、O.、Shui、D.Y.、Kinoshita、T.、Kamada、T.、and Stern、D.、J.Exp.Med.、180、2297-2308(1994)]从新生大鼠体内得到大鼠原代星形细胞和小神经胶质细胞。简而言之，摘取出生后24小时之内的新生Sprague-Dawley大鼠的脑半球，小心除去脑膜，于37℃在经Joklik修改后含有Dispase II(3mg/ml；Boehringer-Mannheim、Germany)的最低必需培养基(MEM)(Gibco，Boston MA)中消化脑组织。离心后，在添加有胎牛血清(FCs；10％；Cell Grow、MA)的MEM中重悬并培养细胞沉淀物。
10天后，加入阿拉伯呋喃糖胞苷(10μg/ml；WakoChemicals、Osaka、Japan)经48小时以防止成纤维细胞过量生长，将培养瓶置于振荡平台上振荡。然后吸出漂浮的细胞(此为小神经胶质细胞)，通过形态学观察标准和用抗-神经胶质纤维酸性蛋白质抗体的免疫组织化学染色来鉴定附着细胞群体。用于实验的培养物是基于这些技术的＞98％的呈形细胞。
人星形细胞瘤细胞系U373得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在添加有10％FCS的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(由Life Technology生产)中培养。
细胞以约5×104细胞/cm2的密度在上述培养基中铺敷，当培养物铺满时，使用一个与低氧室器(Coy Laboratory Products.Arm Arbor MI)，相连的培养箱将细胞培养物暴露于低氧状态下所述低氧室中如前所述[Ogawa、S.、Gerlach、H.、Esposito、C.、Macaulay、A.P.、Brett、J.、and Stem、D.、J.Clin.Invest.、85、1090-1098(1990)]维持有低氧张力的潮湿空气。实施例2大鼠150KDa多肽的纯化和N-末端测序
收获在低氧状态下已暴露48小时的大鼠原代星形细胞(约5×108细胞)，用PBS(PH7.0)将细胞洗三次，用含NP-40(1％)、PMSF(1mM)、和EDTA(5mM)的PBS抽提蛋白质。然后将提取物过滤(0.45μm硝酸纤维素膜)，或者流经还原性的SDS-PAGE(7.5％，约25μg)，或者用50ml含NP-40(0.05％)和EDTA(5mM)的PBS(PH7.0)稀释2-3mg蛋白质并用于FPLC Mono Q(床体积为5ml，PharmaciaSweden)。
用0.2M NaCl洗柱，用上行盐梯度(0.2-1.8M NaCl)洗脱，每份级分(0.5ml)的10μl和分子量标记物(Biorad)一起被用于还原性的SDS-PAGE(7.5％)。通过银染，肉眼可见凝胶中的蛋白质。合并从FPLC Mono Q上洗脱的含有150KDa多肽的级分(#7-8)，通过超滤(Amicon)浓缩50倍，将约200μg蛋白质用于制备性的还原SDS-PAGE(7.5％)。电泳后，将凝胶中的蛋白质电泳转移(2A/cm2)到聚偏二氟乙烯(PVDF)纸(Millipore、Tokyo)上，将纸干燥，用考马斯亮蓝染色，切下对应于150KDa蛋白质(OPR150)的带以使用自动化肽测序系统(Applied Biosystems、Perkin-Elmer)进行N-末端测序，从而测定了N-末端的31个氨基酸序列(SEQ IDNO：5)。实施例3大鼠星形细胞cDNA文库的制备
通过酸胍-苯酚-氯仿法[Chomczynski、P.andSacchi.N.、Anal.Biochem.、162、156-159(1987)]由大鼠原代呈形细胞(1.1×108细胞)制备总RNA，所述细胞中ORP150已在低氧状态下被诱导。使用所得的300μg总RNA，根据使用寡(dT)-磁性珠(由PerceptiveDiagnostics制备)的Poly(A)+RNA纯化方案进行两次纯化可产生poly(A)+RNA。然后根据SuperscriptChoiceSystem(由Life Technology制备)的方案，使用随机的六聚体引物合成双链cDNA，并插入pSPORT1载体的EcoRI位点以制备由5.4×105个独立克隆组成的cDNA文库。实施例4大鼠ORP150 cDNA的克隆
按下述克隆大鼠的ORP150 cDNA：首先，为了得到集落杂交的探针，可使cDNA文库进行PCR，所述PCR使用一个20碱基的引物5′-AATACG ACTCACTATAGGGA-3′(SEQ IDNO：6)和20碱基的混合引物5′-AARCCIGGIGTNCCNATGGA-3′(SEQ ID NO：8)，前者相当于pSPORT1载体中T7启动子区的反义链，后者含有肌苷残基和简并的多核苷酸，并以由N-末端氨基酸序列(LAVMSVDLGSESMKVAIVKPGVPMEIVLNKE)(SEQ ID NO：5)内的部分序列(KPGVPME)(SEQ ID NO：7)推导出的寡核苷酸序列为基础制备；将所得的长约为480bp的PCR产物插入pT7 Blue质粒载体。使用自动化核苷酸测序仪(由Perkin-Elmer Applied Biosystems生产)测定含有预期大小(480bp)的相当于PCR产物之插入片段的克隆的核苷酸序列，由此得到一个克隆，它含有一39核苷酸序列，所述序列编码的肽与插入片段中大鼠ORP150-特异性氨基酸序列KPGVPMEIVLNKE(SEQ ID NO：9)相同。
使用上述克隆中的插入片段作为探针，使得自经培养的大鼠呈形细胞的RNA进行Northern印迹；结果表明长度约为4kb的mRNA是经低氧处理诱导的。随即，通过使用α-[32P]dCTP的随机引物标记法(Ready TOGO.由Pharmacia制备)标记上述克隆中的插入片段以产生探针。使用此探针，通过集落杂交筛选cDNA文库的1.2×104个克隆以得到含有一个2800bp插入片段的克隆。通过使用千序列缺失试剂盒(由Takara Shuzo生产)制备缺失突变体以测定此克隆插入片段的核苷酸序列。
由于此克隆不含ORP150编码序列的3′区，应以上述插入片段3′末端附近特异性核苷酸序列为基础制备下列两个20碱基的寡核苷酸以得到全长序列。
5′-GCACCCTTGAGGAAAATGCT-3′
(SEQ ID NO：10)
5′-CCCAGAAGCCCAATGAGAAG-3′
(SEQ ID NO：11)
使用这两个寡核苷酸，根据Gene Trapper cDNAPositive Selection System(由LifeTechnology制备)的方案从大鼠呈形细胞cDN文库中选择含有完整编码区的克隆并测定其核苷酸序列。
由此测定的大鼠ORP150 cDNA的核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO：4。根据此核苷酸序列测定的大鼠ORP150的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO：3。实施例5人U373 cDNA文库的制备
按与实施例3中所述相同的方法，从U373细胞(1×108细胞)中纯化poly(A)′RNA，所述细胞中ORP150已在低氧状态下被诱导。然后根据Super-script Choice System(由Life Technology制备)的方案，使用随机六聚体引物和寡(dT)引物的1∶1混合物合成双链cDNA。将此cDNA插入pSPORT1载体的EcoRI位点以制备由2×105个独立克隆组成的cDNA文库。
具体地说，按下述制备文库：按实施例3中所述Ogawa等人的方法[Ogawa、S.、Gerlach、H.、Esposito、C.、Mucaulay、A.P.、Brett、J.、and Stern、D、J.Clin.Invest.、85、1090-1098(1990)]将培养于10个塑料培养皿(直径为150mm)中的人U373细胞(1×107细胞/皿)在低氧状态下处理48小时，然后通过酸胍-苯酚-氯仿法[Chomczynski、P.and Sacchi、N.、Anal.Biochem.、162、156-159(1987)]制备总RNA。使用所得的500μg总RNA，根据使用寡(dT)磁性珠(由Perceptive Diagnostics制备)的poly(A)′RNA纯化进行两次纯化可产生poly(A)′RNA。然后根据Superscript Choice System(由LifeTechnology制备)的方案，使用5μg poly(A)′RNA和随机六聚体引物与寡(dT)引物的1∶1混合物合成双链cDNA，并插入pSPORT1载体的EcoRI位点以制备由2×105个独立克隆组成的人U373 cDNA文库。实施例6人ORP150 cDNA的克隆
使用根据上述大鼠ORP150 cDNA特异序列制备的两个引物(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)，根据GeneTrapper DNA Positive SelectionSystem(由Life Technology制备)的方案从人U373 cDNA文库中选择含有完整编码区的克隆并测定其核苷酸序列。由此测定的人ORP150 cDNA的核苷酸序列示于序列表中的SEQID NO：2。
具体地说，根据Gene Trapper cDNA PositiveSelection System(由Life Technology制备)的方案扩增人U373 cDNA文库的2×104个克隆。用试剂盒中包括的Gene II和Exo III核酸酶处理纯化自扩增克隆的5微克质粒以得到单链DNA。将根据上述大鼠URP150 cDNA-特异性序列制备的寡核苷酸(SEQ ID NO：10)生物素酰基化，随后于37℃与上述单链DNA杂交1小时。通过使用链霉抗生物素蛋白-磁性珠可选择性地回收与衍生自大鼠ORP150 cDNA的寡核苷酸杂交的单链DNA，使用序列表中SEQ ID NO：10所示寡核苷酸为引物，用试剂盒中包括的修复酶处理上述单链DNA，从而产生双链质粒DNA。
然后根据Gene Trapper cDNA PositiveSelection System的方案将双链质粒DNA导入Electro Max DH10B细胞(由Life Techology制备)，再根据相同方案，使用根据大鼠ORP150 cDMA-特异性序列制备的两个引物(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)进行集落PCR以选择可产生约为550bp PCR产物的克隆。这些克隆中最长插入片段的核苷酸序列，即相当于人ORP150 cDNA被测定为序列表中的SEQ ID NO：2。
根据此核苷酸序列测定的人ORP150的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO：1。
用纯化的大鼠ORP150得到的N-末端氨基酸序列(SEQ IDNO：5)相当于由人和大鼠cDNA推导出的氨基酸33-63，这表明最先的32个残基代表分泌的信号肽。C-末端的KNDEL序列与KDEL序列(保留ER中存在蛋白质的信号)[Pelham、H.R.B.、TrendsBiochem.Sci.15、483-486(1990)]类似，可行使ER-保留信号功能。N-末端信号肽和C-末端ER-保留信号一样序列的存在暗示ER中的ORP150残基与Kuwabara等人报道的免疫细胞化学分析结果一致[Kuwabara、K.、Matsumoto、M.、Ikeda、J.、Hori、O.、Ogawa、S.、Maeda、Y.、Kitagawa、K.、Imuta、N.、Kinoshita、T.、Stern、D.M.、Yanagi、H.、and Kamada、T.、J.Biol.Chem.271.5025-5032(1996)]。
用BLAST程序分析蛋白质基本数据[Altschul、S.F.、Gish、W.、Miller、W.、Myers、E.W.、andLipman、D.J.、J.Mol.、Biol.215、403-410(1990)]表明ORP150N-末端的一半与许多HSP70家族序列的ATPase区县有中等程度的相似性。以配对的方式排列以进一步分析[Pearson、W.R.、and Lipman、D.J.、Proc.Natl.Acad.Sci.WSA 85、2444-2448(1988)]揭示出人ORP150的氨基酸33-426与可诱导的人HSP70.1[Hunt、C.、and Morimoto、R.I.、Proc.Natl.Acad.Sci.WSA 82、6455-6459(1985)]和组成型的牛HSC70[Deluca-Flaherty、C.、andMckay、D.B.、Nucleic Acids Res.18、5569(1990)]的氨基酸1-380有32％相同，人HSP70.1和牛HSC70是HSP70家族典型的成员。与属于大HSP70一样蛋白质新亚族的HSP70RY和仓鼠HSP110类似的际加区域[Lee-Yoon、D.、Easton、D.、Murawski、M.、Burd、R.、and Subjeck、J.R.、J.Biol.chem。270、15725-15733(1995)]进一步延伸？残基487。用PROSITE探查蛋白质序列基元[Bairoch、A.、and Bucher、P.、Nucleic Acids Res、22、3583-3589(1994)]表明ORP150含有3个HSP70蛋白质家族特征中的2个：FYDMGSGSTVCTIV(氨基酸230-243、SEQID NO：1)和VILVGGATRVPRVQE(氨基酸380-394、SEQ ID NO：1)，它们分别与HSP70特征2和3完全匹配，以及VDLG(氨基酸38-41，SEQ ID NO：1)，它与特征1的前4个氨基酸匹配。另外，ORP150的N-末端区含有推导的ATP-结合位点，该位点由相当于Bork等人特定描述[Bork、P.、Sander、C.、and Valencia、A.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89、7290-7294(1992)]的5个基元的区域(氨基酸36-53、197-214、229-243、378-400和411-425、SEQ ID NO：1)组成。尽管HSP70家族的C-末端推导的肽结合区一般较不保守[Rippmann、F.、Taylor、W.R.、Rothbard、J.B.、andGreen、N.M.、EMBO J.10、1053-1059(1991)]、侧翼为氨基酸701和898的C-末端区(SEQ ID NO：1)与HSP110共有可估计剂的相似性(氨基酸595-793，SEQID NO：1；29％相同)。实施例7人ORP150基因组DNA的克隆
使用购自Clontech的人基因组文库(得自人胎盘，Cat.#HL1067J.Lot #1221、2.5×106个独立的克隆)。由得自大鼠cDNA克隆的202bp的5′非翻译区、369bp的编码区以及出自人cDNA的含有终止密码子的1351bp DNA片段组成的DNA片段被用作噬斑杂交的探针。
将已经被1×106pfu人基因组文库感染的大肠杆菌LE392涂布于10个直径为15cm的培养皿中以形成噬斑。将噬菌体DNA转移到尼龙膜(Hybond-N*、Amersham)上并用氢氧化钠变性，然后通过紫外光照射来固定。使用DNA标记试剂盒(Ready To Go、Pharmacia)标记大鼠cDNA探针，并与Rapidhyb缓冲液(Amersham)中的膜杂交。于65℃保温2小时之后，用0.2×SSC-0.1％SDS洗尼龙膜，在显像底片(Fuji PhotoFilm)上检测阳性克隆。由于分离出的克隆仅含外显子1至24，可用相同方法使用人cDNA探针再次筛选相同文库的1.5×106个克隆，最终分离出1个克隆。发现此克隆含有外显子16至26，它与上述克隆的3′区有重叠。通过联合这两个克隆从而克隆出ORP150基因的完整区域。
用BamHI裂解这两个克隆并亚克隆到pBluescript IISK(Stratagene)中，随后测定完整的15851bp的人ORP150基因组DNA的核苷酸序列，从5′末端至外显子2中翻译起始密码子ATG之前的核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO：12。
另外，将15851bp的人ORP150基因组DNA的核苷酸序列与序列表中SEQ ID NO：2所示的人ORP150 cDNA的核苷酸序理相比较，结果表明外显子在以下所示的位置处存在。外显子位置的示意图示于1中。
(SEQ ID：2中的碱基位置)
外显子1 1908-2002 (1-95)
外显子2 2855-2952 (96-193)
外显子3 3179-3272 (194-287)
外显子4 3451-3529 (288-366)
外显子5 3683-3837 (367-521)
外显子6 3962-4038 (522-598)
外显子7 4347-4528 (599-780)
外显子8 4786-4901 (781-896)
外显子9 6193-6385 (897-1089)
外显子10 6593-6727 (1090-1224)
外显子11 6850-6932 (1225-1307)
外显子12 7071-7203 (1308-1440)
外显子13 7397-7584 (1441-1628)
外显子14 7849-7987 (1629-1767)
外显子15 9176-9236 (1768-1828)
外显子16 9378-9457 (1829-1908)
外显子17 9810-9995 (1909-2094)
外显子18 10127-10299 (2095-2267)
外显子19 10450-10537 (2268-2355)
外显子20 10643-10765 (2356-2478)
外显子21 10933-11066 (2479-2612)
外显子22 11195-11279 (2613-2697)
外显子23 12211-12451 (2698-2938)
外显子24 12546-12596 (2939-2989)
外显子25 13181-13231 (2990-3040)
外显子26 13358-14823 (3041-4503)实施例8Northern印迹分析
通过使用DNA标记试剂盒(Pharmacia)用[α-32P]dCTP(3,000Ci/mmol；Amersham Corp.、Arlington Heights、IL)标记人ORP150 cDNA的4.5-Kb EcoRI片段以用作杂交探针。将20μg由暴露于不同应激条件下的U373细胞制备的总RNA电泳并转移到Hybond N+膜上(Amersham Corp.)。从Clontech购买MultipleTissue Northern Blot，其中每个泳道含有2μg得自所需成人组织的poly(A)′RNA。于65℃，在Rapid-hyb缓冲液(Amersham Corp.)中使滤膜与各自经[α-32P]dCTP标记的人ORP150、GRP78、Hsp70、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和β-肌动蛋白cDNA杂交，于65℃用含0.1％SDS的0.1×SSC洗涤，随后进行放射自显影。
如图2所示，通过在低氧状态下暴露24-48小时可大大增强ORP150 mRNA的水平，在平行实验中，用2-脱氧葡萄糖(25mM、24小时)或霉素(5μg/ml，24小时)处理可将ORP150mRNA的水平增强到可与经低氧状态下诱导的水平相当。诱导水平也与典型的葡萄糖调节蛋白GRP78的mRNA水平相当。热激处理不能显著增强ORP150 mRNA。
已发现ORP150 mRNA在肝脏和胰腺中高度表达，而在肾脏和脑中仅观察到很少的表达(图3)。另外，ORP150表达的组织特异性与GRP78的十分类似。在含有发育良好之ER并合成大量分泌型蛋白质的组织中观察到的较高水平的表达与ORP150位于ER中这一发现一致(Kuwabara、K.、Matsumoto、M.、Ikeda、J.、Hori、O.、Ogawa、S.、Maeda、Y.、Kitagawa、K.、Imuta、N.、Kinoshita、T.、Stern、D.M.、Yanagi、H.、and Kamada、T.、J.Biol.Chem.271、5025-5032(1996))。
总之，特征性的一级蛋白质结构和已发现的与GRP78在应激诱导能力和组织特异性上的相似性暗示ORP150在蛋白质折叠和ER中的分泌起到重要作用，可能作为分子伴侣与其他GRP协同作用以处理环境中的应激刺激。
本领域技术人员仅使用常规实现会认知或能确定本文特定描述的本发明特殊实施方案的很多等同方案，这种等同方案欲包括在下述权利要求的范围之内。
序列表(1)一般资料：
(iii)序列数：12(2)序列数SEQ ID NO：1：的资料
(i)序列特征：
(A)长度：999个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Ala Asp Lys Val Arg Arg Gln Arg Pro Arg Arg Arg Val Cys Trp
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980 985 990Pro Leu Lys Asn Asp Glu Leu
995(2)SEQ ID NO：2：的资料 (i)序列特征：
(A)长度：4503个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线形 (ii)分子类型：cDNA (ix)特征
(A)名称/关键词：CDS
(B)鉴定方法：E (xi)序列描述：SEQ ID NO：2TTGTGAAGGG CGCGGGTGGG GGGCGCTGCC GGCCTCGTGG GTACGTTCGT GCCGCGTCTG 60TCCCAGAGCT GGGGCCGCAG GAGCGGAGGC AAGAGGGGCA CTATGGCAGA CAAAGTTAGG 120AGGCAGAGGC CGAGGAGGCG AGTCTGTTGG GCCTTGGTGG CTGTGCTCTT GGCAGACCTG 180TTGGCACTGA GTGATACACT GGCAGTGATG TCTGTGGACC TGGGCAGTGA GTCCATGAAG 240GTGGCCATTG TCAAACCTGG AGTGCCCATG GAAATTGTCT TGAATAAGGA ATCTCGGAGG 300AAAACACCGG TGATCGTGAC CCTGAAAGAA AATGAAAGAT TCTTTGGAGA CAGTGCAGCA 360AGCATGGCGA TTAAGAATCC AAAGGCTACG CTACGTTACT TCCAGCACCT CCTGGGGAAG 420CAGGCAGATA ACCCCCATGT AGCTCTTTAC CAGGCCCGCT TCCCGGAGCA CGAGCTGACT 480TTCGACCCAC AGAGGCAGAC TGTGCACTTT CAGATCAGCT CGCAGCTGCA GTTCTCACCT 540GAGGAAGTGT TGGGCATGGT TCTCAATTAT TCTCGTTCTC TAGCTGAAGA TTTTGCAGAG 600CAGCCCATCA AGGATGCAGT GATCACCGTG CCAGTCTTCT TCAACCAGGC CGAGCGCCGA 660GCTGTGCTGC AGGCTGCTCG TATGGCTGGC CTCAAAGTGC TGCAGCTCAT CAATGACAAC 720ACCGCCACTG CCCTCAGCTA TGGTGTCTTC CGCCGGAAAG ATATTAACAC CACTGCCCAG 780AATATCATGT TCTATGACAT GGGCTCAGGC AGCACCGTAT GCACCATTGT GACCTACCAG 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(A)长度：999个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线形 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Ala Ala Thr Val Arg Arg Gln Arg Pro Arg Arg Leu Leu Cys Trp
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(A)长度：3252个碱基对
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(A)名称/关键词：CDS
(B)鉴定方法：E
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4TGAGGATGGA GCAGCGGTCG GGCCGCGGCT CCTAGGGGAG GCAGCGTGCT AGCTTCGGGG 60GCGGGCCAGT AGCGGGAGCG AGGGCCGTAC GGACACCGGT CCCTTCGGCC TTGAAGTTCA 120GGCGCTGAGC TGCCCCCTCG CGCTCGGGGT GGGCCGGAAT CCATTTCTGG GAGTGGGATC 180TTCCACCTTC ATCAGGGTCA CAATGGCAGC TACAGTAAGG AGGCAGAGGC CAAGGAGGCT 240ACTCTGTTGG GCCTTGGTGG CTGTCCTCTT GGCAGACCTG TTGGCACTGA GTGACACACT 300GGCTGTGATG TCTGTGGACC TGGGCAGTGA ATCCATGAAG GTGGCCATTG TCAAGCCTGG 360AGTGCCCATG GAGATTGTAT TGAACAAGGA ATCTCGGAGG AAAACTCCGG TGACTGTGAC 420CTTGAAGGAA AACGAAAGGT TTCTAGGTGA CAGTGCAGCT GGCATGGCCA TCAAGAACCC 480AAAGGCTACG CTCCGTTATT TCCAGCACCT CCTTGGAAAG CAGGCAGATA ACCCTCATGT 540GGCTCTTTAC CGGTCCCGTT TCCCAGAACA TGAGCTCAAT GTTGACCCAC AGAGGCAGAC 600TGTGCGCTTC CAGATCAGTC CGCAGCTGCA GTTCTCTCCC GAGGAGGTGC TGGGCATGGT 660TCTCAACTAC TCCCGTTCCC TGGCTGAAGA TTTTGCAGAA CAACCTATTA AGGATGCAGT 720GATCACCGTG CCAGCCTTTT TCAACCAGGC CGAGCGCCGA GCTGTGCTGC AGGCTGCTCG 780TATGGCTGGC CTCAAGGTGC TGCAGCTCAT CAATGACAAC ACTGCCACAG CCCTCAGCTA 840TGGTGTCTTC CGCCGGAAAG ATATCAATTC CACTGCACAG AATATCATGT TCTATGACAT 900GGGCTCGGGC AGCACTGTGT GTACCATCGT GACCTACCAA ACGGTGAAGA CTAAGGAGGC 960TGGGACGCAG CCACAGCTAC AGATCCGGGG CGTGGGATTT GACCGCACCC TGGGTGGCCT 1020GGAGATGGAG CTTCGGCTGC GAGAGCACCT GGCTAAGCTC TTCAATGAGC AGCGCAAGGG 1080CCAGAAAGCC AAGGATGTTC GGGAAAACCC CCGAGCCATG GCCAAACTGC TTCGGGAAGC 1140CAATCGGCTT AAAACCGTCC TGAGTGCCAA TGCTGATCAC ATGGCACAGA TTGAAGGCTT 1200GATGGACGAT GTGGACTTCA AGGCAAAAGT AACTCGAGTG GAGTTTGAGG AGCTGTGTGC 1260AGATTTGTTT GATCGAGTGC CTGGGCCTGT ACAGCAGGCC CTGCAGAGTG CTGAGATGAG 1320CCTGGATCAA ATTGAGCAGG TGATCCTGGT GGGTGGGCCC ACTCGTGTTC CCAAAGTTCA 1380AGAGGTGCTG CTGAAGCCTG TGGGCAAGGA GGAACTAGGA AAGAACATCA ATGCCGATGA 1440AGCAGCTGCC ATGGGGGCCG TGTACCAGGC AGCGGCACTG AGCAAAGCCT TCAAAGTGAA 1500GCCATTTGTT GTGCGTGATG CTGTTATTTA CCCCATCCTG GTGGAGTTCA CAAGGGAGGT 1560GGAGGAGGAG CCTGGGCTTC GAAGCCTGAA GCACAATAAA CGTGTGCTCT TCTCCCGAAT 1620GGGGCCCTAC CCTCAGCGCA AAGTCATCAC CTTTAACCGA TACAGCCATG ATTTCAACTT 1680TCACATCAAC TACGGTGACC TGGGCTTCCT GGGGCCTGAG GATCTTCGGG TATTTGGCTC 1740CCAGAATCTG ACCACAGTGA AACTAAAAGG TGTGGGAGAG AGCTTCAAGA AATATCCTGA 1800CTATGAGTCC AAAGGCATCA AGGCCCACTT TAACCTAGAC GAGAGTGGAG TGCTCAGTTT 1860AGACAGGGTG GAGTCCGTAT TCGAGACCCT GGTGGAGGAC AGCCCAGAGG AAGAGTCTAC 1920TCTTACCAAA CTTGGCAACA CCATTTCCAG CCTGTTTGGC GGTGGTACCT CATCAGATGC 1980CAAAGAGAAT GGTACTGATG CTGTACAGGA GGAGGAGGAG AGCCCTGCTG AGGGGAGCAA 2040GGATGAGCCT GCAGAACAGG GGGAACTCAA GGAGGAAGCT GAAGCCCCAA TGGAGGATAC 2100CTCCCAGCCT CCACCCTCTG AGCCTAAGGG GGATGCAGCC CGTGAGGGAG AAACACCTGA 2160TGAAAAAGAA AGTGGGGACA AGTCTGAGGC CCAGAAGCCC AATGAGAAGG GGCAGGCAGG 2220GCCTGAGGGT GTCCCTCCAG CTCCCGAGGA AGAAAAAAAG CAGAAACCTG CCCGGAAGCA 2280GAAAATGGTG GAGGAGATAG GTGTGGAACT GGCTGTCTTG GACCTGCCAG ACTTGCCAGA 2340GGATGAGCTG GCCCATTCCG TGCAGAAACT TGAGGACTTG ACCCTGCGAG ACCTTGAAAA 2400GCAGGAGAGG GAGAAAGCTG CCAACAGCTT AGAAGCTTTT ATCTTTGAGA CCCAGGACAA 2460ACTGTACCAA CCTGAGTACC AGGAAGTGTC CACTGAGGAA CAACGGGAGG AGATCTCTGG 2520AAAACTCAGT GCCACTTCTA CCTGGCTGGA GGATGAGGGA TTTGGAGCCA CCACTGTGAT 2580GTTGAAGGAC AAGCTGGCTG AGCTGAGAAA GCTGTGCCAA GGGCTGTTTT TTCGGGTGGA 2640AGAGCGCAGG AAATGGCCAG AGCGGCTTTC AGCTCTGGAT AATCTCCTCA ATCACTCCAG 2700CATTTTCCTC AAGGGTGCCC GACTCATCCC AGAGATGGAC CAGATCTTCA CTGACGTGGA 2760GATGACAACG TTGGAGAAAG TCATCAATGA CACCTGGACC TGGAAGAATG CAACCCTGGC 2820CGAGCAGGCC AAGCTTCCTG CCACAGAGAA ACCCGTGCTG CTTTCAAAAG ACATCGAGGC 2880CAAAATGATG GCCCTGGACC GGGAGGTGCA GTATCTACTC AATAAGGCCA AGTTTACTAA 2940ACCCCGGCCA CGGCCCAAGG ACAAGAATGG CACCCGGACA GAGCCTCCCC TCAATGCCAG 3000TGCTGGTGAC CAAGAGGAAA AGGTCATTCC ACCTACAGGC CAGACTGAAG AGGCGAAGGC 3060CATCTTAGAA CCTGACAAAG AAGGGCTTGG TACAGAGGCA GCAGACTCTG AGCCTCTGGA 3120ATTAGGAGGT CCTGGTGCAG AATCTGAACA GGCAGAGCAG ACAGCAGGGC AGAAGCGGCC 3180TTTGAAGAAT GATGAGCTGT GACCCCGCGC CTCCGCTCCA CTTGCCTCCA GCCCCTTCTC 3240CTACCACCTC TA 3252(2)SEQ ID NO：5：的资料 (i)序列特征：
(A)长度：31个碱基对
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线形 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Leu Ala Val Met Ser Val Asp Leu
5Gly Ser Glu Ser Met Lys Val Ala
10 15Ile Val Lys Pro Gly Val Pro Met
20Glu Ile Val Leu Asn Lys Glu25 30(2)SEQ ID NO：6：的资料 (i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线形 (ii)分子类型：其他核酸、合成的核酸 (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：AATACGACTC ACTATAGGGA(2)SEQ ID NO：7：的资料 (i)序列特征：
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线形 (ii)分子类型：肽 (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Lys Pro Gly Val Pro Met Glu
5(2)SEQ ID NO：8：的资料
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：其他核酸，合成的核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：AARCCiGGiG TNCCNATGGA 20
(2)SEQ ID NO：9：的资料
(i)序列特征：
(A)长度：13个碱基对
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Lys Pro Gly Val Pro Met Glu Ile
5Val Leu Asn Lys Glu
10
(2)SEQ ID NO：10：的资料
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：其他核酸，合成的核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GCACCCTTGA GGAAAATGCT 20(2)SEQ ID NO：11：的资料
(i)序列特征：
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：其他核酸，合成的核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CCCAGAAGCC CAATGAGAAG 20(2)SEQ ID NO：12：的资料
(i)序列特征：
(A)长度：2861个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GAAAGAAGTA GACATGGGAG ACTTCATTTT GTTCTGTACT AAGAAAAATT CTTCTGCCTT 60GGGATGCTGT TGATCTATGA CCTTACCCCC AACCCTGTGC TCTCTGAAAC ATGTGCTGTG 120TCCACTCAGG GTTAAATGGA TTAAGGGCGG TGCAAGATGT GCTTTGTTAA ACAGATGCTT 180GAAGGCAGCA TGCTCGTTAG GAGTCATCAC CACTCCCTAA TCTCAAGTAC CCAGGGACAC 240AAACACTGCG GAAGGCCACA GGGTCCTCTG CCTAGGAAAG CCAGAGACCT TTGTTCACTT 300GTTTATCTGC TGACCTTCCC TCCACTATTG TCCTATGACC CTGCCAAATC CCCCTCTGCC 360AGAAACACCC AAGAATGATC AATAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAGGAAG AATAGACTCT 420CTCTGGGACT GCCAATAATT TTTCCTTCTA AGCATAGACA CCGGACCACT CTCCACCTAA 480GCATCACGAA AAATGTAGAG AAAGGAAGAG CTAAGAGCTC CTTAAACAAG TTCAGGCTTG 540ACACAACCCT GGCCCTGACA GCCAGGGTCT TCAAGCGGGC CTTTCTGTGA AGGGTGGCCA 600GGCATCAACT TAGTAGGAGA GAAAACAGAT GACTTATTTC CATCCACACT TAAGGAAAAT 660GCAGTCTCCA AGGACTGCGT ACATTTCTTT TTCGAGAAGG AGTCTCGCTG TTGTCGCCCA 720GGCTGGAGTG CAGTGGCGCA GTCTGGGCTC ACAGCAACCT CTGCCTCCCG GATTCAAGCA 780ATTCTCCTGC CTCAGCCTCG TGAGTAGCTG GGATTACAGG CACCCGCCAC CACGCCTGGC 840TAATTTTTGT AGTTTTGGTA GAGACGGGGT TTCACCATGT TGGCCAGGCT GGTCTCGAAC 900TCCTGACCTC CAGTGATTCG CCCGCCTTGG CCTCCCAAAA TGCTGGGATT ACAGGCGTGA 960GCCACCGCGC CCGGGCGACT GCGCACATTT CTATGGAGCT GTAAGTTAAA AGAGAAGGCA 1020GTGAGGTGCT TCTGTCATTC TATGACAGAA ACAGCTAAAG AGTAGAGAAA TGTTCACAAG 1080ATTTAATAGA ACAGAAATAG GAGAAGGTGC ACACAAGCTC AACCAACTAT AGCCTCACAA 1140ATAAAAGTGT CTTTTGTGTG TAGTACTTAA GTTTGGAATA TTCTTTCTTA TACAAATGAG 1200TGGGGCTTAA CCTAAGAAAT CCTGGCCAGA TTCTGCGACG AATGCATCGG TTATCTCTGA 1260CCCATCAGCA AACATCTTTT TCTGTGGCTT CAGTTTCCTC AGTAAAACAG AGGGGGTTGC 1320GACGGACTCA GTCCGAGGCA CAGCCATTCT CCAACGTCTA TCCAAAGCCT AGGGCACCTC 1380AATACTAACC GGCAGGCCAG CGCCCCCTCC GCGGGGCTGC GGACAGGACG CCTGTTATTC 1440CATTCCTCGG CCGGGCTCTA CAGGTGACCG GAAGAAGAGC CCCGAGTGCG GGACTGCAGT 1500GCGCCCGACC TGCTCTAGGC GCAGGTCACT CCCGAACCCC GGCAGCAAAG CATCCAGCGC 1560CGGAAAAGGT CCCGCGGTCG CCCCGGGGCC GGCGCTGGGG AGGAAGGAGT GGAGCGCGCT 1620GGCCCCGTGA CGTGGTCCAA TCCCAGGCCG ACGCCGGCTG CTTCTGCCCA ACCGGTGGCT 1680GGTCCCCTCC GCCGCCCCCA TTACAAGGCT GGCAAAGGGA GGGGGCGGGG CCTGGGACGT 1740GGTCCAATGA GTACGCGCGC CGGGGCGGCG GGGGCGGGGC CGGGCGCGCA GCGCAGGGCC 1800GGGCGGCCGA GGCTCCAATG AGCGCCCGCC GCGTCCGGGG CCGGCTGGTG CGCGAGACGC 1860CGCCGAGAGG TTGGTGGCTA ATGTAACAGT TTGCAAACCG AGAGGAGTTG TGAAGGGCGC 1920GGGTGGGGGG CGCTGCCGGC CTCGTGGGTA CGTTCGTGCC GCGTCTGTCC CAGAGCTGGG 1980GCCGCAGGAG CGGAGGCAAG AGGTAGCGGG GGTGGATGGA GGTGCGGGCC GGCCACCCCT 2040CCTAGGGGAG ACAGCGTGCG AGCTCCGGGG GCGGGTCGGG AGCGCAAGGG AGGGCCGCGC 2100GGACGCCGGG CGCTCGGCCT CGCACCGGGG GGCACGCAGC TCGGCCCCCG GTCTGTCCCC 2160ACTTGCTGGG GCGGGCCGGG ATCCGTTTCC GGGAGTGGGA GCCGCCGCCT TCGTCAGGTG 2220GGGTTTAGGT GAACACCGGG TAACGGCTAC CCGCCGGGCG GGGAACCTTA CCGCCCCTGG 2280CACTGCGTCT GTGGGCACAG CGGGGCCGGG GAGTGAGCTG GGAAAGGGGA GGGGGCGGGA 2340CAACCCGCAG GGATGCCGAG GAGGAGATAG GCCTTTCCTT CATCCTAGCT ACCCCCAACG 2400TCATTACCTT TCTCTTCCCG TCCAGGCCCA GCTGGCTTTC CCCGTCAGCG GGGGAGCTCC 2460AGGTGTGGGG AGGTGGTTGA GCCCTGGGCG GGGATCCCTG GCCGCACCCC AGGTGTCTGA 2520CAACAGGCAC AGTGCTGCGG TGCGCCACTC ACTGCCTGTG TGGTGGACAA AAGGCTCGGG 2580TCTCCTTTCT CTTGTCCTGT TAGCTTCTCT GTTTAGGGAT GTGGCAAAGC CGAGGACCCA 2640TGCTCTTTCA CTTGGGCCTT TGTGTGGGCG CTGCTGGGAT GATTAGAGAA TGGTTTGTAC 2700CCATCAGGAG GGAGAAGGGG AGAAGTAGGC TGATCTGCCC TGGGTAAGAA TGAAGTAGAT 2760ATGAATCTTA CAGCCTCTCC GTTCTGGGAT GTGATTCTGT CTCCTTCACT CCGGGTATCC 2820AGTTTTAAGT GTTTTCTTTC TTCGCCTCCC CCAGGGGCAC T 2861