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1、10申请公布号CN104313109A43申请公布日20150128CN104313109A21申请号201410513049722申请日20140929C12Q1/04200601C12N15/01200601C12R1/4620060171申请人安徽工程大学地址241000安徽省芜湖市镜湖区北京中路72发明人薛正莲周扬秦艳飞赵世光王洲74专利代理机构北京科亿知识产权代理事务所普通合伙11350代理人汤东凤54发明名称一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法57摘要本发明提供了一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，利用新型ARTP育种系统诱变那西肽活跃链霉菌，通过响应面法优化24。
2、深孔板发酵条件，并且利用24深孔板培养法建立高通量筛选突变体的方法，获得高产稳产那西肽突变株。本发明验证24深孔板效价及摇瓶效价之间的相关性，使其筛选方法非常准确快速，同时与传统摇瓶发酵筛选相比，24深孔板法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图4页10申请公布号CN104313109ACN104313109A1/1页21一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤1采用常压室温等离子体处理那西肽活跃链霉菌150S；2将诱变后待筛选的那西肽活跃链霉菌。
3、稀释涂布于固体平板，在3705下培养72H；3用牙签挑取诱变后的单菌落孢子接入每孔装有46ML固体培养基的24深孔板中进行固体培养，同时一一对应地用接种铲挖0203CM2的菌体接入装有255ML种子培养基的24深孔板进行液体培养；种子培养结束分别转接装有093ML发酵培养基的24深孔板，发酵培养结束测效价，对应的固体培养孔板菌落作保存，液体培养2805，转速260R/MIN，种子培养40H，发酵120H，固体培养3705，72H；4接种24深孔板固体培养的菌落于斜面试管培养好后用于摇瓶发酵，测效价。2如权利要求1所述的那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于，在步骤3中，种子培养基。
4、为豆饼粉20，葡萄糖30，玉米浆20，MGSO47H2O005，NH42SO403，轻质碳酸钙05，115灭菌25MIN。3如权利要求2所述的那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，其特征在于，在步骤3中，所述固体培养基为可溶性淀粉2，豆饼粉05，KNO301，NACL005，MGSO47H2O005，K2HPO43H2O005，FESO47H2O0001，琼脂2030，121灭菌20MIN；步骤3中所述的种子培养基豆饼粉20，葡萄糖30，玉米浆20，MGSO47H2O005，NH42SO403，轻质碳酸钙05，115灭菌25MIN。4如权利要求3所述的那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方。
5、法，其特征在于，在步骤3中，所述发酵培养基为淀粉70，淀粉酶淀粉的01，葡萄糖05，酵母粉02，黄豆粉含油40，NH42SO401，KNO3005，NACL04，轻质碳酸钙04，115灭菌25MIN。权利要求书CN104313109A1/6页3一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法技术领域0001本发明属于微生物诱变育种、发酵工程领域，尤其涉及一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法。背景技术0002那西肽NOSIHEPTIDE是种含硫多肽类抗生素，又称诺西肽，主要有活跃链霉菌产生。它具有促进动物的生长、提高饲料利用率、增强动物的抗病能力，且在动物体内无残留，对人畜安全，对环境污染小。
6、等优点，是一种理想的饲用抗生素换代品。0003目前，在欧盟、日本、台湾等地区，那西肽作为唯一饲用抗生素在饲料添加。国内的科研工作者在那西肽活跃链霉菌种的选育及发酵工艺优化等方面做了大量的研究，使那西肽的生产技术得到很大提高。但目前工业发酵单位总体水平较低，生产菌种的性能仍有很大的提升空间。0004利用新型ARTP育种方法诱变那西肽活跃链霉菌可以快速有效地获得那西肽活跃链霉菌突变库。近年培养基优化方法已由传统的非统计优化法逐渐转向统计优化法，即通过实验设计与结果分析，建立相关的数学模型，再求解模型的最优值并进行校验。其中响应面优化法在生物医药领域取得了一系列良好的效果。高通量筛选是获得高产突变株。
7、的关键步骤。0005目前关于高产那西肽活跃链霉菌株的筛选方法通常是随机筛选法或抗性平板筛选法，然后采用摇瓶逐个进行发酵培养并测定菌株的目标产量，该方法筛选工作量大、周期长、效率低及成本高。发明内容0006针对目前筛选那西肽活跃链霉菌高产菌株的方法耗时、费力、低效率、成本较高，本发明通过提供一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，可以有效地解决上述存在的问题；同时优化24深孔板的发酵条件，验证24深孔板效价及摇瓶效价之间的相关性。0007本发明是这样实现的，一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，包括以下步骤00081采用常压室温等离子体处理那西肽活跃链霉菌150S；00092将诱变。
8、后待筛选的那西肽活跃链霉菌稀释涂布于固体平板，在3705下培养72H；00103用牙签挑取诱变后的单菌落孢子接入每孔装有46ML固体培养基的24深孔板中进行固体培养，同时一一对应地用接种铲挖0203CM2的菌体接入装有255ML种子培养基的24深孔板进行液体培养；种子培养结束分别转接装有093ML发酵培养基的24深孔板，发酵培养结束测效价，对应的固体培养孔板菌落作保存，液体培养2805，转速260R/MIN，种子培养40H，发酵120H，固体培养3705，72H；说明书CN104313109A2/6页400114接种24深孔板固体培养的菌落于斜面试管培养好后用于摇瓶发酵，测效价。0012优选地。
9、，在步骤3中，种子培养基为豆饼粉20，葡萄糖30，玉米浆20，MGSO47H2O005，NH42SO403，轻质碳酸钙05，115灭菌25MIN。0013优选地，在步骤3中，所述固体培养基为可溶性淀粉2，豆饼粉05，KNO301，NACL005，MGSO47H2O005，K2HPO43H2O005，FESO47H2O0001，琼脂2030，121灭菌20MIN；步骤3中所述的种子培养基豆饼粉20，葡萄糖30，玉米浆20，MGSO47H2O005，NH42SO403，轻质碳酸钙05，115灭菌25MIN。0014优选地，在步骤3中，所述发酵培养基为淀粉70，淀粉酶淀粉的01，葡萄糖05，酵母粉0。
10、2，黄豆粉含油40，NH42SO401，KNO3005，NACL04，轻质碳酸钙04，115灭菌25MIN。0015本发明克服现有技术的不足，提供一种那西肽活跃链霉菌高产菌株的高通量筛选方法，利用新型ARTP育种系统诱变那西肽活跃链霉菌，通过响应面法优化24深孔板发酵条件，并且利用24深孔板培养法建立高通量筛选突变体的方法，获得高产稳定的那西肽突变株。0016相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果利用新型ARTP育种方法诱变那西肽活跃链霉菌，利用多孔板培养法建立高通量筛选突变体的方法，该方法验证24深孔板效价及摇瓶效价之间的相关性，使其筛选方法非常准确快速，同时与传统摇瓶发酵筛选相。
11、比，24深孔板法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。附图说明0017图1是本发明实施例1中种子培养基装液量对24深孔板培养效价的影响；0018图2本发明实施例2中发酵培养基装液量对24深孔板培养效价的影响；0019图3本发明实施例3中发酵时间对24深孔板培养效价的影响；0020图4是本发明实施例5中突变株24深孔板效价与摇瓶效价之间的相关性；0021图5是本发明实施例6中突变株的相对效价；0022图6本发明实施例7中孔板发酵后分光光度计与酶标仪测孔板效价的相关性；0023图7本发明实施例8中摇瓶发酵后分光光度计与酶标仪测摇瓶效价的相关性。具体实施方式0024为了使本发明的目的、技术方案及优点更。
12、加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。0025菌株那西肽产生菌活跃链霉菌STREPTOMYCESACTUOSUNXTNA10菌株由安徽工程大学实验室保藏，该菌株已在文章“响应面法优化那西肽发酵条件”中国抗生素杂志,2013,386430433中公开。0026仪器及试剂ZHWYC2112B恒温恒湿培养箱上海智城分析仪器制造公司；HTST008恒温振荡器上海甘薇生物技术有限公司；超净台苏州净化设备有限公司，SORVALLST16R离心机赛默飞世尔，酶标仪赛默飞世尔；ARTP育种机北京思清源生物科技有限公。
13、司。化学药品均为国产分析纯。说明书CN104313109A3/6页50027那西肽的含量测定723分光光度计比色法、96孔板酶标仪比色法。0028实施例124深孔板种子培养基装液量对那西肽效价的影响0029种子培养基分别选取初始装液量为07ML、10ML、13ML、16ML、19ML、22ML、25ML、28ML、31ML，比较其对24深孔板中那西肽产量的影响，结果如图1所示。由图1可看出，当初始装液量在25ML时那西肽的产量最高。0030实施例224深孔板发酵培养基装液量对那西肽效价的影响0031按质量百分比将淀粉70，淀粉酶淀粉的01，葡萄糖05，酵母粉02，黄豆粉含油40，NH42SO4。
14、01，KNO3005，NACL04，轻质碳酸钙04，115灭菌25MIN得到发酵培养基。0032分别在07ML、10ML、13ML、16ML、19ML、22ML、25ML、28ML、31ML、34ML的发酵培养基装液量下进行发酵试验，比较其对那西肽产量的影响，结果如图2所示。当24深孔板中发酵培养基在10ML的条件下24深孔板发酵的产量最高。0033实施例3发酵时间对24深孔板培养效价的影响0034选择不同的发酵时间测定那西肽的产量，结果如图3所示。由图3可以看出，在发酵前期，随着发酵时间的延长那西肽的产量在增大，但发酵120H后其产量有所下降，因此，发酵时间选择120H为宜。0035实施例4。
15、响应面模型的建立及方差分析0036在单因素实验结果的基础上设计BOXBEHNKEN中心组合实验，以24深孔板发酵的那西肽效价为响应值，对种子培养基装液量A、发酵培养基装液量B和发酵时间C设计响应面分析试验。结果如表1所示0037表1BOXBEHNKEN实验设计与结果0038说明书CN104313109A4/6页60039利用SAS91软件对表3的实验数据进行回归分析得到二次回归方程0040Y1871850726957A5209825B736475C9561708A254925AB23331AC1070856B2335345BC1413516C2。0041根据该回归模型进行方差结果分析，如下表2。
16、所示0042表2回归模型的方差分析结果说明书CN104313109A5/6页700430044从表2中可以看出，模型PRF0000286，该模型回归极显著，其失拟项PRF006722，失拟不显著，模型较准确。相关系数R209880表明拟合程度良好，具有较好的相关性。同时，一次项A显著，B项极显著，二次项A2、B2、C2均为极显著水平，交互项AC极显著，BC项显著，说明因素间有明显的交互作用。0045对以上得到的回归方程偏导微分处理得到模型的极值点坐标为A008176，B023173，C006029。即24深孔板发酵产那西肽的最佳条件是种子培养基装液量254906ML，发酵培养基装液量09304。
17、8ML，发酵时间1214469H，根据实际实验操作将优化条件修正为种子培养基装液量255ML，发酵培养基装液量093ML，发酵时间121H。0046实施例5突变株高通量筛选模型的建立0047为了快速筛选到高产那西肽的菌株，本发明建立了利用24深孔板的高通量筛选方法。将按实施例1操作获得的诱变处理液稀释，涂布于固体平板培养基中在3705下进行培养72H，随机挑取21个单菌落，分别接入装有种子培养基和固体培养基的24深孔板中，种子培养结束转接发酵培养，120H后测效价，对应的固体培养孔板菌落作保存，液体培养2805，转速260R/MIN，72H，固体培养3705，72H。接种24深孔板固体培养的菌。
18、落于斜面试管培养好后，按比例接入装有种子培养基的摇瓶中培养，温度2805，湿度4050，转速260R/MIN，种子培养40H，转接入有一定量发酵培养基的摇瓶中培养，温说明书CN104313109A6/6页8度2805，湿度4050，转速260R/MIN，培养120H，测效价。测得的数据用ORIGIN86软件进行回归分析，以验证突变株24深孔板效价及摇瓶效价之间的相关性，结果如图4所示。21株突变株24深孔板效价与摇瓶效价之间的相关性很高，相关系数绝对值R为088264。一般来说，当实验样本量超过9时，只要R值达到07，那么就认定两变量间是确实相关。本发明的样本量为21，相关系数绝对值R达到了0。
19、88264，因此24深孔板培养法可以作为快速筛选那西肽高产突变体的有效方法。0048实施例6高产突变株的筛选0049采用实施例4优化的培养基装液量及发酵时间，对按实施例1实施获得的突变株进行24深孔板培养法筛选，对获得的高产菌株用摇瓶发酵测效价，结果如图5所示。选育到17株效价提高20以上的突变株，其中提高30以上的5株，40以上的3株。0050实施例7突变株的遗传稳定性分析0051在固体平板上活化菌，转移到种子培养基中进行一级培养，连续转移8次，然后做摇瓶发酵比较突变株产那西肽能力的稳定性。结果如表3所示0052表3高产菌株的遗传稳定性分析00530054经等离子体诱变的三株高产突变体均具有。
20、较好的遗传稳定性。0055实施例8酶标仪测定和分光光度计测定24深孔板效价的相关性0056采用实施例4优化的培养基装液量及发酵时间，对突变株进行24深孔板培养发酵，对24深孔板效价分别采用酶标仪和分光光度计测定，结果如图6所示，酶标仪测定和分光光度计测定24深孔板效价的相关系数绝对值R为099534。0057实施例9酶标仪测定和分光光度计测定摇瓶效价的相关性0058对按实施例1实施获得的突变株进行摇瓶发酵，对摇瓶效价分别采用酶标仪和分光光度计测定，结果如图7所示，酶标仪测定和分光光度计测定摇瓶效价的相关系数绝对值R为0967。0059以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104313109A1/4页9图1图2说明书附图CN104313109A2/4页10图3图4说明书附图CN104313109A103/4页11图5图6说明书附图CN104313109A114/4页12图7说明书附图CN104313109A12。