一种沉默DF1细胞系中OASL基因的方法.pdf

本发明公开了一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法。它首先根据OASL基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低OASL基因表达的siRNA；再构建含有OASL RNAi基因的慢病毒载体；通过上述慢病毒载体，将OASL RNAi基因介导入DF-1细胞系，沉默OASL基因的表达，提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度。此方法可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，大大降低疫苗生产成本，不仅能解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养技术的研发进程。

1.  一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，
(1)根据OASL基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低OASL基因表达的siRNA；
(2)构建表达上述筛选的OASL基因siRNA的慢病毒载体；
(3)通过上述慢病毒载体，将OASL基因siRNA导入DF-1细胞系，沉默OASL基因的表达，提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度。

2.  如权利要求1所述的一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，所述步骤(1)的筛选方法是：将设计的多个siRNA插入pLKO.1-TRC克隆载体中，转染DF1细胞，再收获并提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平干扰OASL基因的有效siRNA。

3.  如权利要求2所述的一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，所述步骤(1)筛选得到的siRNA为5′-AA GGACAGTAACAAGACCACA-3′。

4.  如权利要求1-3中任意一项所述的一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，所述步骤(2)的慢病毒载体为LV-OASL-RNAi。

5.  如权利要求4所述的一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，所述慢病毒载体为LV-OASL-RNAi的构建方法为：
1)根据筛选的siRNA的DNA序列设计合成单链DNA oligo，退火配对产生双链，再通过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248-OASL；
2)大量提取重组质粒GV248-OASL，与辅助质粒pHelper1.0、pHelper2.0混合后通过脂质体转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上清液过滤后得到慢病毒载体LV-OASL-RNAi。

6.  如权利要求5所述的一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，所述双链为：
OASL-RNAi-1：5′-CCGG AAGGACAGTAACAAGACCACA CTCGAGTGTGGTCTTGTTACTGTCCTT TTTTTG-3′；
OASL-RNAi-2：5′-AATTCAAAAA AAGGACAGTAACAAGACCACA CTCGAGTGTGGTCTTGTTACTGTCCTT-3′。

7.  如权利要求4或5所述的一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，所述脂质体为Lipofectamine2000。

8.  如权利要求4所述的一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，所述步骤(3)具体包括以下步骤：
1)将DF-1细胞接种至细胞培养皿中，待生长密度达70％时，接种慢病毒LV-OASL-RNAi；
2)以含10μg/mL聚凝胺的10％FBS DMEM培养基稀释LV-OASL-RNAi至终浓度为5×10⁶PFU/mL，进而通过10倍倍比稀释，获得至少3个不同的病毒滴度，分别接种至DF-1细胞中；同时设定阳性病毒对照；
3)将接种LV-OASL-RNAi的DF-1细胞置37℃条件下5％CO₂维持培养4h，更换为含5％FBS DMEM培养基，继续培养至48h，更换含4μg/mL嘌呤霉素的10％FBS DMEM培养基，筛选出阳性细胞克隆。

一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法
技术领域
本发明涉及一种沉默DF-1细胞系中2',5'寡聚腺苷酸合成酶样(2',5'oligoadenylate synthetases-like,OASL)基因的方法，用于提高禽流感病毒在该细胞系中的增殖滴度，属于生物技术领域。
背景技术
随着集约化养殖业的迅猛发展，禽流感等家禽重要疫病正成为公共卫生安全领域的焦点，从源头上控制疫病是当前防控策略的重中之重。实践证明，疫苗免疫和快速检测是防控重大动物疫病最有效的措施。由于禽流感病毒细胞培养的滴度较低，目前国内仍主要采用禽胚生产疫苗，效率低、耗能高，存在外源病毒污染的可能。我国农业“十二五”规划已将重大动物疫病防控技术研究和农产品安全生产与质量控制技术研究列入重大关键技术攻关。
DF-1细胞是一种稳定的、无肿瘤基因的、可传代的鸡胚成纤维细胞系，细胞形态呈纤维状，该细胞缺少禽白血病病毒，肉瘤病毒内源性基因，被广泛用于动物病毒研究、疫苗研制及癌症研究等诸多领域。OASL是一种寡聚腺苷酸合成酶，研究表明，RNA病毒如丙肝病毒、流感病毒等感染患者的细胞中OASL水平较高，高水平OASL可增强人类机体细胞检测病毒RNA的能力，从而激活机体的免疫系统抑制病毒复制。因此，建立一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，可有效提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度，大大降低疫苗生产成本，对于我国禽流感的预防和控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有禽流感疫苗生产中存在的不足，提供一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，不仅能解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养技术的研发进程。
本发明的技术方案是：一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，其特征是，
(1)根据OASL基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低OASL基因表达的siRNA；
(2)构建表达上述筛选的OASL基因siRNA(OASL RNAi基因)的慢病毒载体；
(3)通过上述慢病毒载体，将OASL基因siRNA(OASL RNAi基因)导入DF-1细胞系，沉默OASL基因的表达，提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的增殖滴度。
进一步地，所述步骤(1)的筛选方法是：将设计的多个siRNA插入pLKO.1-TRC克隆 载体中，转染DF1细胞，再收获并提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平干扰OASL基因的有效siRNA。
进一步地，所述步骤(1)筛选得到的siRNA为sh1：5′-AA GGACAGTAACAAGACCACA-3′；
进一步地，所述步骤(2)的慢病毒载体为LV-OASL-RNAi；
上述慢病毒载体的构建方法为，包括以下步骤：
1)根据上述siRNA的DNA序列设计合成单链DNA oligo，退火配对产生双链，再通过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248-OASL；
上述双链为：
OASL-RNAi-1：5′-CCGG AAGGACAGTAACAAGACCACA CTCGAGTGTGGTCTTGTTACTGTCCTT TTTTTG-3′；
OASL-RNAi-2：5′-AATTCAAAAA AAGGACAGTAACAAGACCACA CTCGAGTGTGGTCTTGTTACTGTCCTT-3′；
2)大量提取重组质粒GV248-OASL，与辅助质粒pHelper1.0、pHelper2.0混合后通过脂质体(Lipofectamine2000)转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上清液过滤后得到慢病毒载体LV-OASL-RNAi。
进一步地，所述步骤(3)通过慢病毒载体LV-OASL-RNAi将OASL基因siRNA(OASLRNAi基因)介导入DF-1细胞系，包括以下步骤：
1)将DF-1细胞接种至细胞培养皿中，待生长密度达70％时，接种慢病毒LV-OASL-RNAi；
2)以含10μg/mL聚凝胺的10％FBS DMEM培养基稀释LV-OASL-RNAi至终浓度为5×10⁶PFU/mL，进而通过10倍倍比稀释，获得至少3个不同的病毒滴度，分别接种至DF-1细胞中；同时设定阳性病毒对照；
3)将接种LV-OASL-RNAi的DF-1细胞置37℃条件下5％CO₂维持培养4h，更换为含5％FBS DMEM培养基，继续培养至48h，更换含4μg/mL嘌呤霉素的10％FBS DMEM培养基，筛选出阳性细胞克隆。
本发明具有下列优点：
1.本发明将三个shRNA插入pLKO.1-TRC克隆载体中，通过转染收获并提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平干扰OASL基因的有效siRNA，为筛选siRNA提供了一种快速、准确、高通量的方法。
2.本发明利用慢病毒载体系统，将干扰OASL基因的shRNA快速连接到慢病毒载体系统，通过转染获得一种含有OASL RNAi基因的慢病毒。
3.本发明通过慢病毒将OASL RNAi基因介导入DF-1细胞系，建立一种沉默DF-1细胞系中OASL基因的方法，可提高禽流感病毒在DF-1细胞系中的抗原量达5-10倍，大大降低疫苗生产成本，不仅能解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养技术的研发进程。
附图说明
图1是设计筛选的三个siRNA在OASL基因的位置及筛选出的有效siRNA(sh1)；
图2是pLKO.1质粒经Age I酶切琼脂糖凝胶电泳产物，其中M泳道为DNA marker DL15000；第1泳道为pLKO.1质粒Age I酶切产物；第2泳道为pLKO.1质粒对照；
图3是pLKO.1质粒经Age I和EcoR I双酶切琼脂糖凝胶电泳产物，其中M泳道为DNAmarker DL 15000；第1泳道为pLKO.1质粒Age I和EcoR I酶切产物；
图4是pLKO.1质粒经AgeI和EcoRI双酶切琼脂糖凝胶回收产物，其中M泳道为DNAmarker DL 15000；第1泳道为pLKO.1质粒Age I和EcoR I酶切回收产物；
图5是pLKO.1-TRC-OASL质粒经EcoR I和Nco I双酶切鉴定产物，其中M泳道为DNAmarker DL 15000；第1泳道为pLKO.1-TRC-OASL质粒经EcoR I和Nco I双酶切产物；
图6是OASL有效shRNA筛选荧光定量PCR检测的△Ct值；
图7是载体GV248示意图；
图8是荧光显微镜下观察慢病毒LV-OASL-RNAi感染293T细胞；其中左图为普通光视野，右图为荧光视野；
图9是禽流感病毒1215株在DF-1、DF-1△OASL细胞中TCID₅₀测定。
具体实施方式
一、干扰OASL基因转录的siRNA筛选
1、干扰OASL基因的shRNA的寡核苷酸序列的设计与合成
根据Genbank中登录的OASL基因序列，结合addgene慢病毒载体构建程序，于http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext网站设计3个RNA干扰靶点序列的siRNA(如图1所示)，同时设立对照组Scramble，序列如下：sh1：5′-AA GGACAGTAACAAGACCACA-3′(SEQ  No.1)；sh2：5′-AA CTGCAGAAGAACTTTGTGA-3′(SEQ No.2)；sh3：5′-AA GTACTATTCCCTGGAGGAT-3′(SEQ No.3)；Scramble：CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG(SEQ No.4)，根据pLKO.1-TRC克隆载体特性，将siRNA的DNA序列与其相应的互补序列以loop序列连接形成正义链和反义链，并在两端引入接头序列，通过退火形成shRNA。序列由宝生物工程(大连)有限公司合成。
2、干扰OASL基因pLKO.1-TRC-OASL载体的构建与鉴定
参考Addgene公司pLKO.1-TRC克隆载体说明书操作，将pLKO.1-TRC克隆载体于37℃经Age I酶切2h，回收载体片段(如图2所示)，将经Age I酶切回收片段于37℃以EcoR I酶切2h，分别获得7kb、1.9kb的片段(如图3所示)，回收7kb线性载体(如图4所示)。回收片段与退火形成的shRNA序列16℃连接过夜，转化感受态菌DH5α，挑取单克隆菌落，经过夜培养后提取质粒pLKO.1-TRC-OASL，以EcoR I及Nco I双酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测，获得2kb、5kb的片段(如图5所示)。鉴定的阳性的克隆利用pLKO.1测序引物(5’-CAA GGC TGT TAG AGA GAT AAT TGG A-3’SEQ No.5)进行测序。
3、检测引物的设计与合成
采用SYBR Green I荧光定量PCR方法(ABI 7300)扩增靶基因OASL，同时设定内参β-actin。其中OASL片段长度为106bp，参考NM_205041.1序列；β-actin片段长度为113bp，参考NM_205518.1序列，引物序列如下：
OASL F：AGATGTTGAAGCCGAAGTACCC        (SEQ No.6)；
OASL R：CTGAAGTCCTCCCTGCCTGT          (SEQ No.7)；
β-actin F：ATTGTCCACCGCAAATGCTTC     (SEQ No.8)；
β-actin R：AAATAAAGCCATGCCAATCTCGTC  (SEQ No.9)。
SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法所用引物采用△Ct验证靶基因与内参扩增的平行性，以上引物序列由宝生物工程(大连)有限公司合成。
4、质粒pLKO.1-TRC-OASL的转染
转染前24h制备12孔板DF-1单层细胞，待细胞生长至80％时进行转染：将以试剂盒提取的无内毒素质粒pLKO.1-TRC-OASL取1.2μg溶于100μL MEM-OPTI减血清培养基中，另 取3μL脂质体(Lipofectamine2000)溶于100μL MEM-OPTI减血清培养基中；将质粒混合液加入脂质体混合液中充分混匀，室温感作20min；转染前2h更换无血清DMEM培养基，吸弃细胞板中的培养基，加入质粒与脂质体混合液，置37℃5％CO₂条件下继续培养5.5h；更换3％FBS DMEM培养基维持培养至48h，收集细胞提取总RNA。
5、荧光定量PCR方法检测OASL的转录水平
利用RNA小量抽提试剂盒(AXYGEN)提取细胞总RNA，获得的RNA经ReverTra AceqPCR RT Master Mix with gDNA Remover反转录为cDNA，2倍稀释后，采用SYBR Green I荧光定量PCR(ABI 7300)扩增靶基因OASL，同时设定内参β-actin。扩增条件为95℃预变性45s，95℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸20s，40个循环，每一样品做3个重复。以△Ct值作为指标比较不同靶基因的shRNAs与Scramble表达之间的差异，结果，通过瞬时转染DF-1细胞48h筛选出OASL-sh1在mRNA水平上敲低了OASL基因的表达(如图6所示)。
二、含有OASL RNAi基因的慢病毒载体构建
1、针对OASL RNAi基因慢病毒载体构建
根据筛选出的siRNA的DNA序列设计合成shRNA，首先合成单链DNA oligo，序列如下：
OASL-RNAi-1：5′-CCGG AAGGACAGTAACAAGACCACA CTCGAGTGTGGTCTTGTTACTGTCCTT TTTTTG-3′(SEQ No.10)；
OASL-RNAi-2：5′-AATTCAAAAA AAGGACAGTAACAAGACCACA CTCGAGTGTGGTCTTGTTACTGTCCTT-3′(SEQ No.11)；
将合成的单链OASL-RNAi-15μL(20μM)、OASL-RNAi-25μL(20μM)、10×buffer2(NEB)5μL、35μL ddH₂O，90℃水浴15min，自然冷却至室温退火形成DNA片段。通过T4DNA连接酶将经Age I、EcoR I双酶切线性化的载体GV248(载体GV248示意图见图7)与退火的DNA片段连接，获得GV248-OASL。经16℃连接过夜，转化至感受态菌DH5α，通过PCR方法鉴定阳性克隆，并对阳性克隆进行序列测定及分析。
2、LV-OASL-RNAi慢病毒包装与滴度测定
大量制备高纯度无内毒素的编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒，以及两种辅助包装原件载体质粒。转染前24h制备单层293T细胞，以含10％FBS DMEM培养基调整细胞密度为1.2×10⁷细胞/6mL，接种于60mm细胞培养皿，37℃5％CO₂培养至细胞密度达70％-80％时可用于转染，转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。分别取质粒GV248-OASL、pHelper1.0载体、pHelper2.0载体分别为10μg、7.5μg、5μg与MEM-OPTI减血清培养基混合使总体积为1mL，室温作用5min。取20μL脂质体(Lipofectamine2000)与1mL MEM-OPTI减血清培养基混合，室温作用5min。将稀释的质粒与脂质体轻轻颠倒混匀，室温作用20min，形成转染复合物。将转染复合物转移至293T细胞，37℃5％CO₂培养8h后弃去转染复合物，并以5mL PBS洗涤一次，更换为含10％FBS DMEM培养基，继续培养48h后收集293T细胞上清液，4000g 4℃离心10min，上清经0.45μm滤器过滤，-80℃保存，将获得的慢病毒命名为LV-OASL-RNAi。取病毒原液10μl，加入90μl无血清DMEM培养基中，依次10倍倍比稀释，接种至96孔板中，培养至第4d观察荧光表达情况(见图8)，计算病毒滴度为3E+8TU/mL。
三、慢病毒介导OASL RNAi基因DF-1细胞系的筛选与验证
1、慢病毒介导OASL RNAi基因DF-1细胞系的筛选
制备单层DF-1细胞，接种至60mm细胞培养皿中，37℃5％CO₂培养至生长密度达70％时，更换含10μg/mL Polybrene(聚凝胺)的DMEM培养基。用含10μg/mL Polybrene的10％FBS DMEM将慢病毒适当稀释，使LV-OASL-RNAi慢病毒终浓度分别为5×10⁶PFU/mL、5×10⁵PFU/mL、5×10⁴PFU/mL，分别接种至DF-1细胞培养皿中，接种量为1.0mL/孔，同时接种阴性对照病毒CON077，其终浓度为5×10⁵PFU/mL。将接种LV-OASL-RNAi的DF-1细胞置37℃条件下5％CO₂维持培养4h，更换为5％FBS DMEM培养基，继续培养至48h，更换含4μg/mL Puromycin(嘌呤霉素)的10％FBS DMEM，通过荧光信号及药物加压筛选出阳性细胞克隆，命名为DF-1△OASL。
2、将禽流感病毒1215株(中国动物卫生与流行病学中心保存chicken/Jiangsu/P278/2014H5N2)以0.1MOI接种DF-1、DF-1△OASL细胞，分别取接种后24h、48h、72h的病毒液，冻融三次后接种DF-1细胞，测定其TCID₅₀值，并进行三次重复，结果表明H5N2在DF-1△ OASL细胞中的TCID50高于DF-1细胞(表1和图9)，其中DF-1△OASL细胞接种24h、48h的病毒滴度是DF-1细胞培养的1.1倍。
表1 TCID₅₀测定结果(0.1mL)