芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法.pdf

芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法，涉及蛋白酶和发酵培养基。所述芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基的原料配方为：蛋白胨7g/L、酵母膏7g/L、NaCl20g/L、CaCl20.2g/L，pH为9.0。发酵方法如下：在锥形瓶中装入已消毒灭菌的芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，再将芽孢杆菌A3440的种子液接种至锥形瓶中进行发酵培养，即完成采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵。通过优化发酵条件，提高了菌液的芽孢率与蛋白酶活力。在优化条件下芽孢率为94.3％，蛋白酶活力为294.44U/mL，有利于芽孢杆菌的培养，降低后续工作的成本。

1.  芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，其特征在于其原料配方为：蛋白胨7g/L、酵母膏7g/L、NaCl20g/L、CaCl₂0.2g/L，pH为9.0；所述芽孢杆菌为芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440。

2.  采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法，其特征在于具体方法如下：在锥形瓶中装入已消毒灭菌的芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，再将芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440的种子液接种至锥形瓶中进行发酵培养，即完成采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵。

3.  如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法，其特征在于所述锥形瓶采用250mL锥形瓶，发酵培养基的加入量为30mL。

4.  如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法，其特征在于所述消毒灭菌的温度为120℃，消毒灭菌的时间为30min。

5.  如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法，其特征在于所述接种的接种量按质量百分比为芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基的8％。

6.  如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法，其特征在于所述发酵培养的条件是置于恒温摇床上进行发酵培养，培养温度30℃，培养时间24h。

芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法
技术领域
本发明涉及蛋白酶和发酵培养基，尤其是涉及芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法。
背景技术
伴随着养殖业的快速发展、集约化程度的提高以及沿海水质的日益恶化，水产养殖动物爆发性病害日益增多。虽抗生素及化学药物的应用在一定程度上缓解和控制了水产生物病害的发生和蔓延，但随之而来的弊端也日渐显露。它不仅违背人们所倡导的健康养殖宗旨，同时也干扰养殖环境及水生动物微生态平衡，导致水产动物对病原微生物的易感性，更严重的是病原菌的耐药性增强，使得水产养殖病害防治工作越加困难。另外，抗生素在水生动物体内的残留、富集，使得水产品质量降低，成为了水产品销售量和出口贸易量的限制因素。
1986年，Kozasa等首次利用芽抱杆菌处理日本鳗鲡降低了由于感染爱德华氏菌而引起的死亡后，益生菌在水产研究方面得到迅速发展。益生菌是指“当摄入一定量时对宿主健康有作用的微生物活体”，具有无毒副作用、无残留、无耐药性等优点。现阶段益生菌在水产养殖中的应用，主要体现在通过改善养殖对象体内外的微生物群落，增大养殖对象对饲料的摄食率，增强其营养价值，同时提高养殖对象的免疫能力，以此提高养殖对象的产量，在鱼类与贝类的养殖中都发挥积极的作用。近年来，对益生菌制剂在水产养殖方面的理论与应用研究已逐渐成为世界范围内的热潮。我国农业部公布了5种能够应用于动物养殖的微生物，包括乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、粪链球菌和双歧杆菌。
芽孢杆菌，多属芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性，大多为好氧或兼性厌氧。其具有分解转化和适应能力强，可代谢产生蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶类，提高养殖对象对饲料的吸收与转化，促进动物生长，同时其对养殖对象和人类无害等特点，使其在作为饲料微生态添加剂和水体微生态调节剂上都有广阔的应用前景。芽孢杆菌作为益生菌的作用机理表现在(1)降低养殖水体中有毒物质含量，改善水环境；(2)提高动物的机体免疫力、减少病害发生几率；(3)提高动物消化酶活力、促进快速生长；(4)调节动物体内微生态平衡等方面。因此，提高益生菌的消化酶活力，有利于促进宿主健康生长。芽孢杆菌的一个重要特征 是，当环境苛刻或营养供给不足时，在芽孢杆菌内会形成一个近似圆形的内生孢子，成为芽孢。此时，细菌的新陈代谢几乎停止，对不利的条件具有极强的抵抗性，具有耐高温、耐干燥、耐酸碱的特点。因此芽孢杆菌制剂易于保存与运输，在恶劣条件下仍不影响其品质，活化后可以继续投入使用。微生态制剂中芽孢杆菌形成的芽孢数量是一个判断微生态制剂质量的重要指标。
目前，对益生芽孢杆菌的研究包括两个方面：其一，筛选优良菌株，构建庞大的益生菌资源库。其二，对于已知的有益菌株，通过研究优化其培养条件，降低培育成本、提高菌株产量与活性，具有重要的现实意义。芽孢杆菌的发酵培养是工业化大规模生产芽孢杆菌制剂的前提。
本申请人在中国专利201210016016.2中公开一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉及其制备方法，其中披露了芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440，该菌于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5253。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基。
本发明的另一目的在于提供一种采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法。
所述芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基的原料配方为：蛋白胨7g/L、酵母膏7g/L、NaCl20g/L、CaCl₂0.2g/L，pH为9.0；所述芽孢杆菌为芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440，该菌于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5253(参见本申请人的在先中国专利申请201210016016.2)。
所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法如下：在锥形瓶中装入已消毒灭菌的芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，再将芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440的种子液接种至锥形瓶中进行发酵培养，即完成采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵。
所述锥形瓶可采用250mL锥形瓶，发酵培养基的加入量可为30mL；所述消毒灭菌的温度可为120℃，消毒灭菌的时间可为30min；所述接种的接种量按质量百分比可为芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基的8％；所述发酵培养的条件可置于恒温摇床上进行发酵培养，培养温度30℃，培养时间24h。
本发明通过优化发酵条件，提高了菌液的芽孢率与蛋白酶活力。经试验，在优化条件下 芽孢率为94.3％，较出发培养基提高8.77％；蛋白酶活力为294.44U/mL，较出发培养基提高76.67％。有利于芽孢杆菌的培养，降低后续工作的成本。
本发明优化了芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440的培养条件，为芽孢杆菌制剂的工业化生产提供理论依据与技术支持。
附图说明
图1是本发明中酪蛋白标准曲线。
图2是本发明中芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440的生长曲线。
图3是本发明中不同碳源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图4是本发明中不同碳源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响图。
图5是本发明中不同氮源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图6是本发明中不同氮源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响图。
图7是本发明中不同无机盐对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图8是本发明中不同无机盐对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响图。
图9是本发明中不同金属离子对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图10是本发明中不同金属离子对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响图。
图11是本发明中不同温度对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图12是本发明中不同温度对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响图。
图13是本发明中不同接种量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图14是本发明中不同接种量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响图。
图15是本发明中不同装液量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图16是本发明中不同装液量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响图。
图17是本发明中不同初始pH值对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产蛋白酶的影响图。
图18是本发明中不同初始pH值对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440产芽孢的影响 图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440，于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5253(参见本申请人的在先中国专利申请201210016016.2)。
1材料与方法
1.1菌株
芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440，由厦门大学海洋与地球学院分离保存。
1.2基础发酵培养基
以2216E液体培养基作为基础发酵培养基：蛋白胨5g/L、酵母膏1g/L、磷酸高铁0.01g/L、陈海水1L。
1.3试验方法
1.3.1种子液培养
用接种环将-80℃保存的芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440接种于2216E固体培养基上，30℃培养48h进行活化。活化2次之后，从2216E平板上挑取一环单克隆A3440，接种于装有100mL 2216E液体培养基的250mL锥形瓶，200r/min、30℃摇床培养20h后备用。
1.3.2生长曲线的测定
将上述种子液接种于装有100mL基础发酵培养基的250mL锥形瓶中，接种量为1％，200r/min、30℃摇床培养。每隔2h取样，以基础发酵培养基为空白，测定发酵液在630nm条件下的吸光度。以培养时间为横坐标，OD₆₃₀为纵坐标，绘制芽孢杆菌A3440的生长曲线。
1.3.3芽孢率的测定
采用稀释平板计数法，选取10⁶、10⁷、10⁸三个浓度梯度，每个梯度涂布3个平板，30℃培养48h后进行计数。将菌液80℃水浴10min后稀释平板计数，芽孢率＝80℃水浴计数/发酵液活菌数。
1.3.4蛋白酶活力的测定
用100μg/mL的酪蛋白标准溶液配制标准系列溶液，酪蛋白终浓度0、10、20、30、40、50μg/mL，分别使用生工改良型lowey法蛋白浓度测定试剂盒处理，在酶标仪上测定 其OD₆₃₀，绘制标准曲线。以蒸馏水作为空白对照。标准曲线见图1。
样品测定方法：取发酵菌液1ml，在8000rpm离心15min，分别取0.2ml加入2个1.5mL离心管，标记为实验组与空白组。40℃水浴2min，空白组加入0.4mol/L三氯乙酸0.4ml。各组加入1％酪蛋白0.8ml，40℃保温20min。实验组加入0.4ml 0.4mol/L三氯乙酸，保温20min。离心取上清，稀释100倍。取20ul于酶标板，以20ul蒸馏水作为对照。使用生工改良型lowey法蛋白浓度测定试剂盒处理，在酶标仪上测定其OD₆₃₀。
计算公式：
酶活力(U/mL)＝△OD*1ml*N/(k*20min)
其中△OD为实验组与空白组OD₆₃₀差值；N为酶液的稀释倍数；k为标准曲线斜率。
1.3.5不同碳源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
将基础发酵培养基中的蛋白胨替换为等量的淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，以不加碳源的培养基作为阴性对照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200r/min条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同碳源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
1.3.6不同氮源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
将基础发酵培养基中的酵母膏替换为等量的牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵，以上述实验的最优碳源代替基础发酵培养基中的蛋白胨、以不加氮源的培养基作为阴性对照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同氮源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
1.3.7不同无机盐对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
将基础发酵培养基中的陈海水替换为10‰NaCl、10‰KCl、10‰MgSO4、10‰CaCl₂加单蒸水，以上述实验的最优碳源和氮源代替基础发酵培养基中的蛋白胨和酵母膏、以不加无机盐的培养基作为阴性对照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同无机盐对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
1.3.8不同金属离子对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
将基础发酵培养基中的磷酸高铁替换为等量Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺，以上述实验的最优 碳源、氮源和无机盐代替基础发酵培养基中的蛋白胨、酵母膏和陈海水、以不加金属离子的培养基作为阴性对照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同金属离子对A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
1.3.9培养基成分的正交优化
根据以上的实验结果，选择最优碳源、最优氮源、最优无机盐、最优金属离子四因素四水平设计正交实验。具体实验设计如表1所示。
表1 芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440摇瓶正交试验设计

1.3.10温度对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
根据正交试验结果配制发酵培养基。以1％接种量加入种子液，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五种温度培养，在200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同温度对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
1.3.11接种量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
根据正交试验结果配制发酵培养基。分别以1％、3％、5％、8％、10％接种量加入种子液，在最优温度、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同接种量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
1.3.12装液量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
根据正交试验结果配制发酵培养基。在250mL锥形瓶中分别加入20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL培养基，以最优接种量加入种子液，在最优温度、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同装液量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
1.3.13初始pH值对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响
根据正交试验结果配制发酵培养基。以最优接种量加入种子液，在最优温度、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同初始pH值对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
2.结果与分析
2.1芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440生长曲线(见图2)
在0～10h，菌体生长速度缓慢；在10～28h，菌体生长速度加快；从28h开始，菌体生长速度逐渐减小。因此选择处于生命力旺盛的对数期的菌体作为种子液，选择24～26h作为种龄。
2.2培养条件优化
2.2.1不同碳源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响(见图3和4)
结果表明，以蛋白胨、蔗糖、乳糖作为碳源，芽孢率较大，都在85％以上。但蛋白胨作为碳源，生物量和蛋白酶活力都高出其他组，因此选择蛋白胨作为最优碳源。
2.2.2不同氮源对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响(见图5和6)
结果表明，以酵母膏、乙酸铵、牛肉膏作为氮源，芽孢率较大，都在80％以上。但酵母膏作为氮源，生物量和蛋白酶活力都高出其他组，因此选择酵母膏作为最优氮源。
2.2.3不同无机盐对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响(见图7和8)
结果表明，各实验组芽孢率并无明显差异，以NaCl和KCl作为无机盐，生物量较大，且NaCl作为无机盐时，发酵液的蛋白酶活力最强，因此选择NaCl作为最优无机盐。
2.2.4不同金属离子对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响(见图9、图10)
结果表明，以Fe³⁺和Ca²⁺作为金属离子时，发酵液蛋白酶活力较高。以Ca²⁺作为金属离子作为金属离子时，有最高的生物量和芽孢率，因此选择Ca²⁺作为最优金属离子。
2.2.5芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440菌株摇瓶正交试验结果(见表2)
由表2可知，极差值R_蛋白胨>R_NaCl>R_酵母膏>R_CaCl2，可知蛋白胨作为主要的影响因素，NaCl次之。由均值K得出最佳的组合为A3B3C4D4，即7‰蛋白胨、7‰酵母膏、20‰NaCl、0.2‰CaCl₂组合进行发酵条件的优化。
2.2.6不同温度对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响 (见图11和12)
结果表明，在30℃和35℃时，发酵液的蛋白酶活力最高，但随着温度的升高，发酵液的芽孢率不断降低，因此选择30℃最为最适温度。
2.2.7不同接种量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响(见图13和14)
结果表明，接种量在3％～8％时，蛋白酶活力最高，但接种量为5％时，生物量偏低，接种量为8％时，具有较高的生物量和芽孢率，因此选择8％作为最适接种量。
表2 芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440摇瓶正交试验结果

2.2.8不同装液量对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响(见图15和16)
结果表明，在装液量为20～40mL时，发酵液的蛋白酶活力较高，在装液量为30mL时，具有最高的生物量和芽孢率，因此选择30nL作为最适装液量。
2.2.9不同初始pH值对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响(见图17和18)
结果表明，pH值为9.0时，发酵液具有最高的蛋白酶活力和芽孢率，因此选择最适pH值为9.0。
微生物发酵是一个复杂的生理生化过程，当菌体处于不同营养条件时，会直接影响菌体的生理代谢。要提高芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440发酵液中蛋白酶活力和芽孢率，必须对发酵条件进行优化。本发明对芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440发酵条件进行优化，通过单因素和正交优化法确定了其最佳发酵产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，该发酵培养基的原料配方为：蛋白胨7g/L、酵母膏7g/L、NaCl20g/L、CaCl₂0.2g/L，pH为9.0。培养条件为将芽孢杆菌(B.stratosphericus)A3440的种子液按8％接种量接种至250，L锥形瓶中，该锥形瓶中装有30mL已消毒灭菌的发酵培养基；之后将所述锥形瓶置于恒温摇床上进行发酵培养，培养温度30℃、培养时间24h。