用于培养外生菌根性食用菌和药用菌菌根苗的苗床 【技术领域】
本发明涉及培养菌根苗的苗床，苗床的获得方法。本发明还涉及菌根苗的培养方法。
背景技术
菌根性食用菌和药用菌指能与松科、壳斗科、榛科、安息香科、桦木科、杨柳科等植物根系形成共生关系，具有外生菌根特性的一类真菌。这些真菌包括黑孢块菌(Tuber melanosporum Vitt.)、尊块菌(Tuber magnatumPora.)、中华块菌(Tuber sinense K.Tao et Liu)、印度块菌(Tuber indicumCooke et Massee)，夏块菌(Tuber aestivum Vittad.)等块菌目(Tuberales)、鸡油菌(Cantharellus cibarius Fr.)、干巴菌(Thelephora ganbajun Zang)、紫红拟锁瑚菌(Clavulinopsis miyabeana(Ito.)Ito.)等非褶菌目(Aphyllophorales)、松茸(Tricholoma matsutake(Ito et Imai)sing.)、美味牛肝菌(Boletus edulis bull：Fr.)、小美牛肝菌(Boletus speciosus Frost)、褐环乳牛肝菌(Suillus luteus(L：Fr.)Gray)、厚环乳牛肝菌(Suillus greviller(KL.)sing.)、松乳菇(Lactariusdeliciosus(Fr.)Gray)、红汁乳菇(Lactarius hatsutake Tanaka)、变绿红菇(Russula virescens(schaeff.)Fr.)、大红菇(Russula alutacea(Pers.)Fr.)、正红菇(Russula vinosa Lindbl.)、橙盖鹅膏(Amanita caesarea(Scop：Fr.)Pers.exschw.)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum honshimeji(kawam.)Hongo)、烟色离褶伞(Lyophyllum fumosum(Pers.：Fr.)Orton)、灰花纹鹅膏(Amanita fuligineaHongo)、亚稀褶黑菇(Russula subnigricans Hongo)等伞菌目(Agaricales)、大秃马勃(Calvatia gigantean(Batsch ex Fr.)Lloyd)等马勃目(Lycoperdales)、彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius(Pers.)Coker et couch)等硬皮马勃目(Sclerodermatales)、红须腹菌(Rhizopogon rubescens(Tul.)Tul.)等须腹菌目(Hymenogastrales)等具有食用和药用价值的菌根性真菌。
培育菌根苗通常是用孢子或纯培养菌丝体直接接种到无菌植物根部，并控制一定的温度、湿度、光照、营养等培养条件，由孢子自然萌发而成的菌丝或组织培养的菌丝直接浸染植物根尖，并引起根尖组织一系列变化，最终形成菌根。这一感染过程多次重复，最终获得合格的菌根苗。此方法虽行之有效，但过程烦琐、条件要求严、成本较高。如果控制不好，还易感染竞争性菌根杂菌。实际操作时，植物菌根化率往往较低。
到目前为止，全世界仅有黑孢块菌、勃艮第块菌等少数几种食用菌根性真菌的菌根苗在法国、意大利等国家实现规模化繁殖和产业化栽培。其菌根苗的繁殖方法是采用孢子接种植株个体，并在三明治式纸质容器中合成培养的方法。这一方法虽然对块菌目真菌等有效，但繁殖效率不高。而且用该法繁殖其他菌根真菌效果不理想。瑞典的E.Danell[1]在实验室内建立了一套在无菌条件下，将鸡油菌(Cantharellus cibarius)菌丝接种到松树根上的方法。1995年1月接种，1996年4月收获第1个子实体，1996年11月在同一栽培箱中收获3个子实体。但该方法操作过程繁琐，成本高。
美国专利4345403还公开了生产子实体地方法。该方法是在无菌土壤中栽培一定数量幼苗，并使幼苗与已接种了目的菌的植物接触而被感染，再将这些被目的菌感染的植物(称作诱导植物或先锋植物)栽植于灭菌温室或苗圃内，然后将灭菌之成年植物移栽进来，并使之与上述诱导植物根系接触，进而感染上目的菌。这样这些大树即可较快产生子实体。该方法的缺点是，由于成年树往往被多种菌根菌感染，感染目的菌之前难以将竞争性杂菌彻底消毒。而且移栽大树也较费时费力。
关于菌根苗的培养方法，现有技术中已有报道对宿主植物作切根处理，能促进菌根的形成。例如日本《公开特许公报》特开平7-147841号公开一种方法，该方法是在促进菌根形成的容器中，对宿主植物作切根处理，并在切口附近加入促根物质，促进宿主植物发根，使其在无菌条件下与纯培养的目的菌根菌稳定形成菌根。伍家荣，谭著明，蒋丽娟等，也公开了对马尾松当年生实生苗进行截(切)根处理的方法，并对截根方法进行了描述。研究证明该方法能刺激苗木须根发育，促进菌根形成[2]。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种能大面积培养菌根苗的苗床，并提供该苗床的制备方法，和用该苗床培养菌根苗的方法。
在叙述本发明的技术方案前，先说明本发明中所用的术语的定义。
1、目的菌根菌是指栽培活动所期望获得的菌根性真菌。
2、菌根菌繁殖体是指有性或无性的孢子、菌丝或二者的混合体。
3、非竞争性菌根杂菌，是指与目的菌根菌没有竞争性，即不会导致目的菌根菌生长受阻、发育不良、产量降低或死亡的其它菌根菌。
所述非竞争性是指由于环境因子(温度、湿度、光照、pH值、营养元素等)不适于某些菌根真菌发育而使这些真菌对目的菌根菌不构成竞争，或者目的真菌在一定条件下有显著的竞争优势，以至非目的真菌的竞争受到抑制。
4、窒息灭菌是指通过降低氧气分压，使菌根菌或其他真菌无法正常生长发育直至死亡的一种灭菌方法。
本发明提供的培养外生菌根性食用菌和药用菌菌根苗的苗床，其基质是土壤或/和人工基质，该基质仅无菌根性竞争杂菌。
根据所培养的苗木的种类，所选择的土壤是适合该苗木生长的土壤。
人工基质是可选自蛭石、泥炭土、腐质土、苔藓、珍珠岩中的一种或几种。优选如下配比(体积比)：蛭石30-50％，珍珠岩20-40％，泥炭土或苔藓或腐殖土20-40％。
为得到所需的苗床，本发明采用的方法是对用于该苗床的基质用消毒的方法去除菌根性竞争杂菌。
优选化学灭菌法和窒息灭菌法。这些灭菌方法能有效地杀灭竞争性菌根菌，但并不要求彻底杀灭其他非竞争性菌。化学灭菌法采用的试剂可以是臭氧或甲醛。
特别优选窒息灭菌法。该方法是成本最低，无污染的有效杀灭竞争性菌根菌的方法。降低氧分压的方法很多，可以抽真空，或注入液体或惰性气体。一般将用于苗床的基质置于缺氧条件下至少20天，即可达到杀灭竞争性菌根菌的目的。
本发明提供的苗床应置于隔离的环境中，如大棚，温室等，使该苗床不因菌根性竞争杂菌侵入而受到污染。重要的是，这样的苗床面积大，与其他培养方法相比，更适于大规模培养。由于只需控制无菌根性竞争菌，因而，维护成本较低。只要按上述方法制备了大量的苗床基质，用本发明提供的苗床就可以大面积繁殖菌根苗。
用本发明提供的苗床培养菌根苗的方法，包括如下步骤：
1)将菌根真菌的繁殖体或携带繁殖体的载体接种到本发明提供的苗床上培养，所说的载体是适用于做苗床的人工基质或/和土壤；
2)再将相应的共生植物的无菌或无菌根性竞争杂菌的幼苗或种子或插穗移植到上述基质上。
在培养过程中，需使用营养液或复合肥。
为促使苗木的根系发达，以利于真菌的生长，在培养过程中，采用切根的方法。
所用的苗床在培养过一批菌根苗后，可以继续用于下一批菌根苗的培养。
本发明实施例中分别用黑孢块菌、中国块菌、印度块菌、松乳菇、红汁乳菇、美味牛肝菌、乳牛肝菌等的孢子和纯培养菌丝体接种到用甲醛消毒或其他方法处理的无菌根性竞争菌的人工基质(蛭石30-50％+珍珠岩20-40％+泥炭土20-40％)上，以及甲醛消毒或窒息消毒的土壤上，并分别以板栗(Castanea mollissima Blume)、华榛(Corylus chinensis Franch.)、柽栎(Quecus ilex L.)、白栎(Quecus fabri Hance)、欧洲榛(Coryllus avellana L.)、青冈(Cyclobalanopsis glauca(Thumb.)oerst)、乌冈栎(Quecus phillyraeoidesA.Gray)、黄背栎(Quercus pannosa Hand.-Mzt.)马尾松(Pinus massonianaLamb)、湿地松(Pinus elliottii Engelm)、火炬松(Pinus taeda L.)、赤松Pinusdensiflora sieb.et Zucc、辐射松P.radiata D.Don等的无菌苗或种子移植(或播种)于上述已接种目的菌根真菌的基质上，控温、控湿、控光，连续培养120天后，进行切根处理。100-240天内均检测到相应的菌根。其中黑孢块菌菌根为灰黑色，先端膨大，菌丝套致密的棒状菌根；松乳菇与马尾松形成的菌根橙黄色，具二叉分枝；红汁乳菇与马尾松形成的菌根血红色，具二叉分枝；乳牛肝菌与马尾松形成的菌根为二叉分枝，被棉絮状锈褐色菌丝套。用这些菌根苗移栽于无菌根性竞争菌的土壤上，按1.5-8×1.5-8米的株行距种植，并任其自然发育，30个月后，分别获得松乳菇、红汁乳菇、乳牛肝菌子实体。35个月和41个月时在同一地段连续获得同种类的子实体，产量达到每平方米0.4千克。35个月后获得黑孢块菌、中国块菌、印度块菌子实体。说明使用本发明提供的苗床以及培养方法，对菌根性食用菌和药用菌的菌根苗进行规模化繁殖和开放式栽培是切实可行的。
本发明提供的苗床制备方便，易得，为菌根苗大规模培养提供了条件。菌根苗的培养方法具有成本低，规模大的优点。
实施例1：
用分离得到的松乳菇纯培养菌丝体，接种到高温灭菌的蛭石35％、珍珠岩35％和泥炭土28％以及营养液2％的人工基质作成的固体培养基上，在10-28℃条件下，培养35天，将上述带菌基质接种于无竞争性菌根杂菌的苗床基质(蛭石35％，珍珠岩35％，泥炭土28％和复合肥2％)上层，并混合均匀。然后将提前培养了25天的无竞争性菌根杂菌的马尾松苗移栽至该菌床上，在自然条件下培养120天后切根，继续培养至180天后，即获得合格的松乳菇—马尾松菌根苗，每平方米菌根苗产苗量达到80-100株。将上述合格菌根苗11000株按2×2米株行距移栽到4.5hm2红壤土上，33个月后即获得与天然松乳菇形态、风味一致的子实体。每平方米子实体14个，重量0.4千克。
实施例2
用分离得到的红汁乳菇菌种，在蛭石30％、珍珠岩40％、泥炭土28％及营养液2％配制的固体培养基条件下，控温控湿培养，后接种于无菌根性杂菌的苗床基质(蛭石30％、珍珠岩40％、泥炭土28％)上层，并加入复合肥2％，混合均匀，将提前培养了25天的无菌根性杂菌的马尾松苗移栽至该菌床上，在自然条件下培养180天后，按2×1.5米株行距移栽到无菌根性杂菌的紫色砂岩发育的1公顷砂壤土上，33个月后获得第一批红汁乳菇子实体，39个月后获得第二批红汁乳菇子实体，44个月后获得第三批子实体。所有子实体与天然红汁乳菇子实体形态、风味完全一致。产量一平方米子实体达16个，重量0.48千克。
实施例3
用分离得到的乳牛肝菌菌种，在蛭石40％、珍珠岩30％和泥炭土28％和营养液2％混合的固体培养基条件下，在23℃条件下培养40天后，接种于无竞争性菌根真菌的苗床基质(蛭石40％、珍珠岩30％和腐殖土28％)上层，并加入复合肥2％，混合均匀。将培养了20天的无菌马尾松苗移栽至该苗床上，在自然条件下培养200天后，移栽到紫色砂土上，45个月后获得乳牛肝菌子实体，子实体数量为每平方米10个，新鲜子实体重量0.52千克。
实施例4
用中华块菌孢子接种于板栗和乌冈栎无菌幼苗(培养了50天)根上，在用甲醛消毒的人工基质(蛭石25％，珍珠岩40％，腐殖土28％，石灰6％)和复合肥1％作成的苗床上(pH6.5-7.5)培养10个月，获得典型的中华块菌菌根，该菌根呈棒状，先端膨大，外层形成较致密的菌丝套。
实施例5
用黑孢块菌菌种接种蛭石25％、珍珠岩40％、泥炭土26％、石灰8％、营养液1％配制的基质(pH7.2-8.2)，并分别移入板栗、青冈栎、乌冈栎、柽栎、黄背栎、华榛、欧洲榛的无菌苗，并一同培养9个月，均获得了典型的黑孢块菌菌根。在上述合格黑孢块菌菌根苗移走后的菌(苗)床上，移入新的无菌板栗、乌冈栎、柽栎、青冈、欧洲榛无菌苗，继续培养10个月，也获得了合格的黑孢块菌菌根苗，菌根感染率达到80-95％。
实施例6
用红汁乳菇、小美牛肝菌胞子接种到经窒息灭菌的酸性(pH4.2-6.3)土壤上，然后将无竞争性菌根杂菌的马尾松苗和种子分别移植于上述土壤上，适当隔离条件下，使其自然生长。经6个月即获得健康、纯度高的目的菌根菌感染的菌根苗。上述菌根苗移栽于无竞争性菌根杂菌的山坡地上，任其生长。连续干旱季节，每4-8天浇灌一次透水。2.5年后分别获得红汁乳菇和小美牛肝菌子实体。
参考文献：
1、Eric Danell，Successful cultivation ofthe golden chanterelle，Nature，1997，vol.385：303
2、伍家荣，谭著明，蒋丽娟等，马尾松播种苗截根提高造林成活率研究，林业科技通讯，1994.6：16-17