分离紫杉醇的方法 本发明涉及从植物原料中分离下式所示的紫杉醇(taxol)的方法。
紫杉醇对恶性肿瘤如卵巢癌、乳腺癌等具有显著的效果，所以作为药物具有很大的价值。紫杉醇是具有抗肿瘤活性的已知化合物，1963年美国国家癌症研究院(NCI)的研究人员发现了，在源自北美洲的一种叫Taxus brevifolia的紫杉树的树皮的提取物中存在着一种强有效的抗肿瘤物质。他们后来分离出了该活性物质，鉴定为上式化合物，命名为紫杉醇(M.C.Wani等人，J.Am.Chem.Soc.93：2325，1971)。
后来知道，紫杉醇具有抗各种恶性肿瘤如卵巢、子宫和乳腺的癌症的抗肿瘤活性，它作用于对顺氯氨铂不敏感的肿瘤细胞。今天，紫杉酚作为一种非常有希望的抗癌药物已经引起人们的注意。
如上所述，紫杉醇可以从北美洲的紫杉树的树皮分离。然而，该化合物以非常少的量存在于所述树皮中，并且该紫杉树生长极慢，所以不能以足够的量进行生产。此外，从森林保护的观点看对现有的树皮地使用具有许多限制。
因为如上所述的那样不仅从北美洲的紫杉树中分离了紫杉醇而且也分离了其有关物质(taxoids)，所以也已进行了将这样的有关化合物化学转化成紫杉醇的研究(国际专利公报WO93/16059)。此外，也对紫杉酚的化学合成进行了研究，但是由于其极其复杂的化学结构迄今尚未找到其全合成方法(USP 5274137)。
有效地大量生产紫杉醇已成为力争促进对紫杉醇的临床研究和解除病人癌症的一个非常重要的目标。
在这些环境条件下，本发明的目的是提供有效地分离紫杉醇的方法。
本发明的要旨是从Taxus sumatrana(紫杉科)提取分离紫杉醇以得到紫杉醇。在一个优选的具体实施方案中，本发明是通过对所述Taxus sumatrana的叶子进行提取来分离紫杉醇的方法。
本发明所述的Taxus sumatrana是一种产于印度尼西亚苏门答腊的紫杉属植物。它的叶子可被稳定地收获而不会引起树死亡影响保护自然。
根据本发明，大量的紫杉醇可以有效地从Taxus sumatrana获得。
图1是实施例1中获得的紫杉醇的1H-NMR图谱。
图2是实施例1中获得的紫杉醇的13C-NMR图谱。
图3是实施例1中获得的cepharomannine的1H-NMR图谱。
图4是实施例1中获得的cepharomannine的13C-NMR图谱。
本发明的分离方法包括提取步骤，其中起始原料是所述Taxussumatrana的叶子，和从所述提取步骤得到的提取物的纯化步骤，
在所述的提取步骤中，Taxus sumatrana的叶子可以是原状的，但优选地，它们是干的，这样可以提高提取效率。叶子是切细的更好。
在所说的提取步骤中，没有什么限制，即在制备Taxussumatrana叶子的提取物时，可以使用或不使用有机溶剂。然而，由于紫杉醇不溶于水，所以优选使用有机溶剂。
对用于提取步骤的有机溶剂的种类没有任何限制，实际上可以使用任何常用的有机溶剂。优选的有机容剂包括，但不限于，醇类如甲醇、乙醇等、二氯甲烷、苯、氯仿、二噁烷和丙酮。特别地，优选甲醇和二氯甲烷。这些有机溶剂可单独使用，也可以结合使用。
提取时，将Taxus sumatrana的叶子与溶剂混合，使它们在冷却或加热，优选地是在室温或加热下放置数小时至数天，所述提取步骤可以在酸—碱条件下进行，但优选在中性条件下进行以防止目标化合物降解，所述提取可以通过任何已知的从植物源提取药物活性要素的方法步骤进行。在优选的提取方法中，将叶子浸泡在冷的有机溶剂中或在所用的有机溶剂回流下用所述有机溶剂提取。也可以应用使用二氧化碳和乙醇的混合物的超临界流体提取方法(The Journal of Supercritical Fluids，5，1，1992)。可将这些方法步骤结合起来形成多步提取方法。
从上述提取步骤得到的提取物中，通过蒸馏，需要时使用合适的设备，除去溶剂，得到了提取浓缩物。所述蒸馏可按常规方法例如在减压或加热下进行。
然后使提取物经受如上所述的纯化步聚。先使提取物在水不混溶性有机溶剂和水之间进行分配，并回收有机部分。水不混溶性有机溶剂和水之间的分配体系没有特别限制。所述分配可按常规方式进行，例如，使用乙酸乙酯—水、二氯甲烷—水、正丁醇—水或苯—水等。优选的体系是乙酸乙酯—水。
然后，将如上回收的有机溶剂部分需要的话通过合适的方法浓缩并通过色谱法纯化。
浓缩可以按常规技术如通过与如上所述的相同的蒸馏方法进行。所述的色谱法也可以是任何已知方法如柱色谱或薄层色谱。柱色谱没有特别地限制，可以使用常规方法。例如可以使用硅胶等的吸附色谱或使用Sephadex(商标)等的凝胶渗透色谱。也可以使用超临界流体色谱或高效液相色谱(HPLC)。可以单独使用这些色谱方法，也可以通过多步纯化使用这些色谱方法。
在实施本发明时，在一些情况下，不仅得到了紫杉醇，而且也得到了紫杉醇的一些结构类似物如下式(II)所示的cephalomannine。
当得到紫杉醇和其有关化合物的混合物时，随后可以将其有关化合物用例如OsO2氧化以得到纯的紫杉醇。需要的话，可以通过例如HPLC分离纯化混合物以分离出紫杉醇。
所述的cephalomannine(II)可以用作合成紫杉醇的中间体，并且预期它本身也具有有用的药理学活性。
本发明的Taxus sumatrana(紫杉科)作为紫杉醇的提取源不是已知的，而是本发明人首次确定其含有紫杉醇和其有关化合物。由于Taxus sumatrana的叶子含有比较大量的紫杉醇和其类似物，所以不需要采集树皮或芯木。此外，可以栽培苗木并收获叶子或对叶组织进行组织培养。
下列实施例是用于详细说明本发明的，但绝不是用来限制本发明的范围。
实施例1
1.紫杉醇提取
将50g干的Taxus sumatrana叶子切成薄片，然后通过在500ml二氯甲烷—甲醇(1∶1)中冷浸进行提取(2小时×3次)。将提取后的残留物在回流下再用500ml甲醇提取(3小时×2次)。合并得到的提取液，减压下蒸掉溶剂，得到了5.14g提取物(基于干叶计，收率10.28％)。
2.提取物的分离纯化
通过在乙酸乙酯—水之间(1∶1，1.2L)进行分配来分离提取物(5.10g)，减压下浓缩乙酸乙酯部分，得到了2.43g可溶于乙酸乙酯的提取物(基于干叶计收率4.86％)。
通过硅胶柱色谱[硅胶60(Merck & Co.)120g，先用正己烷∶二氯甲烷∶乙醇7∶5∶1的混合溶剂，然后用甲醇洗脱]纯化可溶于乙酸乙酯的提取物(2.40g)，得到了7个流份[流份A(415mg)、流份B(534mg)、流份C(64mg)、流份D(285mg)、流份E(183mg)、流份F(172mg)和流份G(744mg)]。通过Sephadex LH—20柱色谱[Sephadex LH—20(Pharmacia)，400g，用二氯甲烷∶甲醇1∶2的混合溶剂洗脱]对在薄层色谱(TLC)上与紫杉醇有相同Rf值的流份D(285mg)进一步分馏，得到了三个流份[流份D1(46mg)、流份D2(189mg)、流份D3(44mg)]。通过硅胶柱色谱[SIL—120—S50(YMC)15g，用正己烷∶二氯甲烷∶乙醇8∶5∶1的混合溶剂洗脱，然后用甲醇洗脱]对流份D2(189mg)进一步分馏，得到了四个流份[流份D21(61mg)、流份D22(19mg)、流份D23(68mg)和流份D24(31mg)]。通过正相HPLC[YMC-Pack SIL，250mm×10mm ID，用正己烷∶二氯甲烷∶异丙醇17∶5∶1的混合溶剂洗脱]进一步纯化含紫杉醇的流份D23(68mg)，回收到6mg紫杉酚(I)和cephalomannine(II)的混合物。通过反相HPLC(CASPCELLPAK ODS C18SG—120，250mm×10mm ID，用甲醇∶水67∶33的混合溶剂洗脱)纯化该混合物(6mg)，得到3.0mg流份(I)(基于干叶计，收率0.006％)和2.5mg流份(II)(基于干叶计，收率0.005％)，白色无定形固体。基于下面测得的物理数据，流份(I)和流份(II)分别鉴定为紫杉醇(I)和cephalomannine(II)。
上面所获得的流份(I)(紫杉醇(I))的物理数据如下。
[α]D＝-43°(c＝0.41，MeOH，24℃)lit.[α]D20＝-49°(MeOH)(J.Am.Chem.Soc.，93，2325，1971).FAB-MS(m/z)：854(M＋H)+IR νKBrmaxcm-1：3433，2930，1722，1653，1602，1244UV λmax(MeOH)nm(ε)：227(25500)，265(1800)1H-NMR(500MHz，CDCl3，δ)：
5.67(1H，d，J＝6.8Hz，2-H)
3.80(1H，d，J＝6.8Hz，3-H)
4.94(1H，d，J＝7.7Hz，5-H)
2.55(1H，m，6α-H)
1.88(1H，m，6β-H)
4.40(1H，m，7-H)
6.27(1H，s，10-H)
6.23(1H，t，J＝8.6Hz，13-H)
2.35(1H，m，14α-H)
2.29(1H，m，14β-H)
1.14(3H，s，16-Me)
1.24(3H，s，17-Me)
1.79(3H，s，18-Me)
1.68(3H，s，19-Me)
4.30(1H，d，J＝8.5Hz，20 α-H)
4.20(1H，d，J＝8.5Hz，20 β-H)
4.79(1H，s br，2′-H)
5.79(1H，dd，J＝8.5，2.6Hz，3′-H)
6.97(1H，d，J＝8.5Hz，3′-NH)
8.13(2H，dd，J＝8.6，1.7Hz，2-OBz(邻)-H)
7.51(2H，m，2-OBz(间)-H)
7.61(1H，dd，J＝8.6，1.7Hz，2-OBz(对)-H)
7.48(2H，m，3′-Ph(邻)-H)
7.42(2H，m，3′-Ph(间)-H)
7.35(1H，m，3′-Ph(对)-H)
7.74(2H，dd，J＝8.6，1.7Hz，NBz(邻)-H)
7.40(2H，m，NBz(间)-H)
7.49(1H，m，NBz(对)-H)
1.76(1H，s，1-OH)
2.45(1H，d，J＝4.3Hz，7-OH)
3.53(1H，d，J＝5.1Hz，2′-OH)
2.38(3H，s，4-OAc)
2.24(3H，s，10-OAc)13C-NMR(67.8MHz，CDCl3，δc)：C-1 79.0(s)C-1′ 172.7(s)C-2 74.9(d)C-2′ 73.1(d)C-3 45.6(d)C-3′ 55.0(d)C-4 81.1(s)4-OCOCH3170.3(s)C-5 84.4(d) 4-OCOCH3 22.6(q)C-6 35.6(t) 10-OCOCH3 171.2(s)C-7 72.2(d) 10-OCOCH3 20.8(q)C-8 58.6(s) 2-COC6H5 167.0(s)C-9 203.6(s)2-COC6H5 (q)129.1(s)C-10 75.5(d) (o)130.2(d)C-11 133.2(s) (m)128.7(d)C-12 141.9(s) (p)133.7(d)C-13 72.4(d)3′-C6H5 (q)133.6(s)C-14 35.6(t) (o)127.0(d)C-15 43.1(s) (m)128.7(d)C-16 21.8(q) (p)131.9(d)C-17 26.8(q)N-COC6H5 166.9(s)C-18 14.8(q)N-COC6H5 (q)137.9(s)C-19 9.5(q) (o)127.0(d)C-20 76.5(t) (m)129.0(d)
(p)128.4(d)
所得流份(II)(cephalomannine(II))的物理数据如下。[α]D＝-49°(c＝0.37，MeOH，24℃)，lit.[a]20D-41°(MeOH)(J.Org.Chem.，46，1469(1981))FAB-MS(m/z)：832(M＋H)+IR νKBrmaxcm-1：3433，2947，1722，1664，1633，1242UV λmax(MeOH)nm(ε)：227sh(25500)，265(1800)1H-NMR(270MHz，CDCl3，δ)：
5.67(1H，d，J＝7.0Hz，2-H)
3.78(1H，d，J＝7.0Hz，3-H)
4.94(1H，d，J＝7.6Hz，5-H)
2.55(1H，m，6α-H)
1.88(1H，m，6β-H)
4.40(1H，m，7-H)
6.27(1H，s，10-H)
6.20(1H，t，J＝8.6Hz，13-H)
2.35(1H，m，14α-H)
2.29(1H，m，14β-H)
1.15(3H，s，16-Me)
1.26(3H，s，17-Me)
1.80(3H，s，18-Me)
1.68(3H，s，19-Me)
4.29(1H，d，J＝8.2Hz，20α-H)
4.18(1H，d，J＝8.2Hz，20β-H)
4.71(1H，m，2′-H)
5.61(1H，dd，J＝8.9，2.6Hz，3′-H)
6.50(1H，d，J＝8.9Hz，3′-NH)
8.12(2H，dd，J＝8.5，1.7Hz，2-OBz(邻)-H)
7.50(2H，dd，J＝8.5，8.3Hz，2-OBz(间)-H)
7.61(1H，dd，J＝8.3，1.7Hz，2-OBz(对)-H)
7.41(2H，m，3′-Ph(邻)-H)
7.40(2H，m，3′-Ph(间)-H)
7.35(1H，m，3′-Ph(对)-H)
1.80(3H，s，2″-Me)
6.43(1H，q，J＝6.9Hz，3″-H)
1.72(3H，d，J＝6.9Hz，3″-Me)13C-NMR(67.8MHz，CDCl3，δc)：C-1 79.0(s)C-1′ 172.7(s)C-2 74.9(d)C-2′ 73.3(d)C-3 45.6(d)C-3′ 54.8(d)C-4 81.1(s)4-OCOCH3 170.3(s)C-5 84.4(d)4-OCOCH3 22.6(q)C-6 35.8(t)10-OCOCH3 171.2(s)C-7 72.1(d)10-OCOCH3 20.8(q)C-8 58.6(s)2-COC6H5 167.0(s)C-9 203.6(s)2-COC6H5 (q)129.1(s)C-10 75.5(d) (o)130.2(d)C-11 133.1(s) (m)128.7(d)C-12 142.1(s) (p)1 33.7(d)C-13 72.7(d)3′-C6H5 (q)131.2(s)C-14 35.6(t) (o)126.9(d)C-15 43.1(s) (m)128.7(d)C-16 21.8(q) (p)131.9(d)C-17 26.8(q)C-1″ 169.0(s)C-18 14.8(q)C-2″ 138.1(s)C-19 9.5(q) C-3″ 128.2(d)C-20 76.5(t)2″-CH3 12.4(q)
3″-CH3 13.9(q)