一种检测癌症相关DNA甲基化的试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种检测癌症相关DNA甲基化的试剂盒及应用。
背景技术
DNA甲基化是一项重要的表观遗传学机制，在人类癌症发生发展中发挥着重要的作用。特定基因的启动子区甲基化异常引起了人们的广泛关注，被认为是癌症诊断的潜在标志物。在癌症中只有极少数的单独基因被证明是甲基化比例很高的。因此，检测一组基因的甲基化状态，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好。至今人们已研究了多种癌症的甲基化谱。对于一个理想的甲基化谱而言，准确的检测方法和逻辑的数据分析都是必不可少的。2012年，已经建立了一种统计多个基因的甲基化水平的方法，根据候选基因的甲基化水平进行癌症样本和正常样本的逐步累积分析。与以前的统计方法相比，这个方法充分考虑了不同基因的甲基化程度和影响，然而，这个方法需要对大量样本进行统计分析，因此很难应用于即时单个样本或少量样本的诊断。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质的用途。
本发明提供了检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本产品中的应用。
本发明的另一个目的是提供检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质的用途。
本发明提供了检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为卵巢癌患者产品中的应用。
上述应用中，所述待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值为所述待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值之和。
所述赋值标准如下：若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值小于0.3，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为1；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于等于0.3 且小于等于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为2；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为3。
本发明第三个目的是提供检测待测样本基因组中RASSF1A基因启动子区CCGG位点甲基化水平、OPCML基因启动子区CCGG位点甲基化水平和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质的用途。
本发明提供了检测待测样本基因组中RASSF1A基因启动子区CCGG位点甲基化水平、OPCML基因启动子区CCGG位点甲基化水平和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本产品中的应用。
本发明第四个目的是提供检测待测患者基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质的用途。
本发明提供了检测待测患者基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为卵巢癌患者产品中的应用。
上述应用中，所述待测样本为单个样本。
上述应用中，所述产品为试剂盒。
本发明的第五个目的是提供上述物质。
本发明提供的上述物质，为如下1)或2)：
1)鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本的产品；
2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为卵巢癌患者产品。
上述物质包括扩增RASSF1A基因启动子区CCGG位点的引物对、扩增OPCML基因启动子区CCGG位点的引物对和扩增HOXA9基因启动子区CCGG位点的引物对。
上述物质中，所述扩增RASSF1A基因启动子区CCGG位点的引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；
所述用于扩增OPCML基因启动子区CCGG位点的引物对由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；
所述用于扩增HOXA9基因启动子区CCGG位点的引物对由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成。
所述物质还包括记载在可读载体上的赋值标准和判断标准：
所述赋值标准如下：若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值小于0.3，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为1；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于等于0.3且小于等于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为2；若RASSF1A 基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为3。
所述判断标准如下:
(1)若SUM大于4，则待测样本为或候选为卵巢癌样本；待测患者为或候选为卵巢癌患者；
(2)若SUM小于等于4，则待测样本为或候选为非卵巢癌样本；待测患者为或候选为非卵巢癌患者。
HpaII酶是一种甲基化敏感限制性内切酶，能特异性地切断非甲基化的5′-CCGG-3′序列，而不影响甲基化的5′-CCGG-3′序列。提取的基因组DNA被分为两部分：A部分进行HpaII处理，非甲基化的DNA被切断，只保留甲基化的DNA；B部分不进行HpaII处理，甲基化和非甲基化的DNA都保持完整。在进行PCR扩增时，A部分只有甲基化的DNA被扩增，B部分非甲基化和甲基化的DNA都被扩增。
所用的引物的设计原则为：设计的扩增区域应含有2或3个5′-CCGG-3′位点，而且不能占据引物位置。PCR引物用DNAMAN软件设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm值接近或高于60℃。
荧光标记采用PCR扩增，扩增中的dNTP为荧光素标记的dATP或dGTP或dCTP或dUTP。
本发明的实验证明，本发明的方法及引物对可以鉴定待测样本是否为癌症样本或鉴定待测患者是否为癌症患者，通过甲基化水平的联合分析，设定了癌症诊断的阈值，待测样本的SUM值超过阈值即为癌症样本，这一诊断结论是确定的。本发明可及时准确鉴定单个样本，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好。而且用阈值代替统计和累积分析，更有可能用于癌症的即时诊断。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为低甲基化水平样品的荧光光谱。
图2为中甲基化水平样品的荧光光谱。
图3为高甲基化水平样品的荧光光谱。
图4为35个癌症样本和11个正常样本的RASSF1A基因的甲基化水平分布。
图5为35个癌症样本和11个正常样本的OPCML基因的甲基化水平分布。
图6为35个癌症样本和11个正常样本的HOXA9基因的甲基化水平分布。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、合成PFPN
向150mL的单口瓶加入1,6-二溴己烷(23mL,154mmol)和2,7-二溴芴(5.01g,15.4mmol)，加热搅拌使其溶解。将50mL 50％的KOH水溶液加入到上述反应体系中，随后加入四丁基溴化铵(0.7g,2.17mmol)，将反应混合液加热至75℃反应2h。反应完毕后向反应混合液用二氯甲烷萃取(50mL×2)，合并有机相，有机相经水洗，1M盐酸洗，水洗，无水硫酸镁干燥后旋转蒸发除溶剂。减压蒸馏除去过量的1,6-二溴己烷，得棕色粗产品。粗产品用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂为石油醚，得到2,7-二溴-9,9-二(6-溴己基)芴(7.40g,74％)。1H NMR(300MHz,CDCl3,ppm):7.53(d,2H),7.46(m,4H),3.29(m,4H),1.93(m,4H),1.70(m,4H),1.08-1.35(m,8H),0.61(m,4H)。
将2,7-二溴-9,9-二(6-溴己基)芴(400mg,0.62mmol)溶于10mL THF，然后将反应液冷却至-78℃。将4mL浓缩的三甲胺逐滴滴加至反应液中，反应液逐渐恢复到室温，向反应液中加入10mL水使其中的沉淀物溶解。再次将反应混合液冷却至-78℃，并加入4mL浓缩的三甲胺。反应混合液搅拌反应24h。旋转蒸发除去溶剂，粗品经丙酮再沉淀得白色粉末状固体2,7-二溴-9,9-二(6-(N,N,N-三甲胺)-己基)芴(462mg,97％)。1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):7.77(d,2H),7.70(d,2H),7.60(dd,2H),3.39-3.31(m,4H),3.15(s,18H),2.22-2.05(m,4H),1.75-1.58(m,4H),1.33-1.16(m,8H),0.79-0.61(m,4H)。
将4-(6-溴己氧基)-2,5-二溴苯甲醚(288mg,0.65mmol)溶于10mL THF，逐滴加入二甲胺的水溶液(33％，2mL)，室温下搅拌过夜。旋转蒸发除去溶剂，真空干燥后得黄色片状固体4-(6-二甲基胺基己氧基)-2,5-二溴苯甲醚(264mg，100％)。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):7.09(s,2H),3.95(t,2H),3.84(s,3H),3.02(t,2H),2.80(s,6H),1.92(p,2H),1.82(p,2H),1.58(p,2H),1.48(p,2H).
将4-(6-二甲基胺基己氧基)-2,5-二溴苯甲醚(23mg,0.06mmol)，2,7-二溴-9,9-二(6-(N,N,N-三甲胺)-己基)芴(100mg,0.13mmol)和1,4-双(1,3,2-二氧硼烷-2-基)苯(46mg,0.19mmol)溶于2mL THF、2mL DMF和2mL 2M K2CO3水溶液组成的混合溶剂，因为比较难溶，补加少量THF和DMF，并加热直至溶解，溶解过程大约30min。通入氮气15min后，加入催化剂Pd(dppf)Cl2(10mg,0.01mmol)。反应升至80℃反应2天。将反应混合液恢复至室温，旋转蒸发除去溶剂，加入甲醇，除去不溶物。将可溶的部分浓缩后用丙酮沉淀，再用3500g mol-1的透析袋透析两天(换水8次)。旋转蒸发除去溶剂后得黄色固体PFPN(50mg，18％)。1H NMR(400MHz,CD3OD,ppm):8.52(s),7.86-7.34(br),7.12-6.83(br),4.03-3.45(br),3.13(s),2.96-2.90(br),2.22-2.16(d),1.85(s),1.75(s),1.53(s),1.16(s), 0.72(s).
PFPN的化学结构式如式I所示：
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实施例2、基于PFPN的FRET技术检测待测DNA甲基化
下面实施例选择基因的启动子区应该在正常样本中是非甲基化的，在癌症样本中是甲基化的。根据文献报道，实验中选择了三个相关基因RASSF1A、OPCML和HOXA9。所有的基因序列都能在网址http//:www.ensembl.org中查到。设计的扩增区域(隶属启动子区)应含有2或3个5′-CCGG-3′位点，其中CG甲基化与卵巢癌相关而且不能在引物位置。
一、基因组DNA的获得
选取了35个卵巢癌组织样本和11个正常组织样本，样本来自常州妇幼保健医院。所有样本的获取均已获得知情同意。福尔马林固定和石蜡包埋的组织样本用TIANamp基因提取试剂盒提取基因组DNA，得到35个卵巢癌组织样本的基因组DNA和11个正常组织样本的基因组DNA。
DNA浓度用NanoDrop光度计根据260nm处的吸光度定量。
二、HpaII酶切
上述1得到的各个样本的基因组DNA均被分为两部分：A部分进行HpaII处理，B部分不进行HpaII处理。
A部分的反应体系包括200ng基因组DNA、20单位的HpaII酶、1×NEB缓冲液I(10mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH 7.0),10mM MgCl2,和1mM二硫苏糖醇)、去离子水，体积为20μL。B部分反应体系包括200ng基因组DNA、1×NEB缓冲液I、去离子水。两部分反应体系都在37℃下孵育12小时，然后再85℃失活15min。消化好的DNA用于PCR扩增或者储存在-80℃。
得到经过HpaII酶切处理的待测DNA样本和未经过HpaII酶切处理的待测DNA样本。
三、PCR扩增各个基因启动子区CCGG位点
1、引物设计
用DNAMAN设计扩增RASSF1A基因启动子区CCGG位点的引物对(序列1和序列2)、扩增OPCML基因启动子区CCGG位点的引物对(序列3和序列4)和扩增HOXA9基因启动子区CCGG位点的引物对(序列5和序列6)，通过调整引物长度，使溶解温度Tm值接近或高于60℃，引物序列见表1。
表1 为各基因扩增所需引物
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上述引物由上海生工生物技术有限公司合成，纯化级别为PAGE级。
2、PCR扩增各基因启动子区CCGG位点
用表1中基因对应的引物对上述二得到的经过HpaII酶切处理的待测DNA样本和未经过HpaII酶切处理的待测DNA样本分别进行第一轮PCR扩增，得到各个样本的RASSF1A基因启动子区CCGG位点扩增产物、OPCML基因启动子区CCGG位点扩增产物和HOXA9基因启动子区CCGG位点扩增产物；
上述第一轮PCR扩增反应体系包括1μL上述二得到的DNA样品、各1μL正向引物和反向引物(终浓度均为0.4μM)、0.5μL dNTPs(50μM)、0.1μL 0.02单位的GoTaq热启动DNA聚合酶、5μL 5×GoTaq Flexi缓冲液、0.6μL MgCl2(0.6mM)，15.8μL水，总体积为25μL。
上述第一轮PCR扩增反应程序为先进行95℃、4min的热启动，然后进行15个循环，每个循环程序为95℃、30s，合适的退火温度30s，72℃、40s。
得到各个样本的RASSF1A基因启动子区CCGG位点扩增产物、OPCML基因启动子区CCGG位点扩增产物和HOXA9基因启动子区CCGG位点扩增产物。
四、荧光标记各个基因启动子区CCGG位点扩增产物
将上述三得到的各个样本的RASSF1A基因启动子区CCGG位点扩增产物、OPCML基因启动子区CCGG位点扩增产物和HOXA9基因启动子区CCGG位点扩增产物用荧光素进行荧光标记，荧光标记采用第二轮PCR扩增的方法，具体如下：
第二轮PCR扩增体系体积为20μL，包括各1μL的正向引物和反向引物(终浓度均为0.5μM)、2μL的dNTP/Fluorescein-12-dNTP混合物(终浓度为4μM dCTP、4μM dATP、3.5μM dGTP、3.5μM dTTP、0.5μM Fluorescein-12-dGTP、0.5μM Fluorescein-12-dUTP)、0.2μL的0.025单位的HotMaster Taq DNA聚合酶、2μL的10×HotMaster Taq缓冲液或者10μL的2×GC缓冲液,4.8μL水。
第二轮PCR扩增反应程序如下：95℃、4min,然后进行30个循环，每个循环程序为95℃、30s,合适的退火温度30s，65℃、60s。
为了除去过量的dNTPs和Fluorescein-12-dNTPs，在12μL PCR产物中加入3μL含1.5单位的虾碱性磷酸酶SAP和1.5μL of 10×SAP缓冲液[500mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH 9.0),50mM MgCl2]的混合物，37℃孵育30min，然后经85℃、10min将SAP酶失活。
得到各个样本的RASSF1A基因启动子区CCGG位点荧光标记产物、OPCML基因启动子区CCGG位点荧光标记产物和HOXA9基因启动子区CCGG位点的荧光标记产物。
五、基于PFPN进行FRET检测
将30μL PFPN储备液(1mM)加入到485μL二甲亚砜(DMSO)、485μL of N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸HEPES缓冲液(25mM,pH 8.0)中配成PFPN工作液。
90μL PFPN工作液分别和10μL上述四得到的各个样本的RASSF1A基因启动子区CCGG位点荧光标记产物、OPCML基因启动子区CCGG位点荧光标记产物和HOXA9基因启动子区CCGG位点的荧光标记产物在96孔板中混合。然后将96孔板放入Multi-Mode酶标仪中检测，选激发波长为380nm，发射波长424nm和530nm。滤光片1(440/30nm)被用于检测424nm处的发射，滤光片2(528/20nm)被用于检测530nm处的发射，检测各个样本各基因启动子区CCGG位点荧光标记产物的I530nm和I424nm。
六、计算RASSF1A基因启动子区CCGG位点甲基化水平值、OPCML基因启动子区CCGG位点甲基化水平值和HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值
根据公式1计算各个基因启动子区CCGG位点的甲基化水平值，得到RASSF1A基因启动子区CCGG位点甲基化水平值、OPCML基因启动子区CCGG位点甲基化水平值和HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值；
公式1为：
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其中，E为各基因启动子区CCGG位点甲基化水平值，FRET比值HpaII为经过HpaII酶切处理待测DNA中各基因启动子区CCGG位点I530nm与I424nm的比值；FRET比值non-HpaII为 未经过HpaII酶切处理待测DNA中各基因启动子区CCGG位点I530nm与I424nm的比值；FRET比值Blank为用水代替基因组DNA的空白对照的I530nm与I424nm的比值。
不同甲基化水平的荧光光谱不同，以低、中、高三种甲基化水平为例。低甲基化水平如图1所示，计算所得甲基化水平值为0.21；中甲基化水平如图2所示，计算所得甲基化水平值为0.46；高甲基化水平如图3所示，计算所得甲基化水平值为0.89。
测定35个癌症样本和11个正常样本的RASSF1A基因的甲基化水平分布如图4所示。11个正常样本的甲基化水平值都低于0.3；35个癌症样本中8个样本的甲基化水平值高于0.7；9个样本的甲基化水平值在0.3至0.7之间，18个样本的甲基化水平值低于0.3。
测定35个癌症样本和11个正常样本的OPCML基因的甲基化水平分布如图5所示。11个正常样本中的9个样本的甲基化水平值低于0.3，2个样本的甲基化水平值在0.3至0.7之间；35个癌症样本中12个样本的甲基化水平值高于0.7；15个样本的甲基化水平值在0.3至0.7之间，8个样本的甲基化水平值低于0.3。
测定35个癌症样本和11个正常样本的HOXA9基因的甲基化水平分布如图6所示。11个正常样本的甲基化水平值都低于0.3；35个癌症样本中17个样本的甲基化水平值高于0.7；10个样本的甲基化水平值在0.3至0.7之间，8个样本的甲基化水平值低于0.3。
七、赋值确定待测DNA分子中癌症相关基因启动子区CCGG位点整体甲基化水平及是否为癌症样本
对步骤六)得到的RASSF1A基因启动子区CCGG位点甲基化水平值、OPCML基因启动子区CCGG位点甲基化水平值和HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值进行赋值，若各基因启动子区CCGG位点甲基化水平值小于0.3，则该基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为1；若各基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于等于0.3且小于等于0.7，则该基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为2；若各基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于0.7，则该基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为3。
计算三个基因赋值后数值之和SUM，确定待测DNA分子是否来源于卵巢癌样本，具体确定条件如下：
(1)若SUM大于4，则待测DNA来源于或候选来源于卵巢癌样本；
(2)若SUM小于等于4，则待测DNA来源于或候选来源于非卵巢癌样本；
35个卵巢癌样本依次标记为“1”至“35”，11个正常样本依次标记为“N1”至“N11”。甲基化水平低于0.3赋值为1，0.3至0.7赋值为2，高于0.7赋值为3。样本的SUM值列于右侧。
上述样本中RASSF1A、OPCML和HOXA9三个基因甲基化水平赋值及SUM值如表2 所示：
表2为RASSF1A、OPCML和HOXA9三个基因水平赋值及SUM值
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从上述表2可以看出，
11个正常样本的SUM值都小于或等于4，表明，可以通过SUM值小于或等于4判断为非卵巢癌样本，判断准确率高；
35个卵巢癌样本中有31个卵巢癌样本的SUM值大于4，其余4个卵巢癌样本的SUM值小于4，表明，可以通过SUM值大于4判断为卵巢癌样本，判断准确率高达88％。
上述实验可以看出，检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质可以鉴定待测样本是否为卵巢癌样本，本实施例的方法可以用来鉴定单个样本，可以及时准确鉴定。
鉴定的具体方法如下：
若待测样本的RASSF1A、OPCML和HOXA9三个基因甲基化水平的SUM值大于4，则待测样本为或候选为卵巢癌样本；
若待测样本的RASSF1A、OPCML和HOXA9三个基因甲基化水平的SUM值小于等于4，则待测样本为或候选为卵巢癌样本。
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