一种从发酵液中提取纯化高分子聚Γ谷氨酸的方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201410357519.5

申请日:

2014.07.20

公开号:

CN104163916A

公开日:

2014.11.26

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C08G 69/10申请日:20140720|||公开

IPC分类号:

C08G69/10

主分类号:

C08G69/10

申请人:

黑龙江康普生物科技有限公司; 哈尔滨商业大学

发明人:

梁金钟; 段旭煌; 王风青

地址:

150020 黑龙江省哈尔滨市利民开发区沈阳大街与长沙路交口

优先权:

专利代理机构:

代理人:

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内容摘要

本发明公开了一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法,属于化学技术领域,步骤1.发酵液中菌体的去除;步骤2.活性炭脱色;步骤3.发酵液中阴阳离子的去除顺序;步骤4.发酵液浓缩;步骤5.干燥。本发明建立了一套经济可行的预处理工艺,可有效实现γ-PGA高黏发酵液的菌液分离、色素等杂质的去除,并进行超滤冻干,最终精制得到高纯度的γ-PGA成品,为γ-PGA的最终商品化提供了可行的工艺路线。

权利要求书

1.  一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1.发酵液中菌体的去除
(1)发酵液预处理
发酵结束后,将发酵液在40~100℃条件下处理10~60min,用蒸馏水稀释1~10倍;
(2)硅藻土过滤除菌体
将滤纸浸湿后,铺于抽滤漏斗的底部,使滤纸与漏斗底部紧紧相贴;将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内,待硅藻土沉淀后,开启真空泵进行真空抽滤,抽滤压力为0.1MPa;硅藻土形成1~2.5cm厚涂层且其表面水抽尽后,倒入预处理后的发酵液,虑液有黏性后收集,在不换硅藻土滤层的情况下,连续过滤4次,1g硅藻土可以去除3.4mL原发酵液中的菌体;
步骤2.活性炭脱色
(1)发酵液中有色杂质吸光度的确定
对用活性炭处理前后的γ-PGA发酵液及购买的标准γ-PGA分别在波长200nm~500nm下进行紫外光谱全波长扫描,确定γ-PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长,作为脱色处理的评价指标,结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱;经紫外扫描后,γ-PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260nm;
(2)发酵液中有色杂质的去除
硅藻土除菌体后的发酵液,添加颗粒状活性炭0.1~2.0%(质量体积比),以20~100rpm的速度搅拌5~60min;
步骤3.发酵液中阴阳离子的去除顺序
脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂,后过阴离子交换树脂;
步骤4.发酵液浓缩
用0.1μm-0.6μm孔径的中空纤维膜进行浓缩,浓缩液稀释至浓缩前液体体积的0.5~2倍,再进行浓缩,此浓缩-稀释-浓缩的过程重复1~4次,发酵液中的小分子物质,如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0;
步骤5.干燥
将浓缩后的γ-PGA发酵液分装于样品盘中,置于-80℃冰箱内预冻6h后,在-60℃下真空冷冻干燥,获得纯品γ-PGA。

说明书

一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于化学技术领域,具体为一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法。
背景技术
γ-PGA是自然界中微生物发酵产生的阴离子型多聚氨基酸,由D型谷氨酸和L型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成的高分子聚合物。在每一个重复单元的α碳原子,还有一个游离的羧基,因此γ-PGA的分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基,可在分子内部或分子之间形成氢键。γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成,相对分子质量一般在100~1000kDa,没有典型的肽链结构,也不是一种环状多肽,基本骨架呈直链纤维状。

γ-PGA分子中有大量游离的亲水性羧基,它具有很多优良特性:(1)可在分子内部或分子之间形成氢键,水溶性好;(2)对金属离子的吸附性强;(3)优良的生物降解性。主链上存在大量肽键,也带来很多优良特性:(1)在体内环境下受酶的生物作用,会降解生成无毒的短肽、小分子或氨基酸单体。在医药行业上开发出的手术线和手术粘合剂就是利用这点性质。(2)在自然环境中,会受到某些微生物的作用而降解,可食无毒。利用这点可生产可降解的塑料。其他性质:良好的生物相容性;无自身抗原性;抗冻特性;絮凝特性;高分子量,平均分子量为100-1000kDa,化学合成一般达不到这么高的分子量,且合成成本要很高。在生理功能方面可防止细胞脱水、保护细胞免受蛋白酶的降解等;γ-PGA在放射线照射下会增加分子间的结合,提高吸水性能,由此可开发出一种强吸水性很强的生物树脂。这种树脂有良好的粘弹性,并在一定范围内具有耐酸、碱、盐,耐高渗透压,抗冻融等优 良特性。γ-PGA强酸高温彻底酸水解后测得γ-PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值稳定在D∶L=60∶40。γ-PGA水溶液的流变性能溶液是非牛顿剪切变稀的假塑性流体,其粘度随温度的升高而呈现下降。这些优良的理化性质决定这种材料在多行业有着广泛的发展前景。
γ-PGA的应用领域γ-PGA由前所提及的优良的理化性质可广泛用做环保领域如生物絮凝剂、重金属吸附剂,食品工业如增稠剂,农业领域如保湿剂,医药工业如药物载体、医用生物粘合剂等等,一般认为它对人类和环境无毒害,甚至可食用。γ-PGA及其衍生物潜在应用价值极大可发展出许多特殊用途是一种有极大开发价值和应用前景的多功能新型生物制品。
1.γ-PGA在食品工业上的应用γ-PGA在食品中可用于新型的食品添加剂、抗冻剂、矿质吸收促进剂、除涩剂、稳定剂等。
γ-PGA作为新型的食品添加剂 γ-PGA分子上含有大量亲水基团,因而具有良好的吸水保湿性能可应用于淀粉类食品。日本将它用于淀粉类食品(糕点、面条)中,可防止老化、增强质地、维持食品外形和延长货架期;γ-PGA可以增加面包、蛋糕的弹性,使面包、蛋糕的颗粒更加细致,γ-PGA还可以增强面条的韧性,防止面条中的固体物质溶解在沸水中。
γ-PGA作为抗冻剂 频繁冷冻和融化生物细胞、生物活性物质和食品等会加速其退化和腐败,而加入γ-PGA可以避免这种状况。γ-PGA具有好的抗冻性能,γ-PGA的抗冻性和可食用性使γ-PGA可被广泛的应用于食品加工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷藏冻藏,而且γ-PGA比通常的低分子量防冻剂(如糖类无机盐和蛋白质等)味淡,食品中即使加入了大量的γ-PGA对口感影响也不大。
γ-PGA作为矿质吸收促进剂 γ-PGA还可以作为矿质吸收促进剂,在含高矿物质的食品中加入了γ-PGA或其降解产物可以促进小肠对矿物质的吸收。与酪蛋白磷酸肽相比,γ-PGA具有优良的水溶性,效果更佳。而且γ-PGA可以掩盖高浓度矿质元素所带来的刺激性、收敛性和粗糙感等适口性问题,尤其适用于补钙和补铁的保健品。
γ-PGA作为除涩剂 γ-PGA可作为各种食品的苦味掩盖剂和除涩剂,研究发现,γ-PGA可以消除或减少诸如氨基酸、多肽、奎宁、咖啡因、矿物质引 起的酸味,是高钠调味剂的替代品,可为糖尿病患者和高血压患者所用,作为健康饮食的一个组分。
γ-PGA作为稳定剂 可用作冰淇淋的稳定剂;果汁饮料的增稠剂等。
2.γ-PGA在农业领域的应用γ-PGA与其他单体经过聚合能够得到一种高倍吸水性树脂(Superabsorbent polymer,SAP),吸水能力急剧增强目前报道的最高可达5300倍。这种高吸水性树脂无毒、无味、无色透明,具有高吸水性和保水性。将这种高吸水性树脂应用在荒山、秃岭、沙漠治理等方面可发挥积极作用,我国科研人员采用γ-PGA吸水树脂种子做发芽实验取得了良好的效果。另外,在肥料、杀虫剂、除草剂、驱虫剂等使用时,加入适量的γ-PGA盐可以延长这些药物在作用对象表面上的停留时间,不易因干燥、下雨而被冲刷掉。
3.γ-PGA在环保领域的应用
γ-PGA用于生物修复 全世界工业的高速发展的同时,也带来了对环境的严重污染,目前被污染的土壤、水和空气的净化修复是我们迫切解决的难题。利用γ-PGA与这些污染物之间的黏附浓缩作用机制可对被污染的环境进行修复。如利用γ-PGA吸水与土壤结合,能提高土壤吸湿能力、通风性、保肥性能,在大规模改造荒山、沙漠方面能发挥积极作用。γ-PGA能吸收农药和化肥,防止流失并缓慢释放,改善作物栽培条件、提高肥料的利用率。
γ-PGA作为生物絮凝剂治理水污染 生产上已经开发了的用于废水处理、工业下游处理的许多絮凝剂如铝盐、聚丙烯酸、活性炭材料,这些材料既经济又有效,应用最为广泛,但是大多数不能被生物降解,长期使用也会对环境造成二次污染。利用γ-PGA的电负性和粘结性对水中的污染物进行处理不仅可以应用于废水处理、饮用水的纯化及深海水的加工,而且也可以用于食品和发酵工业的下游工程操作。此外还可以作为重金属和放射性核物质的吸附剂。
4.γ-PGA在工业领域的应用 利用γ-PGA聚合成高分子材料此类聚合物性质类似于塑料,可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等,具有适合的强度、透明度和较好弹性。γ-PGA用苯乙烯改性后,可得到高抗碱性的纤维树脂。若通过改性再聚合,可得到比一般天然纤维和化学纤维更优的材料。利用γ-PGA合成的材料相对于现有的材料优点在于可降解,无毒,对环境没有危害是一种绿色的高分子塑料。
5.γ-PGA在医药领域的应用 γ-PGA聚合的高分子材料可用于药品的包装膜,可降解手术线等。近年来国外还有人研究得出γ-PGA还能够增强前列腺素EI的作用。还建立了用谷氨酞聚合物作为基因治疗的载体。由交联胶原蛋白和γ-PGA制备的一种新型生物粘合剂表现出比外科手术粘合剂及纤维胶更高的软组织粘合和止血作用,并且能够在体内降解而不会引起任何炎症反应。
目前,微生物发酵法合成γ-PGA的分离纯化主要存在2个难题:1是发酵液黏度高,菌液分离困难;2是发酵液成分复杂,提取纯化成本高。目前适合高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝法成本过高,且除杂不彻底;由于γ-PGA分子大小与菌体较为接近,微孔滤膜法不能有效实现γ-PGA与菌体的分离;对于高浓度的γ-PGA发酵液,酸化处理后虽黏度大大降低,但高速离心的方法仍难以实现彻底的菌液分离和杂蛋白的去除,且难以应用于工业化生产。如何实现γ-PGA高黏发酵液中的菌液分离是γ-PGA提取纯化工艺的关键之一。γ-PGA的提取纯化通常采用有机溶剂沉淀法、铜盐沉淀法和膜分离沉淀法,膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能,已被应用于γ-PGA的分离纯化。Do等采用发酵液酸化、离心、过膜微滤、超滤浓缩、醇析、真空干燥的工艺进行了γ-PGA的提取与纯化,与传统的有机溶剂沉淀-复溶-透析的方法相比,节省了乙醇用量,降低了成本。但由于该工艺采用离心步骤,使得处理发酵液的能力有限,且得到的成品品质不够高。目前用于高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝法成本过高,且除杂不彻底;由于γ-PGA分子大小与菌体较为接近,微孔滤膜法不能有效实现γ-PGA与菌体的分离;对于高浓度的γ-PGA发酵液,酸化处理后虽黏度大大降低,但高速离心法消耗动力大,成本高,不适于工业化生产。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明提供一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法,建立了一套经济可行的预处理工艺,可有效实现γ-PGA高黏发酵液的菌液分离、色素等杂质的去除,并进行超滤冻干,最终精制得到高纯度的γ-PGA成品,为γ-PGA的最终商品化提供了可行的工艺路线。其技术方案为:
一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法,包括以下步骤:
步骤1.发酵液中菌体的去除
(1)发酵液预处理
发酵结束后,将发酵液在40~100℃条件下处理10~60min,用蒸馏水稀释1~10倍;
(2)硅藻土过滤除菌体
将滤纸浸湿后,铺于抽滤漏斗的底部,使滤纸与漏斗底部紧紧相贴;将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内,待硅藻土沉淀后,开启真空泵进行真空抽滤,抽滤压力为0.1MPa;硅藻土形成1~2.5cm厚涂层且其表面水抽尽后,倒入预处理后的发酵液,虑液有黏性后收集,在不换硅藻土滤层的情况下,连续过滤4次,1g硅藻土可以去除3.4mL原发酵液中的菌体;
步骤2.活性炭脱色
(1)发酵液中有色杂质吸光度的确定
对用活性炭处理前后的γ-PGA发酵液及购买的标准γ-PGA分别在波长200nm~500nm下进行紫外光谱全波长扫描,确定γ-PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长,作为脱色处理的评价指标,结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱;经紫外扫描后,γ-PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260nm;
(2)发酵液中有色杂质的去除
硅藻土除菌体后的发酵液,添加颗粒状活性炭0.1~2.0%(质量体积比),以20~100rpm的速度搅拌5~60min;
步骤3.发酵液中阴阳离子的去除顺序
脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂,后过阴离子交换树脂;
步骤4.发酵液浓缩
用0.1μm-0.6μm孔径的中空纤维膜进行浓缩,浓缩液稀释至浓缩前液体体积的0.5~2倍,再进行浓缩,此浓缩-稀释-浓缩的过程重复1~4次,发酵液中的小分子物质,如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0;
步骤5.干燥
将浓缩后的γ-PGA发酵液分装于样品盘中,置于-80℃冰箱内预冻6h后,在-60℃下真空冷冻干燥,获得纯品γ-PGA。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1.传统去除高粘度γ-PGA发酵液中菌体的高速离心法,动力消耗大,菌体去除率低;酸处理虽可有效降低发酵液粘度,以利于γ-PGA纯化工艺,但对其质量造成一定损害。本发明采用适当的热处理,联合硅藻土过滤,有效的分离了菌体,而且由于硅藻体本身的特性,还除去了部分其它杂质。
2.本发明确定了微生物发酵合成γ-PGA发酵液中有色物质的最大吸收波长,有助于工业化生产过程中产品质量的控制。
3.本发明确定了活性炭脱除发酵液色素的工艺条件。
4.微生物发酵合成γ-PGA发酵液中含有培养基残余的阴阳离子,本发明确定了阴阳离子的去除顺序。
5.浓缩可有效的降低工业化生产中干燥成本,本发明确定了发酵液浓缩的工艺参数。
附图说明
图1是活性炭脱色处理液紫外扫描图谱,样品从上到下依次为:未经活性炭处理的γ-PGA、经活性炭处理的γ-PGA、购买的标样;
图2是精制品γ-PGA;
图3是γ-PGA酸水解液HPLC分析γ-PGA的组成;
图4是γ-PGA酸水解液薄层层析分析γ-PGA的组成;
图5是标准γ-PGA红外扫描光谱;
图6是微生物发酵产γ-PGA红外扫描光谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明的目的在于提供一个微生物发酵法合成γ-PGA的发酵液预处理,γ-PGA分离纯化精制的方法。详细技术方案如下:
1.发酵液中菌体的去除
(1)发酵液预处理
发酵结束后,将发酵液在40~100℃条件下处理10~60min,用蒸馏水稀释1~10倍。
(2)硅藻土过滤除菌体
将滤纸浸湿后,铺于抽滤漏斗的底部,使滤纸与漏斗底部紧紧相贴;将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内,待硅藻土沉淀后,开启真空泵进行真空抽滤,抽滤压力为0.1MPa。硅藻土形成1~2.5cm厚涂层且其表面水抽尽后,倒入预处理后的发酵液,虑液有黏性后收集,在不换硅藻土滤层的情况下,连续过滤4次,1g硅藻土可以去除3.4mL原发酵液中的菌体。
2.活性炭脱色
(1)发酵液中有色杂质吸光度的确定
对用活性炭处理前后的γ-PGA发酵液及购买的标准γ-PGA分别在波长200nm~500nm下进行紫外光谱全波长扫描,确定γ-PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长,作为脱色处理的评价指标,结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱。经紫外扫描后,γ-PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260nm。
(2)发酵液中有色杂质的去除
硅藻土除菌体后的发酵液,添加颗粒状活性炭0.1~2.0%(质量体积比),以20~100rpm的速度搅拌5~60min。
3.发酵液中阴阳离子的去除顺序
脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂,后过阴离子交换树脂。
4.发酵液浓缩
用0.1μm-0.6μm孔径的中空纤维膜进行浓缩,浓缩液稀释至浓缩前液体体积的0.5~2倍,再进行浓缩,此浓缩-稀释-浓缩的过程重复1~4次,发酵液中的小分子物质,如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0。
5.干燥
将浓缩后的γ-PGA发酵液分装于样品盘中,置于-80℃冰箱内预冻6h后,在-60℃下真空冷冻干燥,获得纯品γ-PGA,见图2。
6.γ-PGA精制品的鉴定
(1)γ-PGA精制品组成分析
取样品0.5g放入水解管中,加入10mL6mol/L HCl,抽真空,110℃水解24h,冷却后移至100mL容量瓶中,定容,经0.45μm微孔滤膜过滤后取滤液用高压液相色谱测定谷氨酸和薄板层析分析氨基酸组成,其结果是图3所示酸水解HPLC测定γ-PGA的组成。
用硅胶G制备薄层层析用硅胶板,110℃活化5min后,在硅胶板上点样,选用正丁醇∶乙酸∶水=3∶1∶1展开剂溶液,上行法展开后,以0.25%茚三铜显色,于干燥箱中加热60℃烘干15min。其结果是图4所示的图硅胶薄层层析测定γ-PGA的组成。
委托农业部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨)做γ-PGA水解液的氨基酸分析,采用水解后利用氨基酸分析仪直接测定的方法,检测报告的数据如表1所示,所示的氨基酸分析仪分析γ-PGA水解液的氨基酸组成。
表1 氨基酸分析仪测定γ-PGA酸水解液的氨基酸组成

检验项目单位标准要求检验结果检验方法天门冬氨酸-0.00GB/T5009.124-2003苏氨酸-0.00GB/T5009.124-2003丝氨酸-0.00GB/T5009.124-2003谷氨酸-65.75GB/T5009.124-2003甘氨酸-0.00GB/T5009.124-2003丙氨酸-0.00GB/T5009.124-2003胱氨酸-0.00GB/T5009.124-2003缬氨酸-0.00GB/T5009.124-2003蛋氨酸-0.00GB/T5009.124-2003异亮氨酸-0.00GB/T5009.124-2003亮氨酸-0.00GB/T5009.124-2003酪氨酸-0.00GB/T5009.124-2003苯丙氨酸-0.00GB/T5009.124-2003赖氨酸-0.00GB/T5009.124-2003组氨酸-0.00GB/T5009.124-2003精氨酸-0.00GB/T5009.124-2003脯氨酸-0.00GB/T5009.124-2003氨基酸总量-65.75GB/T5009.124-2003

通过酸水解HPLC测定γ-PGA的组成,可见,此聚合物的水解产物只含有一种氨基酸,与标准谷氨酸的出峰时间相同,推断此水解物为谷氨酸。同时对照硅胶薄层层析图4,水解物只显示一个斑点,也说明此水解物只有一种氨基酸组成,并且其迁移率与标准L-谷氨酸相同,另外结合氨基酸分析仪测定结果,更进一步证明该聚合物是由谷氨酸一种氨基酸组成,可以认为是谷氨酸的同聚物。
(2)γ-PGA精制品分子量的测定
精密称取经真空冷冻干燥后的γ-PGA固体样品1.0mg,加水溶解制成0.1mg/mL的溶液,经0.45μm的微滤膜处理,转移至Angilent HPLC专用实样瓶中,进样20μL,以pH为7的磷酸缓冲溶液为流动相,流速为1.0mL/min。其结果是表2所示的GPC法测定γ-PGA的分子量。
表2 GPC法测分子量的结果

样品的比折光指数增量dn/dc=0.180>0.05,完全可以用GPC法确定样品的分子量;γ-PGA的洗出时间为13.075-23.830min;γ-PGA的Mw为1095kDa,Mz为1206kDa,Mp为740kDa,Mn为1033kDa;γ-PGA的分子量分散指数Mw/Mn为1.060,Mz/Mw为1.01,都说明该样品的聚合度很高,分子量分布较窄,高聚物的“纯度”较高。综上所述,γ-PGA的分子量很大,且聚合度很好。
(3)标准γ-PGA与精制γ-PGA红外扫描光谱分析
取样品0.2mg,在60℃下真空干燥,与少量KBr研磨压片制样,然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱,扫描范围4000~400cm-1。聚酰胺由于具有一系列特征吸收、可由红外光谱鉴定,其结果是图5标准γ-PGA红外扫描光谱。图6是精制γ-PGA红外扫描光谱,通过红外扫描图谱解析,结合标准谱图对照可知该聚合物为γ-PGA聚酰胺类化合物无疑。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员,在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变换或等效替换均落入本发明的保护范围内。

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1、10申请公布号CN104163916A43申请公布日20141126CN104163916A21申请号201410357519522申请日20140720C08G69/1020060171申请人黑龙江康普生物科技有限公司地址150020黑龙江省哈尔滨市利民开发区沈阳大街与长沙路交口申请人哈尔滨商业大学72发明人梁金钟段旭煌王风青54发明名称一种从发酵液中提取纯化高分子聚谷氨酸的方法57摘要本发明公开了一种从发酵液中提取纯化高分子聚谷氨酸的方法,属于化学技术领域,步骤1发酵液中菌体的去除;步骤2活性炭脱色;步骤3发酵液中阴阳离子的去除顺序;步骤4发酵液浓缩;步骤5干燥。本发明建立了一套经济可行的。

2、预处理工艺,可有效实现PGA高黏发酵液的菌液分离、色素等杂质的去除,并进行超滤冻干,最终精制得到高纯度的PGA成品,为PGA的最终商品化提供了可行的工艺路线。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图3页10申请公布号CN104163916ACN104163916A1/1页21一种从发酵液中提取纯化高分子聚谷氨酸的方法,其特征在于,包括以下步骤步骤1发酵液中菌体的去除1发酵液预处理发酵结束后,将发酵液在40100条件下处理1060MIN,用蒸馏水稀释110倍;2硅藻土过滤除菌体将滤纸浸湿后,铺于抽滤漏斗的底部,使滤。

3、纸与漏斗底部紧紧相贴;将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内,待硅藻土沉淀后,开启真空泵进行真空抽滤,抽滤压力为01MPA;硅藻土形成125CM厚涂层且其表面水抽尽后,倒入预处理后的发酵液,虑液有黏性后收集,在不换硅藻土滤层的情况下,连续过滤4次,1G硅藻土可以去除34ML原发酵液中的菌体;步骤2活性炭脱色1发酵液中有色杂质吸光度的确定对用活性炭处理前后的PGA发酵液及购买的标准PGA分别在波长200NM500NM下进行紫外光谱全波长扫描,确定PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长,作为脱色处理的评价指标,结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱;经紫外扫描后,PGA发酵液中有色杂质的最大吸收。

4、波长为260NM;2发酵液中有色杂质的去除硅藻土除菌体后的发酵液,添加颗粒状活性炭0120质量体积比,以20100RPM的速度搅拌560MIN;步骤3发酵液中阴阳离子的去除顺序脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂,后过阴离子交换树脂;步骤4发酵液浓缩用01M06M孔径的中空纤维膜进行浓缩,浓缩液稀释至浓缩前液体体积的052倍,再进行浓缩,此浓缩稀释浓缩的过程重复14次,发酵液中的小分子物质,如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0;步骤5干燥将浓缩后的PGA发酵液分装于样品盘中,置于80冰箱内预冻6H后,在60下真空冷冻干燥,获得纯品PGA。权利要求书CN104163916A1/7页3一种从发酵液中提取纯。

5、化高分子聚谷氨酸的方法技术领域0001本发明属于化学技术领域,具体为一种从发酵液中提取纯化高分子聚谷氨酸的方法。背景技术0002PGA是自然界中微生物发酵产生的阴离子型多聚氨基酸,由D型谷氨酸和L型谷氨酸通过氨基和羧基形成的高分子聚合物。在每一个重复单元的碳原子,还有一个游离的羧基,因此PGA的分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基,可在分子内部或分子之间形成氢键。PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成,相对分子质量一般在1001000KDA,没有典型的肽链结构,也不是一种环状多肽,基本骨架呈直链纤维状。00030004PGA分子中有大量游离的亲水性羧基,它具有很多优良特性1可在分子内部。

6、或分子之间形成氢键,水溶性好;2对金属离子的吸附性强;3优良的生物降解性。主链上存在大量肽键,也带来很多优良特性1在体内环境下受酶的生物作用,会降解生成无毒的短肽、小分子或氨基酸单体。在医药行业上开发出的手术线和手术粘合剂就是利用这点性质。2在自然环境中,会受到某些微生物的作用而降解,可食无毒。利用这点可生产可降解的塑料。其他性质良好的生物相容性;无自身抗原性;抗冻特性;絮凝特性;高分子量,平均分子量为1001000KDA,化学合成一般达不到这么高的分子量,且合成成本要很高。在生理功能方面可防止细胞脱水、保护细胞免受蛋白酶的降解等;PGA在放射线照射下会增加分子间的结合,提高吸水性能,由此可开。

7、发出一种强吸水性很强的生物树脂。这种树脂有良好的粘弹性,并在一定范围内具有耐酸、碱、盐,耐高渗透压,抗冻融等优良特性。PGA强酸高温彻底酸水解后测得PGA中D谷氨酸和L谷氨酸的比值稳定在DL6040。PGA水溶液的流变性能溶液是非牛顿剪切变稀的假塑性流体,其粘度随温度的升高而呈现下降。这些优良的理化性质决定这种材料在多行业有着广泛的发展前景。0005PGA的应用领域PGA由前所提及的优良的理化性质可广泛用做环保领域如生物絮凝剂、重金属吸附剂,食品工业如增稠剂,农业领域如保湿剂,医药工业如药物载体、医用生物粘合剂等等,一般认为它对人类和环境无毒害,甚至可食用。PGA及其衍生物潜在应用价值极大可发。

8、展出许多特殊用途是一种有极大开发价值和应用前景的多功能新型生物制品。说明书CN104163916A2/7页400061PGA在食品工业上的应用PGA在食品中可用于新型的食品添加剂、抗冻剂、矿质吸收促进剂、除涩剂、稳定剂等。0007PGA作为新型的食品添加剂PGA分子上含有大量亲水基团,因而具有良好的吸水保湿性能可应用于淀粉类食品。日本将它用于淀粉类食品糕点、面条中,可防止老化、增强质地、维持食品外形和延长货架期;PGA可以增加面包、蛋糕的弹性,使面包、蛋糕的颗粒更加细致,PGA还可以增强面条的韧性,防止面条中的固体物质溶解在沸水中。0008PGA作为抗冻剂频繁冷冻和融化生物细胞、生物活性物质和。

9、食品等会加速其退化和腐败,而加入PGA可以避免这种状况。PGA具有好的抗冻性能,PGA的抗冻性和可食用性使PGA可被广泛的应用于食品加工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷藏冻藏,而且PGA比通常的低分子量防冻剂如糖类无机盐和蛋白质等味淡,食品中即使加入了大量的PGA对口感影响也不大。0009PGA作为矿质吸收促进剂PGA还可以作为矿质吸收促进剂,在含高矿物质的食品中加入了PGA或其降解产物可以促进小肠对矿物质的吸收。与酪蛋白磷酸肽相比,PGA具有优良的水溶性,效果更佳。而且PGA可以掩盖高浓度矿质元素所带来的刺激性、收敛性和粗糙感等适口性问题,尤其适用于补钙和补铁的保健品。0010PGA作为。

10、除涩剂PGA可作为各种食品的苦味掩盖剂和除涩剂,研究发现,PGA可以消除或减少诸如氨基酸、多肽、奎宁、咖啡因、矿物质引起的酸味,是高钠调味剂的替代品,可为糖尿病患者和高血压患者所用,作为健康饮食的一个组分。0011PGA作为稳定剂可用作冰淇淋的稳定剂;果汁饮料的增稠剂等。00122PGA在农业领域的应用PGA与其他单体经过聚合能够得到一种高倍吸水性树脂SUPERABSORBENTPOLYMER,SAP,吸水能力急剧增强目前报道的最高可达5300倍。这种高吸水性树脂无毒、无味、无色透明,具有高吸水性和保水性。将这种高吸水性树脂应用在荒山、秃岭、沙漠治理等方面可发挥积极作用,我国科研人员采用PGA。

11、吸水树脂种子做发芽实验取得了良好的效果。另外,在肥料、杀虫剂、除草剂、驱虫剂等使用时,加入适量的PGA盐可以延长这些药物在作用对象表面上的停留时间,不易因干燥、下雨而被冲刷掉。00133PGA在环保领域的应用0014PGA用于生物修复全世界工业的高速发展的同时,也带来了对环境的严重污染,目前被污染的土壤、水和空气的净化修复是我们迫切解决的难题。利用PGA与这些污染物之间的黏附浓缩作用机制可对被污染的环境进行修复。如利用PGA吸水与土壤结合,能提高土壤吸湿能力、通风性、保肥性能,在大规模改造荒山、沙漠方面能发挥积极作用。PGA能吸收农药和化肥,防止流失并缓慢释放,改善作物栽培条件、提高肥料的利用。

12、率。0015PGA作为生物絮凝剂治理水污染生产上已经开发了的用于废水处理、工业下游处理的许多絮凝剂如铝盐、聚丙烯酸、活性炭材料,这些材料既经济又有效,应用最为广泛,但是大多数不能被生物降解,长期使用也会对环境造成二次污染。利用PGA的电负性和粘结性对水中的污染物进行处理不仅可以应用于废水处理、饮用水的纯化及深海水的加工,而且也可以用于食品和发酵工业的下游工程操作。此外还可以作为重金属和放射性说明书CN104163916A3/7页5核物质的吸附剂。00164PGA在工业领域的应用利用PGA聚合成高分子材料此类聚合物性质类似于塑料,可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等,具有适合的强度、透明度和较好。

13、弹性。PGA用苯乙烯改性后,可得到高抗碱性的纤维树脂。若通过改性再聚合,可得到比一般天然纤维和化学纤维更优的材料。利用PGA合成的材料相对于现有的材料优点在于可降解,无毒,对环境没有危害是一种绿色的高分子塑料。00175PGA在医药领域的应用PGA聚合的高分子材料可用于药品的包装膜,可降解手术线等。近年来国外还有人研究得出PGA还能够增强前列腺素EI的作用。还建立了用谷氨酞聚合物作为基因治疗的载体。由交联胶原蛋白和PGA制备的一种新型生物粘合剂表现出比外科手术粘合剂及纤维胶更高的软组织粘合和止血作用,并且能够在体内降解而不会引起任何炎症反应。0018目前,微生物发酵法合成PGA的分离纯化主要存。

14、在2个难题1是发酵液黏度高,菌液分离困难;2是发酵液成分复杂,提取纯化成本高。目前适合高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝法成本过高,且除杂不彻底;由于PGA分子大小与菌体较为接近,微孔滤膜法不能有效实现PGA与菌体的分离;对于高浓度的PGA发酵液,酸化处理后虽黏度大大降低,但高速离心的方法仍难以实现彻底的菌液分离和杂蛋白的去除,且难以应用于工业化生产。如何实现PGA高黏发酵液中的菌液分离是PGA提取纯化工艺的关键之一。PGA的提取纯化通常采用有机溶剂沉淀法、铜盐沉淀法和膜分离沉淀法,膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能,已被应用于PGA的分离纯化。DO等采用。

15、发酵液酸化、离心、过膜微滤、超滤浓缩、醇析、真空干燥的工艺进行了PGA的提取与纯化,与传统的有机溶剂沉淀复溶透析的方法相比,节省了乙醇用量,降低了成本。但由于该工艺采用离心步骤,使得处理发酵液的能力有限,且得到的成品品质不够高。目前用于高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝法成本过高,且除杂不彻底;由于PGA分子大小与菌体较为接近,微孔滤膜法不能有效实现PGA与菌体的分离;对于高浓度的PGA发酵液,酸化处理后虽黏度大大降低,但高速离心法消耗动力大,成本高,不适于工业化生产。发明内容0019为了解决现有技术中存在的问题,本发明提供一种从发酵液中提取纯化高分子聚谷氨酸的方法,。

16、建立了一套经济可行的预处理工艺,可有效实现PGA高黏发酵液的菌液分离、色素等杂质的去除,并进行超滤冻干,最终精制得到高纯度的PGA成品,为PGA的最终商品化提供了可行的工艺路线。其技术方案为0020一种从发酵液中提取纯化高分子聚谷氨酸的方法,包括以下步骤0021步骤1发酵液中菌体的去除00221发酵液预处理0023发酵结束后,将发酵液在40100条件下处理1060MIN,用蒸馏水稀释110倍;00242硅藻土过滤除菌体0025将滤纸浸湿后,铺于抽滤漏斗的底部,使滤纸与漏斗底部紧紧相贴;将硅藻土与水说明书CN104163916A4/7页6的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内,待硅藻土沉淀后,开启真空。

17、泵进行真空抽滤,抽滤压力为01MPA;硅藻土形成125CM厚涂层且其表面水抽尽后,倒入预处理后的发酵液,虑液有黏性后收集,在不换硅藻土滤层的情况下,连续过滤4次,1G硅藻土可以去除34ML原发酵液中的菌体;0026步骤2活性炭脱色00271发酵液中有色杂质吸光度的确定0028对用活性炭处理前后的PGA发酵液及购买的标准PGA分别在波长200NM500NM下进行紫外光谱全波长扫描,确定PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长,作为脱色处理的评价指标,结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱;经紫外扫描后,PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260NM;00292发酵液中有色杂质的去除0030硅藻土除菌。

18、体后的发酵液,添加颗粒状活性炭0120质量体积比,以20100RPM的速度搅拌560MIN;0031步骤3发酵液中阴阳离子的去除顺序0032脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂,后过阴离子交换树脂;0033步骤4发酵液浓缩0034用01M06M孔径的中空纤维膜进行浓缩,浓缩液稀释至浓缩前液体体积的052倍,再进行浓缩,此浓缩稀释浓缩的过程重复14次,发酵液中的小分子物质,如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0;0035步骤5干燥0036将浓缩后的PGA发酵液分装于样品盘中,置于80冰箱内预冻6H后,在60下真空冷冻干燥,获得纯品PGA。0037与现有技术相比,本发明的有益效果为00381传统去除高粘度P。

19、GA发酵液中菌体的高速离心法,动力消耗大,菌体去除率低;酸处理虽可有效降低发酵液粘度,以利于PGA纯化工艺,但对其质量造成一定损害。本发明采用适当的热处理,联合硅藻土过滤,有效的分离了菌体,而且由于硅藻体本身的特性,还除去了部分其它杂质。00392本发明确定了微生物发酵合成PGA发酵液中有色物质的最大吸收波长,有助于工业化生产过程中产品质量的控制。00403本发明确定了活性炭脱除发酵液色素的工艺条件。00414微生物发酵合成PGA发酵液中含有培养基残余的阴阳离子,本发明确定了阴阳离子的去除顺序。00425浓缩可有效的降低工业化生产中干燥成本,本发明确定了发酵液浓缩的工艺参数。附图说明0043图。

20、1是活性炭脱色处理液紫外扫描图谱,样品从上到下依次为未经活性炭处理的PGA、经活性炭处理的PGA、购买的标样;0044图2是精制品PGA;说明书CN104163916A5/7页70045图3是PGA酸水解液HPLC分析PGA的组成;0046图4是PGA酸水解液薄层层析分析PGA的组成;0047图5是标准PGA红外扫描光谱;0048图6是微生物发酵产PGA红外扫描光谱。具体实施方式0049下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。0050本发明的目的在于提供一个微生物发酵法合成PGA的发酵液预处理,PGA分离纯化精制的方法。详细技术方案如下00511发酵液中菌体的去除00521发酵液预。

21、处理0053发酵结束后,将发酵液在40100条件下处理1060MIN,用蒸馏水稀释110倍。00542硅藻土过滤除菌体0055将滤纸浸湿后,铺于抽滤漏斗的底部,使滤纸与漏斗底部紧紧相贴;将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内,待硅藻土沉淀后,开启真空泵进行真空抽滤,抽滤压力为01MPA。硅藻土形成125CM厚涂层且其表面水抽尽后,倒入预处理后的发酵液,虑液有黏性后收集,在不换硅藻土滤层的情况下,连续过滤4次,1G硅藻土可以去除34ML原发酵液中的菌体。00562活性炭脱色00571发酵液中有色杂质吸光度的确定0058对用活性炭处理前后的PGA发酵液及购买的标准PGA分别在波长200NM5。

22、00NM下进行紫外光谱全波长扫描,确定PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长,作为脱色处理的评价指标,结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱。经紫外扫描后,PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260NM。00592发酵液中有色杂质的去除0060硅藻土除菌体后的发酵液,添加颗粒状活性炭0120质量体积比,以20100RPM的速度搅拌560MIN。00613发酵液中阴阳离子的去除顺序0062脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂,后过阴离子交换树脂。00634发酵液浓缩0064用01M06M孔径的中空纤维膜进行浓缩,浓缩液稀释至浓缩前液体体积的052倍,再进行浓缩,此浓缩稀释浓缩的过程重复14次,发酵液中。

23、的小分子物质,如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0。00655干燥0066将浓缩后的PGA发酵液分装于样品盘中,置于80冰箱内预冻6H后,在60下真空冷冻干燥,获得纯品PGA,见图2。00676PGA精制品的鉴定00681PGA精制品组成分析说明书CN104163916A6/7页80069取样品05G放入水解管中,加入10ML6MOL/LHCL,抽真空,110水解24H,冷却后移至100ML容量瓶中,定容,经045M微孔滤膜过滤后取滤液用高压液相色谱测定谷氨酸和薄板层析分析氨基酸组成,其结果是图3所示酸水解HPLC测定PGA的组成。0070用硅胶G制备薄层层析用硅胶板,110活化5MIN后,在硅胶。

24、板上点样,选用正丁醇乙酸水311展开剂溶液,上行法展开后,以025茚三铜显色,于干燥箱中加热60烘干15MIN。其结果是图4所示的图硅胶薄层层析测定PGA的组成。0071委托农业部谷物及制品质量监督检验测试中心哈尔滨做PGA水解液的氨基酸分析,采用水解后利用氨基酸分析仪直接测定的方法,检测报告的数据如表1所示,所示的氨基酸分析仪分析PGA水解液的氨基酸组成。0072表1氨基酸分析仪测定PGA酸水解液的氨基酸组成0073检验项目单位标准要求检验结果检验方法天门冬氨酸000GB/T50091242003苏氨酸000GB/T50091242003丝氨酸000GB/T50091242003谷氨酸657。

25、5GB/T50091242003甘氨酸000GB/T50091242003丙氨酸000GB/T50091242003胱氨酸000GB/T50091242003缬氨酸000GB/T50091242003蛋氨酸000GB/T50091242003异亮氨酸000GB/T50091242003亮氨酸000GB/T50091242003酪氨酸000GB/T50091242003苯丙氨酸000GB/T50091242003赖氨酸000GB/T50091242003组氨酸000GB/T50091242003精氨酸000GB/T50091242003说明书CN104163916A7/7页9脯氨酸000GB/T。

26、50091242003氨基酸总量6575GB/T500912420030074通过酸水解HPLC测定PGA的组成,可见,此聚合物的水解产物只含有一种氨基酸,与标准谷氨酸的出峰时间相同,推断此水解物为谷氨酸。同时对照硅胶薄层层析图4,水解物只显示一个斑点,也说明此水解物只有一种氨基酸组成,并且其迁移率与标准L谷氨酸相同,另外结合氨基酸分析仪测定结果,更进一步证明该聚合物是由谷氨酸一种氨基酸组成,可以认为是谷氨酸的同聚物。00752PGA精制品分子量的测定0076精密称取经真空冷冻干燥后的PGA固体样品10MG,加水溶解制成01MG/ML的溶液,经045M的微滤膜处理,转移至ANGILENTHPL。

27、C专用实样瓶中,进样20L,以PH为7的磷酸缓冲溶液为流动相,流速为10ML/MIN。其结果是表2所示的GPC法测定PGA的分子量。0077表2GPC法测分子量的结果00780079样品的比折光指数增量DN/DC0180005,完全可以用GPC法确定样品的分子量;PGA的洗出时间为1307523830MIN;PGA的MW为1095KDA,MZ为1206KDA,MP为740KDA,MN为1033KDA;PGA的分子量分散指数MW/MN为1060,MZ/MW为101,都说明该样品的聚合度很高,分子量分布较窄,高聚物的“纯度”较高。综上所述,PGA的分子量很大,且聚合度很好。00803标准PGA与精。

28、制PGA红外扫描光谱分析0081取样品02MG,在60下真空干燥,与少量KBR研磨压片制样,然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱,扫描范围4000400CM1。聚酰胺由于具有一系列特征吸收、可由红外光谱鉴定,其结果是图5标准PGA红外扫描光谱。图6是精制PGA红外扫描光谱,通过红外扫描图谱解析,结合标准谱图对照可知该聚合物为PGA聚酰胺类化合物无疑。0082以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员,在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变换或等效替换均落入本发明的保护范围内。说明书CN104163916A1/3页10图1图2说明书附图CN104163916A102/3页11图3图4说明书附图CN104163916A113/3页12图5图6说明书附图CN104163916A12。

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