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1、10申请公布号CN104046680A43申请公布日20140917CN104046680A21申请号201310077102922申请日20130311C12Q1/6820060171申请人苏州承美生物科技有限公司地址215200江苏省苏州市吴江经济技术开发区科技创业园72发明人孙喜元74专利代理机构苏州华博知识产权代理有限公司32232代理人黄珩54发明名称甲基化DNA检测方法57摘要本发明提供一种甲基DNA检测方法，该方法包括以下步骤处理样品、合成探针、杂交反应、加入单克隆抗体、加入偶联单克隆抗体、加入检测试剂、测定、判断。本发明具有检测特异性高、不容易被干扰、假阳性率低等优点，在对肿瘤。
2、早期检测、肿瘤个性化治疗、肿瘤病情判断和复发监控等方面的检测和检测试剂的开发有着重要的意义。51INTCL权利要求书2页说明书5页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页附图1页10申请公布号CN104046680ACN104046680A1/2页21一种甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述甲基化DNA检测方法包括如下步骤步骤1，采用亚硫酸盐处理待测样品DNA，以及已知的标准非甲基化DNA和已知的标准甲基化DNA；步骤2，确定待测基因的检测区域，选择目标检测序列，按照基因序列设计并合成检测探针序列；步骤3，用亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和标准非甲基。
3、化DNA作为检测的阳性标准对照和阴性标准对照，按比例作梯度稀释；用所述的检测探针与梯度稀释的标准甲基化DNA样品和标准非甲基化DNA样品分别进行杂交反应；同时用所述的检测探针与用亚硫酸盐处理过的待测样品DNA进行杂交反应；步骤4，将步骤3所得的反应物分别加入到反应载体中，捕捉经过了杂交反应的被标记的探针，并洗涤；步骤5，加入抗甲基化胞嘧啶单克隆抗体进行反应，并洗涤；步骤6，加入HRP偶联单克隆抗体进行反应，并洗涤；步骤7，加入HRP检测试剂进行反应，终止反应后进行测定，并计算甲基化DNA的浓度和量；步骤8，判断是否存在甲基化DNA。2根据权利要求1所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述步。
4、骤1中所用的亚硫酸盐为亚硫酸钠，浓度为5M，PH50，所述步骤1的反应温度为60度，反应时间为4小时。3根据权利要求1所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述步骤2中确定待测基因的检测区域和目标检测序列并设计合成探针，是指在待测基因中选择一段序列A，使该序列A含有尽可能多的CPG位点，序列长度为18120碱基，以序列A经亚硫酸盐处理后的甲基化状态作为目标检测序列进行检测探针设计，以序列A的互补序列作为检测探针序列1；在待测基因组DNA中序列A下游区域的另一条链上，选择一段序列B，使序列B富含CPG位点且不与序列A重合，序列长度为18120碱基，以序列B经亚硫酸盐处理后的甲基化状态作为目标检。
5、测序列进行检测探针设计，以序列B的互补序列作为检测探针序列2，合成检测探针，并在合成的探针的5端进行标记。4根据权利要求3所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述对合成的探针进行标记，是指用生物素或具有可检测性质的物质进行标记。5根据权利要求1所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述步骤3中的标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA，是经确定的纯的人类甲基化DNA和非甲基化DNA；所述杂交反应是在2XSSC的盐浓度、PH值为80、60的反应温度条件下进行的。6根据权利要求1所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述步骤5中加入的单克隆抗体是小鼠抗甲基化胞嘧啶单克隆抗体，所述步骤5的反应是。
6、在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行的。7根据权利要求1所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述步骤6中加入的偶联抗体是HRP偶联的羊抗小鼠单克隆抗体，所述步骤6的反应是在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行的。8根据权利要求1所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述步骤7中的HRP检测试剂为HRP底物TMB，3，3，5，5四甲基联苯胺。权利要求书CN104046680A2/2页39根据权利要求1所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述待测样品为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA。
7、、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。10根据权利要求9所述的甲基化DNA检测方法，其特征在于，所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠细胞、直肠细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠组织、直肠组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。权利要求书CN104046680A1/5页4甲基化DNA检测方法技术领域0001本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种甲基化DNA的检。
8、测方法。背景技术0002DNA甲基化是指DNA链上CPG位点的胞嘧啶（C）残基的5碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早被发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CG二核苷酸的胞嘧啶残基上，这常见于基因5端表达调控序列。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。0003DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CPG岛局部甲基化水平的异常升高,可以导致基因组的不稳定和抑癌基。
9、因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高，所以DNA甲基化在肿瘤早期检测中的应用十分引人注目。研究表明，表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，因而检测DNA甲基化改变可以有助于肿瘤的早期发现。目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因，这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CPG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CPG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。0004CPG岛甲基化的检测方法众多,其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/SOU。
10、THERN法（METHYLATIONSENSITIVERESTRICTIONENDONUCLEASE/SOUTHERN,MSRESOUTHERN）是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法（METHYLATIONSPECIFICPCR,MSP）及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，其灵敏度较高，但容易受干扰，特异性差，从而导致检测的假阳性率也很高。发明内容0005本发明提供一种甲基化DNA检测方法，能够有效地排除非甲基化DNA的影响，很好地解决了现有技术中检测特异性低、容易被干扰、假阳性高等缺点。0006为达到上述目的，本发明的技术方案是，。
11、一种甲基化DNA检测方法，所述甲基化DNA检测方法包括如下步骤步骤1，采用亚硫酸盐处理待测样品DNA，以及已知的标准非甲基化DNA和已知的标准甲基化DNA；步骤2，确定待测基因的检测区域，选择目标检测序列，按照基因序列设计并合成检测探针序列；步骤3，用亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA作为检测的阳性标准对照和阴性标准对照，按比例作梯度稀释；用所述的检测探针与梯度稀释的标准甲基化说明书CN104046680A2/5页5DNA样品和标准非甲基化DNA样品分别进行杂交反应；同时用所述的检测探针与用亚硫酸盐处理过的待测样品DNA进行杂交反应；步骤4，将步骤3所得的反应物加入用亲和素包。
12、被的反应载体上，捕捉经过了杂交反应的被标记的探针，并洗涤；步骤5，加入抗甲基化胞嘧啶单克隆抗体进行反应，并洗涤；步骤6，加入HRP偶联单克隆抗体进行反应，并洗涤；步骤7，加入HRP检测试剂进行反应，终止反应后进行测定，并计算甲基化DNA的浓度和量；步骤8，判断是否存在甲基化DNA。0007优选的，所述步骤1中所用的亚硫酸盐为亚硫酸钠，浓度为5M，PH50。0008优选的，所述步骤1的反应温度为60度，反应时间为4小时。0009优选的，所述步骤2中确定待测基因的检测区域和目标检测序列并设计合成探针，是指在待测基因中选择一段序列A，使该序列A含有尽可能多的CPG位点，序列长度为18120碱基，以序。
13、列A经亚硫酸盐处理后的甲基化状态作为目标检测序列进行检测探针设计，以序列A的互补序列作为检测探针序列1；在待测基因组DNA中序列A下游区域的另一条链上，选择一段序列B，使序列B富含CPG位点且不与序列A重合，序列长度为18120碱基，以序列B经亚硫酸盐处理后的甲基化状态作为目标检测序列进行检测探针设计，以序列B的互补序列作为检测探针序列2，合成检测探针，并在合成的探针的5端进行标记。0010优选的，所述对合成的探针进行标记，是指用生物素或具有可检测性质的物质进行标记。0011优选的，所述步骤3中的标准甲基化DNA和标准非甲基化DNA，是经确定的纯的人类甲基化DNA和非甲基化DNA；所述杂交反应。
14、是在2XSSC的盐浓度、PH值为80、60的反应温度条件下进行的。0012优选的，所述步骤4的反应载体是用亲和素包被的酶标板或玻璃微球。0013优选的，所述步骤5中加入的单克隆抗体是小鼠抗甲基化胞嘧啶单克隆抗体，所述步骤5的反应是在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行的。0014优选的，所述步骤6中加入的偶联抗体是HRP偶联的羊抗小鼠单克隆抗体，所述步骤6的反应是在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行的。优选的，所述步骤7中的HRP检测试剂为HRP底物TMB，3，3，5，5四甲基联苯胺。0015优选的，。
15、所述待测样品为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。0016优选的，所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠细胞、直肠细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠组织、直肠组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。0017优选的，所述步骤8中判断是否存在甲基化DNA，是对照以标准品检测到的甲基化说明书CN104046680A3/。
16、5页6DNA相应的特征性曲线，判断待测样品中是否存在甲基化DNA。0018以重亚硫酸盐处理过的待测DNA中由于非甲基化的胞嘧啶（C）被转变为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶（C）维持不变，从而使得DNA链上总体的GC含量降低，有利于检测探针与目标DNA的特异性杂交。在用特异性的检测探针进行杂交捕获后，有效地消除全局性DNA甲基化（GLOBALDNAMETHYLATION）的影响，使得仅有目标检测区域的甲基化DNA得以保存，从而可以检测到样品中存在的极微量的甲基化DNA。0019相比于现有技术而言，本发明能够有效排除非甲基化DNA的影响，使样品中的甲基化DNA得以富集，因此本发明具有检测特异性高、不。
17、容易被干扰、假阳性率低等优点，同时还具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、适用混合样本等好处，在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。附图说明0020图1为本发明甲基化DNA检测方法流程图。具体实施方式0021下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。0022实施例1,步骤1，用已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA作为检测样品；采用浓度为5M的亚硫酸钠溶液处理待测样品DNA。
18、，反应温度为60度，处理时间为4小时；步骤2，确定待测基因的检测区域，按照基因序列设计并合成能与亚硫酸盐处理过的甲基化DNA序列互补配对的序列作为检测的探针序列；在基因组序列相对应的两条链上各设计一条探针序列，使这一段序列长18120碱基，并使两条探针的序列不重合；对所设计并合成的探针的5端进行生物素标记；步骤3，按1/2的梯度稀释步骤1所得的用亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA，用步骤2所得的检测探针在2XSSC的盐浓度、PH值为80、60的反应温度条件下与梯度稀释的标准DNA样品进行杂交反应；步骤4，将步骤3的反应物分别加入用亲和素包被的酶标板，捕捉经过进行杂交反应的生物素标。
19、记的探针，并洗涤；步骤5，加入小鼠抗甲基化胞嘧啶（ANTI5METHYLCYTOSINE）单克隆抗体，在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行反应，并洗涤；步骤6，加入HRP偶联的羊抗小鼠单克隆抗体（GOATANTIMOUSEIGGHLHRPPAB），在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行反应，并洗涤；步骤7，加入HRP检测试剂（HRP底物TMB，3，3，5，5四甲基联苯胺）进行反应，然后终止反应并用酶标仪进行测定，并计算甲基化DNA的浓度和量；步骤8，判断是否存在甲基化DNA，判断方法为将步骤7中所计算。
20、得到的数据，对照以说明书CN104046680A4/5页7标准品检测到的甲基化DNA相应的特征性曲线，判断待测样品中是否存在甲基化DNA。0023实施例2，取正常人和已经证实为结肠癌病人粪便5克，加入5倍体积1XTE并充分混合，用等体积氯仿抽提一次，用06倍的异丙醇沉淀获得总DNA。以此DNA为待测样品，在与实施例1相同的条件下，检验本发明的实用性。0024其中与实施例1相同的条件，指的是除以实际临床样品提取的DNA为待测样品外，所有操作与实施例1相同。0025实施例二中的待测DNA样品，为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、各种体液DNA或各种排泄物DNA。
21、的样品。0026所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠细胞、直肠细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠组织、直肠组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述各种体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等。0027步骤1，用上述待测DNA样品为检测样品，已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA作为阴性对照和阳性对照；采用浓度为5M的亚硫酸钠溶液分别处理待测样品DNA和阴性对照、阳性对照，反应温度为60度，处理时间为4小时；步骤2。
22、，确定待测基因的检测区域和目标检测序列并设计合成探针在待测基因中选择一段序列A，使该序列A含有尽可能多的CPG位点，序列长度为18120碱基，以序列A经亚硫酸盐处理后的甲基化状态作为目标检测序列进行检测探针设计，以序列A的互补序列作为检测探针序列1；在待测基因组DNA中序列A下游区域的另一条链上，选择一段序列B，使序列B富含CPG位点且不与序列A重合，序列长度为18120碱基，以序列B经亚硫酸盐处理后的甲基化状态作为目标检测序列进行检测探针设计，以序列B的互补序列作为检测探针序列2，合成检测探针，并在合成的探针的5端进行标记；步骤3，按1/2的梯度稀释步骤1所得的用亚硫酸盐处理过的标准甲基化D。
23、NA和非甲基化DNA，用步骤2所得的检测探针在2XSSC的盐浓度、PH值为80、60的反应温度条件下与用亚硫酸盐处理过的待测样品DNA、梯度稀释的标准DNA样品分别进行杂交反应；步骤4，将步骤3的反应物分别加入用亲和素包被的酶标板，捕捉经过进行杂交反应的生物素标记的探针，并洗涤；步骤5，加入小鼠抗甲基化胞嘧啶（ANTI5METHYLCYTOSINE）单克隆抗体，在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行反应，并洗涤；步骤6，加入HRP偶联的羊抗小鼠单克隆抗体（GOATANTIMOUSEIGGHLHRPPAB），在1XPBST的盐浓度、PH80、05的脱。
24、脂奶粉作为封闭剂、25的反应温度条件下进行反应，并洗涤；步骤7，加入HRP检测试剂（HRP底物TMB，3，3，5，5四甲基联苯胺）进行反应，然后终止反应并用酶标仪进行测定，并计算甲基化DNA的浓度和量；步骤8，判断是否存在甲基化DNA，判断方法为将步骤7中所计算得到的待测样品DNA的数据，对照以标准品检测到的甲基化DNA相应的特征性曲线，判断待测样品中是否存在甲基化DNA。说明书CN104046680A5/5页80028实施例3，检测探针的设计P16基因转录启动区的甲基化是肺癌等多种癌症细胞具有的特征。P16基因转录启动区的序列如下，有下划线的部分为所选定的检测区域。0029HOMOSAPIE。
25、NSP16PROTEINCDKN2AGENE,CPGISLANDANDPARTIALCDS，DQ3255441基因组DNA正链SENSESTRAND5CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG3基因组DNA副链（ANTISEN。
26、SESTRAND）3GCCTGGCGCACGCGAGCCGCCGACGCCTCTCCCCCTCTCGTCCGTCGCCCGCCGCCCCTCGTCGTACCTCGCCCGCCGCCCCTCGTCGTACCTCGGAAGCCGACTGACCGACCGGTGCCGGCGCCGGGCCCGAGCCCATCTCCTCCACGCCCGCGACGACCTCCGCCCCCGCGACGGGTTGCGTGGCTTATCAATGCCAGCCTCCGGC5正链DNA在经过亚硫酸盐处理后的序列下划线部分是所设计的探针位置5CGGATCGCGTGCGTTCGGCGGTTGCGGAGAGGGGGAGAGTAGGTAGCG。
27、GGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGCGGGCGGCGGGGAGTAGTATGGAGTTTTCGGTTGATTGGTTGGTTACGGTCGCGGTTCGGGTTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGTTGTTGGAGGCGGGGGCGTTGTTTAACGTATCGAATAGTTACGGTCGGAGGTCG3副链DNA在经过亚硫酸盐处理后的序列下划线部分是所设计的探针位置3GCTTGGCGCATGCGAGCTGCTGATGCTTTTTTTTTTTTTGTTTGTTGCTTGCTGCTTTTTGTTGTATTTTGCTTGCTGCTTTTTGTTGTATTTTGGAAGCTGATTG。
28、ATTGATTGGTGCTGGCGCTGGGCTTGAGCTTATTTTTTTTATGCTTGCGATGATTTTTGCTTTTGCGATGGGTTGCGTGGCTTATTAATGCTAGCTTTTGGC5设计的上游探针5BIOTINCCCGCCGCCCGCTACCTACTCTCCCCCTCTCCGCAACCGCCGAACGCACGCGATCCG3设计的下游探针5BIOTINCGAACGCTACTAAAAACGAAAACGCTACCCAACGCACCGAATAATTACGATCGAAAACCG3上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。0030以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。说明书CN104046680A1/1页9图1说明书附图CN104046680A。