用PANTOEAAGGLOMERANSKFS－9菌生产2,3－丁二醇及其在化妆品中的应用.pdf

本发明的目的是提供一种能够生产2，3－丁二醇的菌株，以及利用2，3－丁二醇作为抗紫外辐射及抗氧化剂在化妆品中的应用。本发明从红树林中分离纯化出一株具有强紫外辐射耐受性细菌，其具有生产2，3－丁二醇的能力，该菌种具有营养要求范围广，生长周期短，成本低，产率高的特点，是一株具有工业化潜力的菌种。2，3－丁二醇具有很强的紫外吸收和抗氧化作用，能够清除活性氧自由基，阻断脂质过氧化反应。可作为抗氧化和抗紫外辐射剂应用于化妆品的开发。

1、  对生产2，3-丁二醇的菌种Pantoea agglomerans KFS-9实施专利保护，菌种保藏单位：CCTCC，保藏编号：M205086。

2、  对菌种Pantoea agglomerans KFS-9生产2，3-丁二醇实施专利保护，菌种保藏单位：CCTCC，保藏编号：M205086。

3、  对将2，3-丁二醇应用在化妆品中实施专利保护。

用Pantoea agglomerans KFS-9菌生产2，3-丁二醇及其在化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及一株生产2，3-丁二醇的细菌Pantoea agglomerans KFS-9以及2，3-丁二醇在化妆品中的应用。
背景技术
据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，能够生产2，3-丁二醇的菌种有：克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、气单孢菌属、沙雷氏菌属。未见关于本专利涉及的菌种Pantoea agglomerans产2，3-丁二醇的报道。目前能够实现工业化的只有Klebsiella pneumoniae(即Klebsiella oxytoca)和Bacillus polymyxa。前者分批发酵生产2，3-丁二醇的终浓度最高，可达到118g/L，产率为24g/L·h，产生2，3-丁二醇的量是后者的两倍，但是缺乏后者糖化淀粉的能力。本专利菌种采用双段发酵培养，发酵生产2，3-丁二醇的终浓度为104g/L，产率可达2.8g/L·h。本专利菌种生产2，3-丁二醇，用蔗糖代替葡萄糖作为发酵底物仍可获得同样的产率。因此与现有的菌种生产2，3-丁二醇相比，该菌种具有营养要求范围广，生长周期短，成本低，产率高的特点，是一株具有工业化潜力的菌种。
化妆品是以涂抹、喷洒或其它类似方法，施于人体表面任何部位(皮肤、毛发、指甲、口唇、口腔粘膜等)，以达到清洁消除不良气味护肤美容和修饰目的的产品化学性防晒成分是透过防晒品中的有效化学成分的分子，经皮肤表皮吸收后，跟紫外线生成交互作用使其转变成无害的能量目前国内外用于化妆品中的防晒产品主要有：4-氨基苯甲酸、乙氧基化-4-氨基苯甲酸乙酯、聚乙二醇-25对氨基苯甲酸、4-二甲氨基苯甲酸-2-乙基己酯、水杨酸高盂酯(胡莫柳酯)、水杨酸-2-乙基己酯、水杨酸钠、水杨酸苯酯、4-甲氧基肉桂酸-2-乙基己酯、羟苯甲酮、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮-5-磺酸及钠盐、二苯甲酮-2、二苯甲酮-9、异丙基二苯甲酰甲烷、3-亚苄基樟脑、3-(4’甲基亚苄基)-d-1-樟脑、1-(4-叔丁基苯基)3-(4-甲氧基苯基)丙烷-1，3-二酮、2，4，6-三-苯胺基-(对2羰-2’-乙基己基-1’-氧)-1，3，5-三嗪、2-氰基-3，3’二苯基丙烯酸-2-乙基己酯、2-苯基苯并咪唑-5-磺酸及盐等19种。没有将2，3-丁二醇作为抗紫外和抗氧化剂应用于化妆品的相关报道。
本发明人首次从红树林中筛选到一株具有强紫外辐射耐受性细菌，其对紫外辐射(主要是UV-B)的耐受性是大肠杆菌的8倍。实验结果表明该菌种高产2，3-丁二醇，且与大肠杆菌相比其代谢产物(主要是2，3-丁二醇)的存在与否对于该菌体的紫外存活率具有很大的影响(图1)。研究表明2，3-丁二醇具有很强的紫外吸收作用(图2)。2，3-丁二醇具有很强的抗氧化作用，能够清除活性氧自由基，阻断脂质过氧化反应。目前2，3-丁二醇的应用主要是作为燃料、化工原料合成其它化学品、制备聚和物、油墨、香水、防冻剂、熏蒸剂、增湿剂、炸药以及药物的手性载体等等。未见有关将其用于化妆品的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有生产2，3-丁二醇的细菌Pantoea agglomerans KFS-9以及将2，3-丁二醇作为抗紫外和抗氧化制剂应用于化妆品的开发。
本发明分离纯化出一株来源于红树林土壤的抗辐射细菌Pantoea agglomerans KFS-9。保藏单位简称CCTCC，保藏号为M205086。该菌株能够生产2，3-丁二醇。
本发明的特点是：
首次分离筛选出产生2，3-丁二醇的抗紫外辐射的Pantoea agglomerans KFS-9菌株。本专利菌种为兼性厌氧细菌，在发酵培养过程中采用双段发酵培养(首先是好氧发酵培养，然后是厌氧发酵转化)，该菌种具有生长周期短、成本低、产率高的特点。2，3-丁二醇由于其具有两个相邻的活泼-OH，具有吸附紫外辐射的能力，起到抗紫外作用有很强的抗氧化性和清除自由基的能力，具有抗衰老的作用，还原性羟基可捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链长度，因此，可阻断或减缓脂质过氧化的进行，起到抗氧化的作用。本发明首次提出可将2，3-丁二醇作为抗紫外辐射和抗氧化剂应用于化妆品的开发。
下面通过实施例说明本发明：
具体实施例
一、菌株的获得方法：
从红树林采集样品，将采集的样品用无菌生理盐水稀释到一定浓度后，分别取4ml置于一系列无菌小平皿(6cm)中，在平皿底部形成一层厚约15mm的菌悬液层将各个系列的小平皿分别利用UV-B辐照一系列的时间(5-20min)，然后在改进的蛋白胨牛肉膏葡萄糖培养基上涂平板，将在最大剂量辐射下存活的不具有芽孢结构的细菌分离纯化，传代验证其活性稳定，最终得到具有抗UV-B辐射活性的菌种，命名为KFS-9采用16S rRNA基因测序技术与传统生理生化特征相结合的方法对KFS-9菌株进行了鉴定，最终确定其属于Pantoea agglomerans(改进的蛋白胨 牛肉膏 葡萄糖培养基的组成：蛋白胨3g，牛肉膏2g，NaNO₃ 2g，蔗糖20g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，琼胶15g，H₂O 1000ml)。
将菌体接种到100ml IPGY液体培养基中，30℃培养，48h后，3000rpm离心20mM去除菌体，真空减压浓缩得到浓绸的液体，经硅胶减压柱层柝Sephadex LH-20柱色谱分离纯化获得纯化合物后，利用¹H and¹³C NMR获得NMR图谱，确定为2，3-丁二醇。
将生长稳定期的大肠杆菌(作为对照菌)和KFS-9菌离心收集，每种平均分为两份，一份利用无菌生理盐水洗涤三遍，一份直接溶于无菌生理盐水，将菌悬液分别取4ml置于一系列无菌小平皿(6cm)中，在平皿底部形成一层厚约1.5mm的菌悬液层利用UV-B灯(辐照光强为70μW·cm^-2)分别照射10s，20s，40s，1min，15min，2min，3min，4min，5min，6min，8min，10min，15min，20min照射后的菌悬液各取100μl均匀地涂抹在固体培养基上，大肠杆菌37℃培养，KFS-930℃培养，24h后计数菌落，绘制对数存活菌数—剂量曲线(图1)。
二、2，3-丁二醇的发酵工艺：
斜面培养基(g/L)：蛋白胨3，牛肉膏2，NaNO₃ 2，蔗糖20，MgSO₄·7H₂O 0.5，K₂HPO₄ 0.5，琼胶15g，PH7.0。
种子培养基(g/L)：蛋白胨3，牛肉膏2，NaNO₃ 2，蔗糖20，MgSO₄·7H₂O 0.05，K₂HPO₄0.5，FeSO₄·7H₂O0.05，MnSO₄·H₂O 0.05，葡萄糖20，pH7.0。
发酵培养基(g/L)：蛋白胨3，牛肉膏2，MgSO₄·7H₂O 0.05，K₂HPO₄ 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.05，MnSO₄·H₂O0.05，蔗糖140，pH7.0。
工艺流程：

本发明菌株生产2，3-丁二醇的提取工艺如下：
将2L发酵液3000rpm离心20min去除菌体，真空减压旋转蒸发浓缩到0.5L，1∶1(vol/vol)加入乙酸乙酯萃取3遍，将乙酸乙酯层旋转蒸发后得到纯度为986％的2，3-丁二醇。
三、用于化妆品应用：
以一种润肤霜为例，按以下配方配制油相和水相，将2，3-丁二醇添加到水相中，配制成含有2，3-丁二醇的化妆品。
油相：椰油(辛酸/癸酸)酯8.00％霍霍巴油3.00％十八醇7.50％十六酸十六酯5.00％、聚二甲基硅氧烷(350csks)10.00％、2-异辛基-2氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯5.00％、维生素E2.00％、甘油基硬脂酸酯3.00％。
水相：无离子水48.50％、甘油5.00％、2，3-丁二醇300％、柠檬酸调PH到5.6。
制法：将油相组分倒入容器中，搅拌加热到80～85℃，于另一容器中混合水相组分，搅拌加热到80～85℃。搅拌下将水相加入到油相均质、保温10分钟。冷却到50℃，分装。