编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱 氢酶复合物的基因 发明背景
本发明涉及为链霉菌属微生物的支链α-酮酸脱氢酶
(BCKDH)复合物编码的新DNA序列。本发明也涉及通过基因工
程技术生产阿凡曼链菌(streptomyces avermitilis)支链α-酮酸
脱氢酶(bkd)-缺损突变体的方法。所述bkd-缺损突变体缺乏
支链α-酮酸脱氢酶活性，在发酵生产新(非天然)阿凡曼菌素
(avermectins)上是有用的。
阿凡曼链霉菌天然产生被命名为阿凡曼菌素和8种不同的但密
切相关的抗寄生虫聚酮化合物。由阿凡曼链霉菌产生的阿凡曼菌素
复合物具有4种主要组分(A1a、A2a、B1a和B2a)和4种次要
组分(A1b、A2b、B1b和B2b)。各组分的结构描述如下：
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阿凡曼菌素 R1 R2 X-Y
A1a 仲丁基 Me CH＝CH
A1b 异丙基 Me CH＝CH
A2a 仲丁基 Me CH2-CH(OH)
A2b 异丙基 Me CH2-CH(OH)
B1a 仲丁基 H CH＝CH
B1b 异丙基 H CH＝CH
B2a 仲丁基 H CH2-CH(OH)
B2b 异丙基 H CH2-CH(OH)
阿凡曼菌素聚酮化合物的结构由7个乙酸分子、5个丙酸分子
和一个α-支链脂肪酸(S(+)-2-甲基丁酸或异丁酸)分子衍生
而成。符号“A”和“B”指其中5-取代基分别是甲氧基或羟基
的阿凡曼菌素。数字“1”指其中双键在22-23位上的阿凡曼菌
素。数字“2”指在22位具有氢且23位具有羟基的阿凡曼菌素。
最后，C-25具有两种可能的取代基：存在于阿凡曼菌素“a”系
列中的仲丁基取代基(得自S(+)-2-甲基丁酸的引入)和存
在于阿凡曼菌素“b”系列的异丙基取代基(得自异丁酸的引入)
(作为回顾，可参见Fisher，M.H.and Mroziik，H.1984，“Macrolide
Antibiotics”，Academic Press，chapter 14)。
“天然”阿凡曼菌素指由阿凡曼链霉菌产生的其中25位取代基
如上所述是异丙基或仲丁基的那些阿凡曼菌素。其中25位取代基不
是异丙基或仲丁基的阿凡曼菌素这里称作新或非天然阿凡曼菌素。
以其CoA形式存在的天然α-支链脂肪酸的一条代谢途径是
从α-支链氨基酸异亮氨酸和缬氨酸开始经支链氨基酸转氨酶反
应，接着经支链α-酮酸脱氢酶反应(支链脂肪酸酰基-CoA衍生
物也可以从由全程合成产生的支链α-酮酸产生)。这些代谢途径
描述如下：
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过去已分离到在最后提到的酶中不具有可检测的支链α-酮酸
脱氢酶(BCKDH)活性的阿凡曼链霉菌突变体(Hafner et
al.，1988，欧洲专利EP 284，176，1993年10月20日公布)。在
从14C-1标记的2-氧代异己酸底物(亮氨酸类似物)不产生14CO2
的筛选研究中，在阿凡曼链霉菌菌株ATCC 31272的标准化学诱变
后分离到该突变体。除了当S(+)-2-甲基丁酸或异丁酸或携
带异丙基或仲丁基(S-型)基团的前体加入到该突变体的发酵培
养基中之外，该突变体不能合成天然阿凡曼菌素。当在含水有氧条
件下在含有外加可替换的羧酸(例如环己烷羧酸(CHC)或以上指
出的其前体的营养培养基中发酵养时，所述突变体也能产生新(非
天然)阿凡曼菌素。
克隆编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合物的基因是非
常合乎需要的。用重组DNA技术操作这些基因应当有利于天然和新
阿凡曼菌素的产生。就某些菌株而言，通过增加bkd基因的拷贝
数可以预料天然阿凡曼菌素增加的滴度。此外，通过基因取代使
BCKDH活性永久缺失或修饰产生的不可逆阻断的bkd菌株会是以
上提到的经化学诱变获得的bkd突变体的改进的替换物。
α-酮酸脱氢酶多酶复合物-支链α-酮酸脱氢酶
(BCKDH)复合物、丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物和α-酮戊二
酸脱氢酶(KGDH)复合物分别催化支链α-酮酸、丙酮酸和α-
酮戊二酸的氧化脱羧反应，释放出CO2并产生相应的乙酰-CoA和
NADH(Perham，R.N.，1991，Biochemistry，30：8501-8512)。每
一种复合物由三种不同的催化酶组成：脱羧酶(E1)、二氢硫辛酰
胺酰基转移酶(转酰基酶)(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)。
支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)是由三种功能性组分E1(脱
羧酶)，E2(转酰基酶)和E3(硫辛脱氢酶)组成的多酶复合物。
得自恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的纯净的复合物
由4种多肽组成。纯净的哺乳动物复合物也由4种多肽(E1α、E1
β、E2和E3)组成。已从具有丙酮酸和支链α-酮酸脱氢酶两种活
性的枯草芽孢杆菌分离出α-酮酸脱氢酶复合物。这一双功能复合
物氧化膜磷脂的丙酮酸和支链α-酮酸二者。
已报道了克隆假单胞菌和芽孢杆菌原核生物支链α-酮酸脱氢
酶基因。在这些系统中发现编码BCKDH的基因群集在操纵子上。
已克隆恶臭假单胞菌BCKDH复合物基因，并已测定了这一区的核
苷酸序列(Sykes et al.，1987，J.Bacteriol.，169：1619-1625，和Burns et
al.，1988，Eur.J.Biochem，176：165-169和176：311-317)。E1α的分
子量是45289、E1β的是37138、E2的是45134、E3的是48164。
所述4种基因群集在E1α、E1β、E2和E3序列上。Northern
印迹分析表明，这4种基因的表达从单mRNA发生，并且这些基因
构成一个操纵子。有一种紧靠在E1α编码区(它允许假单胞菌bkd
基因的组成型表达)起始位点之前的典型的原核生物共有序列启动
子。E1β编码区的起始密码子位于E1α开放读框(ORF)末端
下游仅40个核苷酸处。相反，在E1β和E2 ORF之间没有基因间
区，因为E1β ORF终止密码子是紧靠在E2 ORF起始密码子之前
的三联体。E2和E3 ORF之间的基因间区降低到仅有2个核苷酸。
因此，假单胞菌bkd基因是紧密连接的。
类似地，已克隆了编码枯草芽孢杆菌BCKDH/PDH双重复合物
的操纵子(Hemila et al.，1990，J.Bacteriol.，172：5052-5063)。这一
操纵子含有编码大小为42、36、48和50千道尔顿(kDa)的蛋
白质的4个ORF，表明它高度同源于假单胞菌bkd簇的E1α、E1
β、E2和E3亚单位。编码嗜热脂肪芽孢杆菌双重BCKDH/PDH多
酶复合物E1组分的α和β亚单位的基因也已被克隆和测序(估计α
和β亚单位的分子量分别为约41,000和35,000(Hawkins et
al.，1990，Eur.J.Biochem.，191：337-346)。
此外，已公开了大量真核生物(人、牛和大鼠)E1α和β
BCKDH亚单位的序列。最近，已通过计算机分析完成了得自多种
物种的PDH和BCKDH复合物E1α和E1β组分两者的所有出版
已知序列的氨基酸序列比较(Wexler et al.，1991，FEBS Letters，282：
209-213)。令人感兴趣地是，认定了α和β亚单位的几个区不仅在
迄今描述过的所有PDH中而且在原核生物和真核生物二者的
BCKDH复合物中都是高度保守的。
最近，分别编码阿凡曼链霉菌BCKDH复合物E1组分的α
(bkd A)和β(bkd B)亚单位及E2(bkd C)组分的基因也
被采用异源基因表达系统克隆、测序和分析(Denoya，C.D.，1993，
“Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydro-
genase complex from Streptomyces avermitilis”，美国专利申请
08/100，518，1993年7月30日申请)。DNA序列分析表明，存
在按以下方式排列成簇的推定的转录启动子序列和bkd结构基因：
启动子序列，E1-α(bkd A)，E1-β(bkd B)和E2(bkd
C)开放读框。此外，完整的阿凡曼链霉菌bkd ABC基因簇被克隆
到用于在大肠杆菌宿主中表达的强大肠杆菌T7启动子的下游。类似
地，E1-α和E1-β开放读框(ORF)也被分别或同时克隆到
T7启动子下游，且对每一构建体进行了表达试验。这些研究表明，
当在大肠杆菌中表达时，至少2个阿凡曼链霉菌bkd基因簇的开放
读框(E1-α-〔bkd A〕和E1-β〔bkd B〕)是完全可翻译
的。此外，旨在特定性分析BCKDH复合物E1组分的酶试验最后证
实，两个重组大肠杆菌克隆(一个携带全部bkd基因簇，另一个同
时携带E1-α和E1-βORF)具有E1 BCKDH-特异性酶活
性。
本发明涉及编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶(BCKD
H)的第二簇新基因的分子克隆和分析，所述簇至少包含3种基因
(bkd F、bkd G和bkd H)，这些基因分别为阿凡曼链霉菌BCKDH
复合物的E1-α、E1-β和E2亚单位编码。这里公开的bkd基
因族位于最近报道(Denoya，C.D.，1993，美国专利申请08/100,
518，1993年7月30日申请)的第一bkd簇(bkd A、bkd B和
bkd C基因)下游约12千碱基(kb)处。两簇都有类似的基因组
构，且它们在阿凡曼链霉菌染色体中以相同的方向取向。两簇中相
应的结构基因尽管高度同源，但是不同的。
此外，本发明也涉及用基因工程技术构建bkd突变体的方法。
所述bkd突变体具有影响bkdF基因的染色体缺失，缺乏支链α-
酮酸脱氢酶活性，它在以异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸单独作碳源时
不能生长，在缺少S-2-甲基丁酸和异丁酸二者的培养基中也不
能产生天然阿凡曼菌素。本文公开的突变体在经发酵产生新(非天
然)阿凡曼菌素上是有用的，所述的发酵是在含有合适的可变羧酸
(例如环己烷羧酸(CHC))的培养基中进行。此外，本发明也涉
及构建具有影响bkd F基因和bkd ABC基因簇二者的染色体缺失的
突变体的方法。
链霉菌具有一个主要的遗传连锁群(一种染色体)，它通常以
每个菌丝分隔含多个拷贝的形式存在，但在孢子中仅以单拷贝存
在。在原核生物中，链霉菌基因组特别大(5×103到7×103千碱
基〔kb〕)(Gladek，A.，and Zakrzew sha，J.，1984，FEMS Microbiol.
lett.，24：73-76)，约是大肠杆菌基因组大小的2倍。
链霉菌遗传学特别有趣的一点是频繁的染色体重排，该重排涉
及常常伴随强烈DNA扩增的广泛的缺失(Birch A.et al.，1990，J.
Bacteriol.，172：4138-4142)。链霉菌中扩增和缺失现象比大肠杆菌
和枯草芽孢杆菌中的类似现象强2到3个数量级。已报道了18％染
色体的缺失和45％基因组的扩增。尽管它们有遗传长期不稳定性，
但某些基因的复制以104细胞中1次的出现次数出现。这种复制常常
是由非常规交换现象(涉及分开的子染色体中DNA的短的、部分同
源部分)产生的。由于在相同的染色体上产生新的DNA骨架，因此
自然易于在这种复制现象之后出现进一步的基因扩增或消除现象。
不仅相同基因而且具有高度相似结构的两种不同基因的多拷贝易于
重组并产生缺失。这样，要求一种基因的遗传稳定性不能与任何其
它基因的太相似。
链霉菌中基因或基因组的多拷贝的出现是不常见的。已报道了
Saccharopoly spora erythraea中合成大环内酯抗生素红霉素的聚酮
化合物部分所需的基因组件结构(Donadio et al.，1991，Science，252：
675-679)。
我们已发现阿凡曼链霉菌具有至少两簇bkd基因：一族包括bkd
A、bkd B和bkd C基因，另一簇包括bkd F、bkd G和bkd H基
因。我们推测bkd ABC基因簇(以前在美国专利申请08/100,518
(1993年7月30日)中公开，以上已提及)和这里公开的bkd FGH
基因簇两者在阿凡曼链霉菌中由基因复制产生，并且2个拷贝经突
变获得了足以维持其存在(避免重组/缺失现象)的不同。
除了公开编码BCKDH的新的第二簇基因外，我们也公开了用
基因工程技术构建阿凡曼链霉菌bkd F突变体的方法。所述bkd F
突变体缺乏支链α-酮酸脱氢酶活性，在用异亮氨酸、亮氨酸和缬
氨酸单独作为碳源时不能生长，在缺少S-2-甲基丁酸和异丁酸
二者的培养基中也不能产生天然阿凡曼菌素。该bkd F突变体在经
发酵产生新阿凡曼菌素中是有用的，所述的发酵是在含有合适的可
变羧酸(例如环己烷羧酸(CHC))的培养基中进行的。我们还公
开了构建携带影响bkd F基因和bkd ABC基因簇二者的染色体缺失
的突变体的方法。
用化学和物理方法诱变产生链霉菌突变体对分析基因功能和基
因调节以及开发改进的工业菌株来说是一项重要的技术。链霉菌基
因克隆最近的进展已使采用重组DNA技术操作大量克隆基因(如抗
性基因、生物合成基因和调节基因)以及阐明基因组构和基因调节
成为可能。另一种诱变方法-基因取代已成功地用于酿酒酵母、大
肠杆菌种枯草芽孢杆菌(Scherer，S.and R.W.Davis，1979，Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76：4951-4955；Shortle，D.，et.，al 1982，Science，
217：371-373；Stahl，M.L.，and Ferrari，E.，1984，J.Bacteriol.，158：411-
418)、Saccharopolyspora erythraea(Weber，J.M.，and
Losick，R.，1988，Gene，68：173-180)和几个种的链霉菌。这一技术使
得携带在质粒上的体外产生的突变引入到宿主菌株的染色体中。这
一方法是基于发现宿主染色体和含有同源区的质粒之间可发生重
组。
阿凡曼链霉菌中的基因取代是用载体中携带的克隆序列和其染
色体配对物之间的同源重组的方法进行的。可假定，引起整合和其
后切除整合质粒的分离步骤的同时发生的双交换或单交换导致克隆
序列和居留序列之间的相互交换。我们已观察到阿凡曼链霉菌中的
双交换和单交换两种现象。双交换和单交换两种机制之后切除产生
相同的产物。采用这一方法，我们可以破坏阿凡曼链霉菌bkd F基
因的E1-α开放读框。该破坏作用涉及约1.4kb的染色体缺失，该
缺失影响编码BCKDH复合物E1-α亚单位的基因的5′-半边。所
形成的突变株表现出bkd突变体所有的特征性表型特征，它是稳定
的并且能用于经发酵产生有价值的新阿凡曼菌素。
本文引用的所有文献以其整体在此一并作为参考文献。
术语解释
本说明书全文使用的技术术语对分子遗传学领域的技术人员是
公知的。本发明中经常使用的术语定义如下：
扩增：指产生以染色体内或染色体外DNA被发现的染色体序列
的额外拷贝。
抗生素抗性基因：当引入到天然对特定抗生素敏感的宿主细胞
中时，使宿主细胞对该特定抗生素有抗性的DNA序列。也称作抗生
素标记。
克隆：与单个始祖细胞相同的大量细胞或分子。
克隆载体：可插入待克隆的外源DNA的任何质粒，经转化后它
将外源DNA携带到宿主细菌细胞中。
CoA：辅酶A。
粘端序列(CoS)：允许体外包装的得自细菌噬菌体λ的DNA
序列。
粘粒：已插入细菌噬菌体λCOS位点的质粒，其结果是该质粒
DNA(携带外源DNA插入片段)可被在噬菌体包被中体外包装。
CRNA：与DNA互补的单链RNA，从前者经体外转录合成。
交换：指出现克隆序列和其染色体配对物之间物质的相互交换
点。
道尔顿：与相当于1个氢原子分子大小相联系的通常使用的质
量单位。
DNA连接：形成连接两个DNA片段的化学键。
双交换现象：同时或相继发生双交换。其结果是克隆序列与居
留序列之间发生相互交换。
基因簇：在染色体上物理性相近的一组基因。
基因取代：将质粒上携带的体外衍生的突变引入到染色体中的
技术。当宿主染色体和含有与其同源的区的质粒重组时发生该取
代。
基因组：完整的染色体组。所有单个基因的总和。
杂交、菌落杂交：用来鉴别细菌菌落的技术，所说的菌落携带
有其中插入的DNA类似于某些特定序列的嵌合载体。
菌丝：霉菌生长或营养形式的主要因素。菌丝是管状结构，直
径约2到10微米，它形成称为菌丝体的大量缠绕在一起的链。
kb：DNA或RNA的1,000个碱基对的缩写。
接头：含有一种或多种限制酶靶位点的短的合成以链寡核苷
酸。将其加入到载体上可产生新的多接头或多克隆位点(MCS)。
NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
核苷酸：核酸的组成部分或单体单位。
寡核苷酸：短链核苷酸。
操纵子：细菌基因表达和调节的一个完整的单位，包括结构基
因、调节基因和被调节基因产物识别的DNA中的调控元件。
质粒：自主、自身复制的染色体外环状DNA。
质粒拷贝数：保持在细菌中的每一宿主染色体的质粒分子数。
引物：与一个DNA链配对并提供自由的3′-羟基末端的短的
DNA或RNA序列，在所述末端，DNA聚合酶开始合成脱氧核糖核
酸链。
原核细胞：包括大多数微生物的小的相对简单的细胞。
启动子：引起转录开始的DNA区。
限制酶：识别并切割特定的短DNA序列的酶。
限制识别序列：被特定的限制酶特异性识别的DNA序列。也称
作靶位点。
穿梭载体：能够在一种或多种可变宿主(例如大肠杆菌和链霉
菌)中复制的双功能载体。
单交换现象：在单点发生的单相互基因重组，它导致新进入的
环状质粒或噬菌体载体在同源染色体序列中的整合和复制。
Southern印迹法：将变性DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维
素滤膜上的方法，在所述滤膜上变性DNA可以与互补的核酸探针杂
交。
亚克隆：将克隆的DNA片段从一种类型的载体转移到另一种类
型的载体中(例如从重组粘粒转移到质粒中)。然后新的重组质粒
转化进合适的宿主细胞中，产生亚克隆菌株。
细菌细胞的转化：经掺入添加的DNA获得新的遗传标记。
发明概述
本发明涉及一种为链霉菌属微生物支链α-酮酸脱氢酶复合物
编码的分离的DNA区段。
本发明也涉及一种以上描述的分离的DNA区段，该区段还包含
调节所述支链α-酮酸脱氢酶复合物表达的DNA区。
本发明也涉及一种为阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合物
编码的分离的DNA区段。
本发明也涉及一种包含如以下描述的SEQENCE ID NO.1、
SEQUENCE ID NO.2、SEQUENCE ID NO.3或SEQENCE ID
NO.4的DNA序列或者其等位变异体的DNA区段。本发明也涉及一
种为外源DNA区段亚组且其功能等同于外源DNA区段的DNA区
段。
本发明也涉及：(a)包含SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCE
ID NO.2、SEQUENCE ID NO.3或SEQUENCE ID NO.4的DNA
序列或其等位变异体的重组DNA；(b)一种包含这种重组DNA
的质粒；和(c)一种其中已掺入这种重组DNA的宿主细胞。
本发明也涉及包含在一种DNA区段中的为支链α-酮酸脱氢
酶复合物编码的基因，其中所说的DNA区段选自由如以下定义的
pCD713、pCD740、pCD747和pCD854组成的组。
本发明也涉及一种包含SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCE
ID NO.2、SEQUENCE ID NO.3或SEQUENCE ID NO.4的DNA
序列或其等位变异体的DNA区段。
本发明也涉及一种包含一种DNA序列的DNA区段，所述的
DNA序列是SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCE ID NO.2、
SEQUENCE ID NO.3或SEQUENCE ID NO.4 DNA序列或其等位
变异体的亚组，当该区段用作探针时，它可以分别杂交到
SEQUENCE ID NO.1、SEQUENCE ID NO.2、SEQUENCE ID
NO.3或SEQUENCE ID NO.4或其等位变异体上，当该区段用作聚
合酶链反应引物时，它可以扩增全部或部分这种序列。
本发明也涉及一种基本上纯化的多肽，该多肽包含SEQUENCE
ID NO.5、SEQUENCE ID NO.6、SEQUENCE ID NO.7或
SEQUENCE ID NO.8的氨基酸序列。
本发明也涉及一种生产天然阿凡曼菌素的方法，该方法包括在
适于产生这种天然阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkd
F、bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因组片段拷贝数在其中
已增加的阿凡曼链霉菌进行发酵。
本发明涉及一种生产天然阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适
于产生这种天然阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用经操作或
取代决定着调节包含bkd F、bkd G和bkd H基因中一种或多种的
基因组片段的表达的基因使这种表达在其中已增强的阿凡曼链霉菌
进行发酵。
本发明也涉及一种生产新阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适
于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkd F、
bkdG和bkd H基因中一种或多种的基因组片段的表达在其中已降
低或消除的阿凡曼链霉菌进行发酵，其中所述的降低或消除是经对
决定着这种表达的基因的缺失、灭活、取代或其它操作进行的。
本发明的一个优选的实施方案涉及前述的生产新阿凡曼菌素的
方法，该方法包括在适于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培
养基中，用包含bkd F、bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因
组片段在其中已缺失或灭活的阿凡曼链霉菌进行发酵。
本发明也涉及一种生产新阿凡曼菌素的方法，该方法包括在适
于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培养基中，用包含bkd
A、bkd B和bkd C基因中一种或多种和bkd F、bkd G和bkd H
基因中一种或多种的基因组片段的表达在其中已降低或消除的阿凡
曼链霉菌进行发酵，其中所述的降低或消除是经对决定着这种表达
的基因的缺失、灭活、取代或其它操作进行的。
本发明一个优选的实施方案涉及前述的生产新阿凡曼菌素的方
法，该方法包括在适于产生这种新阿凡曼菌素的条件下和发酵培养
基中，用包含bkd A、bkd B和bkd C基因中一种或多种和bkd F、
bkd G和bkd H基因中一种或多种的基因组片段在其中已缺失或灭
活的阿凡曼链霉菌进行发酵。
附图简要说明
图1：用来克隆阿凡曼链霉菌bkd F基因(E1α BCKDH)
片段的聚合酶链反应(PCR)引物的核苷酸序列。用9个氨基酸长
的保守区设计每一引物。相应于每一保守氨基酸的密码子表示在相
应的DNA序列的上面。右引物用包含人E1-αBCKDH亚单位(用
作E1-αBCKDE亚单位的代表性模型)的192-200位氨基酸
的区设计。左引物用包含E1-αBCKDH亚单位的286-293位
氨基酸的区设计。在右引物的5′末端，有两个额外的含腺嘌呤的核
苷酸和两个限制酶识别序列(EcoRI和Sacl)(被添加以促进克隆
PCR产物)。类似地，在左引物的5′末端，有两个额外的含腺嘌呤
的核苷酸和两个限制酶识别序列(BamHI和XbaI)。
图2：阿凡曼链霉菌bkd FGH基因簇的基因组限制性酶切图、
位置和亚克隆。也表示了以前公开的bkd ABC基因簇(参见
Denoga，C.D.，美国专利申请08/100,518，以上已提及)的位置。
图F的黑框表示用PCR克隆的起始E1-α-特异性阿凡曼链霉菌
基因组片段的位置和取向。表示了基因组亚克隆(pGEM-3Z衍生
物)。也表示了分别编码E1-α、E1-β和E2 BCKDH亚单位
的bkd F、bkd G和bkd H结构基因的位置和取向。鉴别的开放读
框(以方框表示)的极性是从左到右。缩写字母B代表BamHI；Bg代
表BgIII；P代表PstI；S代表SphI；“X”指如下所述的用于DNA
区测序的转座子小-γ-δ-1插入物的位置，所述DNA区位于
bkd F开放读框下游。
图3：用图1所示的引物经PCR克隆的501-bp阿凡曼链霉
菌基因组DNA片段(CD613)的核苷酸序列和推断的翻译产物。
这一基因组片段含有部分bkd F基因(E1-αBCKDH)。在每
行序列的顶部对核苷酸编号。推断的氨基酸序列表示在相应的密码
子序列下面。
图4：用SP6载体引物从pCD746亚克隆的PstI端测序的201
-bp阿凡曼链霉菌基因组DNA区的核苷酸序列和推断的翻译产
物。推断的翻译产物代表部分相应于bkd G基因的BCKDH复合物
的E1-β组分。在每行序列的顶部对核苷酸编号。推断的氨基酸序
列表示在相应的密码子序列下面。
图5：从小-γ-δ-1插入物“A3”两端测序的194-bp
阿凡曼链霉菌基因组DNA区的核苷酸序列(序列CD785)和推断
的翻译产物。所述“A3”距BamHI端约1.7kb，含有4.1kb BamHI
基因组片段中的bkd F基因。推断的翻译产物代表相应于bkd G基
因的NCKDH复合物E1-β组分的C-末端。在每行序列的顶部
对核苷酸编号。推断的氨基酸序列表示在相应的密码子序列下面。
图6：从小-γ-δ-1插入物“A5”两端测序的455-bp
阿凡曼链霉菌基因组DNA区的核苷酸序列(序列CD 786)和推断
的翻译产物。所述的“A5”距BamHI端约3kb，含有4.1kb BamHI
基因组片段中的bkd F基因。推断的翻译产物代表相应于bkd H基
因的NCKDH复合物E2组分的C-末端。在每行序列的顶部对核
苷酸编号。推断的氨基酸序列表示在相应的密码子序列下面。
图7：基因取代载体pCD768的构建和阿凡曼链霉菌bkd F突
变株CD 794的基因组限制图。质粒pCD768是穿梭载体pCD262的
一种衍生物，pCD262携带有侧翼于emE标记(黑箭头)的2.3和
4.1kb BamHI阿凡曼链霉菌基因组片段。如以下所描述的，质粒
pCD761是一种中间构建体。也显示出了含bkd F基因的阿凡曼链霉
菌染色体区的基因组限制图(野生型和取代型菌株)。这些图是从
用5.0kb PstI基因组片段为探针的Southern杂交分析推断的。
BamHI缩写成B，PstI缩写成P。每一DNA片段上面的数字表示
以千碱基(kb)为单位的片段长度。
图8：基因取代载体pCD768的限制图。有阴影的框表示：tsr
-硫链丝菌肽抗性标记；amp-氨苄青霉素抗性标记；“2.3”-
2.3kb BamHI阿凡曼链霉菌基因组片段；erm-红霉素抗性标记；
“4.1”-4.1kb BamHI阿凡曼链霉菌基因组片段。也表示了链霉
菌和大肠杆菌源复制区。白框表示大肠杆菌载体区。箭头表示转录
和翻译的方向。
图9：bkd ABCF突变体的构建。表示出了基因组限制图、载
体构建体简图和靶基因组区。bkd基因簇的位置及开放读框取向的
表示法和缩写与图3说明中所述的相同。以灰色阴影区表示缺失的
区段。连续的线和虚线分别表示染色体和载体DNA。粗黑线代表用
于基因取代中的克隆基因组片段。垂直箭头表明抗生素抗性标记插
入物的位置。
发明详述
用两种分子遗传学技术(DNA聚合酶链反应(PCR)和同源
性探测)组合克隆了本发明的新DNA序列。
识别和克隆本发明的新DNA序列的方法以及用基因取代构建
bkd突变体的方法在以下描述。
首先，用保守区设计称作“右”和“左”(图1)的2种PCR
引物，所述保守区是从由不同物种的E1-αBCKDH肽序列推断
的和由文献上获得的多种排列识别的。使用右和左两种引物经PCR
扩增阿凡曼链霉菌基因组DNA获得约0.55kb长PCR产物。将这种
PCR扩增的DNA片段进一步克隆到大肠杆菌载体pGEM-3Z中以
产生重组质粒pCD613。接着，将质粒pCD613转化进大肠杆菌DH5
-α感受态细胞。选择出一种转化体，指定为菌株CD613。克隆
DNA片段CD613的DNA测序显示出存在具有高度同源于E1-α
BCKDH亚单位的推断肽的开放读框(图3)。然后将克隆的CD613
基因组DNA片段用作探针，经菌落杂交筛选阿凡曼链霉菌染色体文
库。识别了几个粘粒克隆。限制性分析和Southern印迹分析表明，
所有选择出的粘粒克隆都携带有重叠基因组片段。从亚克隆的基因
组DNA片段(在实施例6中详细描述)获得的染色体区DNA测序
表明，序列CD613是完整bkd基因簇的一部分。克隆的阿凡曼链霉
菌bkd基因包括长度约4kb的染色体区(图2)。DNA序列分析表
明存在bkd结构基因，该基因排列成按以下方式组构的簇：E1-α
(bkd F)、E1-β(bkd G)和E2(bkd H)开放读框(图2
-6)。
其次，构建携带有bkd F基因灭活变体的质粒。如图2所示，
(从左到右)画出了阿凡曼链霉菌染色体中3种邻近的BamHI限制
片段：2.3kb、1.4kb和4.1kb。1.4kb BamHI基因组片段携带起始
E1-α开放读框(ORF-1)(基因bkd F)。4.1kb BamHI携
带剩下的bkd基因簇(bkd F末端、bkd G和bkd H)。质粒pCD768
是携带两种阿凡曼链霉菌基因组片段(2.3和4.1kb BamHI)(它
们与染色体1.4kb BamHI片段两边邻近)的穿梭载体pCD262的衍
生物。此外，pCD768携带有位于2.3和4.1kb BamHI片段的ermE
标记。ermE标记(赋予红霉素抗性)与ORF-1(bkd F)有相
反的取向，避免由下游基因超量表达引起的可能的麻烦。如以下的
描述，经重组，该构建体产生宿主基因组中1.4kb缺失(将影响到
ORF1)。
将质粒pCD768转化进阿凡曼链霉菌31272 SC2宿主原生质
体。选择出表现出对红霉素的抗性(erm-R)和硫链丝菌肽的抗
性(tsr-R)两种抗性的两个转化体。使1号转化体(CD783)
在液体培养基中生长，制备原生质体，并在含红霉素的琼脂培养基
上制成平板。选择50个克隆并进一步分析：46个是erm-R、tsr
-R，4个是erm-R、tsr-S。后面的4个克隆表现出如下的
bkd-缺陷表型：它们不能在ILV基本培养基板上生长；它们没有
可检测的E1(支链脱羧酶)活性；除非外加S(+)-2-甲基丁
酸或异丁酸，它们不能经发酵合成天然阿凡曼菌素(参见实施例9)。
此外，当CHC加到发酵培养基中时，可合成新阿凡曼菌素(CHC
-阿凡曼菌素。说明bkd阻断不影响阿凡曼菌素生物合成的细胞机
制。这一组4个中的1个克隆(克隆pp15)事先命名为阿凡曼链霉
菌菌株CD794，并作为本发明的一个例证保藏在美国典型培养物保
藏中心。最后，Southern杂交分析证实，如所预期的，靠阿凡曼链
霉菌ATCC 31272 SC2中的基因取代，相应于bkd F基因的OR1-
1被破坏。
以下是有关阿凡曼链霉菌bkd基因克隆的实验步骤和所得结果
的详细描述：
(a)可用作结合PCR引物候选位点的E1-α BCKDH肽亚单
位中保守区的识别
对比来自人(Fisher et al.，1989 J.Biol.Chem.，264：3448-
3453)、大鼠(Zhany et al.，1987，J.Biol，Chem.，262：15220-15224)，
恶臭假单胞菌(Sokatch et al.，1988，Eur.J.Biochem.，176：311-317)
和嗜热脂肪芽孢杆菌(Perham et al.，1990，Eur.J.Biochem.，191：337-
346)的4种E1-αBCKDH肽序列，以识别可用作设计相应PCR
引物的序列的保守区。用GCG序列分析软件包(GCG，Madison，
WI)的LineUP和Pretly程序进行计算机分析以识别在原核生物和
真核生物两者的BCKDH复合物中高度保守的E1-α亚单位区。四
种E1-αBCKDH肽的多种对比显示出几个广泛同源性区(参见
Wexler，I.D.，et al.，1991，FEBS letters，282：209-213)。位于人E1-α
氨基酸182-229之间的硫胺素焦磷酸结合基序)Perham et
al.，1989，FEBS Lett ers，255：77-82)和包含磷酸化位点1和2跨越氨基
酸291-307的区在所有4种被分析的E1-αBCKDH肽中明显
保守。也存在前述的位于氨基酸245-289之间的高同源性区。
这一区对α-酮酸脱氢酶(它有α和β亚单位二者)显得是独特的，
它不同源于大肠杆菌PDHE1或大肠杆菌和酵母α-戊二酸脱氢酶
复合物的E1组分(它们是仅由单独的E1多肽组成的二聚体)中的
任何序列。由于以上提到的原因，已说明后面的同源性区在亚单位
相互作用中起作用(Patel et al.，1991，FEBS Letters，282：209-213)。
选来进行PCR引物设计的保守区编码人E1-αBCKDH蛋白质的
氨基酸残基192到200和286到293。
(b)从用作PCR引物的那些E1-αBCKDH保守区衍生的
新寡核苷酸的设计
如以上的描述，从多种比较研究选择出E1-αBCKDH亚单
位的两个保守区。用包含人E1-αBCKDH亚单位(用作E1-α
BCKDH亚单位的代表性模型)氨基酸192-200的区设计右PCR
引物(图1)。这些氨基酸位于硫胺素焦磷酸结合基序的范围内。
用包含人E1-α BCKDH亚单位氨基酸286-293的区设计左
PCR引物(图1)。后面的氨基酸序列包含亚单位相互作用位点末
端部分和磷酸化位点保守区的起始部分。使用链霉菌基因密码子排
布法(F.Wright and M.J.Bibb，1992，Gene，113：55-65)。在右引物5′
-末端有促进克隆PCR产物的2个额外的含腺嘌呤的核苷酸和两个
限制酶识别序列(EcoRI和SacI)。类似地，在左引物的5′-末端
有两个额外的含腺嘌呤的核苷酸和两个限制酶识别序列(BamHI
和XbaI)。
右PCR引物完整的序列是：
5′-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGA
GGGCGAC-3′
左PCR引物完整的序列是：
5′-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSC
GGWA-3′
用国际生物化学联合会(IUB)核苷酸命名规则描述DNA序
列。按如下的IUB组码识别丰余序列：K＝G+T、S＝G+C、
W＝A+T。与E1-αbkd基因不同源的和为克隆目的掺入到引
物中的限制识别序列是下面画线的(参见图1)。
(c)阿凡曼链霉菌基因组DNA片段的PCR扩增
用适于高GC含量DNA和使得链霉菌DNA有效和特异扩增的
反应条件酶促扩增阿凡曼链霉菌基因组DNA(参见实施例2)。用
以上描述的引物(右引物5′-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGG
CGCCACCTCCGAGGGCGAC-3′和左引物5′-AAGGATCCT
CTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3′)。组合完成
PCR。扩增产物用琼脂凝胶电泳按大小分成不同的组分。在以上所
述的PCR条件下，当采用这种引物组合时检测到单个DNA带(长
度约550碱基对)。
(d)扩增的基因组DNA片段克隆到大肠杆菌克隆载体中，再
转化进大肠杆菌宿主中
如以前提到的，为方便克隆，将EcoRI限制位点掺入到右PCR
引物中，使XbaI限制位点存在于左引物5′末端。用电洗脱从琼脂糖
凝胶回收0.55kb PCR片段，并用EcoRI和XbaI限制酶两者消化。
在将特定片段连接进线性化的大肠杆菌载体(pGEM-3Z)后回收到许
多重组克隆，产生重组质粒pCD613，将其转化进大肠杆菌感受态
细胞中。选择出一种转化体用于进一步研究其特征，将其指定为菌
株CD613。证实性限制分析表明，从大肠杆菌菌株CD613分离的
质粒PCD613确定含有0.55kb阿凡曼链霉菌插入物。
(e)克隆片段的DNA测序的bkd-特异性序列的识别
用一对载体引物经双链测序方法对存在于质粒pCD613中的
0.55kb插入物测序(参见实施例6A)。此外，将0.35kb SalI片段
(位于0.55kb PCR插入物内)亚克隆进细菌噬菌体MB中，并用单
链测序方案测序(参见实施例6B)。用单链DNA模板和Taq Track
试剂盒(Promega)按双脱氧核苷酸链终止法完成DNA测序。DNA
测序数据的密码子优先分析(GCG序列分析软件包，
Madison，WI)表明具有预期的用于链霉菌基因的密码子的开放读
框。
接着，用IntelliGenetics Suite软件(IntelliGenetics
Inc.，Mountain View，California)Seq和Translate程序将推定的开放
读框翻译成氨基酸序列。最后用IntelliGenetics软年FASTDB程序
进行具有询问肽序列(query peptide)的数据库类似性检索。检索
DNA数据库(GenBankR，National Institute of Health，和European
Molecular Biolologg Laboratory(EMBL)，Heidelberg，Germang)或
蛋白质数据库(PIR和Swiss-Prot)的所有数据库检索明确显示，源
于克隆CD613的序列高度同源于但是新的且不同于源于原核生物和
真核生物源二者的数据库中所列的所有其它E1-αBCKDH肽。
此外，也比较了被基因bkdA编码的新阿凡曼链霉菌E1-αBCKDH
肽序列(参见Denoya，C.D.，1993，“Cloned genes encoding
brancled-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from
Streptomyces avermitilis”，美国专利申请08/100,518，1993年
7月30日申请)。这一分析的结论是；在大肠杆菌菌株CD613中克
隆的550bp阿凡曼链霉菌基因组PCR产物确实代表了一种新的E1
-αbkd基因片段。
(f)全可凡曼链霉菌bkd基因簇的的克隆、限制性分析和
Southern印迹分析及染色体图的构建
如以上所述，原0.55kb PCR片段含有一个内0.35kb SalI片段。
将这一小片段用作放射性活性标记探针经菌落杂交来筛选阿凡曼链
霉菌基因组DNA粘粒文库。识别并回收10个克隆。限制性分析和
Southern印迹杂交分析表明，所述10个克隆均含有来源于相同染色
体区的重叠序列。高度严格地使用相同探针进行阿凡曼链霉菌
ATCC 31272 SC2的消化的染色体DNA的Southern印迹分析。后
一分析证实从基因组文库回收的克隆的同一性。令人惊奇的是，所
述粘粒克隆中的两个也杂交到bkdA特异性探针(参见
Denoya，C.D.，1993，“Cloned genes encoding branched-chain alpha-
ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis”，
美国专利申请08/100,518，1993年7月30日申请)上，表明这
里所述的bkd基因(命名为bkdF)可能位于靠近包含bkdA、bkdB
和bkdC的基因簇的位置上。构建了含有阿凡曼链霉菌CD613序列
的基因组区的限制图(图2)。如从以上讨论的杂交数据所预测的，
bkdF基因离bkdABC基因簇仅12kb。
(g)得自粘粒克隆的基因组DNA片段的亚克隆和携带bkd
基因簇的阿凡曼链霉菌染色体区的DNA测序
将BamHI和PstI基因组片段(覆盖了阿凡曼链霉菌染色体全
部CD613 bkd区)从DNA文库粘粒克隆亚克隆进大肠杆菌载体
pGEM-3Z中。包括每一质粒简要描述的这一工件中构建的亚克隆的
表如下：
1.含有2.3kb BamHI片段的质粒pCD740；
2.含有1.4kb BamHI片段的质粒pCD854；
3.含有4.1kb BamHI片段的质粒pCD713；和
4.含有约5kb PstI插入物的质粒pCD747。(分别相应于上述4
种质粒的大肠杆菌菌株CD740、CD854、CD713和CD747，保藏
在美国典型培养物保藏中心，有关这些保藏物的相关信息可以在
PCT表RO/134中查到，该表在本申请66页上)此外，从质粒pCD713
中携带的4.1kb BamHI片段衍生含约3.1kb PstI/BamHI片段的亚克
隆。这一新构建体被称作质粒pCD746，并且来进行DNA测序(如
以下描述)。质粒限制性酶切作图、Southern杂交和PCR分析证
实了每一亚克隆的同一性。
(h)从克隆DNA片段获得的DNA测序数据的计算机分析和
阿凡曼链霉菌E1-α、E1-β和E2 bkd开放读框的识别
从大量不同的亚克隆和构建体获得了如下的DNA测序数据：
1.CD613：代表以上“c”和“d”节及实施例2和3中描述
的原PCR克隆。它含有开放读框1(ORF-1)的一部分，ORF
-1相应于编码BCKDH复合物E1-α组分的bkdF基因(图3)。
2.CD746：代表得自pCD713的3.1kb PstI/BamHI片段(参见
以上“g”节)。用SP6载体引物(从Promega Co.购得)经pCD746
插入物PstI末端测序获得的DNA测序数据揭示出部分ORF-2，
ORF-2相应于编码BCKDH复合物E1-β组分的bkdG基因(图
4)。
3.CD785：转座子小-γ-δ-1插入物，该插入物用于位于
克隆的4.1kb BamHI基因组片段中bkdF开放读框下游的DNA区测
序。这一小-γ-δ-1插入物命名为“A3”，位于含bkdF基因
的BamHI末端的约1.7kb处。从插入物A3两个末端进行的DNA
测序(参见实施例6c)表明存在相应于E1-βORF(ORF-2)
(bkdG)的ORF(图5)。
4.CD786：转座子小-γ-δ-1插入物，该插入物用于位于
克隆的4.1kb BamHI基因组片段中bkdF开放读框下游的DNA区测
序。这一小-γ-δ-1插入物命名为“A5”，位于含bkdF基因
的BamHI末端的约3kb处。从插入物A5两个末端进行的DNA测
序(参见实施例6c)表明存在相应于E2 ORF(ORF-3)(bkdH)
的ORF(图6)。
用“DNA Inspector”软件(Textco，N.H.)进行测序的基因组
区的移动碱基组成分析(sliding base composition analysis)，所述
的基因组区含有阿凡曼链霉菌E1-α、E1-β和E2(部分)bkd
开放读框(OFR)。这一分析给出了用30个碱基骨架长度和20的
偏移值(offset value)进行的G+C含量平均值分析的轮廓。相应
于阿凡曼链霉菌染色体这一区的总G+C含量是69％，也分析了
为密码子位置的函数的G+C含量。用带有链霉菌64种基因密码
子使用表(F.Wright and M.J.Bibb，1992，Gene，113：55-65)的
“Codon Preference程序”(Genetics Computer Group，Madi-
son，WI)检测开放读框。Codon Preference程序是一种读框-特异
性基因探测程序，用于利用其与密码子频率表的类似性或其每一密
码子第三位上的组成(通常为GC)的偏移来识别蛋白质编码序列。
ORF表示为其各自读框区下面的框。也检测了所有起始(ATG)
和终止密码子(垂直线)。在每一读框中发现的稀有密码子标注在
每一ORF区下。用25密码子移动窗计算G+C含量，因而在观察
到蛋白质编码区的全部影响之前预料到约25个密码子的偏移。获得
了以下3种分布图：1.三联体中第一位置；2.三联体中第二位置、
3.三联体中第三位置。这一分析的结果是确定了相应于三种BCKDH
亚单位(E1-α、E1-β和E2)的三种bkdORF的位置。
(i)阿凡曼链霉菌bkd突变体的构建
用来引入缺失的技术是一种改进的用于酿酒酵母、大肠杆菌和
枯草芽孢杆菌的基因取代方法(Scherer，S.and
R.W.Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76：4951-4955；Shortle，D.，
et al.，1982，Sience，217：371-373；stabt，M.L.，and Ferrari，E.，1984，
J.Bacteriol.，158：411-418)。这一技术(特别是用于链霉菌的这一技
术)的一般性描述可见于Kieser，T.和Hopwood，D.A.的综述性文章
“Genetic Manipulation of streptomyces：Integrating Vectors and
Gene Replacement”(1991，Methods in Enzgmology，Vol，204，
430-458)。而且，这一方法(包括保证单个克隆分离和增加质粒消
除频率必须的附加原生质体制备步骤)的详细描述可见于Anzai等的
文章“Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic segme-
nts with in vitro altered DNA sequences”Joural of Antibiotics，
1988，vol.XLI，2，pp.226-233。
用基因取代培育工业突变株的一个关键性步骤是构建在所述特
定菌株中有效发挥作用的整合载体。此外，当在链霉菌染色体中进
行基因取代时，一个主要问题是载体的消除。用于链霉菌的带有可
选择性标记的大肠杆菌质粒可看作是理想的，因为它的不能在链霉
菌中复制。大肠杆菌质粒已成功地用于生二素链霉菌和变青链霉菌
中(Kieser，T.，and Hopwood，D.A.，1991，Genetic Manipulation of
Strep-tomyces：Integrating Vectors and Gene Replacement，in：
Methods in Enxymology，vol.204，430-458)。然而，在我们经历的实验
中，这一策略在阿凡曼链霉菌中表现出低的整合效率，极易引起单
交换现象。
我们最近已研究出大量多用途穿梭载体，该载体对于在链霉菌
大肠杆菌二者中克隆和在链霉菌中分子遗传学技术方面的各种用途
上有用)C.D.Denoya，1993，“Novel Bacterial Plasmid Shuttle
Vectors for Streptomyces sp.and Escherichia coli”，美国专利申请
032，925，1993年3月18日申请)。这些穿梭载体是结构稳定的，
并且在大肠杆菌和大量链霉菌的种中有效地复制，使宽的大小范围
内的克隆DNA片段从一种宿主向另一种宿主的来回转移。三种穿梭
载体(pCD262、pCD385和pCD500)携带链霉菌温度敏感性复
制起点，该复制起点控制链霉菌中的中到高拷贝数。这一复制子的
温度敏感性使其能用于链霉菌基因取代和突变体设计实验中。
穿梭载体pCD262和pCD500已成功地用于构建本文所述的bkd
-缺损菌株中。这一载体以自身复制的高拷贝数质粒稳定地保持在
链霉菌中。然而，当已用这些载体中任何载体转化的阿凡曼链霉菌
菌株经受苛刻的条件(如高湿)、孢子形成或原生质体制备和再生
时，可回收到许多无质粒的菌落。我们已利用这一特点，在阿凡曼
链霉菌基因破坏实验中将pCD262或pCD500用作整合载体。
阿凡曼链霉菌中的基因取代机制被假定为导致整合和后续分离
步骤(其中整合质粒被切除)的双交换或单产换。我们已观察到阿
凡曼链霉菌中的双交换和单交换现象。经双交换和单交换两种机
制，接着切除，产生相同的产物。经采用这一方法，我们能破坏相
应于本文所述阿凡曼链霉菌bkd基因簇bkdF基因的E1-α开放读
框。这一破坏作用涉及影响编码BCKDH复合物E1-α亚单位的基
因的5’-半边的约1.4kb染色体缺失。所形成的表现出bkd突变
体所有特有表型特征的突变菌株是稳定的，并且能被用于经发酵产
生有价值的新阿凡曼菌素产物。
更具体地说，我们通过用得自Saccharo polys pora erythraea的
ermE基因(赋予红霉素抗性)取代阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2
染色体中E1-αBCKDH基因(bkdF)区段构建了bkdF突变体。
如以上提及的，这是经采用新双功能(大肠杆菌/链霉菌)载体
(pCD262)获得的，该载体在有关链霉菌的克隆和基因取代两种
实验中有效地发挥作用。如图7所示，画出(从左到右)了阿凡曼
链霉菌染色体中三个邻近的BamHI限制片段2.3kb、1.4kb和
4.1kb。1.4kb BamHI基因组片段携带E1-α开放读框(ORF-
1)(基因bkdF)的起始部分。4.1kb BamHI携带bkd基因簇剩
下的部分(bkdF末端、bkdG和bkdH)。
质粒pCD768是穿梭载体pCD262的一个衍生物，pCD262携
带位于1.4kb BamHI片段侧翼的两个阿凡曼链霉菌基因组片段
(2.3和4.1kb BamHI片段)(图8)。此外，pCD768携带位于
2.3和4.1kb BamHI片段之间的ermE标记。该ermE标记以与OR1
-1(bkd F)相反的取向存在，以避免由下游基因的超量表达引
起的可能的麻烦。预料这一构建体经重组可产生宿主基因组中1.4kb
缺失(ORF-1受影响)。
将质粒pCD768转化进阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2宿主原
生质体。选择出对红霉素(erm-R)和硫链丝菌肽(tsr-R)两种
抗生素有抗性的转化体(参见实施例9)。使转化体#1(CD783)
在液体培养基中生长，制备原生质体，并平板接种到含红霉素的琼
脂培养基上。选择50个克隆并进一步分析：46个是erm-R、tsr
-R；4个是erm-R、tsr-S(pp15、pp17、pp22和pp40)。
进一步分析后一组的4个克隆和前一组的2个克隆(pp14和p21，
参见实施例9表1)。所有这些克隆均表现出如下的bkd-缺陷表
型：所有4个erm-R，tsr-S都不能在1LV基本培养基板上生长；
当试验BCKDH复合物E1组分时它们没有活性；除非补加S(+)
-2-甲基丁酸或异丁酸，它们不能经发酵合成天然阿凡曼菌素(参
见实施例9)。此外，当CHC加到发酵培养基中时，可合成新阿凡
曼菌素(CHC-阿凡曼菌素)，说明bkd阻断不影响阿凡曼菌素生
物合成的细胞机制(参见实施例9)。这一组4个中的1个克隆(克
隆pp15)事先命名为阿凡曼链霉菌菌株CD794，并作为本发明的
例证保藏在美国典型培养物保藏中心。最后，Southern杂交分析清
楚地证实，如所预期的，靠阿凡曼链霉菌ATCC 31272 SC2中的基
因取代，相应于bkdF基因的ORF-1被破坏(参见实施例15)。
实施例
以下是用于识别、克隆和分析阿凡曼链霉菌bkdF基因的实验方
法的详细实施例(附图也说明了这些方法)。此外，也描述了经基
因取代构建两种bkd-缺陷突变体的方法。也描述了分子生物学领
域中专业人员公知的标准技术其它细节和所使用的特定的酶的表示
方法(例如Sanbrook等的实验室手册“分子克隆”(Cold Spring
Harbor Laboratory，1988)中的方法)
实施例1
阿凡曼链霉菌基因组DNA的制备
于29℃下在YPD-2琼脂培养基上以铺满菌苔的方式培养阿
凡曼链霉菌(单菌落分离物#2)菌丝体7天。培养基的组成为：
Difco酵母提取物 10g
Difco Bacto-胨 10g
葡萄糖 5g
Difco Bacto琼脂 20g
乙酸钠 2g
MOPS 10g
PH值调至7.0。
终体积1l。
在121℃下高压灭菌25分钟。
用该菌丝体接种到在300ml折流瓶中的30ml AS-7培养基(参
见Hafner等1988，欧洲专利申请号：88300353.5，公开号：0
284176)中，在29℃下振荡(230rpm)培养24小时。所述培养
基包括：
稀释淀粉1 20g
Ardamine pH2 5g
Pharmamedia3 15g
CaCO3 2g
用NaOH调PH至7.2。
终体积：1l。
在121℃下高压灭菌25分钟。
1 经用“termamyl”(一种从Novo Enzymes，Wilton，CT获得
的得自地衣形芽孢杆菌的α-淀粉酶)水解淀粉至约40％葡萄糖当
量制备。
2 从Yeast Products，Inc.，Clifton，NJ 07012获得。
3 从Traders Protein，Memphis，TN38108获得。
用约0.3ml上述培养物接种到另一个含有30ml改进的液体酵
母提取物麦芽提取物(YEME)培养基
(Bibb，M.J.，Freeman，R.F.，and D.A.Hopwood，1977，Mol.Gen.
Genetics，154：156-166)的折流瓶中。改进的YEME培养基每升含
有：
Difco酵母提取物 3g
Difco Bacto-胨 5g
Oxoid麦芽提取物 3g
蔗糖 300g
葡萄糖 10g
在121℃下高压灭菌40分钟。
高压灭菌后加入2ml 2.5m MgCl2·6H2O。
终体积调至1l。
在29℃下使培养物生长48-72小时。离心收集菌丝体，按教
科学“Genetic Manipulation of Streptomyces，A Laboratory
Manual”(The John Innes Foundation，Norwich，U.K.，1985，by
D.A.Hopwood et al.)中所述的“Isolation of Strep to myces Total
DNA by Caesium Chloride Gradient Centrifugation：Procedure 2”
方案制备基因组DNA。将DNA沉淀悬浮到3ml TE缓冲液(10mM
Tris-HCl，pH8.0，lmMEDTA)中。
实施例2
阿凡曼链霉菌基因组DNA扩增的聚合酶链反应
用Perkin-Elmer Cetus热循环器酶促扩增阿凡曼链霉菌基因组
DNA。用Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)和缓冲液进行PCR
反应30个循环，所述缓冲液(由制造者提供)中存在200μmol
dNTP、0.5μmol各引物、50ng模板DNA和2.5单位酶，终体积
100μl。第1个循环的热分布型为：95℃下3分钟(变性步骤)、
55℃下2分钟(退火步骤)和72℃下2分钟(扩增步骤)。除了变
性步骤缩短到1.5分钟外，后续的29个循环具有类似的热分布型。
DNA引物由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供，右引物
(图1)是：
5′-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGA
GGGCGAC-3′，
左引物(图1)是：
5′-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSC
GGWA-3′。
用国际生物化学联合会(1UB)核苷酸命名规则描述DNA序
列。按如下的1UB组码识别丰余序列：K＝G+T、S＝G+C、
W＝A+T。与E1-αbkd基因不同源的和为克隆目的掺入到引
物中的限制识别序列是下面划线的(参见图1)。扩增产物用琼脂
糖凝胶电泳按大小分成不同的组分。按Sambrook et al.，1989，
“Molecular Cloning：Alaboratory Manual”，2nd Edition，Cold
Spring Harbor Lab，N.Y.r描述，将PCR样品在100V下在1×TBE
缓冲液(90mM Tris-HCl，pH8.5，90mM硼酸，2.5mM EDTA)中
的水平1％琼脂糖凝胶中电泳1.5小时。分离的PCR DNA产物用溴
化乙锭染色在凝胶上定位，用365nm紫外光使荧光带可见。在以上
所述的PCR条件下，当使用这一引物组合时，测得单独的DNA带
(长度约550碱基对)。
实施例3
将0.55kb PCR扩增的阿凡曼链霉菌基因组DNA片段克隆进大
肠杆菌载体，接着转化进大肠杆菌宿主。
A.0.55kb PCR产物的回收
如以上所提及的，用阿凡曼链霉菌基因组DNA为模板和右及左
引物组合经PCR扩增0.55kb DNA片段。如图1所示，右引物具有
位于5′末端的EcoRI识别位点，左引物具有位于5′末端的XbaI识
别位点。用连接步骤(其中用EcoRI和XbaI消化插入物和克隆载
体两者)克隆0.55kb PCR片段。扩增后(如实施例2的描述)，将
约80μl PCR反应混合物加到1％琼脂凝胶上进行电泳。按以上描
述使0.55kb DNA片段可见，按以下方法用电洗脱回收：用剃刀片
移去0.55kb DNA带，用单向电洗脱器(International Biotechnology
Inc.，New Haven，CT)在装有7.5M乙酸铵的V-形孔中于80V下
电洗脱35分钟从琼脂糖凝胶上回收DNA。用乙醇沉淀该DNA，离
主获得沉淀，最后溶解到20μl DNA缓冲液(10mM Tris-Hcl、
4mM NaCl、0.1mM EDTA，pH7.5)中。
B.EcoRI和XbaI限制酶消化
按供给者(Boehringer Mannheim Biochemicals)推荐的方法
用限制酶EcoRI和XbaI各1单位同时消化以上回收的全部PCR物
质。类似地，于37℃下在总反应体积为60μl的制造者指定的试验
缓冲液中温育约1μg质粒pGEM-3Z(Promega Corp.，Madison，WI)
和2单位的限制酶EcoRI和XbaI(所有限制酶均从Boehringer
Mannheim Biochemicals购得)4小时，以产生线性分子。然后，
PCR片段和线性化的载体分别用等体积的苯酚-氯仿抽提两次，分
别用等体积的乙醚抽提两次，最后，加入2体积的无水乙醇沉淀
DNA。经在10,000xg下离心10分钟回收沉淀的DNA，并真空
下干燥。将最终的PCR片段沉淀重新溶解到20μl DNA缓冲液中，
最终的线性化载体沉淀重新溶解到12μl DNA缓冲液中。
C.连接产生pCD613
在20μl总反应体积中于15℃在供给者限定的条件下将约11
μl EcoRI/XbaI处理过的0.55kb PCR DNA产物和约1μl EcoRI/
XbaI线性化的pGEM-3Z与1单位连接酶(New England
Biolabs，Inc.，Beverly，MA)一起温育过夜。将试验微管置于冰上终止
反应，按Sambrook et al.，1989，＂Molecular Cloning：A Laboratory
Manual＂，2nd Edition，Cold Spring Harbor Lab.N.Y.描述的标准方法
用反应混合物(20μl)转化感受态大肠杆菌DH5-α细胸。回收
许多氨苄青霉素抗性转化体。质粒载体pGEM-3Z含有得自大肠杆
菌lac操纵子的DNA的DNA片段，该片段编码β-半乳糖苷酶的
氨基末端片段(Yanisch-Peron，C.，Vieira，J.，and J.Messing，Gene，33，
103，1985〕。这一片段)其合成可被异丙基硫代-β-半乳糖苷酶
(IPTG)诱导)能与由宿主编码的β-半乳糖苷酶缺损形式等位
基因内(α)互补。与诱导剂1PTG接触的大肠杆菌细胞合成酶的
两种片段，且当平板接种到含有生色底物5-溴-4-氯-3-吲
哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)的培养基上时形成蓝色菌落。
外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点灭活β-半乳糖苷酶氨基
末端片段并废除α-互补。因此，携带重组质粒的细菌产生白色菌
落。从这一转化实验回收许多白色菌落。这些菌落应含有质粒
pCD613。选择一个菌落(指定为菌株CD613)并进一步分析证实
了这一点，按标准的微生物学方法将大肠杆菌菌株CD613的单菌落
接种到含50μg/ml氨苄毒霉素的Luria-Bertani(LB)液体培养基
中。LB培养基包含：
Bacto-胰化蛋白胨 10g
Bacto-酵母提取物 5g
NaCl 10g
用5N NaOH调PH至7.0。
溶液的终体积调至1l。
在121℃下高压灭菌20分钟。
将培养物在35℃下培养过夜。第2天早晨，在4℃下以10，
000rpm离心5分钟收获细菌细胞。用改进的Birnboim和Doly方法
(Nucleic Acids Res.，1979 7：1513-1523)，按Denoya等的描述
(Microbios Lett.，1985，29：87-93)从刚收获的大肠杆菌CD613细胞
分离质粒载体。最后将分离的质粒DNA溶解到DNA缓冲液(10mM
Tris-HCl、4mM NaCl、0.1mM EDTA；pH7.5)中，达到每10
μl缓冲液含约1μg pCD613的浓度。证实性限制分析(使用
EcoRI和XbaI)表明，与预期的一样，pCD613携带0.55kb DNA
插入物。
实施例4
均匀放射性标记的双链DNA探针的制备
由切口翻译(参见Sambrook et al.，1989，“Molecular Cloning：A
Laboratory Manual”，2nd Edition，Cold Spring Harbor Lab，N.Y.一
般性地描述了这一技术)制备双链DNA探针。首先，用基本上按实
施例1中所述的合适的限制消化和电洗脱纯化方法制备携带靶序列
的特异性DNA片段。在每一种情况下按从供给者获得的指导用〔α
-32p〕dCTP(脱氧胞苷5′-三磷酸四(三乙胺)盐，〔α-32p〕
-)(从NEN-Dupont购得)和BRL Nick Transltion System(从BRL
Life Technologies，Inc.购得)标记约1μg DNA。在50μl体积中
完成典型的反应。在加入5μg终止缓冲液(如在BRL推荐的方
法中所述的)后，按供给者的说明用Stratagene推进柱从未掺入的
核苷酸中分离标记的DNA。按照这些步骤通常可获得具有超出108
cpm/μg许多的特异性活性的32P-标记DNA。
实施例5
经Southern杂交分析阿凡曼链霉菌基因组DNA
于37℃用2单位的限制酶BamHI消化约10μg纯化的阿凡
曼链霉菌基因组DNA最少2小时。消化完后，经通过1％琼脂凝
胶的电泳(参见实施例1A)分离DNA片段，并用毛细管转移法
(Southern，E.M.1975，J.Mol.Biol.，98：503)向尼龙膜(孔径0.45μ
m)(Schleicher和Schuell Ngtran膜)转移一夜。第2天，将龙尼
膜包进塑料包中，使每一膜的DNA边暴露在紫外辐射源(302nm)
下以将DNA固定在膜上。按Sambrook et al.(1989)，＂Molecular
Cloning：A Laboratory Manual＂，2nd Edition，Cold Spring Harbor
Lab，N.Y.(此后称作“the Sambrook et al.Manual＂)中描述的方案进
行放射性标记RNA或RNA探针对固定在龙尼膜上的DNA的杂交。
在42℃下进行预杂交和杂交.杂交溶液含有6×SSC(1X：
0.15M NaCl，15mM拧檬酸钠，pH7.0)、10×Denhardt′s试剂
〔1X：0.02％菲可(ficoll)、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛
血清白蛋白〕、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)、100μg/ml变性
的片断化的鲑精DNA、100μg/ml大肠杆菌tRNA和50％甲酰胺
(Fluka)。过夜杂交后，按以下方式洗涤膜：两次用1XSSC、0.1％
SDS于室温下洗涤15分钟、两次用0.1×SSC、0.1％ SDS于42
℃下洗涤15分钟。在某些试验中，于65℃在不存在甲酰胺的情况
下进行杂交，且用SSPE(1X：0.18M NaCl、10mM Na3PO4、
PH7.7，1mM EDTA)代替SSC。最后，将膜对X-光胶片曝光
以获得放射自显影影像。
实施例6
DNA测序
A.质粒pCD613中携带的双链DNA PCR产物的测序
按实施例2所述制备超螺旋质粒pCD613。在测序前将约4μg
双链pCD613转化成单链形式。它是按Taq Track Sequencing
Systems Technical Manual(Promega Co.，Madison，WI.)中的描述经
碱变性处理完成的。寡核苷酸测序引物由Genosys Biotechnologies
Inc.(Texas)合成。载体引物1(5′-AAGGATCCTGCAGCCCAG
TCACGACGTTGTAAAACGA-3′)描绘出pGEM-3Z多克隆
位点(MCS)的EcoRI位点(2689-2712位)的上游，引物2
(5′-
AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-
3′)描绘出MCS的HindIII位点(91-114位)的下游。
B.来源于pCD613的0.35kb SalI阿凡曼链霉菌基因组片段克隆
到噬菌体M13中和DNA测序。
如以前的讨论，限制分析显示，PCR来源的基因组片段CD613
含有一个内0.35kb SalI片段。为了制备在Sanger′s二脱氧测序法
(Sanger et al.，1977，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，74：5463-5467)中用
作模板的单链重组DNA，将0.35kb SalI阿凡曼链霉菌DNA片段克
隆进噬菌体M13mp18中。于37℃用限制酶SalI消化约2μg质粒
pCD613(按以前所述的小量制备法制备)2小时以释放0.35kb阿
凡曼链霉菌基因组片段。使消化混合物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳，
按以前所述方法电洗脱和沉淀0.35kb片段。此外，用SalI消化约1
μg纯化的双链复制型(RF)M13mp18 DNA，用小牛小肠碱性
磷酸酶(CIAP)(从Promega Corp.，Madison，WI购得)脱磷酸化，
最后按前面所述连接到0.35kb DNA片段上。纯化的RF M13克隆载
体从New England Biolabs购得。连接混合物用于转染感受态大肠杆
菌JM109细胞。回收几个白色噬斑。选择以相反方向携带插入物的
来源于mp18转染的两个单独的白色噬斑。使噬菌体生长，并按
Sambrook et al.，Manual中所述制备单链DNA。按供给者(Promega)
提供的说明，用M13-特异-40测序引物(New England
Biolabs，Catalog No.1212)、脱氧腺苷5′-〔α-硫代〕三磷酸、
〔35S〕(NEN-Dupont)和Taq Track测序试剂盒(Promega)
进行每一单链DNA模板的DNA测序。
C.位于携带部分bkdF基因的克隆4.1kb BamHI片段上的某些
基因组区的转座子易化测序
将小-γ-δ-1转座子插入物用于位于得自阿凡曼链霉
菌的克隆的4.1kb BamHI基因组片段中bkdF开放读框下游的
DNA区的测序。小-γ-δ-1元件是一种小的(1.8kb)γ-
δ(Tn1000)衍生物，该衍生物含有Tn5的kan基因和在γ-
δ一个末端的两个40bp反向重复序列之间克隆的γ-δ的解离
(res)位点(Berg，C.M.et al.，1992，Gene，113；9-16)。小-
γ-δ-1缺乏编码转酶和解离酶，因此依赖其宿主提供转
座和解离功能。因此，在缺乏辅助转座子的菌株中，小-γ-
δ-1不转移且插入物是稳定的。反向重复序列内末端是可用
作DAN测序引物结合位点的唯一序列。基本上按Berg C.M.et
al.，(1993，Methods in Enzymology，Academic Press，vol.
218，P.279-306)的描述制备转座子插入物。每一插入的转座子用
作位于插入物两个位点的链霉菌DNA测序的起始模板。使用
两种“通用”引物：“res”引物(5’-
GTAGGGAGCCTGATATG-3’)和“Kam”引物(5’-
GCTATCCGCGCATCCAT-3’)。命名为“A3”(克隆
CD785)和“A5”(克隆CD 786)的两个小-γ-δ-1
插入物分别距含bkd F ORF的Bam HI端约1.7kb和3kb。在
每一插入物两端进行的DNA测序表明，A3插入物(序列
CD785)靠近E1-βORF(bkd G)末端(图5)，A5
插入物(序列CD786)靠近E2 ORF(bkd H)末端(图6)。
实施例7
全bkd阿凡曼链霉菌基因簇的克隆
和染色体图的构建
用SalI限制酶限制性酶切约4μg纯化的pCD613，经在1.2
％琼脂糖凝胶中电泳分离DNA片段.经电洗脱回收约0.35kb salI
DNA片段(推带有特异于阿凡曼链霉链菌bkd F E1-α基因的序
列)，按前面的描述经切口翻译标记。然后将〔32P〕标记的DNA
片段用作探针，筛选阿凡曼链霉菌基因组粘粒文库。制备基因组
文库的一般性方法的详细描述可见于Sambrook et al
Manual.Hopwood等(1985)的“Genetic Manipulation of
Streptomyces A Laboratory Manual”中给出了一种链霉菌染色体
文库制备方法的完整的描述。粘粒载体的描述见于“Cosmid
Vectors for Streptomyces Genemic DNA Cloning”(Denoya
C.D.U.S专利申请048，719，1993年4月16日申请)
在筛选2200多个重组文库克隆后识别出10个克隆。在LB液
体培养基中培养这10个杂交克隆(命名为大肠杆菌克隆CD 519、
CD521、CD691、CD692、CD694、CD695、CD696、
CD697、CD698和CD699)，并按以前的描述由各培养物制备
质粒。限制分析和Southern印迹杂交分析揭示出10个克隆相关，
具有重叠染色体区。令人感兴趣的是，这里所列的命名为CD519
和CD521的两个粘粒克隆也包括在用bdk A探针(参见
C.D.Denoya，美国专利申请08/100,518，以上已提及)识别的颗粒克
隆表中。按标准方法获得覆盖包括序列CD613在内的全染色体区
的阿凡曼链霉菌基因组限制图，在图2中给出。该图也显示了这
里所述的新bkd基因和原来描述的bkd基因(C.D.Denoya，美国专
利申请08/100,518，1993年7月30日申请)之间的连锁。两个bkd
基因簇相距的12kb。
实施例8
用穿梭载体转化变青链霉菌和从变青链霉菌转化体大量制备
质粒载体
将变青链霉菌菌株TK64用于这些实验中。变青链霉菌的生
长和原生质体化的培养基，原生质体制备和转化均按
D.A.Hopwood et al.Genetic Manipulation of Streptomy ces-a
laboratory manual，1985，The John Innes
Foundation，Norwich，U.K.的描述进行。此外，后面的参考文献给
出了变青链霉菌菌株TD64的详细描述。选择硫链丝菌肽抗性的直
接用穿梭载体pCD262或大量衍生物转化的变青链霉菌原生质
体。从选择的转化体按以下方法制备质粒DNA：使培养物在液体
YEME培养基(Bibb，M.J.，Free man，R.F.，and
D.A.Hopwood，1977，Mol.Gen.Genetics，154：155-166)中生长。
YEME培养基每升含有：3g酵母提取物、5g bacto-胨、3g麦芽
提取物、340克蔗糖。高压灭菌后，加入2ml 2.5M Mgcl26H2O。
于30℃下使培养物生长40-48小时。经离心从500ml链霉菌细
胞培养物收获菌丝体，并重悬到终体积为50ml的溶菌酶溶液(在
0.3M蔗糖、0.025M Tni-Hcl(PH8.0)和0.025MEDTM中的2mg/ml
溶菌酶)中。这一步骤后，基本上按手册(“Genetic Manipulation
of streptomyces，A Laboratory Manual”，The John Innes
Foundation，Norwich，1985)中的描述用碱溶法制备质粒。将DNA
沉淀再溶解到500ml 10mM Tris-Hcl/Ph8.0，1mM EDTA中，并基
本上按Sambrook et al.Manual中的描述经氯化铯-溴化乙锭梯度
超离心进一步纯化。最后将分离的质粒DNA溶解在DNA缓冲液
(10mM Tris0Hcl、4mM Nacl、0.1mM EDTA；PH7.5)中，达
每10μl缓冲液约1μg质粒DNA的浓度。
实施例9
阿凡曼链霉菌bkdF突变体的构建
用来引入染色体缺失的技术是用于酿酒酵母、大肠肝菌和枯
草芽孢杆菌中的变化的基因取代方法(Scherer，S.and
R.W.Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：4951-
4955；Shortle，D.et al.1982，Science，217：371-373；Stahl，M.L.，and
Ferrari，E.，1984，J.Bacteriol.，158：411-418)。这一技术的一般性描
述(特别是用于链菌的)可见于综述性文章“Genetic Manipulation
of Streptomyces：Integrating Vectors and Gene Replacement”(by
kieser，T.，and Hopwood，D.A.1991，in：Methods in
Enzymologg，vol.204，430-458)。而且，这一技术(包括保证单个
克隆分离和增加质粒消除频率必须的附加原生质体制备步骤)的
详细描述可见于Anzai等所著的文章，标题为“Replacement of
Streptomy ecs hygroscopicus genomic segments with in vitro
altered DNA sequence”(The Jorunal of Antibiotics， 1988，Vol
XLI，No.2，pp：226-233)。原生质体制备和再生步骤常常刺激质粒丧
失。然而，在一或两轮非选择性生长后，大多数双功能(大肠杆
菌/链霉菌)载体(例如pCD262，用于这一工作中)偶然引起产
生无质粒细胞(Kieser，t.，and Hopwood，D.A.1991，in：Methods in
Enzymology，Vol.204，430-458)。
A.携带bkd F基因灭活拷贝的穿梭载体的构建
如图7所示，给出了(从左到右)包括这里讨论的bkd基因
族的阿凡曼链霉菌染色体区中三个邻近的Bam HI限制片段：
2.3kb、1.4kb和4.1kb。1.4kb Bam HI基因组片段携带E1-α
开放读框(ORF-1)起始部分。(bkdF).4.1kb Bam HI
携带剩下的bkd基因簇(bkd F末端部分、bkd G和bkdH)。
将这三种限制片段每一种亚克隆进大肠杆菌载体pGEM-32。
形成的构建体是：质粒pCD740(携带2.3kb Bam HI片段)、质
粒pCD 854(携带1.4kb BamHI片段)和质粒pCd713(携带
4.1kbBamHI片段)(参见图2)。在两个步骤中完成携带bkd F
基因灭活拷贝的载体的构建。首先，按以下方法将携带erm E标
记(使对抗生素红霉素有抗性)和4.1kb BamHI阿凡曼链霉菌片
段和1.6kb Bgl II片段两者克隆进穿梭载体pCD262(C.D.Denoya，
“Novel Bacterial Plasmid Shutlle Vectors for streptomyces sp.
and Escherichia Coli”，美国专利申请032, 925，1993年3月
18日申请)：用限制酶BamHI切割约1.5μg质粒pCD713，并
在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，用Geneclean II试剂盒和制
造者(Bio 101 Inc.，La Jolla，CA)推荐的方法从凝胶上回收4.1kb
BamHI片段。类似地，用限制酶Bgl II切割约2μg pIJ4026，
并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。质粒PIJ4026是携带
Saccharopolyspora erythraea(原来称为Strep tomyces erythra
eus)erm E基因的大肠杆菌克隆载体pUC18的一种衍生物(参见
M.B：66 et al.，1985，Gene，41：357-368，和D.A.Hopwood et
al.，Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory
manual，1985，the John Innes foundation，Norwich，U.K)。电泳后，
用Geneclean II试剂盒和制造者(Bio 101 Inc.，La Jolla，CA)推
荐的方法从凝胶上回收1.6kb BglII片段。此外，一份纯化的质粒
pCd262用限制酶Bgl II线性化，用小牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)
(从Promega Corp.Madison，WI购得)脱磷酸化，最后连接到
以上描述的4.1kb Bam HI和1.6kb Bgl II纯化片段上。通过将试验
微管置于冰上终止连接反应，然后按实施例1中所描述的标准方
法将反应混合物(20μl)用于转化感受态大肠杆菌DH5-α细
胞。回收到许多氨苄青霉素抗性转化体。这些菌落应含有质粒
pCD761。通过选择一个菌落(指定为菌珠CD761)。并进一步
分析重组质粒(用几种限制酶从这一菌株回收到)证实了这一点。
质粒pCD76l是穿梭载体pCD262的一种衍生物，携带4.1kb阿凡
曼链霉菌BamHI基因组片段和1.6kb bgl II DNA片段(携带erm
E标记)两者(两者按图7所示取向)。第二步，质粒pCD761
用Bgl II线性化，用CIAP脱磷酸化，并连接到从质粒pCD 740分
离的2.3kb BamHI阿凡曼链霉菌片段上。通过将试验微管置于冰
上来终止连接反应，按实施例1中描述的标准方法，将反应混合
物(20μl)用于转化感受态大肠杆菌DH5-α细胞。回收到许
多氨苄青霉素抗性转化体。这些菌落应含有质粒pCD768。通过
选择一个菌落(指定为菌株CD768)并进一步分析重组质粒(用
几种限制酶从这一菌株回收到)证实了这一点。质粒pCD768是
穿梭载体pCD262的一种衍生物，pCD262携带两个阿凡曼链霉
菌基因组片段(2.3和4.1kb BamHI)(它们靠近野生型染色体
上1.4kb BamHI片段各端)。此外，pCD768在2.3和4.1kb BamHI
片段之间携带有ermE标记。ermE标记与ORF-1(bkdF)
取向相反，以避免由下游基因的超量表达引起的可能的麻烦。经
重组，这一构建体产生了缩主基因组中1.4kb缺失，影响bkd基
因5’-末端。
B.用穿梭载体转化阿凡曼链霉菌
从转化的大肠杆菌DH5-α或大肠杆菌CD167细胞(菌株C
D 167是从大肠杆菌GM2163是从经单菌落分离衍生的，GM2163
是从Dr.B.J.Bachmann，Curator，E.ColiGenetie Stock
Center，Yale Vniversity获得的)(参见实施例1)或者从转化的
变青链霉菌TK64细胞(参见实施例8)制备用于转化阿凡曼链
霉菌原生质体的穿梭载体(pCD262、pCD768)。
整个过程中使用阿凡曼链霉菌菌株ATCC31272单菌落分离
物#2(SC2)。三种可替换接种物用于制备阿凡曼链霉菌原生质
体：1.孢子(按Hopwood et al.，1985，Genetic Manipulation of
Streplomy ces-A La boratory Manual，The Joh Innes
foundation，Norwich，U.K.所述制备)。冷冻超声过的菌丝体(参见
以下制备)和3、YPD-2琼脂上的菌落(参见实施例1)。冷
冻超声过的菌丝体按如下方法制备：菌丝体培养物在Trypticase
Soy Broth(TSB)中生长至浊度2到9(在600nm)，然后用玻璃
组织研磨机匀浆10次，将匀化过的菌丝体用TSB稀释2倍，并加
入到无菌聚丙烯离心管中。将超声探针(Bronwill Biosonik III)
浸入到液体深度1-2cm，在50％强度(最大瓦数的一半)下超
声处理样品10秒钟。超声处理将菌丝体团块分散成单或双细胞，
单位这导致传代培养时出现快速指数生长。超声过的菌丝体制剂
稀释至40％甘油的终浓度，吸入到小瓶中，在-85℃下冷冻。
将孢子、菌丝体或匀化菌落接种到含0.5％甘氨酸的YEME培养
基(参见实施例1)中。按D.A.Hopwood等的描述(Genetic
Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual，1985，The
John Innes foundation，Norwich，U.D.，按MacNeil，D.J.，and
Klapko，L.M.，J.Industrial Microbiol.1987，2，209-218的描述改进)
进行阿凡曼链霉菌原生质体制备和转化。分别选择硫链丝菌肽或
红霉素抗性的用穿梭载体pCD262或衍生物(例如pCD768)转
化的阿凡曼链霉菌原生质体。
C.用PC768分离阿凡曼链霉菌红霉素抗性硫链丝菌肽敏感突
变体
如以上所述，将质粒pCD768转化进阿凡曼链霉菌31272
SC2。在再生培养基(RM14)板(参见以上所涉及的培养基组
成的描述)上用4μg/ml红霉素选择阿凡曼链霉菌初级转化体。
将两个红霉素抗性(erm-R)转化体(1和2号)挑取到含有4
μg/ml红霉素或4μg/ml硫链丝菌肽的YPD-2琼脂板(参见
实施例1)上。两种转化体均对两种抗生素有抗性(erm-r，tsr-R)
选择转化体#1(命名为阿凡曼链霉菌菌株CD783)进一步研究。
在YEME液体培养基上培养这一菌株，制备原生质体并平板接种
到含红霉素(4μg/ml)的再生培养基板上。包括这一原生质体
再生步骤是为了保证单菌落分离及增加质粒丧失(Anzai，H.，et
al.，1988)“Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic
segments with in vitro altered DNA sequences”，The Journal of
Antibiotics vol.XLI No.2，pp.226-233)，再生许多菌落，将50个
克隆挑取到含红霉素或硫链丝菌肽的板上。50个菌落中的46
个可以在硫链丝菌肽上生长，总之，46个菌落为erm-r、tsr-r，
仅4个菌落为erm-r、tsr-s.erm-r、tsr-S菌落给出整合形成后预
期的表型(双交换现象)并已丧失游离复制子。因此，进一步分
析给出erm-R和tsr-s表型的4个克隆(pp15、pp17、pp22和
pp40)以及为erm-R、tsr的2个克隆(pp14和PP21)(用作
对照)。
D.阿凡曼链霉菌bkdF突变体：携带影响bkd F基因5’末端的
染色体缺失的阿凡霉链霉菌表型
进行下列分析：1.在含有作为仅有的碳(C)源的异亮氨酸、
亮氨酸和缬氨酸(ILV)的基本培养基琼脂板上的生长能力；2.
支链α-酮酸脱氢酶(BCKDH)E1活性试验；和3.发酵产生天
然和新阿凡曼菌素的能力。这些方法描述如下：
1.ILV板：使用改变的经典Mg基本培养基
(Anderson，E.H.，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，32：120-128)。
该修饰的Mg培养基每升包括：琼脂糖(eakem ME，FMC
Bioproducts，Rockland，ME)7.5g
蒸馏水 650ml
于121℃下高压灭菌15分钟。冷却时加入以下无菌溶液：
25×M9盐溶液 40ml
矿质原料溶液 2.1ml
0.1MFeSO4·7H2O 0.1ml
ILV混合物 250ml
PH调节至7.0。
终体积：1l。
每板注入约25ml。
25×M9盐经将下列盐溶解在去离子H2O中达到终体积
1.2l：制备：
K2HPO4 125g
NaH2PO4·H2O 55g
NaNO3 48g
PH调至7.0
将该盐溶液分成160ml等分样，于121℃下高压灭菌15分钟。
矿质原料溶液包含：
1M MgSO4·7H2O
1M CaCl2
0.25M MnSO4·H2O
于121℃下高压灭菌15分钟。
ILV混合物经将L-异亮氨酸、L-亮氨酸和L-缬氨酸各
10g溶解到1l去离子水中制备。混合物经过滤灭菌。
在这些板上，bkd F-缺陷突变体不能生长。于29℃下培养
14天后，记录不利用ILV者。
2.BCKDH E1试验：用原来描述过的改进的放射化学试验方
法(Hafner，E.W.et al.1991，J.Antibiotics，44349-356)测定
BCKDH E1活性。使选择的分离物在YPD-2琼脂板上于29℃
下生长6-7天。生长后，用无菌牙签从生长在YPD-2琼脂板
上的各菌落挑出针尖大小的细胞群，并转移到15ml玻璃闪烁瓶底
部。重新悬浮细胞，并加入100μl甲苯/α-〔1-14C〕酮异己
酸盐混合物(按以下描述制备)透化。立即用己用Solrable(一
种用NEN-Dupont购得的组织和凝胶溶解剂)浸泡的Whatman
4CHR纸(hatman catalog number 3004614)覆盖瓶口。将一弹
性帽稳定地置入到瓶上，帽和瓶的上半部均用石蜡膜
(parafilm)包裹，并于29℃在轻轻振荡下培养3.5小时。培养
完成后，将滤纸转移到含有4ml“Ready safe”(Beckman)液
体闪烁混合物的7ml玻璃闪烁瓶中以测定放射活性。在用这一溶
剂平衡4小时或4小时以上后测定放射活性。通过将22μlα〔1
-14C〕酮异己酸盐原料溶液加入到含5％甲苯(已经超声处理产
生乳白色甲苯分散液)的1ml Mg盐培养基(Davis，R.W.，et
al.，1980，appendix 1：Media，Drug Concentrations，and nutritional
supplements in“A manual for Genetic Engineering-Advanced
Bacterial Genetics”，P.203，Cold spring Harbor
Laboratory，N.Y.)中制备甲苯/α-〔1-14C〕酮异己酸盐混合
物。通过将2.8μ20mM α-酮异己酸盐(钠盐，Sigma K-
0629)、50μlα〔1-14C〕酮异己酸盐(55mCi/mmol，
50μci/ml，Amersham)和足够量的水混合至终体积1ml制备α
-〔1-14C〕酮异己酸原料溶液。用基于Bradford染色-结合
方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.，72：248，1976)的Bio-
Rad蛋白质测定法(Bio-Rad Iaboratorie，Richmond，California)
测定蛋白质浓度。支链α-酮酸脱氢酶E2组分的比活性表示为每
分钟每mg蛋白质放出和CO2的微微摩尔数(表1)。
3.阿凡曼菌素产生：将在新鲜的改进YPD-2琼脂板(改进
包括从常规YPD-2培养基省去乙酸盐，参见实施例1)上生长
5至7天的阿凡曼链霉菌ATCC31272 SC2或阿凡曼链霉菌菌株
CD794(bkdF)菌丝体接种到含8ml基本确定成分培养基(参
见以下)的50ml(1×6英寸)培养管中。然后于29℃以45℃
角在200RPM下振荡培养该管72小时。生长后，用2ml种子培养
物等分样接种另外的300ml培养瓶，培养瓶中含有25ml其中已加
入多种脂肪酸的基本确定成分培养基。除了用水解淀粉(114g/l)
替代稀马铃薯可溶淀粉，不用亮氨酸和氯化钠，加入甘氨酸
(2g/l)外，按现有技术的描述(Hafner，E.W.et
al.，1991，J.Antibioties，44：349-356)制备发酵培养基。在某些发酵
中，向培养基中加入(0.04％终浓度)S(+)-2-甲基丁酸
或环己烷羧酸(CHC)。于29℃振荡(200RPM)培养12天后，
用4倍体积的乙腈-甲醇(7∶118)溶剂混合物抽提培养瓶中
内含物，将上清液用高效液相色谱(HPLC)进行阿凡曼菌素分
析。用Beckman sμm Ultra Sphere ODS C-18柱(4.6mm×
25cm)，流速0.75ml分钟，经240nm处吸光度测定检测进行HPLC
分析。流动相是水(178ml)、乙腈(102ml)和甲醇(加至终
体积为2l)。
表1总结出了这些结果，已丧失游离复制子的4个硫链丝菌
肽敏感性克隆显示出如下典型的bkd-缺陷表型：所有4个克隆均
不能在ILV基本培养基板上生长，且当进行BCKDH复合物E1
组分试验时均无活性。发酵研究表明，阻断培养物不能合成天然
阿凡曼菌素。此外，当将S(+)-2-甲基丁酸加入到发酵培
养基(0.04％终浓度)中时，合成出“a”型天然阿凡曼菌素；
类似地，加入环己烷羧酸(CHC)导致产生新CHC-阿凡曼菌
素。这些发酵结果说明，bkd阻断不影响阿凡曼菌素生物合成的
细胞机制。这一4个克隆的组中的1个克隆(克隆pp15，参见表
1)事先命名为阿凡曼链霉菌菌株CD794，并作为本发明的一个
例子在美国典型培养物保藏中心保藏。有关这一保藏物的相关信
息可见于PCT表RO/134(在本申请说明书第66页上)。
表1
多种阿凡曼链霉菌菌株中E1支链α-酮酸脱氢酶活性
阿凡曼链霉菌菌 抗性表型b ILV上生长cE1BCKDH比 天然阿凡曼
株a 活性d.e 菌素的产生f
ATCC 31272 SC2 Erm-S，Tsr-S + 69 +
PF402-77 Erm-S，Tsr-S - 09 -/+1
CD783 Erm-R，Tsr-R + 67 +
pp14 Erm-R，Tsr-R + 65 +
pp21 Erm-R，Tsr-R + 50 +
pp15(CD794) Erm-R，Tsr-S - 09 -/+1
pp17 Erm-R，Tsr-S - 09 NTh
pp22 Erm-R，Tsr-S - 09 -/+1
pp40 Erm-R，Tsr-S - 09 NTh
a.使用以下阿凡曼链霉菌：ATCC31272 S2(菌株ATCC
31272的单菌落分离物)；PF402-77(菌株ATCC31272 SC2
的bkd-缺陷突变体，由化学诱变产生)；CD783(用质粒pCD768
转化(参见实施例9)的菌株ATCC31272的衍生物)；pp14-40
(原生质体处理的再生(参见实施例9)后分离的CD783的单菌
落衍生物)。
b.Erm-R，对红霉素有抗性，Tsr-R，对硫链丝菌肽有抗
性。
c.+或-，能或不能在计加异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸(作为
仅有碳源)的基本培养基上生长。
d.以每分钟每mg蛋白质放出的CO2的微微摩尔数表示的支
链α-酮酸脱氢酶E1组分的比活性。
e.结果是重复测定的平均值。
f.+或-，经发酵产生或不产生天然阿凡曼菌素。
g.0＝不可测。
h.NT，未测试。
i.-/+＝经发酵不产生天然阿凡曼菌素；然而当S(+)-2
-甲基丁酸加入到发酵培养基中时产生天然阿凡曼菌素，当CHC
加入到发酵培养基中时产生新CHC-阿凡曼菌素。
E.证实bkd-缺陷基因型的Southern杂交分析
用2个erm-R、tsr-s克隆pp15(事先命名为菌株CD794)
和pp22(事先命名为菌株CD798)进行Southern杂交分析。这
些分析表明，经双交换发生了ermE标记的染色体组合和1.4kb
BamHI基基组片段(携带bkdF开放读框(ORF-1)的5’末端)
的伴随缺失。通过经1％琼脂糖凝胶的电泳分离染色体DNA限制
片段，并基本上按实施例5中描述的Southern(1975)方法转移
到尼龙上。
实施例10
阿凡曼链霉菌bkd ABCF突变体的构建
这一实施例描述构建影响下列bkd基因的稳定阿凡曼链霉菌
多重突变体的方法：bkdA、bkdB、bkdC和bkdF。这些基因
中的前面三个分别编码支链α-酮酸脱氢酶复合物的E1-α、
E1-β和E2亚单位。这些基因是bkdABC基因族(如Denoya，C.D，
美国专利申请08/100,518(1993年7月30日申请)中描述的)
的一部分。bkdF基因处于以上描述的bkdFGH基因族中，它编
码支链α-酮酸脱氢酶复合物的E1-α亚单位。
A.携带靶染色体区(bkdC)(用可选择的抗生素抗性标记
(ermE)标记)的运送载体的设计和构建
首先，将6.5kb sphI阿凡曼链霉菌31272基因组片段(携带
bkd ABC基因族)亚克隆进穿梭/运送载体PC500的ShpI克隆位
点(参见Denoya，D.D.，“Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors
for streptomyces and Escherichia coli”，美国专利申请
08/032,925，1993年3月18日申请)，形成质粒PC544(参见
图9)。接着，将携带ermE标记的1.7kb Bal II pIJ4026片段插
入到存在于pCD544插入物中的唯一BglII位点。质粒PIJ4026是
携带Saccha ropoly spora erythraea(原来称为Streptomyces
erythraeus)ermE基因的大肠杆菌克隆载体PUC18的衍生物(参
见M.Bibb et al.，1985，ene，41：357-368和D.A.Hopwood et
al.，Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory
Manual，1985，the John Innes Foundation，Norwich，U.K)所形成的
构建体(pCD547)具有一个插入的bkdC基因灭活拷贝。
B.遗传标记bkdC突变株的构建
按照标准的基因取代方法(参见实施例9)用质粒PCD547
作为运送载体(参见前面部分)，阿凡曼链霉菌野生型菌株
ATCC31272 SC2作为宿主，选择12个表现出红霉素抗性硫链丝
菌肽敏感性表型的原生质体制备/然后再生的单菌落。这一12个菌
落的组中的一个事先命名为阿凡曼链霉菌菌株CD570(参见图
9)，在以下的基因取代步骤中将其用作宿主(参见下述)。
C.携带突变(缺失)bkd ABC靶区的运送载体的设计和构建
质粒pCD728是携带两种阿凡曼链霉菌染色体片段(7kb
BamHI，从亚克隆pCD528制备；和6.5kb BglII/BamHI，从亚
克隆pCD559制备(参见图9))的穿梭载体pCD262(参见
Denoya，C.D.，“Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for
Streptomy ces and Escherichia cdi”美国专利申请#08/032,925，
1993年3月18日申请)的一个衍生物。这里使用的亚克隆的详细
描述也参见Denoya C.D.，US专利申请08/100,518(1993年7
月30日申请)。
D.非标记的bkd ABC缺失菌株的构建
将质粒pCD728转化进阿凡曼链霉菌菌株CD570原生质体，
回收推定的转化体。也经转化将对照质粒pCD739(具有一个以
错误的方向插入的基因组片段)引入到菌株CD570中。获得许多
重组体，在这些重组体中erm E标记已被bkd ABC缺失构建体取
代且运送质粒(pCD262)已从其细胞丧失。总之，经重组和双
交换重组，pCD728产生约2kb的影响bkd A(E1-α)、bkd
B(E1-α)、bkd B(E1-β)和bkdC(E2)基因的阿凡
曼链霉菌染色体缺失。回收的整合体具有红霉素敏感和硫链丝菌
肽敏感表型。Southern印迹分析证实ermE标记被缺失序列取
代。选择式表这一组的一个单菌落进一步研究，并命名为菌株
CD757(参见图9)。
E.bkdF基因取代载体的设计和构建
这一载体的构建在实施例9A节中描述。简单地说，质粒
pCD768是穿梭载体PCD262的一种衍生物，pCD262携带邻近野
生型染色体上1.4kb BamHI片段两端的两个阿凡曼链霉菌基因组
片段(2.3和4.1kbBamHI片段之间的ermE标记。ermE标记与
ORF-1(bkdF)取向相反，以避免由下游基因的超量表达引
起的可能的损害。经重组，这一构建体在宿主基因组中产生1.4kb
缺失(影响bkdF基因5’末端)。
F.阿凡曼链霉菌多重bkd突变体(bkdABCF)的构建
基本上按实施例9所述方法将质粒pCD768转化进阿凡曼链
霉菌菌株CD757(bkd ABC)的原生质体中(参见以上步骤D)。
回收许多转化体，并按标准方法选择推定的整合体。将代表这一
组的并表现出红霉素抗性和硫链丝菌肽敏感表型的一个整合体命
名为菌株CD797，并进行进一步的分析(参见图9)。培养物CD797
表现出如下典型的bkd-缺陷表型：在ILV基本培养基板(参见
实施例9)上不能生长，当进行BCKDH复合物E1组分试验时没
有活性。发酵研究表明，在不补加S(+)-2-用基丁酸或异
丁酸的情况下，阻断培养物不能合成天然阿凡曼菌素。此外，添
加环己烷羧酸(CHC)也导致形成新CHC-阿凡曼菌素。这些
发酵结果说明，包括四种bkd基因(bkd A、bkdB、bkdC和
bkdF)破坏或缺失的多重bkd阻断不影响阿凡曼菌素生物合成细
胞机制。
序列表
(1)一般信息
(i)申请人：DENOYA，CLAUDIO D.(美国)
STUTZMAN-ENGWALL，KIM J.(美国)
PFIZER INC.(美国以外的其它国家)
(ii)发明名称：
编码阿凡曼链霉菌支链α-酮酸脱氢酶复合物的基因
(iii)序列数：8
(iv)通讯地址
(A)联系人：DR.PETER C.RICHARDSON，PFIZER INC
(B)街：235 EAST 42ND STREET，20TH FLOOR
(C)城市：NEW YORK
(D)州：NEW YORK
(E)国家：U.S.A.
(F)邮编：10017-5755
(V)计算机可读形式
(A)介质类型：Floppy disk
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25
(vi)当前申请的资料
(A)申请号：US 08/168,602
(B)申请人：16-DEC-1993
(C)分类号：
(viii)代理人/代理机构信息
(A)姓名：DEBENEDICTIS，KAREN
(b)登记号：32，977
(C)参考/提要号：PC8529A
(ix)电信信息：
(A)电话：(212)573-5425
(B)传真：(212)573-1939
(C)电传：N/A
(2)SEQ ID NO：1信息
(i)序列特征：
(A)长度：501个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
TACGTCTTCC CGACCTACCG CGAGCACGGC GTCGCCTGGT CCGGCGGGGT CGACCCCACC 60
AACCTGCTCG GCATGTTCCG CGGCGTGAAC AACGGCGGCT GGGATCCCAA CAGCAACAAC 120
TTCCACCTCT ACACGATCGT CATCGGCTCG CAGACGCTGC ACGCCACCGG CTACGCCATG 180
GGTATCGCCA AGGACGGCGC CGACTCGGCC GTGATCGCGT ACTTCGGTGA CGGCGCCTCC 240
AGCCAGGGTG ACGTCGCCGA ATCGTTCGCC TTCTCCGCGG TCTACAACGC CCCTGTCGTC 300
TTCTTCTGCC AGAACAACCA GTGGGCGATC TCGAGCCCCA CCGAGAAGCA GACCCGCGTC 360
CCGCTCTACC AGCGCGCGCA GGGCTACGGC TTCCCGGGCG TCCGCGTCGA CGGCAACGAC 420
GTACTGGCCT GCCTCGCCGT CACCAAGTGC CTCGAGCGGG CCCGCCGGGG CGAGGGGCCC 480
ACGTTGGTCG AGGCGTTCAC G 501
(2)SEQ ID NO：2信息
(i)序列特征：
(A)长度：201个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
CTCGCCGAGT CGGGCATCGT CGGCACGGCG ATCGGTCTCG CCCTGCGCGG CTACCGGCCG 60
GTGGTGGAGA TCCAGTTCGA CGGCTTCGTC TTCCCGGCGT ACGACCAGAT CGTCACGCAG 120
CTCGCGAAGA TGCACGCGCG GGCGTCGGGC AAGATCAAGC TCCCCGTTGT CGTCCGCATC 180
CCGTACGGCG GCGGCATCGG C 201
(2)SEQ ID NO：3信息
(i)序列特征：
(A)长度：217个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
CGCCGGTGTT CCTGGGCGGC GGGCCGCCGG AGATCGCCGC CCGCATCACG GAGCGCTGCT 60
TCTACCACCT GGAGGCACCC GTGCTGAGGG TCGGCGGCTA CCACGCCCCG TATCCGCCGG 120
CGCGTCTGGA AGAGGAGTAC CTTCCGGGCC TTGACCGGGT GCTCGATGCC GTCGACCGCT 180
CGCTGGCGTA CTGAGGAGAG GGTCGTGACG ACGATGA 217
(2)SEQ ID NO：4信息
(i)序列特征：
(A)长度：453个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
AACCAGGAGA TCGTCCTCAA GCACTATGTG AACCTGGGCA TCGCGGCGGC CACCCCGCGC 60
GGTCTGATCG TCCCGAACAT CAAGGACGCC CACGCCAAGA CCGTGCCGCA ACTGGCCGAG 120
TCACTGGGTG AGTTGGTGTC GACGGCCCGC GAGGGCAAGA CGTCCCCGACG GCCATGCAG 180
GGCGGCACGG TCACGATCAC GAACGTCGGC GTTCTTCGGC GTCGACACGG GCACGCCGAT 240
CCTATCCTCA ACCCCGGCGA GTCCGCGATC CTCGGCTTCG GCGCGATCAA GCTCCAGCCG 300
TGGGTCCACA AGGGCAAGGT CAAGCCCCGA CAGGTCACCA CGCTGGCGCT CAGCTTCGAC 360
CATCGCCTGG TCGACGGCGA GCTGGGCTCC AAGGTGCTGG CCGACGTGGC GGCGATCCTG 420
GAGCAGCCGA AGCGGCTGAT CACCTGGGCC TAG 453
(2)SEQ ID NO：5信息
(i)序列特征：
(A)长度：167个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Tyr Val Phe Pro Thr Tyr Arg Glu His Gly Val Ala Trp Ser Gly Gly
1 5 10 15
Val Asp Pro Thr Asn Leu Leu Gly Met Phe Arg Gly Val Asn Asn Gly
20 25 30
Gly Trp Asp Pro Asn Ser Asn Asn Phe His Leu Tyr Thr Ile Val Ile
35 40 45
Gly Ser Gln Thr Leu Hie Ala Thr Gly Tyr Ala Met Gly Ile Ala Lya
50 55 60
Asp Gly Ala Asp Ser Ala Val Ile Ala Tyr Phe Gly Asp Gly Ala Ser
65 70 75 80
Ser Gln Gly Asp Val Ala Glu Ser Phs Ala Phe Ser Ala Val Tyr Asn
85 90 95
Ala Pro Val Val Phe Phe Cys Gln Asn Asn Gln Trp Ala Ile Ser Ser
100 105 110
Pro Thr Glu Lys Gln Thr Arg Val Pro Leu Tyr Gln Arg Ala Gln Gly
115 120 125
Tyr Gly Phe Pro Gly Val Arg Val Asp Gly Asn Asp Val Leu Ala Cys
130 135 140
Leu Ala Val Thr Lys Cys Leu Glu Arg Ala Arg Arg Gly Glu Gly Pro
145 150 155 160
Thr Leu Val Glu Ala Phe Thr
165
(2)SEQ ID NO：6信息
(i)序列特征：
(A)长度：67个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Leu Ala Glu Ser Gly Ile Val Gly Thr Ala Ile Gly Leu Ala Leu Arg
1 5 10 15
Gly Tyr Arg Pro Val Val Glu Ile Gln Phe Asp Gly Phe Val Phe Pro
20 25 30
Ala Tyr Asp Gln Ile ValThr Gln Leu Ala Lys Met His Ala Arg Ala
35 40 45
Ser Gly Lys Ile Lys Leu Pro Val Val Val Arg Ile Pro Tyr Gly Gly
50 55 60
Gly Ile Gly
65
(2)SEQ ID NO：7信息
(i)序列特征：
(A)长度：63个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Pro Val Phe Leu Gly Gly Gly Pro Pro Glu Ile Ala Ala Arg Ile Thr
1 5 10 15
Glu Arg Cys Phe Tyr His Leu Glu Ala Pro Val Leu Arg Val Gly Gly
20 25 30
Tyr His Ala Pro Tyr Pro Pro Ala Arg Leu Glu Glu Glu Tyr Leu Pro
35 40 45
Gly Leu Asp Arg Val Leu Asp Ala Val Asp Arg Ser Leu Ala Tyr
50 55 60
(2)SEQ ID NO：8信息
(i)序列特征：
(A)长度：150个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Ash Gln Glu Ile Val Leu Lys His Tyr Val Asn Leu Gly Ile Ala Ala
1 5 10 15
Ala Thr Pro Arg Gly Leu Ile Val Pro Asn Ile Lys Asp Ala His Ala
20 25 30
Lys Thr Val Pro Gln Leu Ala Glu Ser Leu Gly Glu Leu Val Ser Thr
35 40 45
Ala Arg Glu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ala Met Gln Gly Gly Thr Val
50 55 60
Thr Ile Thr Ash Val Gly Val Leu Arg Arg Arg His Gly His Ala Asp
65 70 75 80
Pro Ile Leu Asn Pro Gly Glu Ser Ala Ile Leu Gly Phe Gly Ala Ile
85 90 95
Lys Leu Gln Pro Trp Val His Lys Gly Lys Val Lys Pro Arg Gln Val
100 105 110
Thr Thr Leu Ala Leu Ser Phe Asp His Arg Leu Val Asp Gly Glu Leu
115 120 125
Gly Ser Lys Val Leu Ala Asp Val Ala Ala Ile Leu Glu Gln Pro Lys
130 135 140
Arg Leu Ile Thr Trp Ala
145 150
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