一种 Bt 蛋白 Cry62Aa1、 其编码基因及应用 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种新的 Bt 蛋白及其编码基因和应用。背景技术 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， 简称 Bt) 是一种革兰氏阳性好氧细 菌， 它在形成芽孢的过程中， 会在菌体的一端或两端形成一个或多个独特的伴胞晶体蛋白， 这是唯一能区分两个分类学上的近缘物种 B.thuringiensis 和 B.cereus 的特征。不同 菌株晶体蛋白的形状、 大小和组分均各不相同， 并且常常存在特异的杀虫活性， 故称为杀虫 晶体蛋白 (insecticidal crystal protein， ICP)。这种蛋白对鳞翅目、 双翅目、 鞘翅目等 多种昆虫， 以及线虫、 螨类和原生动物等都具有特异的杀虫活性 (Faust RM.， et al.1983. Plasmid， 9： 98-103.)， 而对哺乳动物没有任何有害作用， 广泛应用于卫生与农业害虫的防 治 (Schnepf HE， et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev， 62 ： 775-806)。 Bt 的杀虫晶体蛋白 主要包含两个结构上无任何相关性的蛋白家族 ： Cry 蛋白和 Cyt 蛋白， 前者对特异的昆虫有 毒性， 而后者对无脊椎动物和脊椎动物细胞具有广泛的溶细胞活性， 包括昆虫和哺乳动物 红细胞。 目前， Cry 蛋白现在已被划分为 69 个不同类型 ： Cry1-Cry69， 而 Cyt 仅有三个类型 ： Cyt1、 Cyt2 和 Cyt3(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt)(Crickmore N， Zeigler DR， Feitelson J.1998.Microbiol Mol Biol Rev， 62 ： 807-813.)。
至今人们已从世界各地的昆虫、 土壤和植物体表等样本中分离到数万株 Bt 菌株， 但其中绝大部分 Bt 菌株没有杀虫活性， 因此这些菌株一直不受重视， 它们的生物学特征也 很少被研究过。直到 1999 年， 日本学者 Mizuki 才对这类能产生晶体蛋白， 而没有杀虫活性 的 Bt 菌进行深入研究 (Mizuki E.et al.1999.J Appl Microbiol， 86 ： 477-486)。他发现 Bt 菌株 A1190 所产生的 81kDa 伴孢晶体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞 ( 人白血病 T 细胞 MOLT-4、 人子宫颈癌细胞等 ) 具有杀伤能力， 而且无溶血作用。此外， 由 于 Cyt 类杀虫晶体蛋白的溶细胞活性， Al-yahaeet 等将 Cyt2 蛋白与肿瘤细胞抗体融合为 一个特异破坏肿瘤细胞的融合蛋白进行临床研究， 结果表明 Cyt2 蛋白对癌细胞具有抑制 作用 (Al-yahaee SAand Ellar DJ.1996.Bioconjug Chem， 7： 451-460)。该研究是继发现 Bt 以色列变种之后又一个与医学联系的全新领域， 可能为抗癌药物的研究与发展开辟新的 方向， 引起了许多科学家的关注， 并将这类具有抗癌活性的蛋白统称为 Parasporin， 具体定 义为 “Bt 及其相关细菌产生的无溶血作用但可优先杀死癌细胞的伴胞晶体蛋白” (Kitada S， et al.2005.Victoria B C ： Minireview， 1-8.)。2006 年， 成立了以 Michio Ohba 为首 的 Parasporin 分类和命名国际委员会 (Committee of Parasporin Classification and Nomenclature)， 并构建了抗癌晶体蛋白完善的分类系统。与 Cry 及 Cyt 蛋白的分类命名一 样， 根据氨基酸序列的同源性， 把现已发现的 Parasporin(PS) 蛋白分划为 4 种不同类型 ： Parasporin 1-4(http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/intro.html)。通过对目前 已有的 4 类 PS 进化分析， 结果表明它们存在很少的亲缘关系， 而这四种 PS 蛋白在抗癌毒性 谱和活性水平上有显著差别。 两种分子量较低的蛋白 PS2 和 PS4 具有相对较宽的杀细胞谱，
每个都能诱导 6 个人类癌细胞系死亡， 而具有典型三域结构的 PS3 蛋白具有最窄的活性谱， 仅对两个癌细胞系 HL-60 和 HepG2 存在中度细胞毒性。与 Cry 和 Cyt 蛋白的活化相似， Bt 菌株合成的抗癌晶体蛋白也属于无活性的原毒素， 需要在碱性溶液中经过蛋白酶水解之后 才能产生有活性的抗癌蛋白， 并且不同的蛋白酶处理对不同菌株蛋白的活化效果也有很大 差异。上述四种 PS 蛋白未经蛋白酶处理时， 不具有杀死癌细胞的活性， 或由于内源酶的水 解活化而具有极低的抗癌活性。
目前的抗癌药物最大的缺陷是不能特异的作用于癌细胞， 在杀死癌细胞的同时 也会杀死正常体细胞。而活化的 Bt 抗癌晶体蛋白能区别癌细胞与正常细胞， 特异地或优 先杀死癌细胞。同时， 不同菌株的水解产物对不同的癌细胞的杀伤力也有很大区别。如 PS2 蛋白能优先杀死来自于肝脏和结肠癌组织的癌细胞， 而不影响正常细胞 (Akio Ito， et al.2004.J Biol Chem， 279(20) ： 21282-21286.)。它对人肝癌细胞有很强的杀细胞活性， 但对人正常肝细胞和人子宫颈癌细胞细胞无毒性作用。抗癌蛋白引发的细胞和线粒体肿 胀与 Cry 杀虫蛋白在体内和体外对鳞翅目和双翅目昆虫细胞引发的症状相似， 而 Cyt 蛋白 导致的细胞病变没有经历细胞肿胀阶段而直接裂解 (Cooksey K.E.1971.London ： Academic Press， 247-274.)。
从非杀虫 Bt 菌株中发现具有识别并特异杀死癌细胞能力的伴胞晶体蛋白意义重 大。有必要大规模发掘我国抗癌 Bt 蛋白新资源， 筛选出高效、 新型的 Bt 菌株， 以及发现新 的抗癌蛋白基因对于推动我国抗癌研究工作的进展以及研发新型的更有效、 更安全的抗癌 药物都具有重要意义。发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新的 Bt 蛋白 Cry62Aa1。
本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。
本发明的第三个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。
本发明提供的菌株为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， Bt)ST7， 该菌株 已于 2010 年 6 月 12 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地 址： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101) 保藏， 分类 命名为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)， 保藏号为 CGMCCNo.3922。
通过对 ST7 的毒力测试表明， ST7 对鳞翅目、 鞘翅目等害虫等均不具有毒力。通 过 PCR 扩增根据抗癌 Cry 类蛋白基因保守序列设计 1 对特异引物， 扩增其基因组 DNA， 进一 步设计其全长基因引物， 克隆得到 cry62Aa1 基因， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.1 所 示， 全长为 2046bp， 分析表明， GC 含量为 39.69％， 编码 681 个氨基酸组成的蛋白。经测定， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO2 所示。被国际 Bt 杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为 cry62Aa1。本发明进一步分析了 Cry62Aa1 蛋白的氨基酸组成 ( 表 1)。在 softberry 网站 采用 bacterial sigma7.0promoter 程序对全序列进行预测表明， 在基因编码区上游含有 RNA 聚合酶活化位点的序列。Cry62Aa1 蛋白的氨基酸组成如表 1。该蛋白的活性中心位于 (2) 区段。
表 1 Cry62Aa1 蛋白的氨基酸组成
4102408472 A CN 102408476 氨基酸 Ala(A) ： Cys(C) ： Asp(D) ： Glu(E) ： Phe(F) ： Gly(G) ： His(H) ： Ile(I) ： Lys(K) ： Leu(L) ：
说百分比％ 5.58 1.32 5.58 4.11 3.67 7.78 2.06 7.05 3.96 8.37明书氨基酸 Met(M) ： Asn(N) ： Pro(P) ： Gln(Q) ： Arg(R) ： Ser(S) ： Thr(T) ： Val(V) ： Trp(W) ： Tyr(Y) ： 百分比％ 1.76 6.17 4.70 4.70 5.29 6.75 8.52 5.29 2.35 4.853/6 页应当理解， 本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白 Cry62Aa1 的氨基酸序列 (SEQ ID No.2)， 在不影响其活性的前提下， 取代、 缺失和 / 或增加一个或几个氨基酸， 得到 所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段， 将第 22 位的 Pro 替换为 Met， 将第 30 位的 Ala 替换为 Ser， 将第 70 位的 Ser 缺失， 将第 86 位增加一个 His 或增加 Trp， 不影响其活性。因 此， 本发明的 Bt 蛋白 Cry62Aa1 还包括 SEQ ID No.2 所示氨基酸序列经取代、 替换和 / 或增 加一个或几个氨基酸， 具有与 Bt 蛋白 Cry62Aa1 同等活性的由 Cry62Aa1 衍生得到的蛋白 质。
本发明基因包括编码所述蛋白 Cry62Aa1 的核苷酸序列。
本发明提供了编码上述 Bt 蛋白 Cry62Aa1 的基因， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO.1 所示。
此外， 应理解， 考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性， 本领域技术 人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的基因和蛋白质可以从菌株 ST7 中克隆或分离得到， 或者通过 DNA 或肽合 成的方法得到。
可将本发明基因与表达载体可操作地连接， 得到能够表达本发明蛋白的重组表达 载体， 进而可以通过诸如农杆菌介导法、 基因枪法、 花粉管通道法等转基因方法， 将所述表 达载体导入宿主， 得到转 cry62Aa1 基因的转化体， 例如微生物、 粮食作物、 水果、 蔬菜等， 使 其对人类癌细胞有杀灭活性。
在本发明的一个实施例中， Bt 蛋白 Cry62Aa1 重组表达载体的获得是通过将 cry62Aa1 基因插入到表达载体 pET-32a(+) 上构建得到重组表达载体 pET-62Aa。
本发明提供了一种含有蛋白 Cry62Aa1 或其编码基因的抗癌药物。优选地， 上述抗癌药物为抗乳腺癌药物。
本发明还提供了 Cry62Aa1 蛋白或其编码基因或含有该基因的表达载体在制备抗 癌药物中的应用。
本发明提供了 Bt 蛋白 Cry62Aa1 或其编码基因或含有该基因的重组表达载体在制 备转基因植物或微生物中的应用。
所述的转基因植物为粮食作物、 水果、 蔬菜。
本发明提供 Cry62Aa1 蛋白是一种新的 Bt 蛋白， 该蛋白不具有杀虫活性， 但对人类 癌细胞具有杀灭能力。因此本发明的 Bt 蛋白 Cry62Aa1 和编码基因 cry62Aa1 可用于研制 抗癌作用的药物， 也可用于制备具有抗癌能力的转基因植物或转基因微生物， 为推动我国 抗癌研究工作的发展提供新的研究资料， 具有重要的经济价值和应用前景。 附图说明
图 1 是 cry62Aa1 基因的 PCR 扩增结果电泳图， 其中 M.DNAmarker， 1.cry62Aa1 基 因；
图 2 是重组质粒 PET-62Aa 的酶切鉴定图， 1. 重组质粒 pET-62Aa， 2.BamH I+Sal I 双酶切 pET-32a， 3.BamH I+Sal I 双酶切 pET-62Aa， 4. 插入的 DNA， M1.DNA marker ； 图 3 是 cry62Aa1 基 因 在 E.coli BL21(DE3) 中 的 SDS-PAGE 检 测， 其 中 M. 蛋 白 marker ； 1. 空载体 (pET-32a) 在 E.coii BL21(DE3) 中的表达， 2. 裂解液上清， 3. 包涵体中 的 Cry62Aa1 蛋白。
图 4 为 Cry62Aa1 晶 体 蛋 白 对 乳 腺 癌 细 胞 MDA-MB-231 的 毒 杀 情 况， 其 中 图 4A 为 Cry62Aa1 晶体蛋白对人正常 T 细胞作用的对照， 图 4B 为 48h 后， 凋亡的乳腺癌细胞 MDA-MB-231。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。
若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例 1 Cry62Aa1 基因的克隆
本发明从四川省成都温江地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) 新菌株 ST7， 该菌株已于 2010 年 06 月 12 日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心 ( 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究 所， 邮编 100101) 保藏， 分类命名为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)， 保藏号为 CGMCC No.3922。
通过如下方法克隆得到 cry62Aa1 基因的全长序列。
采用基因组 DNA 纯化试剂盒 ( 购自赛百盛公司 ) 提取菌株 ST7 的总 DNA。并设计 引物序列如下 ：
P1 ： 5’ -ATGAATCAAAATTGTAAAAAAG-3’
P2 ： 5’ -TTATGCCGGAATAAATTCGATTT-3’25μl PCR 反应体系 ：热循环反应 ： 94℃预变性 5min ； 94℃变性 1min， 43℃退火 50s， 72℃延伸 2min， 30 个循环 ； 72℃延伸 10min ； 4℃停止反应。扩增反应产物在 1％琼脂糖凝胶上电泳， 置凝胶成 像系统中观察 PCR 扩增结果。结果如图 1 所示， 通过扩增得到了约为 2kb 的序列， 将该序列 进行测序， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 与目的序列大小一致。
实施例 2 Cry62Aa1 蛋白的获得
根据 cry62Aa1 基因开放阅读框两端序列， 设计并合成一对特异性引物 ： cryF ： 5’ -GGAATTCATGAATCAAAATTGTAAAAAAG-3’ ； cryR ： 5’ -CGCGTCGACTTATTATGCCGGAATAAATTCGATT T-3’ ， 5’ 端引物下划线部分碱基分别为 BamH I 和 Sal I 酶切位点。 以 ST7 质粒 DNA 为模板进 行扩增， 扩增的产物采用 BamH I 和 Sal I 进行双酶切， 酶切产物与同样进行双酶切后的载 体 pET-32a(+) 连接， 转化 E.coli DH5α 感受态细胞， 将重组质粒命名为 pET-62Aa。 重组质 粒的酶切电泳验证插入片断大小符合目的片段后 ( 图 2) 再转入受体菌 E.coli.BL21(DE3)， 含重组质粒的重组子命名为 E.coli.BL21(62Aa)。然后转接阳性转化子于 LB 培养基中， 在 210r/min、 37℃培养条件下， 当 OD600 值为 0.6 时， 加入 0.6mmol/L IPTG 进行诱导表达 20h。 SDS-PAGE 分析表明 cry62Aa1 基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中 ( 图 3)， 分子量 约为 70kDa 左右， 与预测的蛋白分子量相符。然后利用 Ni 琼脂糖凝胶 ( 北京康为世纪生物 科技有限公司 ) 进行蛋白的纯化。
实施例 3 Cry62Aa1 蛋白对乳腺癌细胞杀灭活性检测
(1)Cry62Aa1 蛋白浓度的测定及其酶处理活化
将 实 施 例 2 获 得 的 纯 化 晶 体 蛋 Cry62Aa1 37 ℃ 下 在 裂 解 液 (50mmol/L pH10.0Na2CO3， 10mmol/L DTT， 1mmol/L EDTA) 中溶解 60min。用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测其分子量， 并用 Lowry 法测定蛋白含量为 3mg/L。用蛋白酶 K 处理晶体蛋白， 30μg/mL 蛋白酶 K 37℃作用 90min， 加入蛋白酶抑制剂 1mmol/L PMSF 终止酶解反应， 最终调节 pH 至 7.2， 过滤除菌备用。得到活化的 Cry62Aa1 蛋白。
(2)Cry62Aa1 对乳腺癌细胞杀灭活性检测 ： 将乳腺癌细胞 MDA-MB-231( 成都晶肽 生物科技有限公司 ) 培养于含 10％新生小牛血清、 100U/ml 青霉素和链霉素的 RPMI1640 培 养液中。分别取 MDA-MB-231 和人正常 T 细胞 ( 成都晶肽生物科技有限公司 ) 的对数生长
本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种新的 Bt 蛋白及其编码基因和应用。背景技术 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， 简称 Bt) 是一种革兰氏阳性好氧细 菌， 它在形成芽孢的过程中， 会在菌体的一端或两端形成一个或多个独特的伴胞晶体蛋白， 这是唯一能区分两个分类学上的近缘物种 B.thuringiensis 和 B.cereus 的特征。不同 菌株晶体蛋白的形状、 大小和组分均各不相同， 并且常常存在特异的杀虫活性， 故称为杀虫 晶体蛋白 (insecticidal crystal protein， ICP)。这种蛋白对鳞翅目、 双翅目、 鞘翅目等 多种昆虫， 以及线虫、 螨类和原生动物等都具有特异的杀虫活性 (Faust RM.， et al.1983. Plasmid， 9： 98-103.)， 而对哺乳动物没有任何有害作用， 广泛应用于卫生与农业害虫的防 治 (Schnepf HE， et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev， 62 ： 775-806)。 Bt 的杀虫晶体蛋白 主要包含两个结构上无任何相关性的蛋白家族 ： Cry 蛋白和 Cyt 蛋白， 前者对特异的昆虫有 毒性， 而后者对无脊椎动物和脊椎动物细胞具有广泛的溶细胞活性， 包括昆虫和哺乳动物 红细胞。 目前， Cry 蛋白现在已被划分为 69 个不同类型 ： Cry1-Cry69， 而 Cyt 仅有三个类型 ： Cyt1、 Cyt2 和 Cyt3(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt)(Crickmore N， Zeigler DR， Feitelson J.1998.Microbiol Mol Biol Rev， 62 ： 807-813.)。
至今人们已从世界各地的昆虫、 土壤和植物体表等样本中分离到数万株 Bt 菌株， 但其中绝大部分 Bt 菌株没有杀虫活性， 因此这些菌株一直不受重视， 它们的生物学特征也 很少被研究过。直到 1999 年， 日本学者 Mizuki 才对这类能产生晶体蛋白， 而没有杀虫活性 的 Bt 菌进行深入研究 (Mizuki E.et al.1999.J Appl Microbiol， 86 ： 477-486)。他发现 Bt 菌株 A1190 所产生的 81kDa 伴孢晶体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞 ( 人白血病 T 细胞 MOLT-4、 人子宫颈癌细胞等 ) 具有杀伤能力， 而且无溶血作用。此外， 由 于 Cyt 类杀虫晶体蛋白的溶细胞活性， Al-yahaeet 等将 Cyt2 蛋白与肿瘤细胞抗体融合为 一个特异破坏肿瘤细胞的融合蛋白进行临床研究， 结果表明 Cyt2 蛋白对癌细胞具有抑制 作用 (Al-yahaee SAand Ellar DJ.1996.Bioconjug Chem， 7： 451-460)。该研究是继发现 Bt 以色列变种之后又一个与医学联系的全新领域， 可能为抗癌药物的研究与发展开辟新的 方向， 引起了许多科学家的关注， 并将这类具有抗癌活性的蛋白统称为 Parasporin， 具体定 义为 “Bt 及其相关细菌产生的无溶血作用但可优先杀死癌细胞的伴胞晶体蛋白” (Kitada S， et al.2005.Victoria B C ： Minireview， 1-8.)。2006 年， 成立了以 Michio Ohba 为首 的 Parasporin 分类和命名国际委员会 (Committee of Parasporin Classification and Nomenclature)， 并构建了抗癌晶体蛋白完善的分类系统。与 Cry 及 Cyt 蛋白的分类命名一 样， 根据氨基酸序列的同源性， 把现已发现的 Parasporin(PS) 蛋白分划为 4 种不同类型 ： Parasporin 1-4(http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/intro.html)。通过对目前 已有的 4 类 PS 进化分析， 结果表明它们存在很少的亲缘关系， 而这四种 PS 蛋白在抗癌毒性 谱和活性水平上有显著差别。 两种分子量较低的蛋白 PS2 和 PS4 具有相对较宽的杀细胞谱，
至今人们已从世界各地的昆虫、 土壤和植物体表等样本中分离到数万株 Bt 菌株， 但其中绝大部分 Bt 菌株没有杀虫活性， 因此这些菌株一直不受重视， 它们的生物学特征也 很少被研究过。直到 1999 年， 日本学者 Mizuki 才对这类能产生晶体蛋白， 而没有杀虫活性 的 Bt 菌进行深入研究 (Mizuki E.et al.1999.J Appl Microbiol， 86 ： 477-486)。他发现 Bt 菌株 A1190 所产生的 81kDa 伴孢晶体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞 ( 人白血病 T 细胞 MOLT-4、 人子宫颈癌细胞等 ) 具有杀伤能力， 而且无溶血作用。此外， 由 于 Cyt 类杀虫晶体蛋白的溶细胞活性， Al-yahaeet 等将 Cyt2 蛋白与肿瘤细胞抗体融合为 一个特异破坏肿瘤细胞的融合蛋白进行临床研究， 结果表明 Cyt2 蛋白对癌细胞具有抑制 作用 (Al-yahaee SAand Ellar DJ.1996.Bioconjug Chem， 7： 451-460)。该研究是继发现 Bt 以色列变种之后又一个与医学联系的全新领域， 可能为抗癌药物的研究与发展开辟新的 方向， 引起了许多科学家的关注， 并将这类具有抗癌活性的蛋白统称为 Parasporin， 具体定 义为 “Bt 及其相关细菌产生的无溶血作用但可优先杀死癌细胞的伴胞晶体蛋白” (Kitada S， et al.2005.Victoria B C ： Minireview， 1-8.)。2006 年， 成立了以 Michio Ohba 为首 的 Parasporin 分类和命名国际委员会 (Committee of Parasporin Classification and Nomenclature)， 并构建了抗癌晶体蛋白完善的分类系统。与 Cry 及 Cyt 蛋白的分类命名一 样， 根据氨基酸序列的同源性， 把现已发现的 Parasporin(PS) 蛋白分划为 4 种不同类型 ： Parasporin 1-4(http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/intro.html)。通过对目前 已有的 4 类 PS 进化分析， 结果表明它们存在很少的亲缘关系， 而这四种 PS 蛋白在抗癌毒性 谱和活性水平上有显著差别。 两种分子量较低的蛋白 PS2 和 PS4 具有相对较宽的杀细胞谱，
每个都能诱导 6 个人类癌细胞系死亡， 而具有典型三域结构的 PS3 蛋白具有最窄的活性谱， 仅对两个癌细胞系 HL-60 和 HepG2 存在中度细胞毒性。与 Cry 和 Cyt 蛋白的活化相似， Bt 菌株合成的抗癌晶体蛋白也属于无活性的原毒素， 需要在碱性溶液中经过蛋白酶水解之后 才能产生有活性的抗癌蛋白， 并且不同的蛋白酶处理对不同菌株蛋白的活化效果也有很大 差异。上述四种 PS 蛋白未经蛋白酶处理时， 不具有杀死癌细胞的活性， 或由于内源酶的水 解活化而具有极低的抗癌活性。
目前的抗癌药物最大的缺陷是不能特异的作用于癌细胞， 在杀死癌细胞的同时 也会杀死正常体细胞。而活化的 Bt 抗癌晶体蛋白能区别癌细胞与正常细胞， 特异地或优 先杀死癌细胞。同时， 不同菌株的水解产物对不同的癌细胞的杀伤力也有很大区别。如 PS2 蛋白能优先杀死来自于肝脏和结肠癌组织的癌细胞， 而不影响正常细胞 (Akio Ito， et al.2004.J Biol Chem， 279(20) ： 21282-21286.)。它对人肝癌细胞有很强的杀细胞活性， 但对人正常肝细胞和人子宫颈癌细胞细胞无毒性作用。抗癌蛋白引发的细胞和线粒体肿 胀与 Cry 杀虫蛋白在体内和体外对鳞翅目和双翅目昆虫细胞引发的症状相似， 而 Cyt 蛋白 导致的细胞病变没有经历细胞肿胀阶段而直接裂解 (Cooksey K.E.1971.London ： Academic Press， 247-274.)。
从非杀虫 Bt 菌株中发现具有识别并特异杀死癌细胞能力的伴胞晶体蛋白意义重 大。有必要大规模发掘我国抗癌 Bt 蛋白新资源， 筛选出高效、 新型的 Bt 菌株， 以及发现新 的抗癌蛋白基因对于推动我国抗癌研究工作的进展以及研发新型的更有效、 更安全的抗癌 药物都具有重要意义。发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新的 Bt 蛋白 Cry62Aa1。
本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。
本发明的第三个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。
本发明提供的菌株为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis， Bt)ST7， 该菌株 已于 2010 年 6 月 12 日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 简称 CGMCC， 地 址： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101) 保藏， 分类 命名为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)， 保藏号为 CGMCCNo.3922。
通过对 ST7 的毒力测试表明， ST7 对鳞翅目、 鞘翅目等害虫等均不具有毒力。通 过 PCR 扩增根据抗癌 Cry 类蛋白基因保守序列设计 1 对特异引物， 扩增其基因组 DNA， 进一 步设计其全长基因引物， 克隆得到 cry62Aa1 基因， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID No.1 所 示， 全长为 2046bp， 分析表明， GC 含量为 39.69％， 编码 681 个氨基酸组成的蛋白。经测定， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO2 所示。被国际 Bt 杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为 cry62Aa1。本发明进一步分析了 Cry62Aa1 蛋白的氨基酸组成 ( 表 1)。在 softberry 网站 采用 bacterial sigma7.0promoter 程序对全序列进行预测表明， 在基因编码区上游含有 RNA 聚合酶活化位点的序列。Cry62Aa1 蛋白的氨基酸组成如表 1。该蛋白的活性中心位于 (2) 区段。
表 1 Cry62Aa1 蛋白的氨基酸组成
4102408472 A CN 102408476 氨基酸 Ala(A) ： Cys(C) ： Asp(D) ： Glu(E) ： Phe(F) ： Gly(G) ： His(H) ： Ile(I) ： Lys(K) ： Leu(L) ：
说百分比％ 5.58 1.32 5.58 4.11 3.67 7.78 2.06 7.05 3.96 8.37明书氨基酸 Met(M) ： Asn(N) ： Pro(P) ： Gln(Q) ： Arg(R) ： Ser(S) ： Thr(T) ： Val(V) ： Trp(W) ： Tyr(Y) ： 百分比％ 1.76 6.17 4.70 4.70 5.29 6.75 8.52 5.29 2.35 4.853/6 页应当理解， 本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白 Cry62Aa1 的氨基酸序列 (SEQ ID No.2)， 在不影响其活性的前提下， 取代、 缺失和 / 或增加一个或几个氨基酸， 得到 所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段， 将第 22 位的 Pro 替换为 Met， 将第 30 位的 Ala 替换为 Ser， 将第 70 位的 Ser 缺失， 将第 86 位增加一个 His 或增加 Trp， 不影响其活性。因 此， 本发明的 Bt 蛋白 Cry62Aa1 还包括 SEQ ID No.2 所示氨基酸序列经取代、 替换和 / 或增 加一个或几个氨基酸， 具有与 Bt 蛋白 Cry62Aa1 同等活性的由 Cry62Aa1 衍生得到的蛋白 质。
本发明基因包括编码所述蛋白 Cry62Aa1 的核苷酸序列。
本发明提供了编码上述 Bt 蛋白 Cry62Aa1 的基因， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO.1 所示。
此外， 应理解， 考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性， 本领域技术 人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明的基因和蛋白质可以从菌株 ST7 中克隆或分离得到， 或者通过 DNA 或肽合 成的方法得到。
可将本发明基因与表达载体可操作地连接， 得到能够表达本发明蛋白的重组表达 载体， 进而可以通过诸如农杆菌介导法、 基因枪法、 花粉管通道法等转基因方法， 将所述表 达载体导入宿主， 得到转 cry62Aa1 基因的转化体， 例如微生物、 粮食作物、 水果、 蔬菜等， 使 其对人类癌细胞有杀灭活性。
在本发明的一个实施例中， Bt 蛋白 Cry62Aa1 重组表达载体的获得是通过将 cry62Aa1 基因插入到表达载体 pET-32a(+) 上构建得到重组表达载体 pET-62Aa。
本发明提供了一种含有蛋白 Cry62Aa1 或其编码基因的抗癌药物。优选地， 上述抗癌药物为抗乳腺癌药物。
本发明还提供了 Cry62Aa1 蛋白或其编码基因或含有该基因的表达载体在制备抗 癌药物中的应用。
本发明提供了 Bt 蛋白 Cry62Aa1 或其编码基因或含有该基因的重组表达载体在制 备转基因植物或微生物中的应用。
所述的转基因植物为粮食作物、 水果、 蔬菜。
本发明提供 Cry62Aa1 蛋白是一种新的 Bt 蛋白， 该蛋白不具有杀虫活性， 但对人类 癌细胞具有杀灭能力。因此本发明的 Bt 蛋白 Cry62Aa1 和编码基因 cry62Aa1 可用于研制 抗癌作用的药物， 也可用于制备具有抗癌能力的转基因植物或转基因微生物， 为推动我国 抗癌研究工作的发展提供新的研究资料， 具有重要的经济价值和应用前景。 附图说明
图 1 是 cry62Aa1 基因的 PCR 扩增结果电泳图， 其中 M.DNAmarker， 1.cry62Aa1 基 因；
图 2 是重组质粒 PET-62Aa 的酶切鉴定图， 1. 重组质粒 pET-62Aa， 2.BamH I+Sal I 双酶切 pET-32a， 3.BamH I+Sal I 双酶切 pET-62Aa， 4. 插入的 DNA， M1.DNA marker ； 图 3 是 cry62Aa1 基 因 在 E.coli BL21(DE3) 中 的 SDS-PAGE 检 测， 其 中 M. 蛋 白 marker ； 1. 空载体 (pET-32a) 在 E.coii BL21(DE3) 中的表达， 2. 裂解液上清， 3. 包涵体中 的 Cry62Aa1 蛋白。
图 4 为 Cry62Aa1 晶 体 蛋 白 对 乳 腺 癌 细 胞 MDA-MB-231 的 毒 杀 情 况， 其 中 图 4A 为 Cry62Aa1 晶体蛋白对人正常 T 细胞作用的对照， 图 4B 为 48h 后， 凋亡的乳腺癌细胞 MDA-MB-231。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。
若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例 1 Cry62Aa1 基因的克隆
本发明从四川省成都温江地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis) 新菌株 ST7， 该菌株已于 2010 年 06 月 12 日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心 ( 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究 所， 邮编 100101) 保藏， 分类命名为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)， 保藏号为 CGMCC No.3922。
通过如下方法克隆得到 cry62Aa1 基因的全长序列。
采用基因组 DNA 纯化试剂盒 ( 购自赛百盛公司 ) 提取菌株 ST7 的总 DNA。并设计 引物序列如下 ：
P1 ： 5’ -ATGAATCAAAATTGTAAAAAAG-3’
P2 ： 5’ -TTATGCCGGAATAAATTCGATTT-3’25μl PCR 反应体系 ：热循环反应 ： 94℃预变性 5min ； 94℃变性 1min， 43℃退火 50s， 72℃延伸 2min， 30 个循环 ； 72℃延伸 10min ； 4℃停止反应。扩增反应产物在 1％琼脂糖凝胶上电泳， 置凝胶成 像系统中观察 PCR 扩增结果。结果如图 1 所示， 通过扩增得到了约为 2kb 的序列， 将该序列 进行测序， 其核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 与目的序列大小一致。
实施例 2 Cry62Aa1 蛋白的获得
根据 cry62Aa1 基因开放阅读框两端序列， 设计并合成一对特异性引物 ： cryF ： 5’ -GGAATTCATGAATCAAAATTGTAAAAAAG-3’ ； cryR ： 5’ -CGCGTCGACTTATTATGCCGGAATAAATTCGATT T-3’ ， 5’ 端引物下划线部分碱基分别为 BamH I 和 Sal I 酶切位点。 以 ST7 质粒 DNA 为模板进 行扩增， 扩增的产物采用 BamH I 和 Sal I 进行双酶切， 酶切产物与同样进行双酶切后的载 体 pET-32a(+) 连接， 转化 E.coli DH5α 感受态细胞， 将重组质粒命名为 pET-62Aa。 重组质 粒的酶切电泳验证插入片断大小符合目的片段后 ( 图 2) 再转入受体菌 E.coli.BL21(DE3)， 含重组质粒的重组子命名为 E.coli.BL21(62Aa)。然后转接阳性转化子于 LB 培养基中， 在 210r/min、 37℃培养条件下， 当 OD600 值为 0.6 时， 加入 0.6mmol/L IPTG 进行诱导表达 20h。 SDS-PAGE 分析表明 cry62Aa1 基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中 ( 图 3)， 分子量 约为 70kDa 左右， 与预测的蛋白分子量相符。然后利用 Ni 琼脂糖凝胶 ( 北京康为世纪生物 科技有限公司 ) 进行蛋白的纯化。
实施例 3 Cry62Aa1 蛋白对乳腺癌细胞杀灭活性检测
(1)Cry62Aa1 蛋白浓度的测定及其酶处理活化
将 实 施 例 2 获 得 的 纯 化 晶 体 蛋 Cry62Aa1 37 ℃ 下 在 裂 解 液 (50mmol/L pH10.0Na2CO3， 10mmol/L DTT， 1mmol/L EDTA) 中溶解 60min。用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测其分子量， 并用 Lowry 法测定蛋白含量为 3mg/L。用蛋白酶 K 处理晶体蛋白， 30μg/mL 蛋白酶 K 37℃作用 90min， 加入蛋白酶抑制剂 1mmol/L PMSF 终止酶解反应， 最终调节 pH 至 7.2， 过滤除菌备用。得到活化的 Cry62Aa1 蛋白。
(2)Cry62Aa1 对乳腺癌细胞杀灭活性检测 ： 将乳腺癌细胞 MDA-MB-231( 成都晶肽 生物科技有限公司 ) 培养于含 10％新生小牛血清、 100U/ml 青霉素和链霉素的 RPMI1640 培 养液中。分别取 MDA-MB-231 和人正常 T 细胞 ( 成都晶肽生物科技有限公司 ) 的对数生长
期细胞， 以 0.25％胰酶与 0.02％ EDTA 混合液 (1 ∶ 1) 消化后制成单细胞悬液， 血小板计数器 5 计数， 调细胞浓度为 1.5×10 /ml 后接种 96 孔培养板中， 每孔 100μl 细胞悬液， 添加正常 T 细 胞的孔为对照孔， 添加 MDA-MB-231 细胞的孔为处理孔。37℃， 5％ CO2， 24h 后， 吸去培养液， 每 孔分别加入步骤 (1) 中得到的活化晶体蛋白 Cry62Aa1【用含 10％新生小牛血清的 RPMI1640 培养基把步骤 (1) 获得的蛋白浓度 (3mg/L) 稀释一倍作为第一个上药浓度， 再作五倍梯度稀 释， 共作 8 个稀释浓度】 的培养液 200μl， 继续培养 48h。然后， 每孔加入 50ul 50％三氯乙酸 (TCA)， 4℃放置 1h， 弃去固定液， 用蒸馏水洗 5 次， 轻轻甩干以除去剩余水分。在对照孔和各 处理孔加入 50ul 0.4％ SRB 染液， 室温放置 20min。吸出染液弃去， 用 1％醋酸溶液洗涤， 每 孔至少 5 次， 直至无红色染液为止， 轻轻甩干以除去残留液体。按 200ul/ 孔加入 10mM Tris 碱， 振荡 10-15s， 使其充分溶解混匀。用酶标仪在 490nm 波长处测定各孔吸光度 (OD) 值。以 Cry62Aa1 浓度为横轴， 吸光度 (OD) 值为纵轴作图观察药物对乳腺癌细胞生长的影响。再用 专用模板 Originpro7.0 中四参数方程 (y ＝ A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p)) 计算半数有效抑制 浓度 (IC50 值 )。结果表明， 晶体蛋白 Cry62Aa1 对人正常细胞不具有抑制作用， 但可使乳腺癌 细胞 MDA-MB-231 凋亡 ( 见图 4)， 具有杀灭癌细胞的作用， IC50 为 30.0mg/L。8102408472 A CN 102408476
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