能够沉默病毒抑制因子表达的可复制病毒.pdf

本发明涉及可复制病毒，其能够在靶细胞中复制且具有裂解能力，所述病毒在其基因组中，包含至少一个DNA序列编码沉默因子，以降低靶基因在所述靶细胞中的表达；可操作的，与一种或多种在所述靶细胞中发挥作用的表达控制序列连接，以及其在制备药剂中的应用和在用于裂解表达病毒抑制因子的靶细胞的方法中的应用。

1.  一种可复制病毒，能够在靶细胞中复制且具有裂解能力，所述病毒在其基因组中包括至少一个编码沉默因子的DNA序列，可以降低靶基因在所述靶细胞中的表达，可操作的连接至一种或多种在所述靶细胞中发挥作用的表达控制序列。

2.  根据权利要求1所述的可复制病毒，其中所述沉默因子含包括双链RNA。

3.  根据权利要求2所述的可复制病毒，其中所述双链的长度包括每条链至少19个核苷酸且少于30个核苷酸。

4.  根据前述权利要求中任何一项所述的可复制病毒，其中所述RNA分子包含发夹RNA。

5.  根据前述权利要求中任何一项所述的可复制病毒，其中所述病毒是人类腺病毒，优选血清型5。

6.  根据权利要求5所述的可复制病毒，其中所述病毒是条件复制腺病毒。

7.  根据权利要求6所述的可复制病毒，其中所述腺病毒在包括E1A的CR2结构域的至少一部分的E1A区携带突变，优选包含E1A的122～129氨基酸(LTCHEAGF)在内的缺失。

8.  根据前述权利要求中任何一项所述的可复制病毒，其中所述靶基因编码病毒抑制因子，优选腺病毒抑制因子。

9.  根据权利要求8所述的可复制病毒，其中所述病毒抑制因子是抗凋亡蛋白。

10.  根据权利要求9所述的可复制病毒，其中所述抗凋亡蛋白是p53拮抗剂或者p53通路抑制剂。

11.  根据前述权利要求中任何一项所述的可复制病毒，其中所述病毒基因组还包含至少一种在所述靶细胞内恢复p53依赖的凋亡通路中起作用的恢复因子的编码序列，可操作的连接至一种或多种在所述靶细胞中发挥作用的表达控制序列。

12.  根据权利要求10或11所述的可复制病毒，其中所述蛋白抑制因子选自由MDM2、Pirh2、COP1、Bruce、HPV-E6、疱疹病毒8 LANA、Parc、Mortalin、Plk-1、BI-1、p73DeltaN、bcl-2、bcl-x_L、bcl-w、bfl-1、brag-1、mcl-1、cIAP1、cIAP2、cIAP3、XIAP以及生存素组成的组。

13.  根据前述权利要求中任何一项所述的可复制病毒，其中所述靶细胞是人类细胞，优选由癌细胞、关节炎细胞或血管平滑肌细胞组成的组。

14.  根据前述权利要求中任何一项所述的可复制病毒在药物中的应用。

15.  根据权利要求14所述的应用，可制造用于抑制缺少控制的细胞生长尤其恶性细胞生长的药物。

16.  用于裂解表达病毒抑制因子的靶细胞的方法，包括下列步骤：
-用病毒感染所述靶细胞，所述病毒在所述靶细胞中具有裂解能力；
-在所述靶细胞中复制所述病毒，进一步包括在病毒基因组中提供至少一个编码沉默因子的DNA序列的步骤，用以降低所述病毒抑制因子在所述靶细胞中的表达，一旦所述靶细胞被所述病毒感染，所述至少一个DNA序列就能够在所述靶细胞中表达。

17.  根据权利要求16所述的方法，其中所述靶细胞被根据权利要求1～13中任何一项所述的可复制病毒感染。

18.  根据权利要求16或17所述的方法，进一步包括下述步骤，即令所述靶细胞遭受放射、有毒化合物、抑制蛋白-蛋白相互作用或抑制信号通路的分子、蛋白，包括但不限于抗体、促凋亡蛋白、抗血管生成蛋白以及膜融合蛋白，或者导入编码所述蛋白的基因，可操作的连接至一种或多种在所述靶细胞中起作用的表达控制序列。

19.  根据权利要求16～18所述的方法，其中所述靶细胞存在于动物体内，优选人体内。

20.  用于治疗患有涉及具有不恰当细胞生存的体细胞的疾病的病患体的方法，包括给予所述病患体有效量的根据权利要求1～13中任何一项所述的可复制病毒的步骤，其中所述病患体优选人体。

21.  根据权利要求20所述的方法，其中所述疾病选自由癌症、关节炎特别是风湿性关节炎或者血管平滑肌细胞过度增生组成的组。

22.  用于鉴定能使靶细胞中表达的病毒抑制因子表达降低的沉默因子的方法，包括下列步骤：
-形成两种类型所述靶细胞，其中所述第一种类型表达沉默因子而所述第二种类型不表达所述沉默因子；
-用在所述靶细胞中具有裂解能力的病毒感染所述两种类型靶细胞；
-在所述两种类型的靶细胞中复制所述病毒；
-比较所述病毒在所述两种类型靶细胞中的复制速率或者比较所述两种类型靶细胞的裂解速率，其中所述病毒的复制在所述第一种类型靶细胞中比在所述第二种类型靶细胞中快，或者所述第一种类型靶细胞的裂解比所述第二种类型靶细胞的裂解更快，均可确定所述沉默因子在所述靶细胞中能降低所述病毒抑制因子的表达。

23.  鉴定靶细胞中表达的病毒抑制因子的方法，包括下列步骤：
-实施根据权利要求22中所述方法的步骤，
-利用已鉴定的沉默因子来表征所述病毒抑制因子。

24.  根据权利要求22或23所述的方法，其中所述第一种类型靶细胞是一系列第一种类型靶细胞中的组成部分，此外其特征在于所述系列细胞的每个组成部分均表达不同的沉默因子。

25.  根据权利要求22～24中任何一项所述的方法，其中所述靶细胞是人类细胞，优选选自由癌细胞、关节炎细胞或者血管平滑肌细胞组成的组。

能够沉默病毒抑制因子表达的可复制病毒
技术领域
本发明涉及遗传修饰、生物化学和药学领域。特别的，本发明提供重组病毒特别是腺病毒，能够裂解其复制所在的细胞并在其复制所在的所述细胞中抑制一种或多种靶基因的表达。本发明还提供了重组病毒，能够沉默一些基因在一些细胞中的表达，从而使得病毒在所述细胞中更有效的复制并裂解所述细胞。因此，本发明提供清除一些细胞种群的更有效的途径。本发明还提供了鉴定靶基因的方法和装置，所述靶基因的沉默使得病毒更有效的复制并裂解其复制所在的细胞。本发明还提供了重组病毒，能够沉默所述已鉴定的靶基因在所述细胞中的表达，使得所述病毒在所述细胞中更有效的复制并裂解所述细胞。本发明在病毒载体生产、治疗性靶点的鉴定、基于抑制蛋白表达并从机体清除一些细胞(如癌细胞)的药物治疗等方面非常有用。
背景技术
重组病毒通过基因工程从病毒基因组产生。所述基因工程常常涉及到将异源DNA(包括但不限于编码治疗产品的DNA)插入腺病毒基因组。然而，应该理解术语“重组病毒”意思还包括一些病毒，该病毒基因组的部分被去除而并未插入异源DNA。重组病毒的另一个实例是嵌合病毒，含有不同病毒或不同类型的同种病毒的基因组部分，例如像不同血清型的病毒或者具有不同的宿主动物种属特异性的病毒。为了本发明的目的，对两种类型的重组病毒加以区别，即复制缺陷型病毒和可复制病毒，本发明仅涉及可复制病毒。
本文中，重组病毒以腺病毒例示说明；因此，术语“腺病毒”可以用本领域中已知的任何合适的病毒取代，只要该病毒能够感染并裂解靶细胞。其他合适病毒的非限定性的实例是单纯疱疹病毒和牛痘病毒。还应该理解本文中定义的其他含有“腺病毒”的术语例如像“腺病毒抑制因子”，术语“腺病毒”可以用本领域中已知的任何合适的病毒取代，只要该病毒能够感染并裂解靶细胞。
可复制腺病毒在本文中定义为该病毒(作为其基因组的一部分)包括在靶细胞中被复制的功能，其中复制仅依赖于病毒提供的复制功能，并与靶细胞的内源性细胞系统相结合。因此，靶细胞基因组不含任何编码病毒复制必需因子的外源性序列。这些因子由可复制病毒的基因组提供。
在这方面术语“外源性”指的是病毒复制必需的细胞系统(包括为此的编码序列)是天然存在的系统，例如并不是通过人为操作技术导入细胞内的。而后者则定义为“外源性”。术语“被复制的功能”包括病毒在靶细胞中复制必需的因子例如由病毒编码的蛋白(本文中也指病毒复制因子)。所述因子对所述病毒而言可能是内源性的，但也可能是由病毒基因组编码的功能性类似物，例如在某些情况下，所述编码内源性病毒因子的基因从病毒基因组被缺失。这些因子由病毒基因组编码而不是由靶细胞编码的外源性因子补充，注意到这一点很重要。因此，如果病毒复制依赖的一种或多种复制功能从所述病毒缺失，而是被导入靶细胞，则病毒定义为复制缺陷，因此不属于本发明的一部分。如所声明的，本发明涉及可复制病毒，即其中编码对调节靶细胞中病毒复制必需的病毒复制因子的所述病毒基因，存在于病毒基因组上。
在第一种类型的可复制腺病毒中，腺病毒基因组的部分没有被去除，或者被去除的腺病毒基因组所述部分不包括对腺病毒感染生活周期的至少一步必需的部分。因此这种类型的重组腺病毒也定义为真正的(genuine)可复制腺病毒，能够像亲代未修饰的腺病毒那样在细胞中复制。通常，腺病毒的复制限制在特定动物种属或动物种属的组的细胞。例如，从人类腺病毒衍生的重组腺病毒只能在人类细胞中跨越完整的生活周期，在一些其他种属的细胞中，高剂量时复制效率仍很低。
第二种类型的可复制腺病毒是所谓的条件复制腺病毒(CRAd)。CRAd中，腺病毒基因组的一个或多个部分被去除，包括在某些生理条件(本文中也称为“第一条件”)下对腺病毒感染生活周期的至少一步必需而在其他一些生理条件(本文中也称为“第二条件”)下则非必需的部分。所述第一和第二条件，例如，可用特定类型细胞中存在的生理条件(本文中也称为“第一细胞”)规定，而在另一种类型的细胞中不加以规定(本文中也称为“第二细胞”)。这种第一种类型细胞是，例如，从特定组织来源的细胞，其中所述细胞含有在来自其他组织的细胞中不存在或少得多的蛋白(第二种类型细胞)。第二种类型细胞的实例是丧失了准确细胞生长控制的细胞，例如像癌细胞，其中所述细胞或者缺乏在未丧失准确细胞生长控制的细胞中存在的蛋白，或者其中所述细胞表达了(或者过度表达)在未丧失准确细胞生长控制的细胞中不存在或少得多的蛋白。所述第二条件的另一个实例是存在于细胞周期特定阶段或者细胞特定发育阶段的条件，其中某种蛋白特异性表达。因此，CRAds可以设计成在特定细胞(例如癌细胞或特定类型癌细胞)中复制，而正常细胞中CRAds不能复制。这一点在本领域中为人熟知并综述例如可见Heise and Kirn，J.Clin.Invest.105(2000)：847-851；Alemany et al.，Nat.Biotech.18(2000)：723-727；Gomez-Navarro andCuriel，Lancet Oncol.1(2000)：148-158)。
第三种类型的可复制腺病毒，基因组中包含能在靶细胞中被复制的功能的部分被去除，但是所述功能通过在重组腺病毒基因组中插入一个或多个提供所述功能的功能性异源蛋白表达盒来补充。这种类型的重组腺病毒在本文中指的是异源性trans补充腺病毒，因此根据本文中给出的定义也认为是可复制病毒。
腺病毒复制过程由下列步骤组成：(1)感染宿主细胞，通过将腺病毒颗粒结合到细胞表面、内化、运输至细胞核并将腺病毒DNA基因组引入细胞核而实现，(2)表达由腺病毒基因组的早期区编码的腺病毒蛋白，(3)腺病毒基因组的复制，标志着从早期复制阶段转为晚期复制阶段，(4)表达由腺病毒基因组的晚期区编码的腺病毒蛋白，(5)装配子代腺病毒颗粒，并将子代腺病毒基因组包埋在这些颗粒中，以及(6)诱导细胞死亡，使得腺病毒子代从细胞中释放。在其细胞周期中，腺病毒调节细胞死亡通路。不同细胞系中，在腺病毒感染后，p53依赖的和p53非依赖性凋亡均有记载(Teodoroand Branton，J.Virol.71(1997)：1739-1746；以及本文中的参考文献)。在早期复制阶段中，细胞死亡被抑制以避免过早的细胞死亡，因此使得腺病毒能够完成其在细胞中的生活周期。与之对比的是，在感染的晚期阶段，则促进细胞死亡和裂解以从细胞释放病毒子代。
重组腺病毒的生产通常起始于通过本领域中为人熟知的标准分子生物学技术，对腺病毒基因组至少一部分进行的基因工程。接下来，一个或多个构建体(此时互相交迭)内含有的腺病毒基因组，通过本领域中熟知的DNA转移法，导入允许所述重组腺病毒复制的细胞。当重组腺病毒开始在重组腺病毒基因组导入的细胞内复制后，所述重组腺病毒即可传播到培养基中其他细胞。重组腺病毒也可以从培养基中或从存在重组腺病毒复制的细胞的裂解物中分离。然后被分离的重组腺病毒可用来再感染新的细胞，以进一步传播并扩展所述重组腺病毒。另外，所述重组腺病毒可以给予动物体或人体，以感染体内细胞。所述给予可以通过几种途径实现，包括但不限于直接注射入组织内、口服给予、注射入血液循环、吸入、注射入体腔以及用于某个身体区域的表面。在体内感染所述细胞后，重组腺病毒可以复制并传播至体内其他细胞，只要被感染细胞支持所述重组腺病毒的复制。
可复制腺病毒将在动物体多种不同细胞内复制，只要其是从具有恰当的种属趋向性的腺病毒衍生而来的，并且所述细胞表达所述腺病毒的表面受体。通过重组腺病毒(包括可复制腺病毒)的特异性细胞表面识别可以通过假模标本化或者靶向作用而改变(Krasnykh et al.，Mol.Ther.1(2000)：391-405；Havenga et al.，J.Virol.76(2002)：4612-4620；Van Beusechem et al.，Gene Ther.10(2003)：1982-1991)。CRAds仅在存在CRAd复制所必需的特定条件的细胞中复制。CRAds被设计成符合特异性的必需条件，在选定(第一)类型的细胞中能够复制，而在其他(第二)类型细胞中不能复制。这种特性使得CRAds在本发明的几个具体实施例中非常有用，根据本发明，其目的在于通过重组腺病毒在动物体或人体内的罹患细胞中特异裂解性复制治疗疾病，导致所述罹患细胞从所述机体中特异性去除。
发现可复制病毒特别是腺病毒，在癌症以及其他涉及到不恰当细胞生存的疾病的治疗中，越来越有用。特别的，CRAds已被开发用于选择性在癌细胞中复制并杀死癌细胞。这种癌特异性CRAds代表一种新型而且非常有前景的类型的抗癌剂(由Heise and Kirn，见上文，Alemany et al.，见上文；Gomez-Navarro and Curiel，见上文综述)。这种类型CRAds的肿瘤选择性复制通过两种可选择策略的其中之一而实现。在第一种策略中，必要的早期腺病毒基因的表达被肿瘤特异性启动子控制(例如，Rodriguez et al.，Cancer Res.57(1997)：2559-2563；Hallenbeck et al.，Hum.Gene Ther.10(1999)：1721-1733；Tsukuda et al.，Cancer Res.62(2002)：3438-3447；Huang etal.，Gene Ther.10(2003)：1241-1247；Cuevas et al.，Cancer Res.63(2003)：6877-6884)。第二种策略涉及到在病毒基因中导入突变以阻断编码的RNA或蛋白产物与细胞蛋白的相互作用，而该相互作用在正常细胞中完成病毒生活周期是必需的，而在肿瘤细胞中则非必需(例如Bischoff et al.，Science 274(1996)：373-376；Fueyo et al.，Oncogene 19(2000)：2-12；Heise et al.，Clin.Cancer Res.6(2000)：4908-4914；Shen et al.，J.Virol.75(2001)：4297-4307；Cascallo et al.，Cancer Res.63(2003)：5544-5550)。CRAds在肿瘤细胞内的复制过程中，通过诱导裂解而破坏癌细胞，该过程又被称为“癌细胞溶解”。病毒子代从裂解的癌细胞中释放，提供了一种原位扩增CRAds的可能性，并实现了在实体瘤中侧向传播至邻近细胞，从而扩大了癌细胞溶解效应。CRAd复制限制于癌细胞或过度增生细胞，表明了该试剂的安全性，通过防止正常组织细胞的裂解而实现。目前，基于CRAd的癌症治疗已经在临床试验中进行评估(例如，Nemunaitiset al.，Cancer Res.60(2000)：6359-6366；Khuri et al.，Nature Med.6(2000)：879-885；Habib et al.，Hum.Gene Ther.12(2001)：219-226)。
然而，尽管从体外实验和动物实验中得到了非常令人鼓舞的结果，但是CRAds作为单一制剂在人类的抗癌功效比较受限制(Kimet al.，Nature Med.4(1998)：1341-1342；Ganly et al.，Clin.Cancer Res.6(2000)：798-806；Nemunaitis et al.，Cancer Res.60(2000)：6359-6366；Mulvihill et al.，Gene Therapy 8(2001)：308-315)。因此，很明显在癌症治疗领域，有必要提高可复制腺病毒作为癌细胞溶解制剂的效力。这一点可通过提高其复制能力和裂解能力而实现。
几种旨在改善可复制腺病毒的复制和裂解能力或者旨在防止野生型腺病毒中这些功能丧失的途径已经被采用。有研究显示，在可复制腺病毒中保留腺病毒E3区域效果更佳(Yu et al，Cancer Res.60(2000)：4200-4203)，或者在大部分E3区域缺失时至少保留编码E3-11.6kDa蛋白的基因则效果更佳(Tollefson et al，J.Virol.70(1996)：2296-2306；Doronin et al，J.Virol.74(2000)：6147-6155)。另外，可复制腺病毒的复制和细胞裂解已经通过整合细胞毒基因而得到改善(Zhang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)：4513-4518；Freytag et al，Hum.Gene Ther.9(1998)：1323-1333；Wildner et al，Gene Ther.6(1999)：57-62)。还有研究显示可复制腺病毒当缺失编码抗凋亡E1B-19kDa蛋白的基因时，在杀死癌细胞时更加有效(MartinDuque et al，Cancer Gene Ther.6(1999)：554-563；Sauthoff et al，Hum.Gene Ther.11(2000)：379-388)。最近我们发现癌细胞溶解以及子代腺病毒从被感染癌细胞中释放可以通过在所述癌细胞中恢复p53功能而加速(Van Beusechem et al.，Cancer Res.62(2002)：6165-6171；WO03/057892，合并于本文中供参考)。所述的恢复p53功能通过在所述癌细胞表达恢复因子而实现，即p53依赖的凋亡通路的功能因子，其功能在所述癌细胞不表达或不充分表达，其中所述恢复因子优选含有蛋白(WO03/057892)。因此，所述恢复因子是p53依赖的凋亡通路的必要的正性元件。
癌细胞和癌细胞系是致瘤性转化的结果。构成致瘤性转化的遗传事件包括原癌基因的激活以及肿瘤抑制基因的失活，这里一个重要参与者为编码肿瘤抑制蛋白p53的基因。p53蛋白是损伤诱导的细胞周期检查点控制的主要协调者。在紊乱细胞内，p53可以诱导生长停滞和细胞死亡。p53作为特异性转录因子而发挥这些效应，因其可以控制一大批基因的表达，这些基因涉及到生长控制、DNA修复、细胞周期停滞、凋亡促进、氧化还原调节、一氧化氮生成以及蛋白降解(Polyak et al.，Nature 389(1997)：237-238；E1-Diery，Sem.Cancer.Biol.8(1998)：345-357；Yu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(1999)：14517-14522；Hupp et al.，Biochem.J.352(2000)：1-17；以及本文的参考文献)。p53诱导的细胞死亡至少部分通过bcl-2家族的促凋亡基因激活而介导，bcl-2家族例如bax、bak、bad、bid、bik、bim、bok、blk、brk、puma、noxa以及bcl-xs(Miyashita and Reed，Cell80(1995)：293-299；Han et al.，Genes Dev.10(1996)：461-477；Zoerniget al.，Biochim.Biphys.Acta 1551(2001)：F1-F37)。另一方面，bcl-2家族的抗凋亡成员例如bcl-2本身以及bcl-xL、bcl-w、bfl-1、brag-1、mcl-1则抑制p53依赖的细胞死亡(Zoernig et al.，见上文)。抗凋亡蛋白Bax抑制剂-1(BI-1)通过与bcl-2以及bcl-xL相互作用而抑制凋亡(Xu and Reed，Mol.Cell 1(1998)：337-346)。p53的快速效应蛋白以及p53本身以线粒体为靶点，从而将细胞色素c释放到胞质溶胶中，通过抑制剂半胱天冬酶-9/Apaf-1复合体激活半胱天冬酶级联反应(Juergensmeier et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)：4997-5002；Fearnhead et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)：13664-13669；Soengas et al.，Science 284(1999)：156-159；Marchenkoet al.，J.Biol.Chem.275(2000)：16202-16212)。半胱天冬酶级联反应的负向调节剂包括但不限于凋亡蛋白的抑制剂(Inhibitor ofApoptosis Protein，IAP)家族蛋白的成员，例如cIAPl、cIAP2、cIAP3、XIAP以及生存素(Zoernig et al.，见上文)。
丧失p53的正常功能与抵抗程序化细胞死亡、体外细胞转化以及体内形成新生物有关。在约50％的人类癌症，编码p53的基因通过确实或突变而丧失其功能(Levine et al，Nature 351(1991)：453-456；Hollstein et al，Science 253(1991)：49-53；Chang et al，J.Clin.Oncol.13(1995)：1009-1022)。其余50％癌细胞中多数的确表达野生型p53蛋白，但p53功能还是被“p53拮抗剂”的作用阻碍。“p53拮抗剂”在本文中定义为能够抑制p53功能的分子。例如，失去肿瘤抑制剂蛋白p14ARF或者过表达MDM2蛋白时，通过将p53结合到MDM2蛋白及随后降解，使得p53功能失活(Landers et al.，Oncogene9(1994)：2745-2750；Florenes et al.，J.Natl.Cancer Inst.86(1994)：1297-1302；Blaydes et al.，Oncogene 14(1997)：1859-1868；Stott et al，EMBO J.17(1998)：5001-5014；Schmitt et al，Genes Dev.19(1999)：2670-2677)。促进p53降解的分子的其他非限定性实例包括Pirh2(Leng et al，Cell 112(2003)：779-791)、COP1(Dornan et al，Nature429(2004)：86-92)以及Bruce(Ren et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102(2005)：565-570)。另一个实例中p53功能失活是宫颈癌中人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白拮抗性结合的结果(Scheffner et al.，Cell63(1990)：1129-1136)或者在Kaposi’s肉瘤中疱疹病毒8的潜伏相关核抗原(LANA)拮抗性结合的结果(Friborg et al.，Nature402(1999)：889-894)。另外一个实例中，p53功能失活是通过将p53结合到Parc(Nikolaev et al.，Cell 112(2003)：29-40)或mot-2/mthsp70/GRP75/mortalin(Wadhwa et al.，Exp.Cell Res.274(2002)：246-253)上而造成胞质滞留的结果。另外，一些分子能间接降低细胞中功能性p53的数量，因此在本文中也认为是p53拮抗剂，尽管并不认为其是p53通路的成员。例如保罗样激酶1(polo-like kinase-1)(plk-1)表达提高会降低p53稳定性(Liu andErikson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(2003)：5789-5794)。另外，即使p53功能本身未受损害，p53依赖的细胞死亡还可由于抗凋亡蛋白的过表达而受阻，所述抗凋亡蛋白作用于p53通路上p53的下游，例如抗凋亡bcl-2和IAP家族成员以及BI-1。另一个实例是p73DeltaN，与p53竞争性结合到p53应答性启动子上，从而拮抗p53依赖的细胞死亡(Kartasheva et al，Oncogene 21(2002)：4715-4727)。为了本发明的目的，所述作用于p53通路上p53下游的抗凋亡蛋白指的是“p53通路抑制剂”。因此，多数(如果不是全部)体内癌症以及体外癌症起源细胞系或永生化细胞系中，p53依赖的细胞死亡由于p53通路上一个或多个障碍而被阻碍。
p53功能的丧失在其他涉及不恰当细胞生存的疾病中也有记载，例如风湿性关节炎(Firestein et al.，J.Clin.Invest.96(1995)：1631-1638；Firestein et al.，Am.J.Pathol.149(1 996)：2143-2151；Firestein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)：10895-10900)以及血管平滑肌细胞增生(Speir et al.，Science 265(1994)：391-394；Kovacs et al.，Am.J.Pathol.149(1996)：1531-1539)。
程序化细胞死亡的调节涉及的其他分子包括但不限于死亡效应子结构域蛋白家族的成员(由Tibbetts et al.论述，Nat.Immunol.4(2003)：404-409)。应该理解，多种已知在程序化细胞死亡的调节以及癌细胞维持中非常重要的抗凋亡蛋白并不作用于p53通路。因此，不认为其是p53通路的成员。例如，cyclin E或者DNA复制起始蛋白或脂肪酸合成酶或PAX2的抑制在癌细胞中引起凋亡(Li etal，Cancer Res.63(2003)：3593-3597；Feng et al，Cancer Res.63(2003)：7356-7364；De Schrijver et al，Cancer Res.63(2003)：3799-3804；Muratovska et al，Oncogene 22(2003)：6045-6053)。因此，所有这些靶标，其抑制导致凋亡，并且不是p53通路成员，被认为是为了本发明的目标的抗凋亡蛋白。多个已知在程序化细胞死亡的调节或癌细胞维持中非常重要的基因已表明是抗癌治疗的靶点(由Jansen和Zangemeister-Wittke综述，Lancet Oncol.3(2002)：672-683)。已有几种方法成功的用于选择性抑制这些靶点，包括表达显性失活(dominant-negative)蛋白，导入小的抑制剂分子、反义RNA表达以及RNA干扰。本发明利用RNA干扰。
RNA干扰(RNAi)是保守的细胞监控系统，可以识别双链RNA(dsRNA)并激活与dsRNA同源RNA种类的序列特异性降解(Hannon，Nature 418(2002)：244-251)。另外，RNAi可以通过RNA指导的启动子DNA甲基化和(或)组蛋白甲基化而引起转录性基因沉默(Kawasaki and Taira，Nature 431(2004)：211-217；Morris et al，Science 305(2004)：1289-1292)。此外，在某些种属，RNAi还在程序性DNA消除以及减数分裂沉默中发现(由Matzke和Birchler综述；Nature Rev.Genet.6(2005)：24-35)。dsRNA能够引起有效而特异的基因沉默效应，在用秀丽隐杆线虫做实验时首次观察到，其中所述dsRNA作为反义RNA生成过程中的副产品，证明比反义RNA本身更加有效(Fire et al. Nature 391(1998)：806-811)。回顾起来，该观察结果为转基因植物中经常遇到的转录后基因沉默现象提供了一种解释(Baulcombe，Plant Mol.Biol.32(1996)：79-88)。在这些最初的报道之后，RNAi相关过程已经在几乎所有真核生物中有过描述，包括原生动物、蝇类、线虫、昆虫、寄生虫以及小鼠和人类细胞系(综述见：Zamore，Nat.Struct.Biol.8(2001)：746-750；Hannon，Nature 418(2002)：244-251；Agrawal et al.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67(2003)：657-685)。迄今，RNA干扰是功能研究中应用最广泛的特异性下调基因的方法。
RNAi的分子机制包括：识别dsRNA并利用RNaseIII酶Dicer和Drosha将dsRNA切割成小干扰RNAs(small interfering RNA，siRNA)(Carmell and Hannon，Nat.Struct.Biol.11(2004)：214-218)、将siRNA整合入称为RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合体)的多蛋白复合物以及降解同源RNA(Caudy et al.，Nature 425(2003)：411-414)。siRNA在将RISC引导至靶mRNA的过程中发挥必要作用。siRNA由双链含21-23核苷酸的RNA双链体组成，其具有2个核苷酸3’-OH的突出端，可以部分决定基因沉默的功效(Elbashir et al.，Genes Dev.15(2001)：188-200)。在将siRNA整合入RISC复合体的过程中，siRNA解旋，仅有一条链装配进活性RISC复合体。这个过程在自然界是不对称的，RISC优先接受siRNA中5’端较不稳定的那条链(Khvorova et al.，Cell 115(2003)：209-216；Schwarz et al.Cell 115(2003)：199-208)。这一点对siRNA序列的选择有重要影响，因为只有这样的siRNA才是有效的，即反义链(关于靶标mRNA)从该siRNA装配进RISC。有人提出一些指导方针，用于根据siRNA序列的自由能模式选择高度有效的siRNA序列(Khvorova et al.，Cell 115(2003)：209-216；Schwarz et al.Cell 115(2003)：199-208；Reynolds et al.Nat.Biotechnol.22(2004)：326-330；Ui-Tei et al.，Nucleic Acids Res.32(2004)：936-948)。
dsRNA应用于在哺乳动物细胞内沉默基因表达方面比较落后，是因为发生由长于30个碱基对的dsRNA分子引发的全身性反应，该反应由dsRNA激活的蛋白激酶(PKR)以及2’，5’OligoA-合成酶/RNAseL介导，导致翻译停止以及随后的凋亡(Kumar andCarmichael，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1998)：1415-1434；Gil andEsteban，Apoptosis 5(2000)：107-114)。因此，最初，利用较长dsRNA的RNAi应用局限于缺乏PKR反应的哺乳动物细胞：即胚胎细胞(Billy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)：14428-14433；Svoboda et al.，Development 127(2000)：4147-4156)。在一个突破性实验中，Elbashir及其同事揭示化学合成的siRNA，类似用Dicer和Drosha产生的siRNA，无需引发PKR反应即可在培养的哺乳动物细胞中诱导基因特异性沉默(Elbashir et al.，Nature411(2001)：188-200)。合成的siRNA现在作为研究单个基因功能的工具广泛应用，提供了方便快捷沉默基因的方法(McManus andSharp，Nat.Rev.Genet.3(2002)：737-747)。然而，沉默效应的瞬时性以及体内传送合成的siRNA的困难性限制了该途径的应用。
另一种生成siRNA的途径是在细胞内表达小RNA分子，通过有义和反义RNA的共表达(Zheng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.101(2004)：135-140；Miyagishi et al.，Nat.Biotechnol.20(2002)：497-500；Lee et al.，Nat.Biotechnol.20(2002)：500-505)，或者通过作为单一转录本，形成茎-环结构。后者RNA分子通常称为短发夹RNAs(shRNAs)，常常由含有互补的有义和反义链、19-29个核苷酸的茎以及大小不定的环组成。细胞内产生的shRNAs经Dicer加工形成siRNAs，能够诱导RNAi。已有多种启动子用于驱动shRNAs表达。RNA聚合酶III启动子尤其合适，因其具有非常确定的起始位点以及由至少连续4个胸腺嘧啶核苷酸的延伸组成的终止位点。RNA聚合酶III(polIII)启动子H1、U6、tRNA(Val)已经成功用于表达shRNAs(Brummelkamp et al.，Science 296(2002)：550-553；Paddison et al.，Genes Dev.  16(2002)948-958；Kawasaki and Taira，Nucleic Acids Res.31(2003)：700-707)。最近，已经开发了基于polIII药物诱导的shRNA表达盒，其允许在哺乳动物细胞内条件性抑制基因(Wiznerowicz and Trono，J.Virol.77(2003)：8957-8961；Guptaet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)：1927-1932)。RNA聚合酶II(polII)启动子用于表达功能性shRNA较为不合适，最初的尝试未能成功诱导沉默(Paddison et al.，Genes Dev.16(2002)948-958)。然而，成功应用polII CMV启动子已有报道，通过利用CMV最小启动子以及修饰的polyA信号而实现(Xia et al.，Nat.Biotechnol.20(2002)：1006-1010)或者通过核酶介导的转录本的剪切而实现(Karo and Taira，Oligonucleotides 13(2003)：335-343；Shinagawa andIshii，Genes Dev.17(2003)：1340-1345)。
关于从质粒表达的shRNAs能够触发RNAi的报道，使得可以利用病毒载体。逆转录病毒或者慢病毒传送入哺乳动物细胞内，导致shRNA表达盒在基因组内的稳定整合以及长期持久的基因抑制，并被频繁应用(例如，Brummelkamp et al.，Science 296(2002)：550-553；An et al.，Hum.Gene Ther.14(2003)：1207-1212)。腺病毒载体感染分裂细胞和非分裂细胞，但保持游离状态。表达shRNA的非复制性腺病毒载体已表明能够在体外和体内诱导靶基因的沉默(Xia et al.，Nat.Biotechnol.20(2002)：1006-1010；Arts et al.，Genome Res.13(2003)：2325-2332；Shen et al.，FEBS Lett.539(2003)：111-114；Zhao et al.，Gene 316(2003)：137-141；WO2004/013355)。迄今为止，伴随病毒载体的RNAi只能利用复制缺陷病毒载体而实现。为了清楚起见，此处重复一下：本发明仅仅涉及可复制病毒。以前并不建议在可复制病毒的环境中应用RNAi，因为不明显。人们已经认识到RNAi是细胞针对病毒感染的一种防御机制，而且该防御使得多种病毒进化出抑制RNAi的分子(Cullen，Nature Immunol.3(200)：597-599；Roth et al.，Virus Res.102(2004)：97-108)。因此，在本发明以前，有理由假定在病毒正进行复制的细胞内RNAi过程被阻碍。本文披露的结果无法从以前的文献推测出，因其表明RNAi可以在可复制病毒的环境中成功应用。
现在，RNA干扰在哺乳动物细胞中广泛应用于分析单个基因的功能。通过转染化学合成的siRNA或者表达shRNA，已经成功的在哺乳动物细胞内沉默了多个基因。靶基因的种类包括信号转导、细胞周期调节、发育、细胞死亡等过程涉及的基因(Milhavet etal.，Pharmacol.Rev.55(2003)：629-648)。当针对人类基因的大型文库可以利用时，则在基因组范围内进行系统性研究以阐明基因功能变得可行。化学合成的siRNA大型文库已经有市售(来自Dharmacon和Qiagen)，可以造成强烈但瞬时的基因表达抑制。与之对比的是，载体表达的shRNA能够较长时间抑制基因表达。两个研究小组(Berns et al.，Nature 428(2004)：431-437；Paddison et al.，Nature428(2004)：427-431)独立构建并报道了以shRNA为基础的文库，分别覆盖了7,914个和9,610个人类基因。两个文库均利用polIII启动子以及以自我激活性鼠干细胞病毒为基础的逆转录载体。这些文库的目的在于利用高通量遗传筛查来鉴定哺乳动物细胞的基因功能。Berns et al(见上文)已经利用他们的文库通过筛查细胞衰老抑制来鉴定p53通路新的组成成分。预计将进行合成致死性的高通量筛选，以评估shRNAs杀死经设计的致瘤细胞而非其同基因的正常细胞类以物的能力(Brummelkamp and Bernards，Nat.Rev.Cancer3(2003)：781-789)。因此，选择性抗癌shRNAs的鉴定可以预见。
发明内容
多数情况下，优选可复制腺病毒在宿主细胞中经历快速生活周期。当可复制腺病毒被生成或其用作载体在细胞中生成蛋白时，快速腺病毒生活周期加速了生成过程。当可复制腺病毒用作杀死细胞种群的方法时，快速生活周期将增加该过程的功效。快速生活周期对可复制腺病毒在体内的应用尤其重要。腺病毒在动物体内诱导强烈的免疫反应，可使所述腺病毒失活。这限制了给予的可复制腺病毒在体内复制的持续时间。因此，更快的生活周期将使得可复制腺病毒在给予和失活的时间跨度内生成更多轮子代病毒。可复制腺病毒的快速生活周期在体内尤为重要的情况为治疗涉及不恰当细胞生存的疾病。这种疾病的范例是癌症。可复制腺病毒给予体内肿瘤时的抗癌效力依赖于(1)所述病毒通过产生能感染邻近肿瘤细胞的子代而在整个肿瘤内播散的效率，以及(2)病毒通过复制并裂解所述细胞而杀死肿瘤细胞的效率。因此，快速生活周期将造成更快的癌细胞溶解、一定时间内产生更多轮的新病毒、及时感染更多肿瘤细胞以及从而更有效的破坏肿瘤。
因此，本发明的第一个目的是提供在宿主细胞内具有较短复制时间的可复制腺病毒。应理解，所述复制时间指的是从可复制腺病毒进入细胞到从细胞释放所述可复制腺病毒的子代之间的时间。
本发明的第二个目的是提供具有较快裂解能力的可复制腺病毒。应理解，所述较快裂解能力指的是可复制腺病毒进入所述宿主细胞后裂解宿主细胞所需要的较短时间。
根据本发明，可复制腺病毒的所述较短复制时间和(或)较快裂解能力通过RNA干扰沉默宿主细胞中一个或多个靶基因表达来实现。因此，应该清楚地理解，本发明利用RNA干扰提供具有较短复制时间和(或)较快裂解能力的所述可复制腺病毒。
在本发明的优选实施例中，所述RNA干扰通过从可复制腺病毒基因组表达的一个或多个沉默因子而诱导，其中进一步优选所述沉默因子是shRNA分子。在本发明的次优选变通例中，其中所述沉默因子由从可复制腺病毒基因组表达的两种RNA分子在细胞内所形成的双链RNA分子组成。
在本发明另一个优选的实施例中，所述可复制腺病毒在其中具有较短复制时间和(或)较快裂解能力的所述宿主细胞是表达一种或多种腺病毒抑制因子的细胞。在本发明的一个优选实施例中，所述宿主细胞是具有细胞死亡通路缺陷的细胞。在本发明的另一个优选实施例中，所述宿主细胞的p53依赖的细胞死亡通路被阻碍。所述细胞优选人类细胞。根据本发明，宿主细胞的非限定性实例是癌或肿瘤细胞、关节炎细胞以及过度增生的血管平滑肌细胞。
应该理解，“细胞死亡通路缺陷”包括细胞对丧失细胞周期检查点控制、DNA损伤和(或)原癌基因表达不能通过执行程序性细胞死亡做出反应。所述细胞死亡通路缺陷引起“不恰当的细胞生存”。
在本发明的一个变通例中，所述宿主细胞是体外培养的细胞。在本发明的另一个变通例中，所述宿主细胞是动物体内的细胞，其中优选所述动物体是人体。
在本发明的一个优选实施例中，所述较快裂解能力是所述细胞死亡通路缺陷恢复的结果。在本发明的另一个优选实施例中，所述恢复是在p53依赖的细胞死亡通路中。
在本发明的一个变通例中，根据本发明从其基因组表达一种或多种沉默因子的可复制腺病毒，根据本发明还表达p53依赖的凋亡通路中的功能性因子，正如本文参考文献所包括的WO03/057892中所披露的。因此，本发明的这个变通例提供通过表达所述功能性因子而恢复p53依赖的凋亡通路与通过所述一种或多种沉默因子而沉默一种或多种腺病毒抑制因子的联合效应。
因此，根据本发明，可复制腺病毒能够在宿主细胞内复制且表达一种或多种沉默因子。所述沉默因子沉默能抑制可复制腺病毒在所述宿主细胞中的所述较短复制时间和(或)较快裂解能力的宿主细胞因子表达。能抑制可复制腺病毒的所述较短复制时间和(或)较快裂解能力的所述宿主细胞因子还被称为“腺病毒抑制因子”。所述腺病毒抑制因子的特征没有用任何方式描述，除了其在宿主细胞中表达以及能够抑制腺病毒复制或腺病毒诱导的宿主细胞裂解。所述腺病毒抑制因子的非限定性实例是p53拮抗剂和p53通路抑制剂。所述腺病毒抑制因子的另一个非限定性实例是非p53通路成员的抗凋亡蛋白。所述腺病毒抑制因子的其他非限定性实例是根据本发明下文中鉴定腺病毒抑制因子的方法而鉴定出的分子。由一种或多种沉默因子引起的沉默量应该足够将腺病毒抑制因子降低至一个水平，该水平使得本发明的可复制腺病毒在所述细胞具有所述较短复制时间和(或)较快裂解能力。
在本发明的一个变通例中，根据本发明从其基因组表达一种或多种沉默因子的可复制腺病毒，其基因组还含有在本领域已知的一种或多种修饰，改变其趋向性即靶细胞识别特异性。
在本发明的另一个变通例中，根据本发明从其基因组表达一种或多种沉默因子的可复制腺病毒，其基因组还含有在本领域已知的一种或多种修饰，降低其免疫原性。
在本发明的另一个变通例中，根据本发明从其基因组表达一种或多种沉默因子的可复制腺病毒，其基因组还含有在本领域已知的一种或多种修饰，限制其在第一种类型细胞而非第二种类型细胞中的复制。
在本发明的另一个变通例中，根据本发明从其基因组表达一种或多种沉默因子的可复制腺病毒，其基因组还含有在本领域已知的一种或多种修饰，增加其复制和(或)裂解能力。
正如上面概括的，可以清楚地理解，术语“可复制”以及“能够在宿主细胞中复制”指的是所述重组腺病毒独自即可在所述宿主细胞中完成其感染生活周期，需要所述宿主细胞内源性系统的协助，而无需通过其他方式提供所述重组腺病毒基因组任何去除部分所编码的任何功能，例如在宿主细胞基因组中提供所述功能。所述重组腺病毒是可复制腺病毒，优选条件复制腺病毒或异源trans-complemented腺病毒。所述重组腺病毒不是复制缺陷腺病毒。
术语“沉默因子”指的是能够通过RNA干扰过程减少靶基因表达的RNA分子。所述RNA分子优选含有双链部分，优选长度至少19个核苷酸(每条链)。双链部分优选含有少于30个核苷酸的长度，而且所述RNA分子优选如上面所概括的含有短发夹RNA(shRNA)，或者含有由两条具有优选的上述长度的互补区的两个不同RNA分子组成的双链结构。在后一种情况，所述RNA分子可以从不同启动子转录。所述RNA分子优选对上面提到的RNAseIII酶的作用(即识别并剪切dsDNA)易感，得到上面论及的siRNA。应该理解，术语“靶基因”表明降低所述基因表达的过程的发生具有特异性。
本发明还提供了含有根据本发明的可复制腺病毒的制剂，可用来保存所述可复制腺病毒以及将所述可复制腺病毒给予细胞。在一个变通例中，制剂用来将所述可复制腺病毒给予体外细胞；在另一个变通例中，制剂用来将所述可复制腺病毒给予体内细胞。
本发明还提供了将根据本发明的制剂给予细胞的方法，导致用本发明的可复制腺病毒感染所述细胞。在一个变通例中，该方法用来将所述制剂给予体外细胞；在另一个变通例中，该方法用来将所述制剂给予体内细胞。
本发明提供了根据本发明的可复制腺病毒的组合物以及细胞，在该细胞中，根据本发明的可复制腺病毒与不表达根据本发明的一种或多种沉默因子的可复制腺病毒相比，可诱导细胞加速裂解和(或)子代病毒较快释放。在本发明的一个优选变通例中，所述细胞是癌细胞，所述细胞裂解是癌细胞溶解。在本发明的另一个优选变通例中，所述细胞是人类细胞。
在本发明的另一个实施例中，本发明还提供了根据本发明的可复制腺病毒的组合物以及肿瘤，其中，根据本发明的可复制腺病毒与不表达根据本发明的一种或多种沉默因子的可复制腺病毒相比，可诱导细胞加速裂解和(或)子代病毒较快释放。在本发明的这个方面，与不表达根据本发明的一种或多种沉默因子的可复制腺病毒相比，优选所述细胞加速裂解和(或)子代病毒较快释放，引起所述可复制腺病毒在所述肿瘤内从感染细胞向邻近细胞的侧向加速传播，其中还优选所述细胞加速裂解、子代病毒较快释放和(或)侧向加速传播，导致所述肿瘤更有效的破坏或生长抑制。在本发明的一个优选变通例中，所述肿瘤在动物体内生长。在进一步的变通例中，所述动物体是人体。
本发明还提供了构建根据本发明的可复制腺病毒的方法以及生成根据本发明的制剂或组合物的方法。
本发明进一步预期了根据本发明的可复制腺病毒、方法和制剂在治疗涉及不恰当细胞生存的疾病中的应用，其中优选所述疾病是人类疾病。在本发明的一个特别实施例中，所述疾病是癌症。
本发明还提供了鉴定细胞中表达的腺病毒抑制因子的方法。在优选实施例中，所述细胞是具有细胞死亡通路缺陷的细胞，并且所述细胞是人类细胞。
本发明还提供了鉴定及选择有用的沉默因子的方法，该沉默因子用于从根据本发明的可复制腺病毒基因组表达。
下文中，在本发明的几个实施例中，给出了多种能提供所述可复制腺病毒、沉默因子、制剂、方法、组合物以及应用的途径。应该清楚地理解，本说明书不以任何方式限定本发明的范围，正如上面概括解释的。熟练的技术人员能够将本发明的教示转至其他本文中没有特别提到的可复制腺病毒、沉默因子、制剂、方法、组合物及应用，而不背离本发明。
还应该理解，本发明包括本发明的可复制腺病毒、沉默因子、制剂、方法及组合物与其他杀死细胞种群的方法和途径的所有联合应用，所述方法和途径包括但不限于放射、导入编码促凋亡蛋白的基因、有毒蛋白例如毒素或药物前体转化酶以及给予化合物、抗体、受体拮抗剂等。
本发明说明书和权利要求书中所用术语的定义可认为或者在本文中被充分定义，或者在本领域中被清楚理解。另外，本文中描述的因子/蛋白的任何核酸或氨基酸序列均为已知序列，其中可参考通用的序列数据库，例如德国海德堡(Heidelberg，Germany)的EMBL数据库以及GENBANK，二者均结合于此供参考。
具体实施方式
本发明及优选实施例来自所附的权利声明。
在一个实施例中，本发明提供了能够在宿主细胞中复制的可复制腺病毒，其特征在于所述病毒包含至少一个编码沉默因子的DNA序列，尤其是短发夹RNA，而沉默因子能降低靶基因在所述宿主细胞中的表达，所述DNA序列功能上与调节性DNA序列相关，以至于所述沉默因子在导入所述可复制腺病毒的所述宿主细胞中表达。
在另一个实施例中，本发明提供了能够在宿主细胞中复制的可复制腺病毒，其特征在于所述病毒包含至少一个编码沉默因子的DNA序列，尤其是短发夹RNA，而沉默因子能降低腺病毒抑制因子在所述宿主细胞中的表达，所述DNA序列功能上与调节性DNA序列相关，以至于所述沉默因子在导入所述可复制腺病毒的所述宿主细胞中表达。
在本发明的一个变通例中，本发明提供了包含一个以上编码沉默因子的DNA序列的可复制腺病毒，沉默因子能降低靶基因在所述宿主细胞中的表达，而所述DNA序列功能上与调节性DNA序列相关，以至于所述沉默因子在导入所述可复制腺病毒的所述宿主细胞中表达。在一个变通例中，所述一个以上DNA序列中至少两个DNA序列每个均能够编码不同沉默因子，能够降低不同靶基因表达。本发明的这个变通例用来沉默一个以上靶基因在所述宿主细胞中的表达。在另一个变通例中，所述一个以上DNA序列中至少两个DNA序列每个均能够编码不同沉默因子，能够降低同一靶基因表达。本发明的这个变通例用来更有效的沉默所述靶基因在所述宿主细胞中的表达。
在本发明的另一个实施例中，本发明提供了包含至少一个编码沉默因子的DNA序列的可复制腺病毒，沉默因子能降低靶基因在所述宿主细胞中的表达，而所述DNA序列功能上与调节性DNA序列相关，以至于所述沉默因子在导入所述可复制腺病毒的所述宿主细胞中表达，还包括至少一个用于恢复因子的开放读码框架，根据WO03/057892，恢复因子能够在所述宿主细胞内恢复p53依赖的凋亡通路，所述开放读码框架功能上与调节性DNA序列相关，以至于所述恢复因子在导入所述可复制腺病毒的所述宿主细胞中表达。
在宿主细胞中(其中所述可复制腺病毒复制)从本发明的可复制腺病毒的基因组表达的有用沉默因子，形成双链RNA分子，在所述宿主细胞内经Dicer加工形成siRNA，能够在所述宿主细胞内诱导RNAi。
病毒可通过上文论及的几种途径在宿主细胞内复制；熟练的技术人员可以知晓对本发明的实施有用的恰当复制策略。
根据本发明的重组腺病毒是可复制腺病毒，例如(1)真正的可复制腺病毒(2)条件复制腺病毒，或者(3)异源trans-complemented腺病毒，或者(4)双成分可复制、异源trans-complemented或条件复制腺病毒，包括重组腺病毒作为第一成分，而所述重组腺病毒包含至少一个编码沉默因子的DNA序列，沉默因子能降低靶基因在所述宿主细胞中的表达，而所述DNA序列功能上与调节性DNA序列相关，以至于所述沉默因子在导入所述重组腺病毒的所述宿主细胞中表达，而可复制、异源trans-complemented或条件复制腺病毒作为第二成分，其中优选根据可能性1、2或3的单成分可复制腺病毒。
根据本发明的条件复制腺病毒的非限定性实例，源于可以控制性表达至少一种通过肿瘤特异性启动子的必要早期腺病毒基因的腺病毒，包括但不限于Rodriguez et al.(Cancer Res.57(1997)：2559-2563)、Hallenbeck et al.(Hum.Gene Ther.10(1999)：1721-1733)、Tsukuda et al.(Cancer Res.62(2002)：3488-3447)、Huang et al.(GeneTher.10(2003)：1241-1247)以及Cuevas et al.(Cancer Res.63(2003)：6877-6884)描述过的那些；或病毒基因有突变的腺病毒，以阻断编码的蛋白与细胞蛋白的相互作用，而该相互作用在正常细胞中对完成病毒生活周期必需，在肿瘤细胞则不然，包括但不限于Heise et al.(Nature Med.6(2000)：1134-1139)、Balague et al.(J.Virol.75(2001)：7602-7611)、Howe et al.(Mol.Ther.2(2000)：485-494)、Feuyoet al.(Oncogene 19(2000)：2-12)、Shen et al.(J.Virol.75(2001)：4297-4307)以及Cascallo et al.(Cancer Res.63(2003)：5544-5550)描述过的那些，或者包含两种类型修饰的腺病毒。根据本发明的异源trans-complemented腺病毒的非限定性实例起源于伴随功能性缺失E1区的重组腺病毒，E1区表达HPV E6和E7蛋白质(Steinwaerderet al.，Mol.Ther.4(2002)：211-216)。
在一个实施例中，根据本发明的可复制腺病毒，其特征在于所述沉默因子能够降低p53拮抗剂的表达，包括但不限于MDM2、Pirh2、COPl、Bruce、HPV-E6、Parc、mortalin以及plk-1。
在另一个实施例中，根据本发明的可复制腺病毒，其特征在于所述沉默因子能够降低p53通路抑制剂的表达，包括但不限于BI-1、p73DeltaN、抗凋亡bcl-2以及IAP家族成员(见上文)。
在另一个实施例中，根据本发明的可复制腺病毒，其特征在于所述沉默因子能够降低腺病毒抑制因子的表达，其中所述腺病毒抑制因子其特征在于延迟缺乏所述沉默因子的可复制腺病毒在宿主细胞中的复制或者延迟缺乏所述沉默因子的可复制腺病毒复制所在的宿主细胞的裂解。应该清楚地理解，在本发明的这个实施例中，所述腺病毒抑制因子的特征未以任何方式进行描述，除了其在所述宿主细胞中表达及其能够抑制腺病毒复制或者腺病毒所致的宿主细胞裂解。所述“能够抑制腺病毒复制或者腺病毒所致的宿主细胞裂解”指的是与不存在所述腺病毒抑制因子时的其他方面完全相同的情形相比，宿主细胞中存在足够量的所述腺病毒抑制因子时，10％腺病毒复制过程的完成或者50％腺病毒诱导的宿主细胞裂解过程的完成，时间上至少延迟10％，其中优选所述过程延迟至少20％，并且其中更优选的是所述过程至少延迟50％。在本发明的一个变通例中，所述腺病毒抑制因子通过根据本发明的方法进行鉴定(见下文)。
与编码沉默因子序列可操作性相关的控制序列包括启动子/增强予以及其他表达调节信号。这些控制序列可以选择与表达载体被设计以在其中应用的宿主细胞相容。术语启动子在本领域是熟知的并且包括在大小和复杂性上从最小启动子到包括上游元件和增强子的启动子范围内的核酸区。启动子常常选自在哺乳动物细胞中起作用的启动子，尽管在其他真核细胞中起作用的启动子也可以使用。选择启动子的类型是为了实现所述沉默因子在所述可复制腺病毒环境中有用的表达模式。如上所述，RNA聚合酶III启动子包括但不限于U6、H1和tRNA(Val)启动子，尤其合适于本发明，但不排除其他启动子。
在本发明的一个变通例中，所述编码沉默因子的DNA序列功能上与一个或多个控制序列即调节性DNA序列相关，使得所述沉默因子在导入所述可复制腺病毒的细胞内普遍表达。在本发明的另一个变通例中，所述编码沉默因子的DNA序列功能上与一个或多个控制序列即调节性DNA序列相关，使得所述沉默因子仅在某些条件下在导入所述可复制腺病毒的细胞内表达或以较高水平表达，所述条件可以由外部信号调节，其中术语“外部”意指其来源于包含包括编码沉默因子的所述DNA序列和所述调节性DNA序列的DNA片段之外。在本发明的这个方面，所述沉默因子的表达由所谓的可调节或可诱导启动子驱动。在本发明的另外一个变通例中，编码所述沉默因子的所述DNA序列功能上与调节性DNA序列相关，使得所述沉默因子仅于腺病毒在细胞中复制的晚期表达，所述细胞导入了所述可复制腺病毒。在本发明的这个方面，优选所述沉默因子的表达由腺病毒主要晚期启动子(MLP)驱动，优选内源性MLP。
本发明不规定编码功能上与调节性DNA序列相关的沉默因子的所述DNA序列在所述可复制腺病毒基因组中的插入位点；所述插入可在所述基因组的任何位置，只要其不抑制所述可复制腺病毒在导入所述可复制腺病毒的所述细胞内的复制，并且其中所述基因组中的内源性表达盒不干扰所述沉默因子的恰当表达。在本发明的非限定性实例中，所述插入取代腺病毒E3区，或者插入于E4启动子和右侧ITR之间。产生具有E3区插入的重组腺病毒的DNA构建体在本领域中为人熟知，包括但不限于pBHG10和pBHG11(Bett etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)：8802-8806)；产生具有在E4启动子和右侧ITR之间插入的重组腺病毒的DNA构建体在实施例1中描述，腺病毒基因组内其他位点的插入可以利用本领域中已知的标准分子生物学方法而实现。在特殊情况下，优选恰当表达所述开放读码框架以屏蔽编码沉默因子的所述DNA序列，该沉默因子功能上与来自存在于所述腺病毒基因组的其他调节性DNA序列的调节性DNA序列相关，通过所谓的绝缘元件与编码功能上与调节性DNA序列相关的沉默因子的所述DNA序列侧面相接而实现(Steinwaerder and Lieber，Gene Therapy 7(2000)：556-567)。在本发明的另一个变通例中，插入编码沉默因子的所述DNA序列取代腺病毒基因，其中优选所述腺病毒基因在腺病毒复制晚期表达，而且进一步优选所述腺病毒基因功能上与内源性MLP相关。
应该理解，本发明还包括根据本发明的可复制腺病毒，其另外含有一个或多个其它修饰以改变其特征，包括但不限于通过假型化或者靶向作用改变其趋向性，例如Krasnykh et al.(Mol.Ther.1(2000)：391-405)、Suzuki et al.(Clin.Cancer Res.7(20012)：120-126)、Van Beusechem et al.(Gene Ther.10(2003)：1982-1991)以及Havenga etal.(J.Virol.76(2002)：4612-4620)所描述的；一种或多种转基因的表达，例如编码细胞因子、促凋亡蛋白、抗血管生成蛋白、膜融合蛋白或者药物前体转化酶的基因；增加其复制能力的突变，例如E3区保留(Suzuki et al.，Clin.Cancer Res.8(2002)：3348-3359)或者ElB-19K基因缺失(Sauthoff et al.Hum.Gene Ther.11(2000)：379-388)，或者其对于某些类型细胞中的复制选择性，包括但不限于生成CRAds(见上文)的修饰或者降低其免疫原性(即当其导入动物体内时诱导免疫反应的能力)的修饰例如E3B区保留(Wang etal.，Nature Biotechnol.21(2003)：1328-1335)。
本发明的可复制腺病毒利用本领域中已知的分子生物学、病毒学以及细胞生物学生成。根据本发明生成可复制腺病毒在实施例部分将详细描述。然而，应该理解本说明书并不意欲以任何方式限制本发明的范围。本领域中的技术人员可以利用其他方法或者利用本文中描述方法的变通例得到本发明的可复制腺病毒。
在另一个实施例中，本发明提供了鉴定腺病毒抑制因子的方法，该抑制因子是本发明的可复制腺病毒有用的沉默靶点，通过比较可复制腺病毒在第一种类型宿主细胞(其中所述腺病毒抑制因子被沉默因子沉默)中与在第二种类型宿主细胞(其中所述腺病毒抑制因子不被沉默因子沉默但其他方面均与所述第一种类型宿主细胞相同)中的复制时间或裂解能力，观察到在所述第一种类型宿主细胞中比所述第二种类型宿主细胞中复制时间较短或者裂解较快即可鉴定。可复制腺病毒在两种类型宿主细胞中复制时间的差异，可以通过利用诸如表达受MLP调节的标记物基因(如萤火虫萤光素酶基因)的可复制腺病毒来测定。在这种情况下，萤光素酶在所述宿主细胞中的表达依赖于所述可复制腺病毒的复制。典型的，通过这种在宿主细胞中复制的病毒的萤光素酶表达将会增加100倍以上甚至1000倍以上，直到复制完成。测量腺病毒在这种情况下复制速率的一个便利标准是达到萤光素酶活性最大值的10％所需要的时间。萤光素酶活性通过本领域中已知的方法及时监控，包括但不限于萤光素酶化学发光分析系统(Promega)或者ReportaLightPlus Kit(Cambrex)，并鉴定第一种类型宿主细胞，在其中萤光素酶活性比在第二种类型宿主细胞中增加较快。在这种情况下“更快”意指所需时间减少至少10％、优选至少20％、更优选至少50％。因此在所述第一种类型宿主细胞而非第二种类型宿主细胞中被沉默的因子鉴定为腺病毒抑制因子。裂解能力的差异可以通过诸如及时监控感染了可复制腺病毒的所述宿主细胞的裂解而测定，利用本领域中已知的多种方法之一包括但不限于ToxiLightBioAssay(Cambrex)，并鉴定第一种类型宿主细胞，裂解比所述第二种类型宿主细胞更快。测量在这种情况下腺病毒裂解能力的一个便利标准是裂解被感染细胞的50％所需要的时间，即达到采用细胞毒性分析测得的标记化合物最大值的50％所需要的时间。而且在这种情况下“更快”意指所需时间减少至少10％、优选时间减少至少20％、更优选时间减少至少50％。因此在所述第一种类型宿主细胞而非第二种类型宿主细胞中被沉默的因子鉴定为腺病毒抑制因子。在本实施例的一个变通例中，所述第一种类型宿主细胞含有一种以上沉默因子，其中所述沉默因子在同一靶基因上每个均具有不同的靶序列。
在本发明的一个变通例中，通过在所述方法中沉默因子的RNA干扰鉴定腺病毒抑制因子，可以通过将siRNA转染入所述第一种类型宿主细胞而实现。在另一个变通例中，通过在所述方法中沉默因子的RNA干扰鉴定腺病毒抑制因子，可以通过用表达shRNA的质粒载体转染所述第一种类型宿主细胞而实现。在另外一个变通例中，通过在所述方法中沉默因子的RNA干扰鉴定腺病毒抑制因子，可以通过用表达shRNA的病毒载体转导所述第一种类型宿主细胞而实现。在本发明的变通例中非常有用的病毒载体的非限定性实例包括从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、猿猴病毒40(sv40)、EB病毒、牛痘病毒以及腺相关病毒衍生而来的载体。
在本发明的一个变通例中，鉴定腺病毒抑制因子的所述方法以功能基因组高通量的模式实现，其中所述沉默因子是包含一系列具有不同靶点特异性的沉默因子的沉默因子文库的一部分。在一个优选的变通例中，所述系列的每个组分均含有一个以上沉默因子，其中所述系列的一个组分中的每个沉默因子在同一靶基因上具有不同的靶序列。
在另一个实施例中，本发明提供了选择对合并入根据本发明的可复制腺病毒非常有用的沉默因子的方法，通过执行根据本发明的鉴定腺病毒抑制因子的方法并选择沉默因子，该沉默因子在导入宿主细胞后，得到可复制腺病毒较短的复制时间或者较快的裂解能力。
在本发明的一个变通例中，所述选择在根据本发明的可复制腺病毒内整合有用的沉默因子的方法，以功能基因组高通量的模式实现，其中所述沉默因子是包含一系列具有不同靶点特异性的沉默因子的沉默因子文库的一部分。在一个优选的变通例中，所述系列的每个组分均含有一个以上沉默因子，其中所述系列的一个组分中的每个沉默因子在同一靶基因上具有不同的靶序列。在本变通例中，所述方法包括第一步即选择包含对本发明有用的一个或多个沉默因子的该系列的组分以及第二步即从所述已选择的该系列的组分中存在的一个以上沉默因子选择对本发明有用的沉默因子。
应该理解，鉴定腺病毒抑制因子的方法或者选择在根据本发明的可复制腺病毒内整合非常有用的沉默因子的方法，既不需要事先了解所述腺病毒抑制因子或沉默因子的性质，也不需要事先了解所述腺病毒抑制因子抑制腺病毒复制或者腺病毒诱导的宿主细胞裂解的生物学过程。一个简单事实即所述腺病毒抑制因子减慢腺病毒复制或腺病毒诱导的宿主细胞裂解或者所述沉默因子加快腺病毒复制或腺病毒诱导的宿主细胞裂解，使其分别成为有用的腺病毒抑制因子或者对于在根据本发明的可复制腺病毒内整合有用的沉默因子。
本发明还提供了包含根据本发明的可复制腺病毒的制剂，可以用来保存所述可复制腺病毒以及将所述可复制腺病毒给予细胞。所述制剂优选包括所述可复制腺病毒和稀释剂。所述稀释剂允许将所述可复制腺病毒长期保存以及(或者)将所述可复制腺病毒给予培养基中的细胞和(或)动物体内的细胞，其中所述动物体优选人体。优选所述稀释剂允许在冻干条件下的保存。还优选所述稀释剂允许保存以及将所述可复制腺病毒给予培养基中的细胞和(或)动物体内的细胞。应该理解，“允许保存”意指在所述制剂保存过程中，所述可复制腺病毒感染细胞的能力保留，半衰期长于一周，其中优选所述半衰期长于一个月，而最优选的半衰期则长于6个月。所述保存可以是在40℃以下的任何温度，但优选所述温度在1℃到10℃之间，或者所述温度低于-60℃。应该理解，所述给予培养基中的细胞和(或)动物体内的细胞意指所述制剂以及所述细胞混合，实现将可复制腺病毒导入所述细胞。优选所述稀释剂对所述细胞和所述动物体无毒。本发明不规定所述稀释剂的精确组成，但对于本发明的目的有用的的几种稀释剂在本领域中为人熟知。在本发明中非常有用的稀释剂的非限定性实例在WO03/057892中披露，合并于本文供参考。可选择的，所述稀释剂可以进一步补充附加成分以增加所述可复制腺病毒在保存过程中的物理稳定性，或者增强所述导入所述细胞，或者改善所述重组腺病毒给予动物体内的所述细胞。所述成分对于所述制剂的每种特异性应用可能不同。所述附加成分的非限定性实例在WO03/057892中披露，合并于本文供参考。本领域的熟练技术人员能够通过恰当的研究确定有用的稀释剂和补充成分以制备根据本发明的制剂，该制剂使得所述可复制腺病毒导入细胞，用于本发明的每一种特殊用途以及根据本发明的每一种特殊给药方法。
本发明还提供了将根据本发明的制剂给予细胞的方法，使得本发明的可复制腺病毒导入所述细胞。在一个变通例中，该方法用来将所述制剂给予体外细胞，在另一个变通例中该方法用来将所述制剂给予体内细胞。根据本发明的方法与本领域中已知的将其他重组腺病毒给予细胞的方法在任何方面均无区别。通常，本发明的可复制腺病毒加以稀释达到在根据本发明的稀释剂中的有用浓度。一般而言，所述稀释剂与动物体内环境等张，但在某些情况下，可能需要在非等张浓度下使用稀释剂。所述可复制腺病毒的所述有用浓度对于本发明的每个不同用途将会不同。熟练的技术人员能够通过试验确定所述的有用浓度。所述制剂可在静止条件下与所述细胞接触，例如给予培养基中的细胞或者注射入动物组织，或者在动态条件下与所述细胞接触，例如注射入动物体的血液循环。所述制剂和所述细胞在0到40℃之间的温度下接触，其中优选所述温度在30到40℃之间。如果所述制剂给予动物体，则优选使所述制剂和所述细胞在所述动物体内现有温度下接触。在本发明的一个变通例中，所述给予在环境大气压下实现。在本发明的另一个变通例中，所述给药在高于大气压的压力下实现。在本发明的又一个变通例中，所述给药以非常缓慢的输注实现，也即已知的加强对流递送(Voges etal.，Ann.Neurol.54(2003)：479-487；Bankiewicz et al.，Exp.Neurol.164(2000)：2-14)。所述接触维持足够长的时间，以实现将所述可复制腺病毒导入所述细胞。
本发明还提供了包含至少一个根据本发明的沉默因子开放读码框架的可复制腺病毒的组合物以及所述可复制腺病毒复制所在的细胞。所述可复制腺病毒具有宿主范围，其允许在所述细胞内复制。在本发明的一个优选变通例中，所述细胞是丧失了通过程序性细胞死亡对失去细胞周期检查点控制发生反应的能力的细胞。在本发明这个变通例的特殊实例中，所述细胞是风湿性关节炎细胞或癌细胞。为了本发明的目的，术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”定义为失去了恰当细胞生长控制的细胞，引起在诸如哺乳动物体内所述细胞失控的生长和(或)复制，或者引起体外加速生长/复制或者永生化。因此，该术语包括恶性、恶化前和良性癌细胞。在本发明一个不相互排斥的优选变通例中，所述细胞是人类细胞。在本发明另一个不相互排斥的优选变通例中，所述细胞是动物体内细胞，其中优选所述动物体是人体。本发明的组合物通过利用根据本发明的方法将含有根据本发明的可复制腺病毒的制剂给予所述细胞而获得。
在本发明的一个实施例中，所述细胞是根据本发明的组合物的一部分，且是实体瘤中的细胞。在本实施例的一个变通例中，所述肿瘤在体外培养基中维持。在本发明的这个变通例中，所述肿瘤可能从癌细胞中人为衍生，例如细胞系起源的球状物，或者所述肿瘤可以从动物体内肿瘤的外植体而衍生。在本实施例的另一个变通例中，所述肿瘤存在于动物体内。在本发明的这个变通例，所述肿瘤可能通过手术植入所述动物体内或者所述肿瘤可能从所述动物体发生。在后一种情况，优选所述动物体是人体。在本发明这个实施例中，与缺乏根据本发明的沉默因子的可复制腺病毒相比，优选所述较短复制时间和(或)较快裂解能力引起所述可复制腺病毒在所述肿瘤内从感染细胞加速侧向传播到邻近细胞。在本发明的这个方面，进一步优选所述较短复制时间、较快裂解能力和(或)加速侧向传播引起所述肿瘤更有效的破坏或者生长抑制。
在本发明的另一个实施例中，所述细胞是根据本发明的组合物的一部分，且是风湿性滑膜细胞。在本实施例的一个变通例中，所述风湿性滑膜细胞在体外培养基中维持。在本实施例的另一个变通例中，所述风湿性滑膜细胞存在于动物体内，其中优选所述风湿性滑膜细胞存在于慢性炎症关节，而且进一步优选所述动物体是人体。在本发明的这个实施例中，与缺乏根据本发明的沉默因子的可复制腺病毒相比，优选所述较短复制时间和(或)较快裂解能力引起所述可复制腺病毒在所述炎症关节内从感染细胞加速侧向传播到邻近细胞。在本发明的这个方面，进一步优选所述较短复制时间、较快裂解能力和(或)加速例向传播引起所述风湿性滑膜细胞更有效的破坏或者生长抑制。
在本发明的一个实施例中，所述细胞是根据本发明的组合物的一部分，且是血管平滑肌细胞。在本实施例的一个变通例中，所述血管平滑肌细胞在体外培养基中维持。在本实施例的另一个变通例中，所述血管平滑肌细胞存在于动物体内，其中优选所述血管平滑肌细胞存在于内膜增生区域，例如动脉粥样硬化、再狭窄或者血管移植物闭塞中，并且进一步优选所述动物体是人体。在本发明这个实施例中，与缺乏根据本发明的沉默因子的可复制腺病毒相比，优选较短复制时间和(或)较快裂解能力引起所述可复制腺病毒在内膜增生的所述区域内从感染细胞加速侧向传播到邻近细胞。在本发明的这个方面，进一步优选所述较短复制时间、较快裂解能力和(或)加速侧向传播引起所述血管平滑肌细胞更有效的破坏或者生长抑制。
本发明进一步预期了根据本发明的可复制腺病毒、方法和制剂在治疗涉及不恰当细胞生存的疾病中的应用，其中优选所述疾病是人类疾病。根据本发明的治疗包括将存在于根据本发明的制剂内的根据本发明的可复制腺病毒利用根据本发明的方法给予动物体内的罹患细胞。在本发明的一个特殊实施例中，所述疾病是癌症并且所述罹患细胞是癌细胞，其中优选所述癌细胞是实体瘤或者肿瘤转移物的一部分。根据疾病类型以及罹患细胞的性质，将选择有用的可复制腺病毒、有用的制剂以及有用的给药途径。关于所述可复制腺病毒，将根据以前试验但通常也优选根据所述疾病的遗传背景知识或更优选根据特别是所述罹患细胞的遗传背景，选择有用的沉默因子。有用的制剂以及给药途径将根据所述罹患细胞在动物体内的定位、所述罹患细胞的特征以及所述制剂给予的动物体的部分存在的其他细胞的特征来选择。所述给药途径的非限定性实例包括直接注射入含有罹患细胞的组织例如通过加强对流输注、口服给予、注射入血液循环、吸入、注射入体腔例如胸腔或腹腔、关节或脑室、注射入部分胃肠道或泌尿生殖道的腔内以及表面应用于某个身体区域例如皮肤或耳鼻喉粘膜，例如通过漱口的方式。如果所述给药途径是经注射入血液循环，优选所述注射入可通向含有所述罹患细胞的所述动物体部分的动脉。
本发明进一步预期了与本领域中已知的能够杀死罹患细胞种群的其他方法和途径联合，治疗根据本发明的疾病，所述其他方法和途径包括但不限于放射、导入编码有毒蛋白的基因例如白喉毒素或假单孢毒素、或者促凋亡蛋白例如凋亡素或TNF相关的凋亡诱导配体、或者药物前体转化酶像胸腺嘧啶激酶、胞苷脱氨酶或者羧酸酯酶、或者细胞因子样白介素-2、白介素-12或GM-CSF、或者抗血管生成制品像内皮他丁或血管他丁、或者膜融合蛋白例如从人类免疫缺陷病毒、冠状病毒或长臂猿白血病病毒衍生的蛋白、以及给予化合物、抗体、受体拮抗剂、信号传导抑制剂、抑制蛋白-蛋白相互作用的分子例如p53与p53拮抗剂之间或者p53通路组分与p53通路抑制剂之间及类似情形的相互作用。预计这种联合治疗与单独治疗相比，可能造成更有效杀死所述罹患细胞种群。另外，一种治疗可能增强另一种治疗的效果。例如，放射以及某些化合物已知能够诱导程序性细胞死亡，因此，这种治疗可能加强有效的细胞裂解以及可复制腺病毒的子代释放，根据本发明可复制腺病毒通过沉默程序性死亡的抑制剂而恢复程序性死亡。
下文中，本发明将进一步以实施例和图形例证说明。几个实施例示出了多种途径提供所述可复制腺病毒、制剂、方法、组合物并示出了根据本发明的应用。应该清楚理解，本说明书不意欲以任何方式限制本发明的范围，正如以上所概括例证说明的。熟练的技术人员能够将本发明的教示转至其他可复制腺病毒、沉默因子、制剂、方法、组合物及应用，而不背离本发明。
附图说明
图1.(A)编码shRNAs的条件复制腺病毒沉默靶基因的表达。CRAd-shRNA诱导萤火虫萤光素酶在四种人类细胞系中沉默。细胞用指明的CRAds感染，随后马上转染报告质粒phAR-FF-RL，感染30小时后分析沉默情况。萤火虫萤光素酶/水母萤光素酶的比率用感染Ad5-Δ24E3对照病毒后获得的比率进行标准化。给出的数据是进行了三次重复的代表性试验的平均值±标准差。(B)CRAd-shRNA在A549细胞诱导萤火虫萤光素酶沉默的时间进程。细胞感染Ad5-Δ24E3或者Ad5-Δ24E3.Ff1-R两者之一，在感染后的多个时间点进行分析。在每个时间点，用Ad5-Δ24E3.Ff1-R获得的萤火虫萤光素酶/水母萤光素酶的比率，用Ad5-Δ24E3病毒获得的比率进行标准化。给出的数据是进行了三次重复的代表性试验的平均值±标准差。(C)CRAd-shRNA诱导萤火虫萤光素酶沉默是序列特异性的。A549细胞用指明的CRAds感染，随后马上转染报告质粒phAR-FF-RL或者突变质粒phAR-FF^★-RL，并如(A)进行分析。给出的数据是进行了三次重复的代表性试验的平均值±标准差。
图2.细胞周期抑制剂芹菜苷配基(apigenin)对来自于重组腺病毒的萤光素酶表达的影响。A549细胞用Ad5Δ24-SA-luc、Ad5Δ24-CMV-luc或Ad5ΔE1-CMV-luc以MOI20PFU/细胞进行感染，在芹菜苷配基逐渐加量的条件下培养。感染后32个小时，将细胞裂解并测定其萤光素酶活性。给出的数据是进行了三次重复的代表性试验的平均值±标准差。
图3.在表达p53拮抗剂HPV18E6的细胞内通过表达p53以及抗HPV18E6shRNA的可复制腺病毒恢复p53功能。HeLa HPV18-阳性宫颈癌细胞用p53报告构建体PG13-Luc转染，24小时后用AdΔ24、AdΔ24-p53或AdΔ24.p53(L).H1_18E6感染。感染后72小时，将细胞裂解并测定其萤光素酶活性。得到的值根据感染类似物的对照标准化。给出的数据是进行了三次重复的代表性试验的平均值±标准差。
表4.在表达p53拮抗剂HPV18E6的细胞内通过表达p53以及抗HPV18E6 shRNA的可复制腺病毒，特异性提高腺病毒裂解性复制。MDA-MB-231 HPV-阴性细胞(A)，SiHa HPV16-阳性细胞(B)以及HeLa HPV18-阳性细胞用AdΔ24、AdΔ24-p53或AdΔ24.p53(L).H1_18E6以指定的剂量范围感染。培养20天后，从腺病毒裂解性复制中生存的剩余细胞进行染色。MOI，感染复数即在接种物中每个细胞感染性病毒的数量。
实施例
实施例1.构建携带Gateway重组目的盒的腺病毒穿梭载体。
为了构建在腺病毒E4区与右侧ITR之间携带Gateway重组目的盒的穿梭载体，采用了构建体pEndK/SpeI(由Dr.R.Alemany惠赠，Institut Catala d’Oncologia，B arcelona，Spain)。pEndK/SpeI的构建首先用KpnI消化pTG3602(Chartier et al.，J.Virol，70(1996)：4805-4810)，然后重新连接含有Ad5图谱0-7单元和93-100单元的载体片段，以生成pEndK。接下来，通过位点指导性突变将Ad5核苷酸35813从A变为T而将unique SpeI位点引入pEndK，以形成pEndK/SpeI。pEndK/SpeI在两个Ad5 ITRs侧面携带有PacI限制性位点。pEndK/SpeI作为粘片段连接Gateway目的盒rfa(Gateway载体转化系统；Invitrogen，Carlsbad，CA)进入SpeI位点(用Klenow聚合酶填充)，从而与Gateway系统相容。选择含有Gateway目的盒的质粒，该目的盒在腺病毒R或L链上带有ccdB基因的编码序列，因此质粒分别命名为pEndK/DEST-R和pEndK/DEST-L。
为了构建携带取代腺病毒E3区的Gateway重组目的盒的穿梭载体，首先将Gateway目的盒rfa(来自于Gateway载体转化系统)克隆进经EcoR V消化的pBluescript SK(-)(Stratagene)而得到pBSK-DEST，从这个模板，DEST盒经PCR扩增，引物为5’-GAGGTCGACGCGATCGATAAGCTTGATATC-3’以及5’-TAGAACTAGTCGATCGCCCGGGCTGCAG-3’，具有突出的PvuI位点，并用PvuI消化。该片段连接进经PacI消化的pBHG11(Microbix)而得到pBHG11-DEST_R。
为了构建携带含有取代腺病毒E3区的Gateway重组目的盒的CRAd全长基因组的穿梭载体，首先，pEndK/SpeI(见上文)经EcoRV消化，然后插入含有来自pBHG11的fier基因的EcoR V片段，得到pEndK-Fiber。接下来，含有来自pBHG11-DEST_R的DEST_R的HpaI片段插入经HpaI消化的pEndK-Fiber，得到pEndK-Fiber_DEST_R。最后，含有来自pEndK_Fiber_DEST_R的SpeI片段的Fiber_DEST_R插入经SpeI消化的pAdΔ24E3(见实施例7)，实现用来自pEndK-Fiber_DEST_R的DEST_R_Fiber片段取代E3区和fier基因。得到的质粒是pAdΔ24-DEST_R。
实施例2.通过Gateway重组，构建带有可以转入按照实施例1的腺病毒穿梭载体的shRNA表达盒的质粒的通用方法。
质粒pSHAG-1(Paddison et al.，Genes Dev.16(2002)948-958；由Dr.G J.Hannon惠赠，Cold Spring Harbor Laboratory，NY)作为GATEWAY系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)的入门克隆。pSHAG-1含有U6启动子驱动的表达盒，侧面是attL1和attL2重组位点，使得利用Gateway系统可将表达盒转入目的质粒载体，包括实施例1的pEndK/DEST-R、pEndK/DEST-L、pBHG11-DEST_R、pAdΔ24-DEST_R。shRNA编码序列可以通过将经BseRI和BamHI消化的pSHAG-1和具有兼容突出DNA序列的两条退火的合成寡合苷酸相连接而引入。两条寡合苷酸中的第一条应该设计成按5’到3’的顺序含有：第一段至少19个优选不多于29个与靶mRNA互补的核苷酸(即：反义)，环序列，第二段核苷酸、与第一段核苷酸长度相同且反向互补以及一段至少4个胸腺嘧啶。第二个寡合苷酸应该反向互补于第一个寡合苷酸。而且，退火得到的双链寡合苷酸应该形成与BseRI和BamHI限制性位点兼容的突出位点。根据选择的19到29个核苷酸序列，可以形成对本发明有用的针对选择靶标的shRNA。例如，有用的针对萤火虫萤光素酶的寡合苷酸序列为：
寡合苷酸1：5’-GATTCCAATTCAGCGGGAGCCACCTGATgaagcttgATCGGGTGGCTCTCGCTGAGTTGGAATCCATTTTTT-3’以及寡合苷酸2：5’-GATCAAAAAATGGATTCCAACTCAGCGAGAGCCACCCGATcaagcttcATCAGGTGGCTCCCGCTGAATTGGAATCCG-3’，其中小写字母代表环序列。寡合苷酸1和2退火、随后连接入经BseRI和BamHI消化的pSHAG-1，即形成pSHAG-shRNA。在萤光素酶特异的shRNA实施例中，得到的是pSHAG-Ff1，编码与萤火虫萤光素酶基因编码序列1340-1368核苷酸同源的shRNA。
实施例3.利用实施例1和2的质粒构建携带shRNA表达盒的腺病毒穿梭载体的通用方法。
为了构建插入在E4区与右侧ITR之间携带shRNA表达盒的腺病毒穿梭载体，根据制造商的方案，利用GATEWAY LR Clonaseenzyme mix(Invitrogen)通过体外GATEWAY LR重组反应将shRNA表达盒从实施例2的pSHAG-shRNA构建体转到实施例1的pEndK/DEST-R或pEndK/DEST-L质粒。这样得到pEndK-shRNA-R或pEndK-shRNA-L。例如，pSHAG-Ff1与pEndK/DEST-R或pEndK/DEST-L重组，分别得到pEndK-Ff1-R或pEndK-Ff1-L。
为了构建携带插入取代E3区shRNA表达盒的腺病毒穿梭载体，将shRNA表达盒从实施例2的pSHAG-shRNA构建体转到实施例1的pBHG11-DEST R质粒，通过相同的体外GATEWAY LR重组反应以得到pBHG11-shRNA。为了构建携带插入取代腺病毒E3区的shRNA表达盒的AdΔ24型CRAd(Fueyo et al.，Oncogene19(2000)：2-12)全长基因组的质粒，将shRNA表达盒从实施例2的pSHAG-shRNA构建体转到实施例1的pAdΔ24-DEST_R质粒，通过相同的体外GATEWAY LR重组反应以得到pAdΔ24-shRNA。
实施例4.利用根据实施例3的质粒构建表达shRNA分子的可复制腺病毒的通用方法
质粒pEndK/shRNA-R和pEndK/shRNA-L可经KpnI和(或)EcoRV线性化。这样即可通过插入的shRNA表达盒将Ad5图谱0-7单元与Ad5图谱93-100单元分开。通过全长可复制腺病毒DNA可以将这些线性化的分子重组在细菌内如E.coli BJ5183。所述全长可复制腺病毒DNA可以从腺病毒颗粒中分离或者可选地可以通过消化从携带全长可复制腺病毒DNA插入子的质粒中释放。这样，双同源重组产生了携带全长可复制腺病毒基因组插入子的质粒，其中shRNA表达盒插入于E4区与右侧ITR之间。应该注意到，任何全长可复制腺病毒均可以用来根据所述方法插入shRNA表达盒，包括携带附加修饰的重组腺病毒例如增强的肿瘤选择性或癌细胞溶解、变更的倾向性或转基因插入。然而，优选全长可复制腺病毒基因组中不包含PacI限制性位点。经PacI消化，携带插入的shRNA表达盒的完整可复制腺病毒基因组随后从质粒中释放出来，该DNA利用如脂质体试剂转染人类细胞。根据本发明得到的重组可复制腺病毒可以按照本领域中已知的标准细胞培养和病毒学方法分离、进一步繁殖并纯化。
pBHG11-shRNA质粒与pXC1(Microbix Biosystems)或由pXC1衍生具有例如在E1区的选择修饰的质粒共同转染人类细胞以生成CRAds，包括但不限于Δ24突变(见上文)，使得同源重组重新组成携带插入取代E3区shRNA表达盒的完整可复制腺病毒基因组。然后该病毒可以按照本领域中已知的方法分离、繁殖、纯化及应用。pAdΔ24-shRNA质粒经PacI消化转染人类细胞以分离携带插入取代E3区shRNA表达盒的Δ24型CRAd，然后该病毒也可以按照本领域中已知的方法分离、繁殖、纯化及应用。
实施例5.构建萤火虫萤光素酶沉默性条件复制腺病毒Ad5-Δ24E3-Ff1-R和Ad5Δ24 E3-Ff1-L。
Ad5衍生的条件复制腺病毒(CRAd)Ad5-Δ24E3在EIA的pRb结合CR2结构域携带24-bp缺失(Suzuki et al.，Clin.Cancer Res.8(2002)：3348-3359)，作为骨架构建能表达抗萤火虫萤光素酶的shRNA分子的CRAds。按照实施例4中描述的通用方法，在全长Ad5-Δ24E3病毒DNA与KpnI消化的pEndK-Ff1-R或pEndK-Ff1-L之间于E.coli BJ5183内进行同源重组(见实施例3)，以分别形成pAdΔ24E3-Ff1-R和pAdΔ24 E3-Ff1-L。这些质粒经PacI消化，以从质粒骨架释放携带Ff1 shRNA表达盒插入子的全长腺病毒DNA，并转入人类293细胞(Graham et al.，J.Gen.Virol.36(1977)：59-74)。收集Ad5-Δ24E3.Ff1-R和Ad5-Δ24 E3.Ff1-LCRAds并继续在A549细胞(从ATCC获得)内繁殖。E1Δ24缺失以及U6-Ff1插入和方向通过在终产物上进行PCR而确证，功能性PFU的效价按照标准技术在293细胞上通过极限稀释空斑滴定法而测定。
实施例6.通过条件复制腺病毒Ad5-Δ24E3-Ff1-R和Ad5-Δ24E3-Ff1-L在人类癌细胞内特异性沉默萤火虫萤光素酶。
为了精确定量沉默效率并足够弥补实验差异，我们采用了报告质粒phAR-FF-RL，该质粒从双向hAR启动子表达萤火虫和水母萤光素酶(Barski et al.，Biotechniques 36(2004)：382-4，386，388)，以使萤火虫萤光素酶沉默相对于水母萤光素酶表达而标准化。为了构建phAR-FF-RL，hAR启动子(相对于转录起始点nt-124至+29，Genebank编号AF112482)利用亚克隆基因组DNA作为模板通过PCR获得，引物为5’-CCAGAAGAGCTCGCAACGTGGCATCTGCTA-3’以及5’-GTTTGGAGAGCTCCTGGGCACAATGAGGC-3’，获得侧面SacI位点(下划线)。PCR产物插入pGL3基础的(Promega，Madison，WI)的SacI位点，启动子3’端朝向萤火虫萤光素酶基因，产生phAR-FF。接下来，水母萤光素酶cDNA以pRL-TK(Promega)为模板通过PCR获得，引物为5’-ACAACGGTACCGAACTTAAGCTGCAG-3’和5’-CCGAAAGGTACCACCTGGATCCTTATC-3’，产生侧面KpnI位点(下划线)并插入phAR-FF的KpnI位点，方向与萤火虫萤光素酶基因相反，这样hAR启动子5’端朝向水母萤光素酶基因的5’一侧。
人类非小细胞肺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞以及宫颈癌HeLa细胞从美国模式菌种收集(ATCC)(Manassas，VA)获得。骨肉瘤SaOs-2细胞是Dr.F.van Valen的赠品(WestfalischeWilhelms-Universitat，Munster，Germany)。细胞在含10％胎牛血清以及50IU/毫升青霉素和50μg/毫升链霉素并补充了F12的DMEM中培养(Life Technologies，Inc.，Paisley，United Kingdom)。人类癌细胞系接种在24孔板达50-70％融合时，利用Lipofectamine+(Invitrogen)按照制造商的流程，用50ng phAR-FF-RL以及250ng不相关质粒pBluescript SK(-)载体DNA(Stratagene，La Jolla，CA)进行转染。在感染的多重性MOI达到500PFU/细胞时，于37℃感染控制CRAdAd5-Δ24E3或者沉默性CRAds Ad5-Δ24E3.Ff1-R或者Ad5-Δ24E3.Ff1-L(见上文)持续2小时，随后立即进行转染。感染30小时后，利用双向萤光素酶报告分析系统(Promega)按照制造商的流程测定萤火虫和水母萤光素酶的活性。
在不同的细胞系，Ad5-Δ24E3.Ff1-R或者Ad5-Δ24E3.Ff1-L每个均能将标准化的萤火虫萤光素酶表达抑制至从亲代控制CRAdAd5-Δ24E3感染后观察到的表达水平的60％到30％(图1A)。这表明从CRAds表达的shRNA能够抑制感染了所述CRAds的宿主细胞内靶基因的表达。
因为shRNAs是由复制腺病毒编码的，推测作为病毒基因组复制的结果，shRNAs表达可能及时增加。利用Ad5Δ24-CMV-luc(实施例10)的Pilot实验揭示在A549中，感染20小时后转基因表达开始指数增加，感染后32小时达到平台期。假设由U6启动子驱动的shRNAs表达遵循类似表达模式，我们预期由shRNAs诱导的沉默效应会在复制周期中增加。为了检测这个假设，我们实施了时间进程试验，测定感染后12、24、36和48小时Ad5-Δ24E3.Ff1-R在A549细胞的沉默效应。该试验显示在感染后最初两天，Ad5-Δ24E3.Ff1-R渐进性增强对A549细胞中萤火虫萤光素酶表达的抑制(图1B)。在感染后48小时，当CPE变得显而易见时，Ad5-Δ24E3.U6-Ff1-R将萤火虫萤光素酶沉默至Ad5-Δ24E3对照的约30％。
由于萤火虫萤光素酶表达值利用水母萤光素酶表达作为内对照进行标准化，将表达shRNA的CRAds的效应与用Ad5-Δ24E3亲代病毒感染后的表达进行比较，所观察到的萤火虫萤光素酶表达抑制似乎不是由于病毒复制引起的非特异效应。然而，为了正式排除这种可能性，我们研究了突变萤火虫萤光素酶的沉默效应。为了这个目的，我们在由phAR-FF-RL编码的萤火虫萤光素酶中的shRNA靶序列中引入了6个无表型点突变。我们构建了对照报告质粒phAR-FF^★-RL，与phAR-FF-RL相似但在萤火虫萤光素酶的靶识别位点含有无表型突变，将识别序列变为：5’-ACCAGGTTGCCCCTGCTGAGTTGGA ATCG-3’(突变用下划结表示)。突变首先在pGL2(Promega)中引入，其中靶识别位点两侧恰好为EcoRV和ClaI限制性位点，因此可使用小的连接子引入所述突变。为了这个目的，将寡合苷酸5’-ACCAGGTTGCCCCTGCTGAGTTGGAAT-3’和5’-CGATTCCAACTCAGCAGGGGCAACCTGGT-3’退火并用激酶处理。连接子连接入经EcoRV和ClaI消化的pGL2，取代非修饰的靶序列。从这个载体，含有携带突变靶位点的的765bp SphI-SgrAI片段连接入phAR-FF-RL，取代相应的SphI-SgrAI区域。正如所预期的，phAR-FF^★-RL中引入的突变不影响萤火虫萤光素酶蛋白活性但阻断了Ff1 shRNA介导的沉默，这一点通过共转染突变报告质粒(phAR-FF^★-RL)和pSHAG-Ff1而得到确证。A549细胞用Ad5-Δ24E3、Ad5-Δ24E3.U6-Ff1-R或Ad5-Δ24E3.U6-Ff1-L进行感染，随后转染报告质粒phAR-FF-RL或突变报告质粒phAR-FF^★-RL。图1C显示，感染后30小时，两种沉默性CRAds如前述均能抑制萤火虫萤光素酶至大约50％，但是不改变突变萤火虫萤光素酶的表达。这确证了观察到的萤火虫萤光素酶表达的沉默依赖于shRNA靶序列，并通过哺乳动物RNAi通路而发生。
实施例7.构建沉默p53拮抗剂的条件复制腺病毒
Ad5-Δ24E3(Suzuki et al.，Clin.Cancer Res.8(2002)：3348-3359)的衍生物，表达由polIII H1启动子驱动的抗HPVl8-E6的shRNA，通过下述途径构建。首先，Ad5-Δ24E3线性dsDNA从病毒颗粒分离并在BJ5183细菌中重组入线性pEndK/Spe(见上文)，得到质粒克隆pAdΔ24E3，其中全长AdΔ24E3 DNA经PacI消化而释放。接下来，合成的双链寡合苷酸插入质粒pSUPER(Brummelkamp et al.，Science 296(2002)：550-553)以产生pSUPER-18E6，其中所述双链寡合苷酸由来自HPV18E6(核苷酸385-403，编号按照Cole和Danos，J.Mol.Biol.193(1987)：599-608)的19nt、9nt环状连接子(小写字母)以及19nt HPV18E6序列的反向互补链组成。为了这个目的，寡合苷酸FP_super18E6(5’-gatccccGTAACACTGGGTTATACAAttcaagagaTTGTATAACCCAGTGTTAGtttttggaaa-3’)和RP_super18E6(5’-agcttttccaaaaaCTAACACTGGGTTATACAAtctcttgaaTTGTATAACCCAGTGRRAGggg-3’)退火变性，并连接入BglII/HindIII消化的pSUPER。然后pSUPER-18E6经HindIII消化，突出末端用Klenow聚合酶填充，并重新连接产生NheI位点。随后，用SpeI和NheI消化释放的H1_18E6片段插入SpeI消化的pEndK/SpeI中，产生质粒pEndK.H1_18E6。HPV-18E6的功能性沉默引起HPV-18转化的人类癌细胞中p53抑制被减弱，这一点通过在HeLa宫颈癌细胞共转染pEndK.H1-18E6与p53特异性报告质粒PG13-Luc(el-Deiry et al.，Cell 75(1993)：817-825)并测定萤光素酶表达而得到确证。该试验揭示，结果显著高于对照转染pEndK/SpeI和PG13-Luc或者单独转染PG13-Luc测定的值。因此由pEndK.H1_18E6表达的shRNA沉默了p53拮抗剂。pEndK.H1_8E6通过KpnI和EcoRV消化而线性化，并在E.coli BJ5183细胞内与PacI-线性化的Ad5-Δ24E3DNA重组。这形成了pAdΔ24.H1_18E6。PacI-线性化的pAdΔ24H1_18E6转染入911细胞(Fallaux et al.，Hum.Gene Ther.7(1996)：215-222)，分离AdΔ24.H1_18E6病毒并继续在A549细胞繁殖。
几个在E1区具有Δ24突变的CRAds(Fueyo et al.，Oncogene19(2000)：2-12)，每个均表达不同的对p53拮抗剂保罗样激酶-1(plk-1)和parc特异的shRNA，可以按照下述途径构建。对于两个靶基因，设计了三个不同的沉默构建体，针对靶mRNA不同序列。对于每个沉默构建体，均合成一对共两个寡合苷酸，其序列下面将给出。这些寡合苷酸可以退火复性并插入按照实施例2经BseRI和BamHI消化的pSHAG-1。来自于生成的pSHAG-shRNA构建shRNA表达盒，按照实施例3通过的LR GATEWAY体外重组反应转染入pAdΔ24-DEST_R(实施例1)。全长克隆经PacI消化并转染入911细胞，以得到表达shRNA的可复制腺病毒，然后继续在A549细胞繁殖。
所使用的寡合苷酸对为：对于plk-1；set-A：5’-GGCGGCTTTGCCAAGTGCTTCTCGAGAAGCACTTGGCAAAGCCGCCCTTTTT-3’和5’-GATCAAAAAGGGCGGCTTTGCCAAGTGCTTCTCGAGAAGCACTTGGCAAAGCCGCCCG-3’；set-B：5’-GCCGCCTCCCTCATCCAGAACTCGAGTTCTGGATGAGGGAGGCGGCCTTTTT-3’和5’-GATCAAAAAGGCCGCCTCCCTCATCCAGAACTCGAGTTCTGGATGAGGGAGGCGGCCG-3’；set-C：5’-ATGAAGAAGATCACCCTCCTTACTCGAGTAAGGAGGGTGATCTTCTTCATCTTTTT-3’和5’-GATCAAAAAGATGAAGAAGATCACCCTCCTTACTCGAGTAAGGAGGGTGATCTTCTTCATCG-3’；对于parc；set-A：5’-GAAGCTTTCCTCGAGATCCACTTCCTGTCATGGATCTCGAGGAAAGCTTCCTTTTT-3’和5’-GATCAAAAAGGAAGCTTTCCTCGAGATCCATGACAGGAAGTGGATCTCGAGGAAAGCTTCCG-3’；set-B：5’-GCATCGAGCAGCACATGGATCTTCCTGTCAATCCATGTGCTGCTCGATGCCTTTTT-3′和5’-GATCAAAAAGGCATCGAGCAGCACATGGATTGACAGGAAGATCCATGTGCTGCTCGATGCCG-3’；以及set-C：5’-CTCGCCAGGAGAAGCGGTTTCTTCCTGTCAAAACCGCTTCTCCTGGCGAGCTTTTT-3′和5’-GATCAAAAAGCTCGCCAGGAGAAGCGGTTTTGACAGGAAGAAACCGCTTCTCCTGGCGAGCG-3’。
实施例8.构建沉默p53拮抗剂且另外表达p53依赖的凋亡通路的条件复制腺病毒
Ad5-Δ24E3(Suzuki et al.，Clin.Cancer Res.8(2002)：3348-3359)的衍生物，表达由polIII H1启动子驱动的抗HpV18-E6的shRNA，且另外表达人类p53，通过下述途径构建。首先，构建质粒pEndK/p53。为了这个目的，缺乏EorRV位点的pBluescript SK(-)(Stratagene，La Jolla，CA)衍生物，通过用SmaI和EorRV消化随后自身连接而构建。该载体用KpnI和SalI消化，并将含有来自pABS.4-p53(VanBeusechem et al.，Cancer Res.62(2002)：6165-6171)由SV40启动子驱动的p53表达盒的Kpn/SalI片段插入以得到pBSK-p53。随后，将pBSK-p53中的KpnI位点变为SpeI位点，通过用KpnI消化pBSK-p53并插入一个合成的双链寡合苷酸而实现，其中所述寡合苷酸通过oligo5，-TCAGGACTAGTGGAATGTAC-3′和oligo5’-ATTCCACTAGTCCTGAGTAC-3′退火复性而得到，然后经过SpeI消化释放2.6kb SV40-p53片段，并插入SpeI消化的pEndK/Spe中(见上文)。携带方向为SV40-p53盒定位于腺病毒L链的插入子的克隆为分离，并命名为pEndK/p53。来自于pEndK/p53的功能性p53表达可以如下确证：将pEndK/p53或对照构建体pEndK/SpeI与p53特异性报告质粒PG13-Luc或阴性对照质粒MG15-Luc(el-Deiry etal.，Cell 75(1993)：817-825)共同转染入无p53的SaOs-2骨肉瘤细胞并于第二天测定萤光素酶表达。pEndK/p53转染得到的p53特异性PG-13/MG-15比率为63，而该比率在转染空白pEndK/SpeI载体后仅为0.7。接下来，pEndK/p53用ClaI消化并用Klenow聚合酶填充，随后插入含有来自pSUPER-18E6(见上文)的H1-18E6片段的HincII/SmaI片段，产生pEndK/p53.H1-18E6。最后，pEndK/p53.H1-18E6经KpnI和EcoRV消化而线性化并在E.coliBJ5183细胞内与PacI-线性化的Ad5-Δ24E3重组，以生成pAdΔ24.p53(L).H1-18E6。该克隆经PacI线性化并转染入911包装细胞，分离AdΔ24.p53(L).H1-18E6病毒，然后继续在A549细胞繁殖。
实施例9.构建沉默p53通路抑制剂的可复制腺病毒。
几个在E1区具有Δ24突变的CRAds(Fueyo et al.，Oncogene19(2000)：2-12)，每个均表达不同的对bcl-2特异的shRNA，可以利用与实施例7中描述的构建携带plk-1或parc的shRNA的CRAds相同的流程，只是采用不同的寡合苷酸对，对bcl-2mRNA的靶序列特异，即set-A：5′-CTGCACCTGACGCCCTTCACCTTCCTGTCAGTGAAGGGCGTCAGGTGCAGCTTTTT-3′和5’-GATCAAAAAGCTGCACCTGACGCCCTTCACTGACAGGAAGGTGAAGGGCGTCAGGTGCAGCG-3’；set-B：5’-GGAGGATTGTGGCCTTCTTTCTTCTTCCTGTCAAAAGAAGGCCACAATCCTCCCTTTTT-3′和5’-GATCAAAAAGGGAGGATTGTGGCCTTCTTTTGACAGGAAGAAAGAAGGCCACAATCCTCCCG-3’；以及  set-C：5’-GATCCAGGATAACGGAGGCTCTTCCTGTCAAGCCTCCGTTATCCTGGATCCTTTTT-3′和5’-GATCAAAAAGGATCCAGGATAACGGAGGCTTGACAGGAAGAGCCTCCGTTATCCTGGATCCG-3’。
实施例10.构建沉默p53拮抗剂且倾向性变更的条件复制腺病毒
Ad5-Δ24RGD(Suzuki et al.，Clin.Cancer Res.7(2001)：120-126)的衍生物，表达由polIII H1启动子驱动的抗HPV18-E6的shRNA，而且其携带修饰的fiber基因扩大了腺病毒倾向性，可引起在多种人类癌细胞上感染性提高、癌细胞溶解效率改善，通过下述途径构建。线性全长双链Ad5-Δ24RGD DNA利用本领域中已知的方法从Ad5-Δ24RGD病毒提取，该DNA在E.coli BJ5183细胞内与KpnI/EcoRV消化的pEndK.H1_18E6(见上文)重组，以生成pAdΔ24RGD.H1_18E6。随后，PacI线性化的pAdΔ24RGD.H1_18E6转染入911包装细胞，分离pAdΔ24RGD.H1_18E6病毒，然后继续在A549细胞繁殖。
实施例11.构建可复制腺病毒Ad5Δ24-SA-Luc，其可通过MLP指导表达萤火虫萤光素酶，且对于鉴定腺病毒抑制因子以及选择能沉默所述腺病毒抑制因子的shRNA的方法非常有用。
为了构建携带由内源性腺病毒MLP指导的转基因的可复制腺病毒，拼接受体序列以及其后的多克隆位点和多聚腺苷酸位点插入取代含有部分Ad5基因组的质粒的E3区。为了这个目的，将寡合苷酸5’-GGCAGGCGCAATCTTCGCATTTCTTTTTTCCAGGAATCTAGAGATATCGAGCTCAATAAAG-3’和5’-AATTCTTTATTGAGCTCGATATCTCTAGATTCCTGGAAAAAAGAAATGCGAAGATTGCGCCT GCCTGCA-3′退火复性并克隆在经EcoRI和PstI消化的pABS.4(Microbix Biosystems，Toronto，Canada)，得到的质粒pABS.4-SA-MCS含有腺病毒血清型40的长达32个核苷酸的序列，而腺病毒血清型40包括长fiber基因拼接受体位点、小的多克隆位点包括XbaI、EcoRV和SacI限制性位点以及多聚腺苷酸位点，且设计灵活可以插入选择的转基因。为了构建携带由内源性腺病毒MLP指导的转基因的可复制腺病毒(可用简单定量的方法测定)，萤火虫萤光素酶基因插入pABS.4-SA-MCS的MCS中。为了这个终端，萤火虫萤光素酶的cDNA通过PCR获得，以pSP-Luc+载体(Promega)作为模板DNA，含有突出XbaI和SacI位点的寡合苷酸5’-GGGTCTAGAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3′和5’-CCCGAGCTCCTTACACGGCGATCTTTCCGC-3′作为引物。PCR产物用XbaI和SacI消化并连接入相同酶消化的pABS.4-SA-MCS中，产生pABS.4-SA-Luc。该质粒用PacI消化，含有SA-Luc和卡那霉素抗性基因的片段插入PacI消化的pBHG11(Microbix biosystems)。分离携带其方向为SA-Luc位于腺病毒R链上的插入子的克隆，随后卡那霉素抗性通过SwaI消化而去除，然后进行自身连接，产生pBHG11-SA-Luc。
为了构建含有CMV启动子而非SA的对照腺病毒，人类CMV启动子经NheI和BglII消化从pAdTrack(He et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)：2509-2514)释放，并亚克隆入经SpeI和BamHI消化的pBluescript SK(-)(-)(Stratagene)。随后，该质粒用XbaI和PstI消化，其中含有CMV启动子的片段连接入经XbaI和PstI消化的pABS.4-SA-MCS，从而用CMV启动子取代其拼接受体位点。以获得pBHG11-SA-Luc(见上文)类似的途径，该质粒(pABS.4-CMV-MCS)可用来构建pBHG11-CMV-Luc。
能表达由MLP或CMV调节的萤光素酶的条件复制腺病毒，在293细胞中通过pXC1(Microbix Biosysetms)的衍生物pXC1-Δ24与pBHG11-SA-Luc或pBHG11-CMV-Luc分别同源重组而获得，其中pXC1-Δ24带有24bp的缺失，该缺失相应于E1A CR2区对结合Rb蛋白必需的122-129氨基酸(Fueyo et al.，Oncogene19(2000)：2-12)。这样即产生了CRAds Ad5Δ24-SA-Luc以及Ad5Δ24-CMV-Luc。
实施例12.萤光素酶通过可复制腺病毒Ad5Δ24-SA-Luc在宿主细胞中的表达依赖于腺病毒复制。
为了研究转基因表达与腺病毒复制的相关性，接种在96孔板中的A549细胞于37℃以20PFU/细胞感染表达萤光素酶的重组腺病毒达2小时，随后感染培养基用含或不含的新鲜培养基取代。因为腺病毒复制要求细胞周期进程为S期，芹菜苷配基处理抑制腺病毒复制，这一点可以用观察结果确证：感染Ad5-Δ24E3(见上文)后32小时，在存在75微摩尔的芹菜苷配基时培养的细胞通过定量PCR测定，含有的Ad5-Δ24E3病毒基因组少1,000到10,000倍。感染后32小时，利用萤光素酶化学发光分析系统(Promega)测定感染腺病毒细胞中的萤光素酶活性，其中培养基不含或含有不同浓度的芹菜苷配基。图2示出了Ad5Δ24-SA-Luc和Ad5Δ24-CMV-Luc(见上文)的观察结果以及复制缺陷的对照病毒Ad5-ΔE1-CMV-Luc的观察结果，其中Ad5-ΔE1-CMV-Luc已经缺失了E1区、E3区、E1内由来源于pCEP4(Invitrogen)的CMV启动子组成的表达盒以及来自pGL3-Basic(Promega)(Yamamoto et al.，Mol.Ther.3(2001)：385-394；由Dr.M.Yamamoto惠赠，University ofAlabama at Birmingham，AL)的萤光素酶基因。通过复制缺陷腺病毒载体Ad5-ΔE1-CMV-Luc的萤光素酶表达不受芹菜苷配基处理的影响，确证了正如预期的，转基因表达不依赖于腺病毒复制。通过可复制腺病毒载体Ad5-Δ24-CMV-Luc的萤光素酶表达经芹菜苷配基处理降低了大约35倍，表明转基因表达部分依赖于腺病毒复制。通过可复制腺病毒载体Ad5Δ24-SA-Luc的萤光素酶表达经芹菜苷配基处理在该病毒内降低了大约4,600倍，表明MLP驱动的转基因表达部分在该病毒强烈依赖于腺病毒复制。因此，Ad5Δ24-SA-Luc是应用于按照本发明的方法中的有用工具，其中在第一种类型细胞中腺病毒复制与第二种类型细胞中的腺病毒复制进行比较。感染了Ad5Δ24-SA-Luc的细胞中的萤光素酶活性与Ad5Δ24-SA-Luc在所述细胞中的复制直接相关并且可以通过简单的分析进行测定(见上文)。
实施例13.鉴定腺病毒抑制因子以及选择能够沉默所述腺病毒抑制因子的shRNA分子的方法
腺病毒复制或裂解的抑制因子以及能降低这些抑制因子表达的沉默因子可以利用RNAi沉默靶细胞中的细胞基因而鉴定，用可复制腺病毒感染这些细胞并测定对复制和(或)裂解的沉默效应。如在本发明的技术背景中提到的，大规模沉默因子文库已经可用，形式为合成的siRNA或编码shRNA的质粒。恰当方法为进行文库单个成员的大规模转染(Bems et al.，Nature 428(2004)：431-437；Paddison et al.，Nature 428(2004)：427-431)，利用可复制腺病毒按照本领域中已知的方法，成员之间很容易合并。为了利用这种文库成功的鉴定抑制因子和沉默因子，优选利用有效且定量的分析来测定病毒复制和(或)细胞裂解，且优选应该与使筛选过程自动化的机器人平台兼容。为了测定腺病毒复制，我们开发了可复制Ad5Δ24-SA-Luc病毒，能表达由主要晚期启动子调节的标记物基因萤光素酶(见实施例12)。因为来自该病毒基因组的萤光素酶表达依赖于病毒复制，萤光素酶在感染了该病毒的细胞中的表达可以作为病毒复制的敏感标记物。为了测定感染了病毒的细胞的裂解，用于细胞死亡和细胞裂解定量的比色、荧光和化学发光分析已经有市售(Roche Applied Science；Cambrex；Promega)，以测定从细胞质或受损细胞释放至上清液中的乳酸脱氢酶为基础。
实施例14.根据实施例8的条件复制腺病毒在表达腺病毒抑制因子(作为p53拮抗剂)的细胞内恢复p53功能，并且由于宿主细胞内表达所述腺病毒抑制因子而减慢腺病毒复制和(或)裂解。
利用LipofectAMINE+(Invitrogen)、按照制造商的流程将200ngPG13-Luc质粒(el-Deiry et al，Cell 75(1993)：817-825)转染HeLa细胞后24小时，使用CRAds AdΔ24和AdΔ24-p53(Van Beusechemet al.Cancer Res.62(2002)：6165-6171)以及AdΔ24.p53(L).H1_18E6(见实施例8)感染HPV-18阳性HeLa宫颈癌细胞(来自ATCC)，10PFU/细胞。PG13-Luc表达由p53依赖的启动子驱动的萤火虫萤光素酶基因。感染后72小时，细胞在报告裂解缓冲液(Reporter LysisBuffer，Promega)中裂解，并利用萤光素酶化学发光分析系统(Promega)和Lumat LB 9507 Luminometer测定其化学发光。测得的相对光单位以模拟物感染对照进行标准化。从图3可以看出，与AdΔ24感染的细胞相比，功能性p53表达在AdΔ24-p53感染的细胞仅有微弱提高，表明在HeLa细胞中p53被HPV-18E6蛋白有效抑制。在AdΔ24.p53(L).H1_18E6感染的细胞，测得显著较高水平的p53活生，表明AdΔ24.p53(L).H1_18E6中的HPV-18E6特异生shRNA减低了HeLa细胞中的p53抑制。
为了研究通过AdΔ24.p53(L).H1_18E6沉默HPV-18E6是否导致腺病毒复制和(或)裂解的特异性提高和/或HPV-18阳性癌细胞中的裂解，AdΔ24、AdΔ24-p53以及AdΔ24.p53(L).H1_18E6感染HeLa细胞或HPV-16阳性SiHa宫颈癌细胞(从ATCC获得)。因为H1_18E6 shRNA对HPV-18E6特异而不抑制HPV-16E6，SiHa细胞作为阴性对照。以前我们曾发现在某些癌细胞系中p53表达功效提高超过100倍(Van Beusechem et al，Cancer Res.62(2002)：6165-6171)，其中一种细胞系乳腺癌细胞系MDA-MB-231包括入内作为阳性对照。细胞以5E4/孔接种于24孔板，第二天进行感染，病毒浓度变化在5-5E5感染性病毒/孔。1小时后，替换培养基，随后培养20天，每3-4天更换50％的培养基。培养过程中，可复制腺病毒可以裂解其宿主细胞，释放能感染新宿主细胞的子代。病毒生活周期(复制、细胞裂解和再感染)进展越有效，则清除培养液中细胞所需的初始病毒接种量越少。20天后，去除培养液，剩余的贴壁细胞在4％(v/v)福尔马林(在PBS中)室温固定20分钟，然后用10g/l结晶紫染料(在70％(v/v)酒精中)室温染色20分钟，用水洗涤几次之后，培养板在空气中干燥并在Bio-RadGS-690成像密度仪上扫描。图4显示，抗MDA-MB-231、SiHa、HeLa细胞方面，AdΔ24-p53比AdΔ24更有效，倍数分别达1000倍、10倍、小于10倍。因此，p53表达增强腺病毒在HPV阳性宫颈癌细胞中的裂解性复制，但到现在为止，尚不如在HPV阴性癌细胞中更有意义。重要的是，AdΔ24.p53(L).H1_18E6比AdΔ24-p53抗HPV18阳性HeLa细胞更有效约10倍，但在抗HPV阴性MDA-MB-231和HPV18阴性SiHa细胞方面，则与AdΔ24-p53有效度相似。这表明表达抗腺病毒抑制因子(HPV18E6)的小发夹RNA沉默因子，特异性减轻腺病毒在表达腺病毒抑制因子的宿主细胞中复制和(或)裂解减慢的程度。
序列表
P27279
SEQUENCE LIS
<110>vereniging voor christelijk we             onderzoek
<120>Replication competent viruses            erncing virus inhibitory
factor expression
<130>P27279PC00
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<151>2004-04-15
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g                                                                    61
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