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羰基清除剂，其已知具有与活性羰基种反应的能力，已经暗示其能够作为加速或诱导异常细胞死亡、而对正常细胞没有平行作用的药剂。同样，当期望加速或诱导细胞死亡时，比如在正常凋亡途径已被破坏并发生过度增殖性细胞增长的细胞中，它们是有用的治疗剂。

1.  在异常细胞中诱导或加速细胞死亡的方法，包括向所述异常细胞施用足以诱导或加速所述异常细胞死亡的量的羰基清除剂。

2.  权利要求1的方法，其中所述羰基清除剂是二羰基清除剂。

3.  权利要求1的方法，其中所述异常细胞是皮肤细胞。

4.  权利要求1的方法，其中所述异常细胞是癌细胞，或癌前细胞。

5.  权利要求4的方法，其中所述癌细胞是鳞状癌细胞、上皮癌细胞、黑素瘤细胞或腺癌细胞。

6.  权利要求1的方法，包括局部施用所述羰基清除剂。

7.  权利要求4的方法，其中所述癌前细胞是角质形成细胞。

8.  权利要求1的方法，进一步包括向人施用所述羰基清除剂。

用羰基清除剂诱导细胞死亡的方法
关联申请
本申请是2004年3月2日提交的S.N.60/549,805的部分连续申请，这个申请的全部内容在这里引作参考。
技术领域
本发明涉及通过应用羰基清除剂比如二羰基清除剂诱导细胞死亡的方法。
背景技术
逐渐增加的皮肤病发病率，包括非黑素瘤疾病，以及黑素瘤皮肤癌，已经有很多的文献记载，同时对恶化前和恶性阶段的皮肤癌一直都缺乏有效的治疗方法。
Diegpen，et al.，Br.J.Dermatology146：1-6(2002)已经记载非黑素瘤皮肤癌，或者称作“NMSC”，是影响高加索人种最常见的癌症类型。接近80％的NMSC是基底细胞癌，20％是鳞状细胞癌。已知的光化性角化病的状态是一种癌前状态，其可以发展成鳞状细胞癌。发展成侵袭性、鳞状细胞癌的速率的估计范围高达每年20％。见May，J.，Am.Acad.Dermatol.42：8-10(2000)。
尽管在美国黑素瘤只占所有皮肤癌疾病的约5％，但是它占皮肤癌死亡的约80％。早期诊断经外科切除导致很高的治愈率；然而，恶性黑素瘤有非常高的扩散和转移的趋势。黑素瘤细胞对化疗、所有形式的治疗性诱导细胞凋亡以及任何形式的治疗有很高的抗性。
最近已经观察到细胞羰基胁迫涉及增殖性信号传递和人肿瘤细胞转移，细胞羰基胁迫由内源性、活性羰基种，或称作“RCS”介导，特别是二羰基化合物，包括乙二醛、甲基乙二醛和丙二醛，它们在糖酵解和脂质过氧化期间形成。见，例如，Taguchi，et al.，Nature405(6784)：354-60(2000)。
RCS-来源的蛋白质表位，称作“高级糖基化终产物”，或“AGE”，其通过RCS和组织蛋白间的反应形成，其在黑素瘤中大量发现，并且AGE是非常有效的RAGE配体，其是参与黑素瘤增殖和转移的膜受体。见，例如，Abe et al.，J.Invest.Dermatol.122(2)，461-467(2004)。
越来越多的证据支持这种观点，即根本上源于肿瘤细胞糖酵解增加和线粒体脂质过氧化的RCS是小分子的抗细胞凋亡调节因子，其通过共价修饰来抑制线粒体通透性转变孔的开放。见，例如，Speer，et al.，J.Biol.Chem.278(37)，34757-63。
Wondrak et al.，Biochem.Pharmacol.7105：1-13(2002)，已经鉴定一系列非常有效的、无毒性羰基清除剂，它们可用于治疗性干预细胞的羰基胁迫。这篇参考文献经引用并入本文，以及公告日为4/6/2004的美国专利No.6,716,635和公告日为7/9/2002的美国专利No.6,417,235。‘635专利特别给出了RCS和RAGE化合物、作用机制，它们如何形成等的详细说明。
现在已经发现这些羰基清除剂对黑素瘤和其它癌细胞具有显著的诱导凋亡作用，但是对正常细胞没有这种作用。这是本发明的特征，正如在随后的实例中所指出的。
附图说明
图1描述使用D-青霉胺对恶性黑素瘤细胞系、鼠(B16)和人(G-361、A-375、LOX)细胞系诱导凋亡的比较。在本图中，“C”表示对照，“P”表示用D-青霉胺处理。
图2总结对恶化前、永生化人角质形成细胞暴露于D-青霉胺之后的试验结果。
图3显示在恶性、人鳞状细胞癌细胞系A431，暴露于D-青霉胺、以及D-青霉胺甲酯之后，细胞凋亡的诱导。
图4显示对上皮细胞癌细胞系使用D-青霉胺，N-乙酰-D-青霉胺和氨基胍的结果总结。
图5比较在人黑素瘤细胞系A375和正常的成纤维细胞系CF3中诱导的细胞凋亡。所用的化合物是D-青霉胺的亲脂衍生物、3-巯基亮氨酸。
图6显示对羰基清除剂活性存在结构要求，其中测试了D-青霉胺、氨基胍、N-乙酰-D-青霉胺和青霉胺二硫化物。
图7显示根据本发明的化合物在正常和恶性细胞的混合物中选择性消除恶性黑素瘤细胞的功效。
图8显示凋亡机制涉及线粒体跨膜电位的去极化。
具体实施方式
实施例1
本实施例描述的试验显示3-巯基-D-缬氨酸(“D-青霉胺”)诱导恶性细胞系的凋亡。
使用鼠黑素瘤细胞系B16，以及三种人黑素瘤细胞系，即，G-361、A-375和LOX。细胞样品持续24小时暴露于10mM D-青霉胺。使用标准测试测量细胞凋亡，即，使用膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶(PI)染色的流式细胞术。作为对照，使用正常的人皮肤成纤维细胞，即，“CF3”细胞。
图1的结果显示对照(没有化合物)和处理(有化合物)，分别在顶部和底部。从这些附图中可以明确在恶性细胞中诱导了细胞凋亡，然而在正常CF3细胞中没有变化。
在没有显示于附图的试验中，3-巯基异亮氨酸产生了相似结果。
实施例2
在这些试验中，加入浓度为12.5mM的D-青霉胺到恶化前、永生化人角质形成细胞，或“HaCaT”细胞中，持续暴露24小时。
在图2中，对照(没有化合物)列在左边，测试化合物D-青霉胺的效果显示在右边。细胞凋亡也被指出。
实施例3
这组试验使用D-青霉胺和它的更亲脂的衍生物，D-青霉胺甲酯。
为了制备这种衍生物，搅拌保存在-10℃的75ml MeOH中的18ml SOCl₂，加入不同量的D-青霉胺(15g，100.5mmol)。混合物达到室温时继续搅拌。混合物回流60小时，然后蒸发溶剂，留下粗产物(15.2g，93.3mmol)，将其溶解于甲醇中，然后加入乙醚进行结晶。收集结晶产物，在真空中干燥，得到7.6g纯产物。它的结构通过¹H-NMR和质谱分析确定。C₆H₁₄O₂NS的计算m/z是164.1[M+H]⁺，观察值是164.1。
在各种情况下，对人A431细胞使用10mM测试化合物持续24小时，并如前述测量细胞凋亡。
在图3中，“D-P”表示D-青霉胺，“D-P-OCH₃”是其甲酯。应用该酯观察到更强的细胞凋亡作用。
实施例4
测定化合物对其他癌症，特别是上皮癌，的功效。使用人HeLa宫颈腺癌细胞，并用10mM D-青霉胺和25mM氨基胍进行测试。这些细胞用N-乙酰-D-青霉胺测试，其不具有羰基清除剂的功能。
图4表示对照(“C”)、D-青霉胺(“D-P”)、N-乙酰-D-青霉胺(“NAP”)和氨基胍(“AG”)的这些试验的结果。已知作为羰基清除剂的D-青霉胺和氨基胍是凋亡诱导剂，而NAP不是。
实施例5
与之前测试的那些比较，3-甲基-3-乙基-L-半胱氨酸(3-巯基异亮氨酸，或称作“MEC”)是一种更加亲脂的羰基清除剂。因为可以期望在局部给药系统中增加亲脂性，测试这个化合物是有意义的。
MEC被合成至95％纯度，根据Leach，B.E.et al.“Synthesis of D，L-penicillaminefrom N-acetyl-D，L-penicillamine”in Clarke，H.T.ed.，The Chemistry of Penicillin，(Princeton University Press，1949)，Pg.466，并且通过¹H-NMR确认其结构。
用10mM MEC暴露24小时测试恶性人黑素瘤细胞A375和正常成纤维细胞(CF3)。
在恶性细胞中观察到明显的诱导凋亡，但是在正常细胞中却没有观察到，正如在图5中所见的。
实施例6
这些试验被设计用来确定是否有结构/功能的关系。换句话说，希望确定是否作为羰基清除剂而不是作为抗氧化剂的活性对抗癌活性是重要的。
化合物D-青霉胺(D-P)、氨基胍(AG)、N-乙酰-D-青霉胺(NAP)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)和青霉胺二硫化物(PSS)被测试。D-P、NAC和NAP已知是抗氧化剂。D-P和氨基胍已知是羰基清除剂。
在对人黑素瘤细胞系G-361的测试中，只有D-P和AG诱导细胞凋亡。这些结果提示对于伯氨基和硫醇基取代基有结构要求，并且抗氧化活性与致凋亡性并不相关。图6总结了这些结果。
实施例7
这些试验显示了羰基清除剂在治疗癌症方面的潜力。
制备皮肤黑素瘤重构体，其中CF3成纤维细胞和A375黑素瘤细胞植入胶原蛋白基质中。在“种植”入基质中后72小时，黑素瘤细胞已经广泛增殖，如图7中作为对照所示。然而，用12.5mM D-P处理消除了黑素瘤细胞并维持了成纤维细胞胶原蛋白网络的结构完整性。
实施例8
些试验显示羰基清除剂处理诱导的优先凋亡的发生伴随有线粒体跨膜电位“Δψm”的去极化。根据Reers，et al.，Biochemistry30(18)：4480-6(1991)，使用电势测定染料JC-1。向培养基加入10mM D-青霉胺后24小时，给予染料。RCS预处理包括使用5mM苯甲酰甲醛15分钟，然后用PBS清洗并加入新鲜培养基。
图8非常清楚的显示，当细胞用羰基清除剂处理时，线粒体跨膜电位丧失；当细胞用苯甲酰甲醛进行预处理后再用羰基清除剂处理时，线粒体跨膜电位保持。
前述公开的内容列出了本发明的特征，其是通过向对象施用羰基清除剂来诱导细胞死亡的方法，其中所施用羰基清除剂的量和施用方式足以诱导细胞死亡。
在实践中，向期望增强细胞死亡的对象施用羰基清除剂。非癌、癌前和癌性过度增殖性细胞障碍包括在本发明的范围内，如观察到不适当的和/或异常的细胞增加的状况，例如炎性过度增殖状态、良性前列腺增生、巴瑞特氏食管(Barrett’s esophagus)、病毒诱导的脚底疣和生殖道疣、光化性角化病、非黑素瘤和黑素瘤皮肤癌。以上所列证据显示清除剂仅对异常细胞发挥细胞死亡诱导剂功能。因此，在引起正常细胞的过早或不适当死亡方面没有问题。
所使用的羰基清除剂可以是任何前面讨论和举例的那些试剂。可以鉴定并使用其它羰基清除剂。前述美国专利No.6,716,635经引用并入本文，其教导如何鉴定这些化合物。
可以改变施用模式。局部应用，例如以洗液(lotion)、乳液(crème)、洗剂(wash)、滚搽(roll-on)、皂等方式，是一种优选的施用方式，还包括皮内、皮下、肌肉内、静脉内、口服、舌下等。递送方式将根据所治疗的病况而改变。
本发明的其他方面对本领域的技术人员是清楚的，并不需要在此重申。
已使用的术语和表述仅用于描述，而非限制，使用这些术语和表述并不意味着排除在此显示和说明的特征或其部分的任何等同物，应该认识到在本发明范围内可以进行多种修改。