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本发明提供一种新型融合蛋白NSCR5及其制备方法，其特征在于：融合蛋白NSCR5由6聚组氨酸标签(6X His)、蜘蛛丝蛋白氮端序列(NT)、果蝇弹性蛋白(Resilin)、蜘蛛丝蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉积肽(R5)等4段顺次连接构成，长度为602个氨基酸残基；融合蛋白NSCR5基因通过全基因合成方法获得，并优化了密码子构成。融合蛋白NSCR5产量为70～1200mg/L发酵液，纯度为82～95％。本发明融合蛋白NSCR5具有光催化交联、高弹、自组装和硅沉积特性，在生物医用领域具有广阔的应用前景。

1.  一种新型融合蛋白NSCR5，其特征在于：该蛋白的序列为SEQ NO：3所示。

2.  根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，该蛋白由6聚组氨酸标签前侧序列、6聚组氨酸标签(6X His)、蜘蛛丝蛋白氮端序列(NT)、果蝇弹性蛋白(Resilin)、蜘蛛丝蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉积肽(R5)等6段顺次连接构成，长度为602个氨基酸残基。

3.  根据权利要求1所述的融合蛋白，编码融合蛋白NSCR5的基因序列为SEQ NO：2所示。

4.  根据权利要求3所述的融合蛋白，编码融合蛋白NSCR5基因序列的上游还包括表达元件：Lac启动子、Lac操纵子和Lac核糖体结合位点(RBS)。

5.  根据权利要求4所述的融合蛋白，融合蛋白NSCR5的表达载体为PUC57，插入位点为EcoR Ⅴ限制性酶切位点，表达宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株。

6.  根据权利要求2所述的融合蛋白，编码融合蛋白NSCR5的基因长度为1809bp，其中6聚组氨酸标签(6X His)前侧为包括起始密码子在内的12bp，6聚组氨酸标签(6X His)密码子长度为24bp，蜘蛛丝蛋白氮端序列(NT)密码子长度为381bp，果蝇弹性蛋白(Resilin)密码子长度为1014bp，蜘蛛丝蛋白碳端序列(CT)密码子长度为372bp，硅藻硅沉积肽(R5)密码子长度为57bp。

7.  根据权利要求1所述的融合蛋白，生产所示融合蛋白NSCR5的方法包括如下步骤：(1)自诱导培养基配方为：酵母抽提物1.0～5.0g/L，胰蛋白胨5.0～10.0g/L，酪蛋白胨5.0～15.0g/L，葡萄糖0.1～1.5g/L，磷酸氢二钾4.0～10.0g/L，磷酸二氢钾3.5～9.0g/L，磷酸铵2.0～6.0g/L，硫酸镁0.2～1.6g/L，氯化钙2.0～5.0mg/L，氯化钴0.5～3.5mg/L，氯化铜0.5～1.5mg/L，硫酸锰1.2～5.0mg/L，钼酸钠3.2～8.0mg/L，硼酸0.1～0.5mg/L，氯化铁1.0～8.0mg/L，氯化锌0.5～3.0mg/L，甘油1.0～10.0g/L，丝氨酸0.5～2.0g/L，甘氨酸2.0～10.0g/L，酪氨酸0.1～1.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)20～300mg/L。(2)自诱导表达温度为16～40℃。(3)发酵时长为12～24h；
融合蛋白NSCR5的纯化方法为：采用超声或其他方法进行细胞破碎，细胞破碎缓冲溶液为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，尿素1.0～3.0M，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0～3.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：50～100mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0～3.0M尿素，pH8.0。

一种新型融合蛋白NSCR5及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物高分子研究领域，主要是涉及一种新型融合蛋白NSCR5及其制备方法。
背景技术
多肽类(或蛋白类)是性能优越的新型载体材料，在药物靶向运输，尤其是抗肿瘤药物的靶向运输和定点释放方面取得良好的研究结果。由于多肽分子链较短，单分子药物负载能力较弱，已有多肽载药均通过多肽的多级组装形成较大的药物负载复合物来实现。长肽或蛋白质较多肽具有更长的分子链，单分子药物负载能力高于多肽，且具有更加丰富多变的组装形式，其材料学性能更为优越。但长肽和蛋白质无法通过化学方法获得，因此在获取方法限制的情况下，长肽和蛋白质相关生物医学应用研究报道较少。
发明内容
本发明新型融合蛋白NSCR5由蜘蛛丝蛋白氮端序列(NT)、果蝇弹性蛋白(Resilin)、蜘蛛丝蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉积肽(R5)等4个主要功能肽段构成，各单一肽段的功能均已为研究所证实，但将蜘蛛丝蛋白氮端序列(NT)、果蝇弹性蛋白(Resilin)、蜘蛛丝蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉积肽(R5)等4个肽段顺次连接融合形成4嵌段线型蛋白的研究尚未见报道，相关制备方法亦未见报道。本发明融合蛋白NSCR5为人为将4个天然肽段融合形成的非天然4嵌段线型蛋白质。该人工4嵌段线型蛋白质具有多种优良性能，包括优异的机械性能(高弹性)、自组装形成规则宏观结构的性能(自组装性能)以及沉积SiO2介导有机-无机材料复合的性能(硅沉积性能)。这些性能赋予该融合蛋白优良的药物负载缓释性能、易加工性以及优良的产品稳定性，在生物医药领域具有广阔的应用前景。
本发明的目的是发明一种性能优异的生物医用高分子，具体为新型融合蛋白NSCR5。本发明的主要发明创新内容为：
(1)本发明融合蛋白NSCR5为人工设计制备的跨物种融合蛋白，不存在天然对应体或类似物。融合蛋白NSCR5的氨基酸序列(SEQ NO:3)经NCBI数据库BLASTp比对分析，表明NSCR5中存在3段分别与蜘蛛丝蛋白和果蝇弹性蛋白高度相似的区域，最高覆盖率72％时，相似度为77％；综合最高相似度为：覆盖率为56％时，相似度95％，未发现覆盖率超过72％的高度相似蛋白。此外，由于蜘蛛和果蝇间存在自然条件下不可能逾越的生殖隔离，因此没有理论依据支持可能存在天然的本发明所述融合蛋白NSCR5。
(2)本发明制备融合蛋白NSCR5所用基因序列非天然基因序列，是经过密码子改造并 由人工合成的全新基因序列。由于编码融合蛋白NSCR5的4个天然肽段的基因序列存在大量大肠杆菌稀有密码子，且编码的肽链具有较高的甘氨酸比例，不适合直接在大肠杆菌中表达。因此，本发明对编码融合蛋白NSCR5的基因密码子进行了优化，移除了所有稀有密码子，并对甘氨酸密码子进行了均衡分配，最后通过全基因合成法获得新型人造融合蛋白NSCR5的基因(图2,SEQ NO:2)。融合蛋白NSCR5基因序列经NCBI数据库BLASTn比对分析，表明果蝇弹性蛋白肽段最高基因相似度为89％，覆盖率为53％；蜘蛛丝蛋白肽段最高基因相似度为74％，覆盖率为40％，未发现覆盖率超过53％的高度相似基因。同样由于生殖隔离的存在，没有理论依据支持可能存在天然的本发明所述融合蛋白NSCR5基因。本发明共计对编码NSCR5的1809个碱基中的307个造成低丰度密码子的位点进行了改动，将编码精氨酸的稀有密码子全部改为非稀有密码子，将编码甘氨酸的高频率重复密码子替换为高丰度低重复度密码子，将丰度较低的丝氨酸的密码子做了均匀分布处理，改动前后全序列相似度为83.03％(改造前后序列差异和密码子丰度差异见附图4A和4B)。改动后的基因序列(图2)直接插入质粒载体(图6)并在大肠杆菌DH5α细胞内合成NSCR5过程中，精氨酸、甘氨酸和丝氨酸转运压力大幅下降，转运上述3中氨基酸能力大幅提高，NSCR5获得高效合成。
(3)本发明融合蛋白NSCR5同时具有pH响应自组装性能、高弹性能和硅沉积强度增强性能。上述性能的集成，使得本发明融合蛋白NSCR5在医用缝合、敷附、支架和载药等方面具有巨大的应用潜力，且目前尚未见到同时具备上述性能的蛋白质材料。
(4)在融合蛋白NSCR5基因上游设计了Lac基因表达原件，使其能够在大肠杆菌DH5α菌株中受IPTG诱导表达。并最终通过细胞破碎和镍离子柱亲和层析分离获得本发明融合蛋白。其中，所述的大肠杆菌，购自宝生物工程(大连)有限公司，保藏号为GIM1.571；质粒PUC57为公用质粒，由南京金斯瑞生物科技公司免费提供。
一方面，本发明提供一种一种新型融合蛋白NSCR5，其特征在于：该蛋白的序列为SEQ NO：3所示。
优选的，其中，该蛋白由6聚组氨酸标签前侧序列、6聚组氨酸标签(6X His)、蜘蛛丝蛋白氮端序列(NT)、果蝇弹性蛋白(Resilin)、蜘蛛丝蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉积肽(R5)等6段顺次连接构成，长度为602个氨基酸残基。
优选的，编码融合蛋白NSCR5的基因序列为SEQ NO：2所示。
优选的，编码融合蛋白NSCR5基因序列的上游还包括表达元件：Lac启动子、Lac操纵子和Lac核糖体结合位点(RBS)(图7)。
优选的，融合蛋白NSCR5的表达载体为PUC57，插入位点为EcoRⅤ限制性酶切位点， 表达宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株(图5)。
优选的，融合蛋白NSCR5全基因长度为1809bp，其中6聚组氨酸标签(6X His)前侧为包括起始密码子在内的12bp，6聚组氨酸标签(6X His)密码子长度为24bp，蜘蛛丝蛋白氮端序列(NT)密码子长度为381bp，果蝇弹性蛋白(Resilin)密码子长度为1014bp，蜘蛛丝蛋白碳端序列(CT)密码子长度为372bp，硅藻硅沉积肽(R5)密码子长度为57bp。
优选的，融合蛋白NSCR5基因上游序列长度为196bp，其中Lac启动子34bp，Lac操纵子25bp，核糖体结合位点(RBS)8bp。
优选的，位于PUC57上EcoRⅤ位点的人工合成序列长度为2005bp。
另一方面，本发明涉及上述融合蛋白NSCR5的制备方法，包括以下步骤：
第一步，融合蛋白NSCR5表达载体构建：将SEQ NO：2所示的基因序列接插入到PUC57载体上EcoRⅤ位点，获得NSCR5表达载体；
第二步，将融合蛋白NSCR5表达载体导入大肠杆菌DH5α中，获得NSCR5表达菌株；
第三步，融合蛋白NSCR5的自诱导表达：将NSCR5表达菌株接种到自诱导表达培养基中，于一定温度下培养一定时间，获得产物发酵液；
其中，自诱导表达培养基配方为：酵母抽提物1.0～5.0g/L，胰蛋白胨5.0～10.0g/L，酪蛋白胨5.0～15.0g/L，葡萄糖0.1～1.5g/L，磷酸氢二钾4.0～10.0g/L，磷酸二氢钾3.5～9.0g/L，磷酸铵2.0～6.0g/L，硫酸镁0.2～1.6g/L，氯化钙2.0～5.0mg/L，氯化钴0.5～3.5mg/L，氯化铜0.5～1.5mg/L，硫酸锰1.2～5.0mg/L，钼酸钠3.2～8.0mg/L，硼酸0.1～0.5mg/L，氯化铁1.0～8.0mg/L，氯化锌0.5～3.0mg/L，甘油1.0～10.0g/L，丝氨酸0.5～2.0g/L，甘氨酸2.0～10.0g/L，酪氨酸0.1～1.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)20.0～300.0mg/L；发酵温度为16～40℃；发酵时长为12～24h；
第四步，融合蛋白NSCR5的分离纯化：将第三步获得的产物发酵液离心收集菌体，并重悬于磷酸盐缓冲溶液中，超声破碎，然后再次离心收集上清液，最后将上清液过镍离子柱并以梯度浓度咪唑洗脱，收集融合蛋白NSCR5洗出液，经透析和冷冻干燥获得本发明目标融合蛋白NSCR5。
本发明所有的百分比含量，没有特备指明，都属于质量百分比含量。
有益效果
本发明新型融合蛋白集成了蜘蛛丝蛋白的自组装性能、果蝇弹性蛋白高弹性能和硅藻R5肽的硅沉积性能，综合性能优异，且长度均一，可完全生物降解，微生物法制备产量高、不存在化工污染。
附图说明
图1编码NSCR5蛋白的原始基因序列
图2为经过优化改良过的编码NSCR5蛋白的基因序列。
图3为图3为融合蛋白NSCR5基因密码子优化前后序列差异对比。
图4融合蛋白NSCR5基因密码子优化前后密码子丰度差异对比，其中图4A为原始基因序列，图4B为优化后的基因序列。
图5为6PUC57质粒图谱和基因序列插入的位子示意图。
图6为NSCR5蛋白的氨基酸序列图。
图7为NSCR5蛋白的结构示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
在下列所有实施例子中的宿主菌为大肠杆菌DH5α(保藏号：GIM1.571)，表达载体框架为PUC57质粒，融合蛋白NSCR5表达框插入位点为EcoRⅤ限制性内切酶位点。大肠杆菌DH5α，购自宝生物工程(大连)有限公司，分类命名：大肠杆菌DH5α，拉丁学名：Escherichia coli DH5α，保藏号：GIM1.571，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心。质粒PUC57，2710bp，来自大肠杆菌，由南京金斯瑞生物科技公司免费提供。
在下列实施例子中，以较具代表性的实施方案为例进行说明，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1
步骤1：将NSCR5表达框序列委托生物技术有限公司进行全基因合成(图2，SEQ NO:2)，并采用限制性酶切连接方法插入PUC57上EcoRⅤ位点，然后采用化学法或电击法导入大肠杆菌DH5α菌株，经羧苄青霉素抗性培养基筛选和DNA测序验证，获得融合蛋白NSCR5表达菌株。
其中限制性酶切连接方法为：以EcoRⅤ酶切PUC57质粒，采用琼脂糖凝胶电泳法分离经EcoRⅤ酶切的PUC57线性片段，然后以琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化PUC57质粒。以高保真DNA聚合酶扩增人工合成NSCR5表达框序列，同样采用琼脂糖凝胶电泳法分离NSCR5表达框片段，以琼脂糖凝胶回收试剂盒回收NSCR5表达框片段。将线性化PUC57质粒200ng与NSCR5表达框片段100ng在20μL T4连接酶反应体系中连接过夜，即获得包含NSCR5表达载体的连接产物。
大肠杆菌DH5α菌株转化方法为(以化学法为例)：吸取5μL包含NSCR5表达载体的连接产物，加入到200μL购自宝生物工程(大连)有限公司的大肠杆菌DH5α化学法感受态细胞中，混合均匀并于冰浴中静置30min，然后于42℃水浴孵育90s，然后于冰浴中静置2min，最后添加800μL无抗生素液体LB培养基，于37℃下培养1h，即获得包含NSCR5表达菌株的混合物。
转化子筛选方法为：将包含NSCR5表达菌株的混合物涂布于含有100μg/mL羧苄青霉素的LB固体培养基平板上，于37℃下倒置培养过夜，获得再生单克隆菌落。挑取单克隆菌落寄往生物公司进行DNA测序，从中选取携带正确NSCR5表达载体的大肠杆菌DH5α表达菌株，即为正确的NSCR5表达菌株。
步骤2：将融合蛋白NSCR5表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于16℃下，以220转/min的振荡速度培养12h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物1.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酪蛋白胨5.0g/L，葡萄糖0.1g/L，磷酸氢二钾4.0g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，磷酸铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙2.0mg/L，氯化钴0.5mg/L，氯化铜0.5mg/L，硫酸锰1.2mg/L，钼酸钠3.2mg/L，硼酸0.1mg/L，氯化铁1.0mg/L，氯化锌0.5mg/L，甘油1.0g/L，丝氨酸0.5g/L，甘氨酸2.0g/L，酪氨酸0.1g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)20mg/L。
步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。
其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：50mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，1.0M尿素，pH8.0。
步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标融合蛋白NSCR5。
基于实施例1获得融合蛋白NSCR5产率为70mg/L发酵液，纯度为82％，该融合蛋白NSCR5的250mg/mL溶液在pH由4.6升高到6.7～8.0时5～20min内能够响应pH变化自组装成为凝胶，进一步经钌和光催化可发生自由基聚合生成具有超过300％伸长率的高弹凝胶，再 进一步以酸性硅酸甲酯溶液处理可获得沉积二氧化硅微纳米颗粒的高弹高强度凝胶，机械强度较二氧化硅沉积前提高30％以上。
实施例2
步骤1：参照实施例子1里的步骤1的方法，获得获得融合蛋白NSCR5表达菌株。
步骤2：将融合蛋白NSCR5表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于40℃下，以220转/min的振荡速度培养24h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，酪蛋白胨15.0g/L，葡萄糖1.5g/L，磷酸氢二钾10.0g/L，磷酸二氢钾9.0g/L，磷酸铵6.0g/L，硫酸镁1.6g/L，氯化钙5.0mg/L，氯化钴3.5mg/L，氯化铜1.5mg/L，硫酸锰5.0mg/L，钼酸钠8.0mg/L，硼酸0.5mg/L，氯化铁8.0mg/L，氯化锌3.0mg/L，甘油10.0g/L，丝氨酸2.0g/L，甘氨酸10.0g/L，酪氨酸1.0g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)300mg/L。
步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。
其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，3.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，3.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：100mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，3.0M尿素，pH8.0。
步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标融合蛋白NSCR5。
基于实施例2获得融合蛋白NSCR5产率为840mg/L发酵液，纯度为87％，该融合蛋白NSCR5的250mg/mL溶液在pH由4.6升高到6.7～8.0时5～20min内能够响应pH变化自组装成为凝胶，进一步经钌和光催化可发生自由基聚合生成具有超过320％伸长率的高弹凝胶，再进一步以酸性硅酸甲酯溶液处理可获得沉积二氧化硅微纳米颗粒的高弹高强度凝胶，机械强度较二氧化硅沉积前提高31％以上。
实施例3
步骤1：参照实施例子1里的步骤1的方法，获得获得融合蛋白NSCR5表达菌株。
步骤2：将融合蛋白NSCR5表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于28℃下，以 220转/min的振荡速度培养18h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物3.0g/L，胰蛋白胨7.5g/L，酪蛋白胨10.0g/L，葡萄糖0.75g/L，磷酸氢二钾7.0g/L，磷酸二氢钾6.0g/L，磷酸铵4.0g/L，硫酸镁1.0g/L，氯化钙3.5mg/L，氯化钴2.0mg/L，氯化铜1.0mg/L，硫酸锰3.1mg/L，钼酸钠5.6mg/L，硼酸0.3mg/L，氯化铁4.5mg/L，氯化锌1.7mg/L，甘油5.0g/L，丝氨酸1.25g/L，甘氨酸6.0g/L，酪氨酸0.5g/L，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)160mg/L。
步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。
其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：75mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0。
步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标融合蛋白NSCR5。
基于实施例2获得融合蛋白NSCR5产率为1080mg/L发酵液，纯度为93％，该融合蛋白NSCR5的250mg/mL溶液在pH由4.6升高到6.7～8.0时5～20min内能够响应pH变化自组装成为凝胶，进一步经钌和光催化可发生自由基聚合生成具有超过360％伸长率的高弹凝胶，再进一步以酸性硅酸甲酯溶液处理可获得沉积二氧化硅微纳米颗粒的高弹高强度凝胶，机械强度较二氧化硅沉积前提高35％以上。
实施例4
步骤1：参照实施例子1里的步骤1的方法，获得获得融合蛋白NSCR5表达菌株。
步骤2：将融合蛋白NSCR5表达菌株克隆接种到200mL自诱导培养基中，于34℃下，以220转/min的振荡速度培养16h，然后于6000×g下常温离心5min收集菌体。其中自诱导培养基配方为：酵母抽提物4.0g/L，胰蛋白胨6.5g/L，酪蛋白胨8.0g/L，葡萄糖0.5g/L，磷酸氢二钾8.0g/L，磷酸二氢钾7.0g/L，磷酸铵3.0g/L，硫酸镁1.0g/L，氯化钙4.2mg/L，氯化钴2.4mg/L，氯化铜0.8mg/L，硫酸锰2.8mg/L，钼酸钠4.5mg/L，硼酸0.3mg/L，氯化铁5.4mg/L，氯化锌1.2mg/L，甘油5.0g/L，丝氨酸1.0g/L，甘氨酸10.0g/L，酪氨酸0.6g/L，异丙基硫代 -β-D-半乳糖苷(IPTG)120mg/L。
步骤3：步骤2离心收集的菌体悬浮于20mL细胞破碎缓冲液中，充分涡混重悬后于超声破碎仪中以130W的功率，超声5s，停歇5s的工作方式，超声破碎30min。然后于12000×g下常温离心30min，将上清转移到新的离心管中，经孔径0.45μm水系滤膜过滤后，上镍离子柱(以金斯瑞High Affinity Ni-Charged Resin为例)，并用梯度咪唑溶液进行洗脱，收集目标洗脱液。
其中细胞破碎缓冲液配方为：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；镍离子柱亲和层析预洗脱缓冲液配方为：10mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：80mM咪唑，50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，2.0M尿素，pH8.0。
步骤4：将收集洗脱液于排阻分子量为14kDa的透析袋中，于超纯水中透析3次，然后进行冷冻干燥获得目标融合蛋白NSCR5。
基于实施例2获得融合蛋白NSCR5产率为1200mg/L发酵液，纯度为95％，该融合蛋白NSCR5的250mg/mL溶液在pH由4.6升高到6.7～8.0时5～20min内能够响应pH变化自组装成为凝胶，进一步经钌和光催化可发生自由基聚合生成具有超过410％伸长率的高弹凝胶，再进一步以酸性硅酸甲酯溶液处理可获得沉积二氧化硅微纳米颗粒的高弹高强度凝胶，机械强度较二氧化硅沉积前提高38％以上。
实施例子5：
参照实施例子1里的步骤1的方法，获得融合蛋白NSCR5表达菌株，但是所插入质粒中的基因序列为原始未优化的基因序列(图1，SEQ NO:1)。并按照实施4中的培养诱导、纯化方法进行培养和处理，融合蛋白NSCR5得率在5mg/L以下，纯度为15％以下。该融合蛋白纯化产物的100mg/mL溶液在pH由4.6升高到6.7～8.0时5～20min内完全不能够响应pH变化自组装成为凝胶，而且也不能进一步经钌和光催化可发生自由基聚合生成具有超过300％伸长率的高弹凝胶，也更不可能再进一步以酸性硅酸甲酯溶液处理可获得沉积二氧化硅微纳米颗粒的高弹高强度凝胶。
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<110> OrganizationName : 浙江省农业科学院
 
Application Project
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<120> Title : 一种新型融合蛋白NSCR5及其制备方法
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<213> OrganismName :  NSCR5蛋白的原始基因序列
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tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttccctctag aaataatttt gtttaacttt     180
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tggaaacggt ggacggccct cagacagcta tggcgctcca ggccagggtc aaggacaggg     780
acaaggacaa ggtggatatg caggcaagcc ctcagatacc tatggagctc ctggtggtgg     840
aaatggcaac ggaggtcgtc catcgagcag ctatggcgct cctggcggtg gaaacggtgg     900
tcgtccttcg gatacctacg gtgctcctgg tggcggaaat ggtggacgcc catcggacac     960
ttatggtgct cctggtggtg gtggaaatgg caacggcgga cgaccttcaa gcagctatgg    1020
agctcctggt caaggacaag gcaacggaaa tggcggtcgc tcatcgagca gctatggtgc    1080
tcctggcggt ggaaacggcg gtcgtccttc ggatacctac ggtgctcccg gtggtggaaa    1140
cggtggtcgt ccttcggata cttacggcgc tcctggtggc ggcaataatg gcggtcgtcc    1200
ctcaagcagc tacggcgctc ctggtggtgg aaacggtggt cgtccatctg acacctatgg    1260
cgctcctggt ggcggtaacg gaaacggcag cggtggtcgt ccttcaagca gctatggagc    1320
tcctggtcag ggccaaggtg gatttggtgg tcgtccatcg gactcctatg gtgctcctgg    1380
tcagaaccaa aaaccatcag attcatatgg cgcccctggt agcggcaatg gcaacggcgg    1440
acgtccttcg agcagctatg gagctccagg ctcaggacct ggtggccgac cctccgactc    1500
ctacggaccc ccagcttctg gatcgggagc aggtggcgct ggaggcagtg gacccggcgg    1560
cgctgactac gataacgatg gtacctccgg acctggtcaa atttattatg gaccccaatc    1620
tgttgctgct ccagcagcag cagcagcttc tgctttggca gctccagcta caagcgcgag    1680
aatttcttca cacgcctcag ctcttctttc aaatggacct actaaccctg cttctatttc    1740
aaacgttatt agtaatgctg tatcccaaat tagttccagc aatccaggag cgtctgcgtg    1800
tgatgttctc gttcaagctc ttcttgaact tgttactgct ttgctcacca ttattggatc    1860
atcaaatatt ggcagtgtta attatgattc ttcaggccaa tatgcgcaag ttgttactca    1920
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<213> OrganismName : NSCR5蛋白的优化基因序列
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caacggtggt cgtccgtctg acagctatgg cgctcctggc cagggtcaag gccagggtca     780
aggtcaaggt ggctatgcag gcaagccgtc tgatacctat ggtgctccgg gtggtggtaa     840
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<212> Type : DNA
<211> Length : 2005
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Sequence
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<213> OrganismName : NSCR5蛋白的氨基酸序列
<400> PreSequenceString :
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LLELVTALLT IIGSSNIGSV NYDSSGQYAQ VVTQSVQNAF ASKLSKKSGS YSGSKGSKRR     600
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