利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及重组方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及重组方法及应用。
背景技术
羟基酪醇(hydroxytyrosol)，中文名称：3,4-二羟基苯乙醇，英文名称：3,4-Dihydroxyphenylethanol。中文别名：2-(3,4-二羟基苯基)乙醇；羟基酪醇；3,4-二羟基苯乙基醇。CAS号：10597-60-1。分子式：C8H10O3。结构式：![]()
分子量：154.1632。
羟基酪醇是一种天然多酚类化合物，它主要是以酯化物橄榄苦苷的形式存在于橄榄的各个部位，橄榄苦苷经过水解后可得到游离的羟基酪醇。羟基酪醇展现了大量有益的特性，例如癌症化学预防、抗动脉粥样硬化、抑制DNA氧化损伤、保护皮肤光损伤以及抗炎等活性，近年来深受生物和医学界的重视。国外已经相继有羟基酪醇的胶囊、片剂和粉末产品问世。除了将羟基酪醇作为一种营养性、功能性的物质直接使用以外，对于其一些衍生物，如橄榄苦苷、羟基酪醇的乙酰化衍生物、带有多不饱和脂肪链的衍生物等的应用研究也在不断进行。这对于不断增加羟基酪醇的应用具有很重要的促进作用。
羟基酪醇在橄榄中主要是以橄榄苦苷的形式存在，橄榄苦苷在橄榄各个部位都占有相当的比例，在干燥的橄榄树叶子中其质量分数约占6％～9％。这也是橄榄果实具有强烈苦味的原因。在橄榄油加工过程中，为除去其中的酸涩味道，水解橄榄苦苷后得到多酚类化合物，羟基酪醇是这些酚类混合物的主要成分。但水解过程会用到大量的酸水，对环境造成污染。目前羟基酪醇主要是从橄榄果、叶以及在制备橄榄油过程中产生的残渣和废水中分离出来的。而羟基酪醇的纯化主要采用柱色谱分离的方法，如硅胶柱、离子交换树脂，过程繁琐，效率不高，目前的技术还不能大量地将羟基酪醇从含有不同分子量的多酚类化合物的废水中萃取并分离出来(王红亮，史慧贤，姜申德，羟基酪醇的研究进展[J]，化工进展，2010，29(6)：1133-1137.)。
利用酶或细菌将酪醇转化得到羟基酪醇。Zouhaier等用藻酸固定绿脓杆菌休眠细胞，然后利用这种细菌将酪醇转化为羟基酪醇(Zouhaier B,SamiS，Production of high hydroxytyrosol yields via tyrosol conversion by Pseudomonas aeruginosa immobilized resting cells.J.Agric.Food Chem.,2006,54:9906-9911.)。Noureddine等利用粘质沙雷菌，它可以利用酪醇为碳源和氮源，生产羟基酪醇(NoureddineA,Sami S，Synthesis ofhydroxytyrosol,and 3-hydroxyphenylacetic acid by differential conversion of tyrosol isomers using Serratia marcescens strain.J.Agric.Food Chem.,2005,53:6525-6530.)。Juan等使用蘑菇酪氨酸酶，并在维生素C以及酪醇存在的条件下，得到了羟基酪醇(Juan C,Cristina S，Synthesis of the antioxidant hydroxytyrosol using tyrosinase as biocatalyst.J.Agric.Food Chem.,2001,49:1187-1193.)。Mar Larrosa等采用酪氨酸酶催化酪醇，经过羟基化反应后合成羟基酪醇(Larrosa J,Carlos M,Antioxidant capacity oftomato juice functionalised with enzymatically synthesized hydroxytyrosol.J.Sci.Food.Agr.,2003,83:658-666.)。但是过程中要控制合成条件，以防氧化生成联苯酚。采用生物酶法合成羟基酪醇，具有安全、绿色无污染的优点，但是目前无论从成本(相关酶和细菌的使用成本和回收问题)，还是大规模的生产技术(酪醇只有在较低浓度下才能够实现其向羟基酪醇的生物转化)都受到一定的限制。
HPAH酶(4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，EC 1.14.13.3)是一类黄素单加氧酶，含有一个羟化酶亚基和一个还原酶亚基。该酶能催化对羟基苯乙酸生成3,4-二羟基苯乙酸。最近有研究发现该酶还能催化一系列化合物的氧化，包括催化酪醇生成羟基酪醇(Liebgott P,Amouric A,Comte A,et al.Hydroxytyrosol fromtyrosolusing hydroxyphenylacetic acid-induced bacterial cultures and evidence of the role of 4-HPA3-hydroxylase[J].Res.Microbiol.,2009,160(10):757-766.)大肠杆菌中也含有一种HPAH酶(HpaBC)，编码该酶的基因簇为HpaBC。
综上所述，羟基酪醇的植物提取过程繁琐，效率不高，污染环境；也有采用化学合成方法的，但化学合成方法存在原料利用率低、反应步骤长、条件不易控制、存在副产物等问题；生物转化安全无污染，但是成本较高，难以大规模生产。虽然已有HpaBC等羟化酶转化酪醇生成羟基酪醇的报道，但是至今还没有大肠杆菌利用葡萄糖等简单碳源生产羟基酪醇的相关报道。因此，创建能够利用葡萄糖生产羟基酪醇的大肠杆菌及构建方法，具有重要的科研价值及社会效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种大肠杆菌利用葡萄糖生产羟基酪醇的方法。
本发明的第二个目的是提供一种利用葡萄糖生产羟基酪醇的大肠杆菌。
本发明的第三个目的是提供一种利用葡萄糖生产羟基酪醇的大肠杆菌生产羟基酪醇的用途。
本发明的技术方案概述如下：
利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌构建方法，其特征是包括如下步骤，以序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为PCR引物，以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，PCR扩增HpaBC基因的开放阅读框架，利用SacI和KpnI双酶切将HpaBC基因连入载体pTrcHisB，得到中间质粒pTrcHisB-HpaBC，以pTrcHisB-HpaBC为模板，利用SEQ ID No.3、SEQ ID NO.2为PCR引物，PCR扩增获得带有Trc启动子的HpaBC基因片段Trc-HpaBC，KpnI单酶切连入质粒pTrcHisB-ARO10，得到表达载体pTrcHisB-ARO10-HpaBC；将pTrcHisB-ARO10-HpaBC与质粒pBb3共转入大肠杆菌菌株 BMGA，得到重组大肠杆菌菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)。
上述方法构建的利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌。
上述利用葡萄糖生产羟基酪醇的重组大肠杆菌发酵生产羟基酪醇的用途。
本发明的一种大肠杆菌利用简单碳源如葡萄糖生产羟基酪醇的方法，重组大肠杆菌含有来自酿酒酵母的ARO10基因及来自大肠杆菌内源的HpaBC基因。同时，重组大肠杆菌酪氨酸通路相关基因进行了敲除或者过表达，能够显著提高羟基酪醇的产量。
附图说明
图1为菌株发酵产物以及羟基酪醇标准品的HPLC检测结果，其中，1是BMGA(pTrcHisB-ARO10&pBb3)发酵产物，峰Ⅰ为酪醇，2是BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&pBb3)发酵产物，峰Ⅱ为羟基酪醇，3是羟基酪醇的标准品；
图2为菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&pBb3)发酵产物(峰Ⅱ)MS图谱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。
以下实施例中，大肠杆菌菌株MG1655、BW25113和DH5α为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，大肠杆菌菌株MG1655用于本发明中所有基因的表达，BW25113用于HpaBC基因的克隆，DH5α用于载体构建。
大肠杆菌表达载体pTrcHisB，购自Invitrogen，货号V360–20。
Phusion高保真DNA聚合酶、限制性内切酶购自Thermo公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
实施例1
基因HpaBC及大肠杆菌表达载体pTrcHisB-ARO10-HpaBC获得方法：
基因组DNA的抽提可利用细菌基因组提取试剂盒完成。
PCR引物为HpaBC-5FPSac，序列见SEQ ID No：1，和HpaBC-3RPKpn序列见SEQ ID No：2。以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，PCR扩增HpaBC基因的开放阅读框架。
利用SacI和KpnI双酶切将HpaBC基因连入载体pTrcHisB，得到中间质粒pTrcHisB-HpaBC。
然后以引物trc-HpaBC-5FPKpn(SEQ ID No：3)及引物HpaBC-3RPKpn(SEQ ID No：2)，以质粒pTrcHisB-HpaBC为模板，PCR扩增获得带有Trc启动子的HpaBC基因片段Trc-HpaBC，KpnI单酶切连入质粒pTrcHisB-ARO10，得到最终表达载体pTrcHisB-ARO10-HpaBC。质粒pTrcHisB-ARO10的构建方法与文献一致(BaiY,Bi H,Zhuang Y,et al.Production ofsalidroside in metabolically engineered Escherichia coli[J].Scientific reports,2014,4:6640-6647.)。
在上述步骤中，PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：94-95℃预变性4-5分钟；96-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。优选为：95℃预变性5分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。
实施例2
含有表达载体pTrcHisB-ARO10-HpaBC的大肠杆菌菌株
BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)获得方法：
对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌，例如，大肠杆菌可以为MG1655、BL21(DE3)或BMGA。为了提高羟基酪醇的产量，本发明采用了酪氨酸高产菌株BMGA，该菌株构建方法与文献(Bai Y,Bi H,Zhuang Y,et al.Production of salidroside in metabolically engineered Escherichia coli[J].Scientific reports,2014,4：6640-6647.)报道一致。
除质粒pTrcHisB-ARO10-HpaBC外，本申请还采用了另一表达质粒PbB3，该质粒含有酪氨酸通路优化相关过表达基因，包括基因tyrA*、aroG*(*代表解除了酪氨酸对其反馈抑制)、ppsA、tktA、aroE、aroD和aroB。pBb3的构建方法与文献(Bai Y,BiH,Zhuang Y,et al.Production of salidroside in metabolically engineered Escherichia coli[J].Scientific reports,2014,4：6640-6647.)报道一致。
将质粒pTrcHisB-ARO10-HpaBC与PbB3用电转化的方法共转入大肠杆菌菌株BMGA：
取LB固体平板培养的BMGA单克隆置于3mL LB液体培养基，37℃摇床振荡培养过夜。取1mL过夜培养菌液转接入50mL LB液体培养基，37℃下振荡培养至OD600达到0.4-0.5。从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却30min。细胞在4℃，4000rpm下离心10min，弃清液。用等体积灭菌的冰水重悬细胞。照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。用1/2体积灭菌的冰水重悬细胞。重复上述步骤一次。用灭菌冰水重悬浮细胞至最终体积为1mL。将细胞按100μL等份分装入微量离心管，添加质粒pTrcHisB-ARO10-HpaBC和PbB3各2μL，冰上培育5min。转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电击杯中。电击转化。立即添加1mL的LB液体培养基至电击杯中。37℃下培养细胞1小时以复原。转移细胞至含有氨苄青霉素(100mg/L)及氯霉素(25mg/L) 的LB固体平板上培养。利用氨苄青霉素及氯霉素抗性筛选携带表达载体的转化菌株重组大肠杆菌菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)，并通过提取质粒进行酶切验证。
实施例3
大肠杆菌菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)的发酵培养：
将菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)在3mL含有100mg/L氨苄青霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。然后将种子液按2体积％的转接量(1ml)转接入50ml加入100mg/L氨苄青霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，30℃诱导培养16个小时。4℃，4000rpm下离心10min收集菌体。转接到50mL M9Y液体培养基中，30℃继续培养48个小时。得到大肠杆菌菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)的发酵液。
M9Y培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物0.25g/L，Na2PO4·7H2O 12.8g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，MgSO40.49g/L,CaCl20.11g/L。
对比例1
大肠杆菌菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10&PbB3)的发酵培养：
将质粒pTrcHisB-ARO10和PbB3电转化菌株BMGA，得到菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10&PbB3)。
将菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10&PbB3)在3mL含有100mg/L氨苄青霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到种子液。然后将种子液按2体积％的转接量(1mL)转接入50ml加入100mg/L氨苄青霉素及25mg/L氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600达到0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)进行诱导，30℃诱导培养16个小时。4℃，4000rpm下离心10min收集菌体。转接到50mL含有2％葡萄糖的M9Y液体培养基中，30℃继续培养48个小时。得到大肠杆菌菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10&PbB3)的发酵液。
测试例
羟基酪醇的检测
(1)产物的HPLC检测：分别取实施例3和对比例1获得的发酵液各1mL，12000rpm离心10min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长225nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；梯度洗脱条件：0–20min，80％A和20％B；21–45min，80％A和20％B到100％B(线性梯度)；46–50min，100％B。进样量20μL。
发酵液及标准品的HPLC检测结果见图1。其中，1是菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10 &PbB3)发酵液，2是菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)发酵液，3是羟基酪醇的标准品。
如图1所示，菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)的发酵液中在7min时存在一个峰(2，峰Ⅱ)，与羟基酪醇标准品的出峰时间一致；菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10&PbB3)的发酵液在12min时存在一个峰(1，峰Ⅰ)，该峰与酪醇的出峰时间一致，为酪醇(Bai Y,Bi H,Zhuang Y,et al.Production of salidroside in metabolically engineered Escherichia coli[J].Scientific reports,2014,4：6640-6647.)。
(2)产物的LC-MS分析：对步骤(1)发酵液中看到的7min的峰Ⅱ进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长225nm；流动相A＝水(含0.1体积％甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；洗脱条件0–20min，80％A和20％B；21–45min，80％A和20％B到100％B(线性梯度)；46–50min，100％B。进样量20μL。
ESI正离子源，分子量扫描范围50–800。菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)的LC-MS检测结果见图2。峰Ⅱ的MS图谱上有羟基酪醇的MS特征峰155.1。
且经测定，菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)发酵液中羟基酪醇的产量为349.05mg/L，而对比例BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)发酵液中无羟基酪醇的产生，只有酪醇。本发明中的菌株BMGA(pTrcHisB-ARO10-HpaBC&PbB3)实现了从葡萄糖到羟基酪醇的从头合成，产量较高，为羟基酪醇的微生物异源合成奠定了坚实基础。
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