以纤维素为基质的亲和膜介质的合成方法 本发明涉及一种以纤维素为基质的亲和膜介质的合成方法。具体地说是以纤维素为基质与甲基丙烯酸环氧丙酯共聚接枝合成复合介质，在此基础上开环氧化或开环接不同长度的间隔臂如氨基、乙二胺、肼等，合成可以连接带可反应基团的生物配基的亲和介质。
近年来随着生物工程技术的发展，人们对生物制品的认识不断深入，需求不断增加，随之而来，各种用于生物制品纯化的分析分离方法得到了长足的发展。其中，亲和色谱由于特异性好、纯化倍数高等优点已成为分析蛋白质核酸等生物大分子的重要手段。目前，可用于做亲和介质的成分有琼脂糖、葡聚糖、纤维素、硅胶、聚丙烯酰胺类、多孔玻璃及各种高分子聚合物等。其中，琼脂糖是使用最早、应用最广泛地常压色谱介质，它结构均一，非特异性吸附极低，是非常好的色谱介质材料，在今后数年内，琼脂糖作为亲和色谱载体的主导地位很难被其它基质取代。但琼脂糖是一种凝胶类物质，即使进行交联，能承受的压力也极为有限。葡聚糖等胶质载体也一样，这样很难满足大规模制备的要求。Janson J.C〖Agr.Foodchem.19(1971)581〗研究了Sephadex G150凝胶柱高流速与压降的关系，增加流速，压力随之增加，但到某一限度时流速减小，压降降低，这表明凝胶产生了不可逆变形，增加柱高，曲线拐点即允许流速降低，可见凝胶类基质难以放大生产，不能满足大规模制备要求。另一种常见的色谱介质硅胶，因其机械性能好，耐受压力高，尤其常见于高效亲和色谱中，但硅胶表面的硅羟基有部分离子性质，使得硅胶表面非特异性吸附强，且硅胶耐受pH范围较窄，限制了硅胶在亲和色谱中的应用。
近年来文献中虽然应用商品琼脂糖、硅胶等分离介质的很多，但作为介质研究已离开了单纯的琼脂糖、硅胶等传统介质，寻找复合介质成为亲和介质研究的一个方向。大规模制备中使用亲和介质具有如下要求：(1)成本低，(2)承受较高压力，(3)高亲和容量，(4)膨胀程度低，(5)压缩不变形。纤维素作为亲和介质机械性能好，化学稳定性高，是所有色谱介质中最廉价易得的原料，纤维素是大规模生产放大的首选亲和介质。但纤维素介质本身也有很大缺陷，这一缺陷限制了它在亲和色谱中的应用。主要是由纤维素的结构造成的。纤维素是由许多β-D-葡萄糖以1-4糖苷键连接成直链，直链间彼此平行，链间葡萄糖羟基可以形成氢键，这种非常有序的结构是纤维素的结晶区，离开这一结晶区的糖苷链则形成非结晶区。结晶区和非结晶区对亲和色谱制备的理化条件特别敏感，纤维素的衍生反应一般发生在结晶程度较低或非结晶区，这样使得连接的配基在微观上相当不均匀，且可活化的基团含量远低于琼脂糖，使单纯的纤维素介质很难取得理想的亲和效果。
本发明的目的是提供一种以纤维素为基质的亲和膜介质和合成方法。按这种方法制备的亲和介质大大提高了纤维素的键合容量。纤维素复合介质可以很方便的制膜，膜介质具有膨胀小、通透性好、耐压高、不易变形等优点。膜介质很容易填装成轴向柱及径向柱，轴向柱适用小规模的分离纯化，径向柱由于具有可线性放大、流速快等特点，适于大规模的分离纯化。该方法将在生物产品的大规模分离纯化及人体免疫治疗等方面有广阔的应用前景。
为实现上述目的，本发明用纤维素与甲基丙烯酸环氧丙酯共聚接枝，使纤维素中不多的可衍生羟基与一条高分子链键合，这个高分子链中的每个单体含有一个可反应的活泼官能团，可大大提高纤维素的配基容量，并可通过改变聚合条件和键合条件使活泼官能团含量得到控制。活性基团含量1.0-2.5mmol/g(介质)，解决了纤维素本身可衍生容量低的问题。同时由于纤维素表面聚集有高分了物质，使纤维素溶涨程度降低，又由于纤维素复合介质制膜方便，制成的膜介质通透性好，流速快，适于做生物大分子的大规模分离。上述本发明的合成亲和介质的方法，其特征在于采用以甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚得到聚合物，再与纤维素进行接枝反应，最后开环反应，得到活性基团为醛基或为氨基的亲和介质，自聚和接枝反应在中性介质中进行，反应温度为50～100℃，开环反应温度为40～80℃。同时，在自聚和接枝反应中要加入引发剂，例如偶氮二异丁腈，正丁基锂或过硫酸铵与硫代硫酸钠，引发剂加入量为反应单体重的1～5％。此外开环反应应控制在一定的pH值下进行，当开环反应物为己二胺时pH值为8～12。具体地说，本发明以纤维素为基质的亲和介质的制备由以下三步进行：
1.甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯自聚成一定大小的聚合物；
2.纤维素与聚合物进行接枝反应；
3.不同间隔臂长度的亲和介质的制备。
在上述1、2反应中，反应介质为中性水溶液，其中纤维素的含量为1.5～2.5％，甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的含量为3～10％，控制反应温度为50～100℃，自聚接枝反应时间以0.5～3小时为宜。在反应过程中要加入引发剂诱发反应，采用的阴离子聚合反应的引发剂为偶氮二异丁腈、正丁基锂或过硫酸铵与硫代硫酸钠，引发剂加入量为反应单体量的1～5％。氨基的开环反应在40～80℃下，并于一定的pH值下进行，具体的操作过程可按常规技术进行。下面通过实例对本发明的技术给予进一步地说明：
实例1复合介质的制备
在装有搅拌器、温度计及冷凝器的250ml三口烧瓶中，加水100ml，升温至80℃加入2克纤维素，充分搅拌均匀，加入5ml甲基丙烯酸环氧丙酯，搅5分钟后，加入含过硫酸铵与硫代硫酸钠各0.5克的混合溶液(约10ml)，恒温反应2小时，停止反应，降至室温后用大量的水洗，再用丙酮或乙醇洗去纤维素表面的残余有机物，在真空烘箱中烘干，合成带有活性环氧基团的复合介质。复合介质中活性环氧基团的含量为1.0～2.5mmol/g(干介质)。
实例2带有4个原子间隔臂的亲和介质的合成
用实例1所制备的环氧型复合介质置于pH＝0.5的盐酸溶液中，均匀搅拌，使环氧充分开环成为邻位羟基，一般室温需要3天，检测不上介质中的环氧，中止反应，过滤，用水充分洗涤至中性，然后加入到新配制的1.5％碘酸钠(NaIO4)中30分钟，过滤，大量水洗涤，制膜烘干。将膜介质装于小柱中进行接配基实验。将小柱用0.1mol/l pH＝7.6的磷酸缓冲液平衡，取一定量的蛋白质溶于平衡缓冲液中，室温或4℃上样循环4小时或更长时间，用平衡缓冲液冲洗至A280无吸收，用0.1mol/l pH＝8.2的硼酸缓冲液平衡，用甘氨酸乙酯盐酸盐溶液钝化1小时，再加入一定量的NaBH4或NaCHBH3还原碳氮键，还原12小时或更长时间，然后依次通过0.1mol/l pH＝8.2的硼酸缓冲液，0.2mol/l pH＝2.3的甘氨酸溶液，0.1mol/l pH＝7.6含1mol/l NaCl的磷酸缓冲液，最后用0.1mol/l pH＝7.6的磷酸缓冲液平衡，合成臂长为4个原子的亲和介质。
实例3：臂长为11个原子的亲和介质的合成
用实例1所制备环氧型复合介质3克，加入150ml水中，强烈搅至分散均匀，升温至80℃后，如氨水10～30ml，控制pH值为8～12，回流1～2小时，抽滤至滤液中性。做膜装柱，0.1mol/l pH＝8.2的硼酸缓冲液平衡，用一定量0.25％戊二醛溶液循环2小时，通过2mol/l醋酸溶液，用纯水洗至A280无吸收，用0.1mol/l pH＝7.6的磷酸缓冲液平衡，键合配基步骤同实例1。合成臂长为11个原子的亲和介质。
实例4：臂长为18个原子的亲和介质的合成
用实例1所制备的环氧型复合介质3克，加入150ml水中，强烈搅拌至分散均匀，升温至80℃后，加入相当于环氧含量1～5倍的乙二胺固体，控制pH值为8～12，反应1～2小时，取出洗涤至中性，做膜烘干装柱，用戊二醛活化及接配基步骤同实例1，合成臂长为18个原子的亲和介质。
比较例1
用本发明技术制备的QHprotein A吸附柱与美国CUNO公司生产的ZETAFINITY-10 protein A吸附柱的比较
(1)实验材料及方法
实验中使用的小牛血清白蛋白为电泳纯，IgG为免疫纯，均购自华美生化试剂公司。所用的泵为Cole Parmer model 7518-10，检测器为GILSONmodel 112紫外检测器，检测波长254(in)/280(out)，Sensitivity(AUFS)1.0，KNUER计录仪，纸速1.0mm/分。752C型紫外可见分光光度计(上海第二分析仪器厂产)。蛋白浓度测定：A280紫外检测法，用小牛血清白蛋白标准浓度曲线测定。
(2)QH protein A柱与ZETA-10 protein A柱简介
QH protein A柱：膜介质按本发明的技术方法合成，柱尺寸为8×20mmI.D.，介质重量1.04g，流量为4ml/分时，柱前压力为10psi。柱子外壳为有机玻璃，ZETA-10protein A柱：介质为以纤维素为基质合成的亲和介质，尺寸为38×10mmI.D.，可装介质0.9～1.0g，柱子外壳为塑料制品，当流量为3ml/min时，柱压增大，柱子极易破裂。
(3)对入lgG最大吸附量的比较
人lgG溶于0.01mol/pH＝7.5磷酸缓冲液中，浓度10.6mg/ml，取4ml上柱，循环10分钟，用平衡缓冲液冲洗记录仪基线，用0.2mol/l pH-2.3甘氨酸缓冲液洗脱至基线，收集洗脱液，测浓度和体积。两柱上样量及处理方法完全相同，其结果为采用QH protein A柱和ZETA-10 protein A柱时，其对人lgG最大吸附容量分别分32.0mg/g于介质和12.0mg/g干介质。
(4)最大非特异吸附容量的比较
将小牛血清白蛋白溶于0.01mol/l pH＝7.5磷酸缓冲液中，浓度1mg/ml，取4ml上样循环10分钟，用平衡缓冲液冲洗记录仪基线，用pH＝7.5mol/lNaCl洗脱至基线，收集洗脱液，测浓度和体积，两柱上样量及处理方法完全相同，其结果为采用QH protein A柱和ZETA-10 protein A柱，其最大非特异吸附容量分别为1.30mg/g干介质和2.11mg/g干介质。
比较例2
用于免疫吸附治疗的protein A膜吸附柱与proteinA琼脂糖吸附柱的比较。
免疫吸附疗法是通过抗原抗体免疫反应或物理化学作用去除人血液中的内原性、外原性致病因子，净化血液，从而达到治疗某些疑骓病症的目的。近些年来，免疫吸附治疗已逐渐成为血液净化技术的重要分枝，日益引起医学界的关注。现在已用于临床治疗效果较好的是A蛋白。目前，已经有商品出售的是瑞典Gambro公司生产的以琼脂糖为基质的A蛋白免疫吸附柱。此柱含琼脂量为62.5ml，A蛋白结合能力为20mgIgG/ml琼脂，外壳由丙烯酸酯包成50×40mm的圆柱形，血浆灌流速度为15～35ml/分，目前以纤维素为基质的商品免疫吸附柱还未见报道。用本发明的技术方法合成了间隔臂长度为18个原子的Protein A免疫吸附柱。柱子形式分两种，一种是轴向柱，尺寸为14×60mm，I.D，装介质12g，血浆灌流速度为20～80ml/分，A蛋白结合能力为32mg IgG/g于介质，另一种柱形式为径向柱，它是采用螺旋卷式膜组件结构，液体由柱外围流向柱芯，尺寸为20×60mmI.D.，内装介质13g，血浆灌流速度为20～200ml/分，A蛋白结合能力不变。正常人血浆通过上述A蛋白膜吸附柱，吸附上的IgG用pH＝2.3的甘氨酸＝HCL缓冲液洗脱下来，做质谱检验其纯度，结果表明，采用本发明的技术制备的protein A膜吸附柱特异性较好。proteinA膜吸附柱经过去菌，去热原处理，临床动物实验效果较好。
由以上比较可以看出，用本发明的技术制备的protein A免疫吸附柱吸附容量比美国CUNO公司的ZETA-10protein A柱高出近2倍，单位体积的吸附容量相当于以琼脂糖为基质的protein A吸附柱的二分之一，但其流量要明显高于琼脂糖柱。
上述实例和比较例的结果表明，本发明的技术方法合成的亲和膜介质避开了琼脂糖等软基质的弱点，具有较强的耐压性，介质以膜的形式存在柱中，在较高的流速下仍能稳定存在，在短时间内就可完成分离操作，大分子以对流的方式在膜空隙中流动，能很快与配基结合，改善了柱中传质，从理论上讲，径向膜色谱具有可线性方大的特点，适于大规模的分离纯化。该方法将在生物产品的大规模分离纯化及人体免疫治疗等方面有广阔的应用前景。