一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核酸分子及其制备方法.pdf

本发明的目的是提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核糖核酸分子及其制备方法，本发明的用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或3。利用本发明的方法可以快速制备大量的双链RNA，低成本，高效率，制备方法操作简便。同时，本发明筛选的核苷酸片段能达到很好的干扰效率，能够有效的干扰罗氏沼虾雄性生殖系统的发育。同时，利用本发明制备的双链可以在虾类动物体内实现长期、高效的基因沉默，为虾类功能基因的研究提供较好的技术手段和方法。

1.  一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，包含有：
1)、核苷酸序列为SEQ ID NO:1的核酸分子；
2)、与1)中的核酸分子具有85％以上同源性，且具有1)中核酸分子作用的核酸。

2.  如权利要求1所述核苷酸分子，其特征在于，所述的2)中的同源性为90％以上。

3.  如权利要求2所述核苷酸分子，其特征在于，所述的2)中的同源性为98％以上。

4.  一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

5.  权利要求1或3所述的核苷酸分子用于制备干扰罗氏沼虾雄性生殖发育的双链RNA。

6.  一种将权利要求1或4所述的核苷酸分子制成双链RNA的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：
1)目的核酸片段的扩增：
以罗氏沼虾雄性生殖系统组织的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因的核苷酸片段，其中扩增所用的引物序列如下：
正向引物序列为：5′-GCTCTAGAATAATGGCTCCCTTCTTCAA-3′，
反向引物序列为5′-CGGGATCCGCTCAATCATAAAAACGTCC-3′；
2)连接转化
利用限制性核酸内切酶，对目的核苷酸片段和双链表达质粒分别进行双酶切，将酶切后的目的片段和质粒进行连接，制备获得含有目的核苷酸片段的重组质粒，将该重组质粒转入到大肠杆菌的感受态细胞E.coli DH5α中，鉴定并挑选出含有正确插入序列的单菌落；
3)双链RNA的诱导表达
从大肠杆菌中抽提出含有目的插入序列的载体，并将其转入到表达型大肠杆菌的菌株E.coli HT115中，摇菌，进行扩大培养，添加适量的异丙基硫代半乳糖苷诱导双链表达；利用离心的方式收集菌体，根据双链RNA的纯化流程，将菌种中的双链RNA抽提纯化，琼脂糖电泳，测定双链RNA浓度，低温保存。

一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核酸分子及其制备方法
技术领域
本发明属于基因缺失失活技术领域，具体涉及一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核糖核酸分子，可用于罗氏沼虾雄性生殖相关的RNA干扰研究。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术作为一种基因功能研究的重要手段，已被广泛用于探索虾蟹动物的基因功能领域。RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能领域。
目前，RNA干扰技术主要是利用小干扰RNA(siRNA)来实现基因沉默，其制备方法主要有化学合成，体外转录和体内表达三种，各有利弊。化学合成方法能制备高质量的RNA干扰样品，但价格高，定制周期长；体外转录方法合成，成本相对较低，但实验的规模和量受到限制，不适用于样品需求量大的长期研究；体内表达主要指采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架，可以进行较长期研究，但只适用于细胞水平。
虾蟹动物作为一种重要的经济甲壳动物，其功能基因的发掘和应用研究进展较慢，主要原因之一是缺乏可用于长期动物实验研究所需的、具有高效基因沉默效果的RNA干扰样品。目前，常用的小干扰RNA在动物实验时难以维持长效的干扰效率，而且动物实验所需RNA用量大，合成成本过高。因此，在探索虾蟹动物基因功能领域中，快速而高效地制备大量的双链RNA样品，是开展长期动物实验研究的重要前提和基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核糖核酸分子及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，包含有：
1)核苷酸序列为SEQ ID NO:1的核酸分子
Tgtttgctggttttgatgaaaaaaggaatcgtcattcttgagatctggagagcgagattagcaacagaggtcactgcgaataatggctcccttcttcaagttgatctccgtcatggtgatggtcgccatgggattcatcctggtctctgaagctgcaagtgatttacaagatgctgcaatgcacgattatccaactgtgcttgaaataatcggaagtccacgaatgaagaggtctccccacaaagcagagagcggtttctacggcagtaacagggggatggaagcagacttctttggcgactctggaacctattccacaggat acggtttggggggtctgtcaagattaacaggcaaattcagtggcgaaggggaattcgctggcggagctcattcaggacgtttttatgattgagctgctgtgcttcagtaatggcgaccacagggtccaatcaggagaatgacccagattcacagtttggacatgatagcggataagaaatatggtactgatttgttaaaaagcatagaatgagctgaattcaatttaaagaaaggattttactacttttactaataagtaaagcgcctgtttctcgacaataaacatcatcacgataggagttaaagaaacatttatgtaaattaggaaataaatcaattcacttaataaaaaaaaaaaa；
2)与1)中的核酸分子具有85％以上同源性，且具有1)中核酸分子作用的核酸。
上述2)中的同源性，优选为90％以上；
上述核苷酸分子编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO2；
MAPFFKLISVMVMVAMGFILVSEAASDLQDAAMHDYPTVLEIIGSPRMKRSPHKAESGFYGSNRGMEADFFGDSGTYSTGYGLGGLSRLTGKFSGEGEFAGGAHSGRFYD.
为了提高RNAi的效率，申请人对序列为SEQ ID NO:1的核酸分子进行了优化选择，在不改变编码蛋白序列的情况下，主要选取目的基因开放阅读框区域，包含338个核苷酸组成的基因片段序列，改造后的核酸分子的序列为SEQ ID NO:3；
ataatggctcccttcttcaagttgatctccgtcatggtgatggtcgccatgggattcatcctggtctctgaagctgcaagtgatttacaagatgctgcaatgcacgattatccaactgtgcttgaaataatcggaagtccacgaatgaagaggtctccccacaaagcagagagcggtttctacggcagtaacagggggatggaagcagacttctttggcgactctggaacctattccacaggatacggtttggggggtctgtcaagattaacaggcaaattcagtggcgaaggggaattcgctggcggagctcattcaggacgtttttatgattgagc
上述的核苷酸分子用于制成双链RNA样品，可实现高效干扰效率，从而干扰罗氏沼虾雄性生殖发育；
本发明还提供把上述核苷酸分子制成双链RNA的方法，包括有如下的步骤：
1)目的核酸片段的扩增：
以罗氏沼虾雄性生殖系统组织的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因的核苷酸片段，其中扩增所用的引物序列如下：
正向引物(Forward Primer，FR)序列为：
5‘-GCTCTAGAATAATGGCTCCCTTCTTCAA-3’，下划线标注核苷酸为XbaI限制性核酸内切酶的识别位点；
反向引物(Reverse Primer，RP)序列为
5‘-CGGGATCCGCTCAATCATAAAAACGTCC-3’，下划线标注核苷酸为BamHI 限制性核酸内切酶的识别位点；扩增得到目的基因的核苷酸片段两端分别含有限制性核苷酸内切酶的识别位点；
2)连接转化
利用限制性核酸内切酶，对目的核苷酸片段和双链表达质粒分别进行双酶切。将酶切后的目的片段和质粒进行连接，制备获得含有目的核苷酸片段的重组质粒。将该重组质粒转入到大肠杆菌的感受态细胞E.coli DH5α中，鉴定并挑选出含有正确插入序列的单菌落，-80度保存菌种。
3)双链RNA的诱导表达
从大肠杆菌中抽提出含有目的插入序列的载体，并将其转入到表达型大肠杆菌的菌株E.coli HT115中，摇菌，进行扩大培养，添加适量的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导双链表达。利用离心的方式收集菌体，根据双链RNA的纯化流程，将菌种中的双链RNA抽提纯化，琼脂糖电泳，测定双链RNA浓度，低温保存待用。
通过上述方法，可以简单快捷地将目的核苷酸分子制成双链RNA样品。双链RNA的产率高，可实现每升菌液中微克级双链RNA的提纯，满足动物实验对双链样品浓度需要。
同时，利用上述核苷酸分子制成双链RNA样品，可实现高效干扰效率，从而干扰罗氏沼虾雄性生殖发育，动物实验包括如下步骤：
1)RNA干扰效率检测
将目的基因的双链RNA样品，注射到成熟雄性罗氏沼虾体内开展RNA干扰实验。对照组选用注射等量的绿色荧光蛋白(GFP)双链RNA的雄性沼虾为参照。经过一定时间的养殖实验后，从沼虾的头胸部解剖取出雄性生殖系统各组织，用于干扰效率测定。利用半定量PCR的方法检测核酸表达水平，研究结果表明，与对照组相比，实验组中目的基因的表达水平明显下降，RNA干扰效率达到80％以上。以上研究结果表明，利用本操作步骤制备的双链RNA样品具有高效的干扰效率，可以有效地实现目的基因沉默。
2)沼虾生殖发育实验
目的基因是罗氏沼虾雄性生殖体统中特异性表达基因，推测其与雄性生殖系统的形成和发育有关。因此，利用本发明制备的RNA样品开展目的基因的动物实验，可进一步阐明其在雄性生殖过程中的生理功能。根据目的基因的表达特征，在幼虾阶段开展RNA干扰实验，沉默目的基因，观察罗氏沼虾在成熟过程中雄性生殖系统的发育和变化情况。
利用石蜡切片的方法制备雄性生殖系统的组织切片，结合曙红和苏木素的细胞染色方法，清晰展现雄性生殖系统中各细胞的形态、数目、分布和发育情况。研究结果表明，雄虾的目的基因沉默后，罗氏沼虾雄性生殖系统中的精巢发育发生明显变化。与对照组相比，目的RNAi组精巢中精囊小泡的细胞组成有较大区别，其精囊小泡中精原细胞较少，而精子细胞数目较多。以上实验结果说明，目的基因在精巢的生精过程及精囊小泡的发育中具有重要作用。
综上所述，利用本发明的方法可以快速制备大量的双链RNA，低成本，高效率，制备方法操作简便。同时，本发明筛选的核苷酸片段能达到很好的干扰效率，能够有效的干扰罗氏沼虾雄性生殖系统的发育。同时，利用本发明制备的双链可以在虾类动物体内实现长期、高效的基因沉默，为虾类功能基因的研究提供较好的技术手段和方法。
附图说明
图1：本发明选用的核糖核酸的分子信息图；
图2：双链RNA电泳结果图；
图3：RNA干扰效率图；
图4：罗氏沼虾目的基因沉默后精巢切片图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：
实施例1干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链RNA制备
1.分子克隆
·申请人在之前的研究中发现了与罗氏沼虾雄性发育有关的基因片段，分别设计带有限制性核酸内切酶的酶切位点的正向引物和反向引物，用于PCR扩增反应。正向引物(Forward Primer，FR)序列为：
5‘-GCTCTAGAATAATGGCTCCCTTCTTCAA-3’(下划线标注为XbaI内切酶的酶切位点)；反向引物(Reverse Primer，RP)序列为
5‘-CGGGATCCGCTCAATCATAAAAACGTCC-3’(下划线标注为BamHI内切酶的酶切位点)。
以罗氏沼虾雄性生殖系统组织的cDNA为模板，进行PCR扩增。
PCR反应体系为：


加水至终体积为25μl。
PCR扩增反应条件为：94℃变性5min，35个扩增循环(94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min。PCR扩增的片段包含开放阅读框，如图1所示。
PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，然后采用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并作定量分析。
纯化后的PCR产物和pET-T7载体分别进行双酶切，反应体系如下：
(以XbaI和BamHI为例)
pET-T7双酶切：

加水至终体积20μl，37℃反应过夜。
PCR产物双酶切：

加水至终体积20μl，37℃反应4小时。
酶切后的产物用凝胶回收试剂盒纯化后进行电泳检测，定量分析。
酶切产物采用DNA连接试剂盒进行连接，并转入大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α中，具体操作方法如下所述。
(1)连接和转化反应
采用pET-T7 载体，10μl的连接体系，具体操作如下：
(a)在200μl PCR管混合下列成分：
PCR产物               4μl
pET-T7 载体            1μl
Solution I               5μl
混匀离心，16℃连接过夜。
(b)取感受态细胞DH5α，融化后加入10μl连接产物，轻轻混匀，然后冰上放置30min；
(c)42℃热击1.5min，然后迅速放到冰上2-5min；
(d)加入1ml LB培养基，37℃，150rpm，培养1hr；
(e)3000rpm,3min离心收集细胞，弃去上清；
(f)用枪头轻轻吹打混匀，将适量菌液涂到预热的LB平板上(含终浓度50μg/ml氨苄青霉素)，37℃，倒置培养过夜。
(2)插入片段检测
用牙签挑取若干个单菌落，放到200μl的LB培养基(含终浓度50μg/ml氨苄青霉素)中，37℃，220rpm，培养1hr；取1μl用作PCR反应的模板。
利用PCR反应筛选阳性克隆，取上述正向引物和反向引物进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，选取含有目的片段的阳性菌落，测序，分析插入片段序列的正确性。
挑取经鉴定含有正确插入序列的单菌落，接种于LB液体培养基中(含50μg/ml氨苄青霉素)，37℃培养12-16hr，然后采用质粒抽提试剂盒抽提质粒，将该质粒转化到表达型菌株E.coli HT115中，转化和鉴定方法同上所述。
2.双链RNA的诱导表达
将含有pET-T7-目的质粒的E.coli HT115菌落进行培养并诱导其表达双链RNA，具体方法如下：
(1)将携带pET-T7-目的的E.coli HT115接种于5ml LB液体培养基中(含有50μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml四环素)，37℃，200rpm，培养过夜；
(2)以1：50的比例转接到新鲜的、含有双抗的LB培养基中(含有50μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml四环素)扩大培养，在同样条件下培养2-3hr；
(3)当细菌生长到OD₆₀₀＝0.4-0.6时，加IPTG至终浓度0.4mM，于37℃诱导培养4hr；
(4)5,000rpm，4℃离心，收集细菌沉淀；
(5)1×PBS漂洗2次，离心收集沉淀，4℃保存；
3.双链RNA的制备
(1)将菌体重悬于适量1M NH₄Ac/10mM EDTA缓冲液中；
(2)将菌液分装于1.5ml离心管中(0.75ml/管)，加入等体积的酸酚(pH4.0)/氯仿混合液(v:v＝1:1)，充分震荡混匀，65℃，水浴20min，自然冷却至室温；
(3)13000g，20min离心，将75-80％的上清转到新的离心管中，加入等体积100％异丙醇，室温放置10min，或30min，4℃；
(4)12000g，10min，4℃离心，去除上清；
(5)加入1ml 75％乙醇重悬洗涤，12000g，5min，4℃离心，去除上清；
(6)将离心管倒扣于干净的吸水纸上，室温干燥；
(7)加入适量RNase A缓冲液(RNase A buffer)，溶解沉淀；
(8)加入终浓度为5ng/ul的RNA核酸酶(RNase A)，37℃反应约30min,电泳检测酶切产物；
(9)将酶切产物混合后，加入等体积的酸酚/氯仿混合液(v:v＝1:1)，充分混匀，室温放置5min，
(10)12000g，10min，4℃离心；
(11)将75-80％的上清转到新的离心管中，加入1ml100％乙醇，颠倒混匀，室温放置30min，或4℃，过夜；
(12)12000g，10min，4℃离心，去除上清；
(13)加入1ml 75％乙醇重悬洗涤，12000g，5min，4℃离心，去除上清；
(14)将离心管倒扣于干净的吸水纸上，室温干燥；
(15)加入适量PBS缓冲液溶解；
(16)取少量样品进行核酸电泳检测，双链RNA电泳结果如图2所示。
(17)用紫外分光光度计(OD_260/280)测定RNA的浓度和质量。浓度计算公式：RNA(μg/μl)＝OD₂₆₀×0.045×稀释倍数，制备获得的双链RNA样品浓度达4.5μg/μl。
(18)双链RNA样品-20℃保存。
上述的LB液体培养基为含有10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠和50μg/ml氨苄青霉素溶液的混合液，pH为7.0；
磷酸缓冲液为8g/l氯化钠NaCl，0.2g/l氯化钾KCl，1.38g/l磷酸氢二钠Na₂HPO₄，0.24g/l磷酸二氢钾KH₂PO₄的混合液，pH为7.0；
核糖核酸酶A缓冲液为含300mmol/L的醋酸钠NaAc，10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸Tris-HCl溶液的混合液，pH为7.5；
酚氯仿溶液为pH 4.0的酸性饱和酚与氯仿按体积比1：1混合而成的混合液。
4.RNA干扰效率和沼虾动物实验
利用本发明制备的双链分子开展罗氏沼虾的RNA干扰实验，研究结果表明该双链RNA分子进入动物体内后会引起目的基因沉默。与对照组(注射绿色荧光蛋白)沼虾体内目的基因的表达情况相比较，实验组沼虾体内目的基因表达量显著降低，很好地实现基因沉默，且能够有效的干扰罗氏沼虾雄性生殖系统的发育。
为了提高RNAi的效率，申请人对序列为SEQ ID NO:1的核酸分子进行了优化选择，在不改变编码蛋白序列的情况下，主要选取目的基因开放阅读框区域，包含338个核苷酸组成的基因片段序列，改造后的核酸分子的序列为SEQ ID NO:3；
ataatggctcccttcttcaagttgatctccgtcatggtgatggtcgccatgggattcatcctggtctctgaagctgcaagtgatttacaagatgctgcaatgcacgattatccaactgtgcttgaaataatcggaagtccacgaatgaagaggtctccccacaaagcagagagcggtttctacggcagtaacagggggatggaagcagacttctttggcgactctggaacctattccacaggatacggtttggggggtctgtcaagattaacaggcaaattcagtggcgaaggggaattcgctggcggagctcattcaggacgtttttatgattgagc
按照上述步骤2-4的方法进行检测，结果表明在动物的RNA干扰实验中，改造后核酸分子的干扰效用比核苷酸序列为SEQ ID NO:1的核酸分子明显提高。SEQ ID NO:1的核苷酸片段长度为683bp，SEQ ID NO:3的核苷酸片段长度为338bp，SEQ ID NO:3的核苷酸片段长度仅为SEQ ID NO:1的49.5％。以SEQ ID NO:3的核苷酸片段制备的双链RNA在动物实验中提升近一倍的干扰效用，即仅用50％的双链RNA样品便可实现高效的干扰效率。
综上所述，利用本发明制备的双链可以在虾类动物体内实现长期、高效的基因沉默，为虾类功能基因的研究提供较好的技术手段和方法。