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1、10申请公布号CN104204215A43申请公布日20141210CN104204215A21申请号201380016379922申请日2013032261/615,44820120326USC12P19/02200601C08B1/00200601C08H8/00200601C12P19/14200601C13K1/02200601C12P7/10200601D21C5/0020060171申请人诺维信北美公司地址美国北卡罗来纳州72发明人X李MT史密斯74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人张文辉54发明名称预调节纤维素材料的方法57摘要本发明涉及使用苯酚氧化酶和半纤维素酶的。
2、组合预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法。本发明还涉及生产糖和发酵产物的工艺，该工艺包括本发明的一种预调节方法。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014092486PCT国际申请的申请数据PCT/US2013/0334912013032287PCT国际申请的公布数据WO2013/148504EN2013100351INTCL权利要求书2页说明书32页序列表23页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书32页序列表23页10申请公布号CN104204215ACN104204215A1/2页21一种预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法，包括用苯酚氧化酶。
3、和半纤维素酶孵育该未洗涤的预处理的纤维素材料。2如权利要求1所述的方法，其中该苯酚氧化酶是一种虫漆酶。3如权利要求1或2所述的方法，其中该半纤维素酶选自一种木聚糖酶例如一种棘孢曲霉或烟曲霉木聚糖酶以及一种木糖苷酶例如烟曲霉木糖苷酶。4如权利要求13中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未解毒的。5如权利要求14中任一项所述的方法，其中该纤维素材料是未洗涤的预处理的玉米秸秆PCS、玉米穗轴、麦秸、稻秸以及柳枝稷。6如权利要求15中任一项所述的方法，其中孵育发生持续至少30分钟，例如至少1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、或24小时，例如30分钟至24小时。7如权利要求16中任一项所述的方法。
4、，其中孵育发生在2070之间，例如40和60之间。8一种从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物的工艺，包括如权利要求17中任一项中定义地进行预调节；用一种纤维素分解酶制剂使该预调节的材料糖化；使用一种发酵生物体进行发酵。9如8所述的工艺，其中该纤维素分解酶制剂源自于木霉属例如里氏木霉。10如权利要求8或9所述的工艺，其中糖化是在包括选自下组的酶活性的一种纤维素分解酶制剂的存在下进行，该组包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶例如烟曲霉或米曲霉葡糖苷酶。11如权利要求810中任一项所述的工艺，其中糖化是使用一种具有纤维素分解增强活性的多肽例如一种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分。
5、解增强多肽进行。12如权利要求8所述的工艺，其中该半纤维素酶选自一种木聚糖酶例如一种棘孢曲霉或烟曲霉木聚糖酶以及一种木糖苷酶例如烟曲霉木糖苷酶。13如权利要求812中任一项所述的工艺，其中该发酵产物是一种醇例如乙醇或丁醇、一种有机酸、一种酮、一种氨基酸、或一种气体。14一种从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种糖的工艺，包括A如权利要求112中任一项中定义地进行预调节；B用一种纤维素分解酶制剂使该调节的材料糖化。15如权利要求14所述的工艺，进一步包括在步骤B之后回收该糖。16如权利要求14或15所述的工艺，其中该纤维素分解酶制剂源自于木霉属例如里氏木霉。17如权利要求1416中任一项所述的工艺。
6、，其中糖化是在包括选自下组的酶活性的一种纤维素分解酶制剂的存在下进行，该组包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶例如烟曲霉或米曲霉葡糖苷酶。18如权利要求1417中任一项所述的工艺，其中糖化是使用一种具有纤维素分解增强活性的多肽例如一种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分解增强多肽进行。19如权利要求1418中任一项所述的工艺，其中糖化是使用选自半纤维素酶、扩张蛋白、酯酶、虫漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧物酶、蛋白酶、以及膨胀素中的一种或多种酶权利要求书CN104204215A2/2页3进行。20如权利要求19所述的工艺，其中该半纤维素酶选自一种木聚糖酶例如一种棘孢曲霉或烟曲霉木聚糖。
7、酶、一种乙酰木聚糖酯酶、一种阿魏酸酯酶、一种阿拉伯呋喃糖苷酶、一种木糖苷酶例如烟曲霉木糖苷酶、以及一种葡萄糖醛酸酶。权利要求书CN104204215A1/32页4预调节纤维素材料的方法0001对序列表的引用0002本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。发明领域0003本发明涉及预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法以及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产糖和发酵产物的工艺。0004背景0005纤维素材料提供了用于产生化石燃料的可替代能源的一个有吸引力的平台。将纤维素材料例如来自木质纤维素原料转化成生物燃料具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的合意性、以及。
8、该生物燃料例如乙醇的清洁性。一旦将纤维素材料转化成可发酵的糖，例如葡萄糖，那么这些可发酵的糖就可以被酵母发酵成生物燃料例如乙醇。0006为了使植物细胞壁成分破裂并允许纤维素分解酶的改善的进入，该纤维素材料被化学和/或物理预处理。这是增加糖化产率的一个常见方法。然而，预处理还可在木质素结构内产生官能团，这导致木质素和纤维素酶之间不希望的相互作用，致使次优的糖化产率。因此，改善生产预处理的纤维素材料的方法和工艺在本领域中会是一个优势。0007概述0008此处说明了预调节未洗涤的预处理的纤维素材料以改善酶促糖化水解的方法。还说明了使用本发明的一种预调节方法用于生产糖即糖浆和发酵产物例如乙醇的过程。0。
9、009在第一方面中，本发明涉及一种预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法，包括用苯酚氧化酶和半纤维素酶孵育未洗涤的预处理的纤维素材料。0010在一个优选实施例中，该苯酚氧化酶是一种虫漆酶例如来自嗜热毁丝霉。在一个优选实施例中，该半纤维素酶是一种木聚糖酶例如源自于棘孢曲霉或烟曲霉和/或一种木糖苷酶例如源自于烟曲霉。该一种或多种半纤维素酶还可以是包括一种或多种半纤维素酶例如木聚糖酶和/或木糖苷酶的一种纤维素分解酶制剂的部分。0011在第二方面中，本发明涉及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物例如乙醇的工艺，包括0012I根据本发明的预调节方法，预调节该未洗涤的预处理的纤维素材料；0013I。
10、I用一种纤维素分解酶制剂使该预调节的材料糖化；0014III使用一种发酵生物体进行发酵。0015根据本发明，步骤II中的糖化和步骤III中的发酵可以按分开水解和发酵SHF、同时糖化和发酵SSF、同时糖化和共发酵SSCF、杂合的水解和发酵HHF、分开水解和共发酵SHCF、杂合的水解和共发酵HHCF，以及直接微生物转化DMC进行。0016在一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂源自于木霉属例如里氏木霉。该纤维素分解酶制剂通常包括内切葡聚糖酶EG、纤维二糖水解酶CBH、以及葡糖苷酶说明书CN104204215A2/32页5BG。该纤维素分解酶制剂可进一步包括一种具有纤维素分解增强活性的多肽例如橙色嗜热。
11、子囊菌THERMOASCUSAURANTIACUS或埃默森青霉菌PENICILLIUMEMERSONII纤维素分解增强多肽、葡糖苷酶例如烟曲霉或米曲霉葡糖苷酶和/或半纤维素酶。0017在第三方面中，本发明涉及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种糖的工艺，包括0018A根据本发明的预调节方法，预调节该未洗涤的预处理的纤维素材料；0019B用一种纤维素分解酶制剂使该调节的材料糖化。0020可将这些糖用在用于生产糖浆例如高果糖玉米糖浆HFCS和/或木质纤维素衍生的塑料例如聚乙烯、聚苯乙烯以及聚丙烯、聚乳酸例如用于生产PET的过程中。0021半纤维素如此处使用的，术语“半纤维素”是指生物质材料除了纤维。
12、素之外的一种寡糖或多糖。半纤维素在化学上是异质的并包括通过氢键结合到该植物细胞壁中的纤维素微纤维的呈复杂的异质的枝状和线性多糖或寡糖的多种聚合的糖，主要是D戊糖，例如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、以及甘露聚糖，并且其中木糖通常呈最大量。半纤维素可共价地附接到木质素，并通常氢键合到纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质，形成高度复杂结构。半纤维素材料包括任何形式的半纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的是，半纤维素可以是呈以下形式木质纤维素的一个组分、包括木质素的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。0022成熟多肽术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N末。
13、端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等之后呈其最终形式的一种多肽。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸的混合物。该成熟多肽可使用信号PSIGNALP程序NIELSEN等人，1997，蛋白质工程PROTEINENGINEERING1016预测。0023成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”在此处被定义为编码具有生物活性的成熟多肽的核苷酸序列。该成熟多肽编码序列可使用信号PSIGNALP程序NIELSEN等人，1997，上文预测。0024预处理的玉米秸杆术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指源自于玉米秸秆的已被预。
14、处理例如通过用热和稀硫酸处理的一种纤维素材料。0025序列一致性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。0026出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包EMBOSS欧洲分子生物学开放软件套件THEEUROPEANMOLECULARBIOLOGYOPENSOFTWARESUITE，赖斯RICE等人，2000，遗传学趋势TRENDSGENET16276277优选500版或更新版本的NEEDLE程序中所实施的尼德尔曼翁施NEEDLEMANWUNSCH算法尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志JMOLBIOL48443453来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的。
15、这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分05，以及EBLOSUM62BLOSUM62的EMBOSS版本取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出使用NOBRIEF选项获得被用作百分比一致性并且被计算如下0027一致的残基100/比对长度比对中的空位总数说明书CN104204215A3/32页60028出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包EMBOSS欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上优选500版或更新版本的NEEDLE程序中所实施的尼德尔曼翁施算法尼德尔曼和翁施，1970，同上来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分05。
16、以及EDNAFULLNCBINUC44的EMBOSS版本取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出使用NOBRIEF选项获得被用作百分比一致性并且被计算如下0029一致的脱氧核糖核苷酸100/比对长度比对中的空位总数0030变体术语“变体”是指包括一个变更即在一个或多个位置处取代、插入、和/或删除一个或多个例如若干个氨基酸残基的一个多肽例如酶。取代是指用不同的氨基酸替换占据一个位置的氨基酸；删除是指除去占据一个位置的氨基酸；并且插入是指添加与占据一个位置的氨基酸相邻的氨基酸。0031在此提及“约”一个数值或参数包括指向那个数值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。0032。
17、如在此和所附权利要求书中所使用，单数形式“一种/个”、“或”以及“该”包括复数指示物，除非上下文以另外的方式清楚表明。应该理解的是在此描述的本发明的这些方面包括“由方面组成”和/或“基本由方面组成”。0033除非另外定义或由背景清楚指示，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。0034详细说明0035本发明尤其涉及预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法以及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物例如乙醇的工艺，该工艺包括本发明的一种预调节方法。0036诸位发明人已经发现，当用虫漆酶和半纤维素酶的组合预调节未洗涤的预处理的玉米秸秆其包括约374。
18、2纤维素和2127半纤维素时，该酶水解速率增加并且总糖含量提高。这种有益效果被认为归因于对木糖低聚物和木质素衍生物抑制的降低。0037本发明的预调节方法可以在其中产生糖的糖化步骤即水解步骤之前进行。这些糖可被转化为多个产物，包括发酵产物例如乙醇或丁醇，或被转化为糖浆例如高果糖玉米糖浆以及木质纤维素衍生的塑料，包括聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯。其他考虑到的终产物包括乳酸，其可充当用于生产聚乳酸PLA以替代石油化学的包装材料例如PET的一种原料。0038预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法0039在第一方面中，本发明涉及一种预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法，包括用苯酚氧化酶和半纤维素酶孵育未洗。
19、涤的预处理的纤维素材料。0040该苯酚氧化酶可以是任何苯酚氧化酶。在一个优选实施例中，该苯酚氧化酶是虫漆酶。特别考虑到的是嗜热毁丝霉虫漆酶WO95/33836中的SEQIDNO2或此处的SEQIDNO12。其他适合的虫漆酶在以下的“虫漆酶”部分中提出。0041还可以使用其他苯酚氧化酶。在以下的“苯酚氧化酶”部分中给出实例。0042该半纤维素酶可以是任何半纤维素酶例如真菌或细菌起源的。在一个优选实施例中，该半纤维素酶是木聚糖酶和/或木糖苷酶。具体地，半纤维素酶可以是一种木聚糖说明书CN104204215A4/32页7酶例如GH10木聚糖酶源自于棘孢曲霉例如披露于WO94/21785中的XYLII。
20、或此处的SEQIDNO6、或烟曲霉例如披露于WO2006/078256中的一种或此处的SEQIDNO8和/或一种木糖苷酶源自于烟曲霉例如披露于WO2011/057140中的一种或此处的SEQIDNO9。0043在以下“半纤维素酶”部分中列出了其他半纤维素酶。0044在一个实施例中，该半纤维素酶可以是一种纤维素分解酶制剂中的其他成分。在这类实施例中，该半纤维素酶可以是一种纤维素分解酶制剂例如来自里氏木霉，该纤维素分解酶制剂进一步包括一种外来半纤维素酶即不源自于该纤维素分解酶制剂生产生物体，例如一种木聚糖酶例如棘孢曲霉或烟曲霉木聚糖酶和/或木糖苷酶例如烟曲霉木糖苷酶。0045可以使用任何适合的方法。
21、预处理该未洗涤的预处理的纤维素材料。在以下“预处理”部分中列出了适合的预处理方法。在一个优选实施例中，该材料是稀酸预处理的或自水解的。0046在一个实施例中，该未洗涤的预处理的材料是未解毒的。0047在一个实施例中，该未洗涤的预处理的材料是压榨的纤维素材料。0048根据本发明，该纤维素材料可以是未洗涤的预处理的玉米秸秆PCS、未洗涤的预处理的玉米穗轴、未洗涤的预处理的麦秸、未洗涤的预处理的稻秸或未洗涤的预处理的柳枝稷。在一个优选实施例中，该纤维素材料是未洗涤的稀酸预处理的玉米秸秆。0049考虑到的纤维素材料的其他实例可以在以下“纤维素材料”部分中找到。0050在一个实施例中，预调节发生在550。
22、W/WTS，例如1040W/WTS，例如1535W/WTS。0051在一个实施例中，该纤维素材料的预调节孵育发生持续例如至少30分钟，例如至少1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、或24小时、或更长，或从30分钟到24小时。0052在一个实施例中，该纤维素材料的预调节孵育发生在2070之间，例如40和60之间。0053在一个实施例中，该苯酚氧化酶装载尤其虫漆酶是1500G之间，例如5100G酶类蛋白质EP/G纤维素。0054在一个实施例中，该半纤维素酶装载是001和20MGEP/G纤维素之间，例如011MGEP/G纤维素。0055在一个实施例中，与当在相同条件下在预调节孵育中不存在苯酚氧化。
23、酶和半纤维素酶时相比，根据本发明的预调节导致减少的木糖低聚物和木质素衍生物。0056纤维素材料0057如此处使用的，术语“纤维素材料”是指包括纤维素14D葡聚糖包括14连接的D葡萄糖单元的聚合物的一种化学上异质的寡糖或多糖的任何木质纤维素材料。尽管纤维素一般为多态的，但可发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、以及木材中。纤维素材料可以是，但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、以及纸浆和造纸厂残余物参见，例如，维色洛戈尔WISELOGEL等人，1995，于生物乙醇手册HANDBOOKONB。
24、IOETHANOL查尔斯E怀曼CHARLESEWYMAN编说明书CN104204215A5/32页8辑，第105118页，泰勒弗朗西斯出版集团TAYLORFRANCIS，华盛顿特区WASHINGTONDC；怀曼WYMAN，1994，生物资源技术BIORESOURCETECHNOLOGY50316；林德LYND，1990，应用生物化学与生物技术APPLIEDBIOCHEMISTRYANDBIOTECHNOLOGY24/25695719；莫思尔MOSIER等人，1999，木质纤维素的生物转化的最近进展RECENTPROGRESSINBIOCONVERSIONOFLIGNOCELLULOSICS，生。
25、物化学工程/生物技术的进展ADVANCESINBIOCHEMICALENGINEERING/BIOTECHNOLOGY，T谢伯TSCHEPER主编，第65卷，第2340页，纽约斯普林格出版社SPRINGERVERLAG,NEWYORK。纤维素材料包括任何形式的纤维素，例如降解或水解为寡糖的多糖。在此应理解的是，纤维素可以是呈以下形式木质纤维素的一个组分、包括木质素的植物细胞壁材料、纤维素、以及混合基质中的半纤维素。0058在一方面，纤维素材料是草本材料包括能源作物。在另一方面，纤维素材料是农业残余物。在另一方面，纤维素材料是木材包括林业残余物。在另一方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一方面，。
26、纤维素材料是废纸。在另一方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。0059在另一方面，纤维素材料是玉米秸杆。在另一方面，纤维素材料是小麦杆。在另一方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一方面，纤维素材料是柳枝稷。在另一方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一方面，纤维素材料是稻草。在另一方面，纤维素材料是芒草。在另一方面，纤维素材料是芦竹。在另一方面，纤维素材料是竹材。在另一方面，纤维素材料是橙皮。在另一方面，纤维素材料是白杨。在另一方面，纤维素材料是松树。在另一方面，纤维素材料是山杨。在另一方面，纤维素材料是冷杉。在另一方面，纤维素材料是云杉。在另一方面，纤维素材料是柳树。在。
27、另一方面，纤维素材料是桉树。0060在另一方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一方面，纤维素材料是棉绒。在另一方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一方面，纤维素材料是滤纸。0061在另一方面，纤维素材料是一种水生生物质。如在此所使用，术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。该水生生物质可以是藻类、沉水植物、挺水植物、以及浮叶植物。0062预处理0063预处理的纤维素材料可以是例如通过一种化学预处理、一种物理预处理、或一种化学预处理和一种物理预处理而被预处理的，如以下所述的。在一方面，该预处。
28、理的纤维素材料已通过一种化学预处理被预处理。在另一方面，该预处理的纤维素材料已通过物理预处理被预处理。在另一方面，该预处理的纤维素材料已通过一种化学预处理和一种物理预处理被预处理。0064可以使用本领域已知的任何适合的预处理工艺来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分参见，例如钱德拉CHANDRA等人，2007，底物预处理木质纤维素的有效酶水解的关键SUBSTRATEPRETREATMENTTHEKEYTOEFFECTIVEENZYMATICHYDROLYSISOFLIGNOCELLULOSICS，生物化学工程/生物技术的进展ADVBIOCHEMENGIN/BIOTECHNOL1086793；盖博GA。
29、LBE和小林ZACCHI，2007，用于高效生物乙醇生说明书CN104204215A6/32页9产的木质纤维素材料的预处理PRETREATMENTOFLIGNOCELLULOSICMATERIALSFOREFCIENTBIOETHANOLPRODUCTION，生物化学工程/生物技术的进展1084165；亨德里克斯HENDRIKS和季曼ZEEMAN，2009，用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处理PRETREATMENTSTOENHANCETHEDIGESTIBILITYOFLIGNOCELLULOSICBIOMASS，生物资源技术BIORESOURCETECHNOL1001018；莫热MOS。
30、IER等人，2005，用于木质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征FEATURESOFPROMISINGTECHNOLOGIESFORPRETREATMENTOFLIGNOCELLULOSICBIOMASS，生物资源技术96673686；塔希尔扎德TAHERZADEH和卡里米KARIMI，2008，预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物气体产生综述PRETREATMENTOFLIGNOCELLULOSICWASTESTOIMPROVEETHANOLANDBIOGASPRODUCTIONAREVIEW，分子科学国际杂志INTJOFMOLSCI916211651；杨YANG和怀曼，2008，预处。
31、理释放低成本纤维素乙醇的关键PRETREATMENTTHEKEYTOUNLOCKINGLOWCOSTCELLULOSICETHANOL，生物燃料、生物产品与生物精炼BIOFUELSBIOPRODUCTSANDBIORENINGBIOFPR22640。0065纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸泡、润湿。0066常规预处理包括但不限于蒸汽预处理伴随或不伴随爆炸、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理、以及生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、以及辐射预处理。在一个。
32、优选实施例中，该纤维素材料例如未洗涤的玉米秸秆是稀酸预处理的。0067在糖化水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。0068蒸汽预处理在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素、以及纤维素，以使酶可接触纤维素和其他级分，例如，半纤维素。使纤维素材料经过或通过反应容器，其中注入蒸汽以将温度增加至所需的温度和压力，并且在其中保持所希望的反应时间。蒸汽预处理可以在140230，例如160200、或170190下执行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理的停留时间可以是115分钟，例如312分钟、或410分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂。
33、的任意添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合，这被称为蒸汽爆炸，即，迅速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积达夫DUFF和默里MURRAY，1996，生物资源技术855133；盖博GALBE和小林ZACCHI，2002，应用微生物学与生物技术APPLMICROBIOLBIOTECHNOL59618628；美国专利申请号2002/0164730。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分水解成变得更增溶的半纤维素单糖和半纤维素寡糖。仅在有限的程度上去除木质。
34、素。所得的液体主要包括溶解的半纤维素材料例如半纤维素单糖和半纤维素寡糖，而余下的固体主要由纤维素材料组成。0069经常在蒸汽预处理之前添加催化剂，如H2SO4或SO2典型地03至3W/W，这降低时间和温度、增加回收率、并且改善酶水解巴列斯特罗斯BALLESTEROS等人，2006，应用生物化学与生物技术129132496508；瓦尔加VARGA等人，2004，应用生物化说明书CN104204215A7/32页10学与生物技术113116509523；萨斯那SASSNER等人，2006，酶与微生物技术ENZYMEMICROBTECHNOL39756762。0070化学预处理术语“化学处理”是指能。
35、促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。适合的化学预处理方法的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸AFEX、氨渗滤APR、以及有机溶剂预处理。0071在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸典型地H2SO4和水混合以形成浆料，通过蒸汽加热至所希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可以用许多反应器设计来进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器达夫和默里，1996，见上文，舍尔SCHELL等人，2004，生物资源技术91179188；李LEE等人，1999，生物化学工程与生物技术的进展6593115。0072还可以使用。
36、碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于石灰预处理、湿氧化、氨渗滤APR、以及氨纤维/冷冻爆炸AFEX。0073用碳酸钙、氢氧化钠、或氨，在85150的低温下进行石灰预处理，并且停留时间为从1小时到几天怀曼等人，2005，生物资源技术9619591966；莫热等人，2005，生物资源技术96673686。WO2006/110891、WO2006/110899、WO2006/110900、以及WO2006/110901披露了使用氨的预处理方法。0074湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂如过氧化氧或过压氧的情况下在180200下持续515分钟进行施密特SCHMIDT和汤姆森T。
37、HOMSEN，1998，生物资源技术64139151；帕罗内PALONEN等人，2004，应用生物化学与生物技术117117；瓦尔加等人，2004，生物技术与生物工程BIOTECHNOLBIOENG88567574；马丁MARTIN等人，2006，化学技术与生物技术杂志JCHEMTECHNOLBIOTECHNOL8116691677。预处理优选以1至40干物质，更优选2至30干物质，并且最优选5至20干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初始PH。0075被称为湿爆炸湿氧化和蒸汽爆炸的组合的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间之。
38、后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压来终止预处理WO2006/032282。0076氨纤维爆炸AFEX涉及在如90100的中等温度和如17至20BAR的高压下，用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60格拉帕里GOLLAPALLI等人，2002，应用生物化学与生物技术982335；俊达瓦特CHUNDAWAT等人，2007，生物技术与生物工程BIOTECHNOLBIOENG96219231；阿里扎德ALIZADEH等人，2005，应用生物化学与生物技术12111331141；泰莫里TEYMOURI等人，2005，生物资源技术9620142018。AFEX预处理导致纤维素的。
39、解聚和半纤维素的部分水解。木质素碳水化合物复合物被裂解。0077有机溶剂预处理通过使用含水乙醇4060乙醇在160200下萃取3060分钟而将纤维素材料脱木质素潘PAN等人，2005，生物技术与生物工程90473481；潘等人，2006，生物技术与生物工程94851861；库拉比KURABI等人，2005，应用生物化学与生物技术121219230。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素被去除。说明书CN104204215A108/32页110078适合的预处理方法的其他实例由谢尔等人，2003，应用生物化学与生物技术1051086985，和马塞尔等人，2005，生物资源技术。
40、96673686，以及美国专利申请2002/0164730进行描述。0079在一个方面中，化学预处理是以酸处理进行，例如持续稀酸和/或弱酸处理。该酸可以是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。弱酸处理优选在15，更优选14，并且最优选13的PH范围内进行。在一方面，该酸浓度在优选从001至20WT酸，更优选005至10WT酸，甚至更优选01至5WT酸，并且最优选02至20WT酸的范围中。使酸与纤维素材料相接触，并在优选160220，并且更优选165195范围内的温度下保持从几秒到几分钟，例如1秒至60分钟范围内的时期。0080在另一方面，预处。
41、理是作为氨纤维爆破步骤AFEX预处理步骤进行。0081在另一方面，预处理在含水浆料中进行。在一个方面，在预处理过程中纤维素材料以优选在1080WT之间，例如2070WT之间或3060WT之间，例如约50WT的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如，用水洗涤。0082机械预处理或物理预处理术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒大小减少的任何预处理。例如，这种预处理可以涉及各种类型的研磨或碾磨例如，干磨、湿磨、或振动球磨。0083纤维素材料可以物理地机械地且化学地预处理。机械或物理预处理可以与以下相结合蒸汽/蒸汽爆炸、水热解HYDROTHERMOLYSIS。
42、、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射例如微波福射、或其组合。在一方面，高压意指在优选约100至约400PSI，更优选约150至约250PSI范围中的压力。在另一方面，高温意指在约100至约300，优选约140至约200范围中的温度。在一个优选方面，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽枪水解器系统，例如从顺智公司SUNDSDEBRATORAB，瑞典SWEDEN可获得的SUNDS水解器SUNDSHYDROLYZER来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。这些物理预处理和化学预处理可以根据需要顺序地进行或同时进行。0084因此，在一个优选方面，使纤维素材料经受物理机械或化学预处理、或其任何组合，。
43、以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。0085生物预处理术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从木质纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物参见，例如，舒TAHSU,TA，1996，生物质的预处理PRETREATMENTOFBIOMASS，生物乙醇手册生产和利用，怀曼CE编辑，泰勒弗朗西斯出版集团，华盛顿特区，179212；高希GHOSH和辛格SINGH，1993，用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学与生物处理PHYSICOCHEMICALANDBIOLOGICALTREATMENTSFORENZYMATI。
44、C/MICROBIALCONVERSIONOFCELLULOSICBIOMASS，应用微生物学进展ADVAPPLMICROBIOL39295333；麦克米兰JDMCMILLAN,JD，1994，预处理木质纤维素生物质综述PRETREATINGLIGNOCELLULOSICBIOMASSAREVIEW，用于燃料生产的生物质的酶转化ENZYMATICCONVERSIONOFBIOMASSFORFUELSPRODUCTION，希默尔ME、贝克JO、以及奥弗伦RPOVEREND,RP编辑，美国化学学会讨论会系列566ACSSYMPOSIUMSERIES566，美国化学学会AMERICANCHEMICA。
45、LSOCIETY，华盛顿说明书CN104204215A119/32页12特区，第15章；贡CSGONG,CS、卡奥NJCAO,NJ、杜JDU,J、以及曹GTTSAO,GT，1999，由可再生资源生产乙醇ETHANOLPRODUCTIONFROMRENEWABLERESOURCES，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔T编辑，施普林格出版社德国海德堡柏林BERLINHEIDELBERG,GERMANY，65207241；奥尔森OLSSON和哈恩哈格达尔HAHNHAGERDAL，1996，用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵FERMENTATIONOFLIGNOCELLULOSICHYDROLYS。
46、ATESFORETHANOLPRODUCTION，酶与微生物技术ENZMICROBTECH18312331；以及瓦蓝德VALLANDER和埃里克松ERIKSSON，1990，由木质纤维素材料生产乙醇技术现状PRODUCTIONOFETHANOLFROMLIGNOCELLULOSICMATERIALSSTATEOFTHEART，生物化学工程/生物技术的进展426395。0086从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物的工艺0087在第二方面中，本发明涉及从未洗涤的预处理的纤维素材料生产一种发酵产物例如乙醇的工艺，包括0088I根据本发明的预调节方法进行预调节；0089II用一种纤维素分解酶制。
47、剂使该预调节的材料糖化；0090III使用一种发酵生物体进行发酵。0091在一个实施例中，该发酵产物是在步骤III之后回收。0092用于预调节的苯酚氧化酶例如虫漆酶和半纤维素酶在以上的“预调节未洗涤的预处理的纤维素材料的方法”和以下的“酶”部分中说明。0093在糖化步骤即水解步骤中，将该预处理的纤维素材料水解，以将纤维素和/或半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。该糖化是使用一种纤维素分解酶制剂酶促地执行的。0094糖化即水解可以在适合的含水环境中在可以由本领域技术人员容易确定的条件下进行。在一个方面中，糖化在适于纤维素分解酶制剂。
48、的活性，优选地对于纤维素分解酶制剂最佳的条件下进行。糖化可以以进料分批过程或连续过程进行，其中将该预调节的未洗涤的预处理的纤维素材料基质逐渐进料至水解溶液中。0095糖化通常在受控的PH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适合的处理时间、温度以及PH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，例如约12至约96小时，约16至约72小时或约24至约48小时。在一方面，糖化发生持续例如12小时，例如24小时、36小时、48小时、60小时、或72小时。0096糖化期间的温度可以在约25至约75，例如约30至约70、约35至约65、或约40至60、或约45至55。
49、、或约50的范围中。0097糖化期间的PH可以在约30至70，例如35至65、40至60、45至55或约50的范围中。0098在一些方面，糖化期间的干固体DS含量例如该纤维素材料中的总固体是少于约25WT、20WT、15WT、10WT、75WT、5WT、25WT、2WT、1WT、或05WT。0099根据本发明，步骤II中的糖化和步骤III中的发酵可以按分开水解和发酵SHF、同时糖化和发酵SSF、同时糖化和共发酵SSCF、杂合的水解和发酵HHF、分开水解和共发酵SHCF、杂合的水解和共发酵HHCF，以及直接微生物转化DMC进行。0100在一个实施例中，在步骤II中使用的纤维素分解酶制剂可以是真菌起源的。在说明书CN104204215A1210/32页13一个优选实施例中，该纤维素分解酶制剂源自于木霉属例如里氏木霉。在一个优选实施例中，糖化水解是在包括选自下组的酶活性的一种纤维素分解酶制剂的存在下进行的，该组包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶例如烟曲霉或米曲霉葡糖苷酶。在一个优选实施例中，糖化是使用一种具有纤维素分解增强活性的多肽例如一种橙色嗜热子囊菌或埃默森青霉菌纤维素分。