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甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白
技术领域
本发明涉及一种甜菜基因及其编码的蛋白。
背景技术
甜菜是我国北方主要的制糖原料，而甜菜M14品系是郭德栋教授将二倍体栽培甜菜(Beta vulgaris L.)与四倍体野生型白花甜菜(B.corollifiora Zoss.)进行种间杂交及回交获得的，在栽培甜菜第18条染色体上附加有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系。甜菜M14品系在转录组水平、基因组水平以及蛋白质水平进行了广泛的研究，并将数据进行比较。其中，主要研究的基因以及蛋白质有：半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BvM14-Cys tatin)基因、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(BvM14-CCoAOMT)基因、乙二醛酶Ⅰ(BvM14-Gly oxAla se Ⅰ)基因等。分析表明，这些基因均对甜菜M14品系在高盐、干旱以及氧化胁迫起到重要作用。可见参与甜菜M14品系抵抗非生物胁迫的过程是一个多基因参与的过程。
发明内容
本发明提供了一种甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白，可进一步深入研究甜菜M14品系耐盐、耐旱的机制，为之后的转基因实验和研究奠定基础。
硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin peroxidase,Tpx)，是过氧化物酶(Peroxiredoxin,Prx)家族的一员。植物中的硫氧还蛋白过氧化物酶能够按照氨基酸序列分为四个不同的亚家族，它们区别于保守半胱氨酸残基的数量及位置；分别是2-Cys Prx、PrxⅡ、PrxQ及1-Cys Prx。
本发明甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1中核苷酸序列所示。
本发明甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx)cDNA全长为1044bp。甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基包含的最大开放阅读框(ORF)由489bp组成如SEQ ID NO：3中核苷酸序列所示，编码162aa，该开放阅读框编码的氨基酸序列含有两个半胱氨酸残基，三个蛋白激酶C磷酸化位点，一个酰基化位点，四个酪蛋白激酶磷酸化位点。
荧光定量分析结果显示甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花中广泛表达，且根中表达量最高。
构建甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx)植物表达载体，对拟南芥突变株(tpx)进行恢复。对转基因拟南芥阳性恢复植株幼苗进行5mmol/L H₂O₂和100mmol/L NaCl胁迫处理，以野生型拟南芥(WT)及拟南芥突变株(tpx)幼苗为对照，观察及测定拟南芥的生长及根长，实验结果显示转基因拟南芥阳性恢复植株幼苗生长状况、根长情况与野生型拟南芥几乎一致，并好于拟南芥突变株(tpx)，证明甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因在拟南芥(tpx)突变恢复植株中的能够恢复拟南芥对氧化及高盐化胁迫的抵御能力，能够与拟南芥中的Tpx基因行使相同的功能。以野生型拟南芥(WT)为对照，对转基因拟南芥阳性恢复植株进行荧光定量PCR测定BvM14-Tpx在转基因拟南芥恢复植株中的表达量，结果显示转基因拟南芥恢复植株中BvM14-Tpx的表达量高于野生型拟南芥(WT)中拟南芥Tpx基因的表达量，说明BvM14-Tpx在转基因拟南芥恢复植株中成功表达，且表达量高于野生型植株(WT)，能够提高拟南芥对氧化以及盐化胁迫的耐受性；氧自由基含量测定结果显示，转基因拟南芥恢复植株中氧自由基与野生型拟南芥(WT)基本一致，低于拟南芥突变株(tpx)；同时K⁺离子含量的测定结果显示5mmol/L H₂O₂及100mmol/L NaCl胁迫处理前后K⁺离子含量没有明显变化，说明H₂O₂及NaCl并不影响K⁺的积累和运输；而Na⁺离子含量的测定结果显示转基因拟南芥恢复植株中Na⁺离子含量与野生型拟南芥(WT)基本一致，均低于拟南芥突变株(tpx)中的Na⁺离子含量，说明BvM14-Tpx在转基因拟南芥恢复株中能够与拟南芥Tpx基因行使相同的功能，能够降低氧自由基以Na⁺离子在叶片中的积累。
本发明甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因能够应答氧化、高盐化胁迫，能够通过应答氧化胁迫进而抵御盐化胁迫，可提高植物抗非生物胁迫能力，增强转基因植物的抗氧化及抗高盐化胁迫的能力。
甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因所编码蛋白的氨基酸序列的亲水性/疏水性预测结果如图1所示。
附图说明
图1是甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因所编码蛋白的氨基酸序列的亲水性/疏水性预测结果图。
图2是甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因在花、叶、茎和根组织中表达量测试结果图。
图3是实施例1中5mmol/L H₂O₂胁迫下植株的根长对比测试结果图。
图4是实施例1中100mmol/L NaCl胁迫下植株的根长对比测试结果图。
图5是实施例1中氧化胁迫下氧自由基含量实验结果图。
图6是实施例1中盐化胁迫下氧自由基含量实验结果图。
图7为5mmol/LH₂O₂胁迫下植物体内钾、钠离子含量的测定结果图。
图8为100mmol/L NaCl胁迫下植物体内钾、钠离子含量的测定结果图。
图9是氧化胁迫下BvM14-Tpx基因表达量测试结果图。
图10是盐化胁迫下BvM14-Tpx基因表达量测试结果图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1中核苷酸序列所示。
具体实施方式二：本实施方式甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例1
①cDNA第一链的合成：
利用TaKaRa RNA PCR Kit，以甜菜M14品系花、叶、茎、根总RNA为模板，按表1组成配制反转录反应体系：
表1

MgCl₂2.0μL10×RT buffer1.0μLddH₂O3.75μLdNTP mixture(10mmol/L)1.0μLRNase Inhibitor0.25μLAMV Reverse Transcriptase0.5μLOligo dT-Adaptor Primer0.5μL花、叶、茎、根总RNA(≤500ng)1.0μLTotal Volume10.0μL
按下列条件进行反转录反应：30℃，10min；42℃，30min；99℃，5min；5℃。
②甜菜M14品系BvM14-Tpx cDNA全长的获得：
以设计的引物S1和引物AS1为引物(引物S1： 5'-AATCAGGTGGTGAATTTTCTGTCTC-3'；引物AS1：5'-ATTTCGCCTACAATGATTTGCTTTT-3')，以cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系如表2所示：
表2
ddH₂O17.25μLEx Taq buffer2.5μLdNTP mixture(2.5mmol/L each)2.0μLcDNA first strand1.0μL引物S11.0μL引物AS11.0μLEx Taq(5U/μL)0.25μLTotal Volume25.0μL
PCR反应条件：94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃90s，30cycles；72℃7min。
PCR反应完毕后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并将获得的目的条带进行测序。甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1中核苷酸序列所示。
实施例2
甜菜M14品系BvM14-Tpx组织表达分析：
采用TRIzol试剂一步法提取正常生长条件下甜菜M14品系根、茎、叶、花组织的总RNA，对总RNA的质量和浓度进行检测。以甜菜18S rRNA为内参基因，采用半定量RT-PCR分析BvM14-Tpx在甜菜M14品系各组织中的表达情况。调整模板量和循环数，使样品中内参基因(18S rRNA)的PCR产物条带亮度一致。内参基因18S rRNA引物为18S-F和18S-R(引物18S-F：5'-CCCCAATGGATCCTCGTTA-3'；引物18S-R：5'-TGACGGAGAATTAGGGTTCG-3')，BvM14-Tpx的PCR反应引物为S2和AS2(引物S2：5'-AATCGCATCGTCTACACCCACTTTT-3'；引物AS2：5'-TTTCGCCTACAATGATTTGCTTTTA-3')。PCR反应体系如表3所示：
表3
ddH₂O17.25μLEx Taq buffer2.5μLdNTP mixture(2.5mmol/L each)2.0μLcDNA first strand1.0μL引物18S-F/S21.0μL引物18S-R/AS21.0μLEx Taq(5U/μL)0.25μLTotal Volume25.0μL
18S rRNA内参基因PCR反应条件：94℃4min；94℃30s，61℃30s，72℃90s，23cycles；72℃7min。BvM14-Tpx的PCR反应条件：94℃4min；94℃30s，61℃30s，72 ℃90s，25cycles；72℃7min。PCR反应完毕后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
根据甜菜M14品系花、叶、茎、根各器官实时荧光定量PCR溶解曲线测定(横坐标表示温度，纵坐标表示荧光强度随温度标化后的负一次幂倒数)，甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因在甜菜M14品系根、茎、叶、花中广泛表达，表达量如图2所示，且根中表达量最高。
实施例3
转基因拟南芥突变株恢复体在氧化、盐化胁迫中的功能鉴定
①植物表达载体pBI121-BvM14-Tpx的构建
A、BvM14-Tpx片段的获得
利用基因特异引物S1和AS1，以甜菜M14品系各器官cDNA第一链为模板进行PCR反应获得目的片段。PCR反应完毕后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并将获得的目的条带进行切胶回收；
B、pBI121质粒载体的提取；
C、BvM14-Tpx和pBI121载体的双酶切；
D、BvM14-Tpx和pBI121载体的连接；
E、构建的重组载体进行转化及阳性克隆子筛选；
F、pBI121-BvM14-Tpx表达载体的PCR及双酶切验证；
根据对pBI121-BvM14-Tpx表达载体进行PCR和双酶切，然后凝胶电泳，PCR结果显示有只有一条条带，且清晰、明亮，并与BvM14-Tpx和pBI121质粒之和相近；双酶切结果显示有两条清晰的条带，分别于BvM14-Tpx及pBI121质粒相近。
②植物表达载体pBI121-BvM14-Tpx转化根癌农杆菌
A、根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备
a、从28℃培养36h的平板中挑取一个农杆菌单菌落，接种于50mL的LB(含Rif50μg/mL)液体培养基中，再置于28℃、180r/min的环境中振荡24h；
b、将上一步骤培养的菌液分装于1.5mL离心管中，6000r/min离心10min；
c、去上清，每管加入1mL 10％的灭菌甘油轻轻悬浮菌体，6000r/min离心10min，收集沉淀，重复一次；
d、去上清，每管加入60μL 20％的灭菌甘油轻轻悬浮沉淀，-70℃保存。
B、连接产物的转化方法
碱裂解法提取重组质粒pBI121-BvM14-Tpx，经冻融法转化农杆菌，方法如下：
a、将农杆菌感受态细胞在冰上融化10～15min，加入2μg重组质粒，轻轻混匀，冰上放置30min；
b、将离心管放入液氮中冷激1min，迅速取出至37℃热激5min；
c、将离心管取出冰上放置5min，加入800μL LB培养基，轻轻混匀后，28℃，200r/min培养3h；
d、将上述培养液5000r/min 4min离心收集，去800μL上清液，剩余液体重新悬浮沉淀，在LB琼脂板(Rif 50mg/L，Kan 50mg/L)上涂布；
e、将平板放置于28℃培养2d，待其长出单菌落。
C、农杆菌阳性克隆子的筛选与鉴定
用无菌枪头随机挑起白色菌落，PCR验证为阳性的农杆菌阳性克隆子进行保菌于-70℃保存，备用于下一步转化拟南芥试验。
③根癌农杆菌转化模式植物拟南芥和拟南芥突变株恢复株系的获得
A、拟南芥的种植
将春化后的拟南芥种子用枪头点在装有土壤(黑土:蛭石＝1:1)的盆中，套上塑料薄膜；待种子萌发后，将薄膜取下，平均每3d浇一次水，每次浇水要充分。
待植株生长大约30d左右，株高大约5cm时，将其顶升花序剪出，刺激植株产生更多花序；待拟南芥植株少数花已经开放，并有大量花苞时，准备进行转化，转化前一天需充足浇水。
B、拟南芥总DNA的提取
以CTAB大规模小量法提取拟南芥基因组总DNA。
C、PCR鉴定拟南芥突变体
利用TAIR提供的突变体检测引物LP+RP，以提取的拟南芥突变体总DNA为模板进行PCR扩增检测突变体的纯合性；利用TAIR提供的突变体检测引物LB+RP，以提取的拟南芥突变体总DNA为模板进行PCR扩增检测突变体。
D、花序侵染法转化拟南芥突变株
a、采用三区画线法挑取农杆菌单菌落，接种50mL无菌的LB液体培养基中(含Rif50μg/mL、Km 50μg/mL)，28℃，250r/min振荡培养24h；
b、取菌液以1％的接种量接入250mL的无菌LB液体培养基中(含Rif 50μg/mL、Km 50μg/mL)28℃，250r/min振荡培养18h；
c、将菌液4℃，3000r/min离心15min；弃上清，加入200mL 1/2MS的液体培养基重悬菌体，同时加入5％的蔗糖和0.05％的表面活性剂吐温80；
d、将上述菌液倒入广口容器中，用玻璃棒搅匀；将待转化的拟南芥植株倒置，使其地上部分完全浸没在菌液中5min；将浸润过后的植株用保鲜膜包好，放在暗处过夜培养；第2d去掉保鲜膜，将植株放在正常条件下培养，注意避免阳光直射；
e、待转化后的植株结荚后，收取种子，以备筛选阳性转基因恢复植株。
E、阳性转基因恢复植株的筛选
a、将转基因恢复植株的转基因种子4℃低温处理2～3d，然后均匀点播于分别含有60μg/mL Km的1/2MS培养基上，放入于长日照培养室培养7～10天；
b、将长势良好的具有Km抗性的拟南芥植株移植到不含Km的1/2MS培养基上生长7d；
c、将正常生长的阳性植株移植于土中生长，用于下一步分子生物学检测。
④转基因突变株恢复株系植株的分子生物学鉴定
A、突变株恢复株系植株的PCR验证
以CTAB大规模小量法提取的阳性转基因恢复植株的基因组DNA为模板，用基因特异引物Zs和Zas(引物Zs：5'-CGCATCGTCTACACCCAC-3'；引物Zas：5'-TGAGCCATTTCGCCTACA-3')进行PCR扩增。PCR反应完毕后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；
B、突变株恢复株系植株的RT-PCR验证
a、采用TRIzol一步法提取转基因拟南芥总RNA；
b、反转录合成cDNA；
c、以上一步骤合成的反转录cDNA第一链为模板，以Zs和Zas为引物进行RT-PCR扩增。PCR反应完毕后，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
⑤转基因突变株恢复株系植株的抗氧化及抗盐性鉴定
将阳性转基因恢复植株进行盐化胁迫鉴定，具体步骤如下：
A、在超净工作台中将阳性转基因恢复株系和作为对照的野生型拟南芥(WT)及拟南芥突变株(tpx)的种子，用3％次氯酸钠消毒5min，并均匀的种植在1/2MS固体培养基的平板上，将平板放入4℃冰箱中春化7d；
B、将有种子的平板放在正常培养条件下，培养5d后，根据H₂O₂、NaCl的浓度梯度胁迫试验，确定进行氧化及盐化胁迫的H₂O₂及NaCl的终浓度为5mmol/L H₂O₂和100mmol/L NaCl；
C、分别将阳性转基因恢复植株和野生型拟南芥(WT)及拟南芥突变株(tpx)的幼苗移置含有5mmol/L H₂O₂、100mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基平板，放于长日照培养箱中竖直培养10d后，测定植株的根长；
5mmol/L H₂O₂胁迫下植株的根长测试结果如图3所示，其中1、2和3号植株为野生型拟南芥(WT)，4、5和6号植株为拟南芥突变株(tpx)，7、8和9号植株为转基因恢复植株。
100mmol/L NaCl胁迫下植株的根长测试结果如图4所示，其中1、2和3号植株为野生型拟南芥(WT)，4、5和6号植株为拟南芥突变株(tpx)，7、8和9号植株为转基因恢复植株。
实验结果显示转基因拟南芥阳性恢复植株幼苗生长状况、根长情况与野生型拟南芥几乎一致，并好于拟南芥突变株(tpx)。
D、将阳性转基因恢复植株和野生型拟南芥(WT)及拟南芥突变株(tpx)的种子4℃低温处理2～3d，然后均匀点播于1/2MS培养基上，放入于长日照培养室培养7～10天后，将长势良好的拟南芥植株移植于土中长日照(16h光/8h暗)下正常生长；待幼苗恢复生长后用5mmol/L H₂O₂、100mmol/L NaCl溶液浇灌转基因拟南芥，每隔一天处理1次，共三次；处理72h后，提取上述植株的RNA并反转录，以反转录获得的第一链cDNA为模板进行Real-time PCR对Trx、BvM14-Tpx的表达量进行测定；
图9是氧化胁迫下BvM14-Tpx基因表达量测试结果图，WT为野生型植株，RT为转基因恢复植株。
图10是盐化胁迫下BvM14-Tpx基因表达量测试结果图，WT为野生型植株，RT为转基因恢复植株。
E、将阳性转基因恢复植株和野生型拟南芥(WT)及拟南芥突变株(tpx)的种子4℃低温处理2～3d，然后均匀点播于1/2MS培养基上，放入于长日照培养室培养7～10天后，将长势良好的拟南芥植株移植于土中长日照(16h光/8h暗)下正常生长；待幼苗恢复生长后用5mmol/L H₂O₂、100mmol/L NaCl溶液浇灌转基因拟南芥，每隔一天处理1次，共三次；处理72h后，测定植株中氧自由基的含量；
根据公式

可以计算出NO₂^－的含量，然后再根据NH₂OH+2O₂^－+H⁺→NO₂^－+H₂O₂+H₂O，可计算出O₂^－含量(O₂^－＝NO₂^－(nmol·g^－1Fw)×2)
氧化胁迫下氧自由基含量实验结果如图5所示，图5中WT为野生型植株，RT为转基因恢复植株，TPX为拟南芥突变株。
盐化胁迫下氧自由基含量实验结果如图6所示，图6中WT为野生型植株，RT为转基因恢复植株，TPX为拟南芥突变株。
氧自由基含量测定结果显示转基因拟南芥恢复植株中氧自由基与野生型拟南芥(WT)基本一致，低于拟南芥突变株(tpx)。
F、将阳性转基因恢复植株和野生型拟南芥(WT)及拟南芥突变株(tpx)的种子4℃低温处理2～3d，然后均匀点播于1/2MS培养基上，放入于长日照培养室培养7～10天后，将长势良好的拟南芥植株移植于土中长日照(16h光/8h暗)下正常生长；待幼苗恢复生长后用5mmol/L H₂O₂、100mmol/L NaCl溶液浇灌转基因拟南芥，每隔一天处理1次，共三次；处理72h后，应用原子分光光度法测定植株叶片中K⁺、Na⁺含量，具体步骤如下：
a、取新鲜叶片称取0.5g，70℃烘干，将烘干后的叶片研磨粉碎，过60目筛；
b、精确称取粉碎后的样品，放入50ml烧杯中，加入混合酸10ml(浓HNO₃：HCLO₄＝4：1)；
c、放置在通风橱内过夜，次日在电热板上180℃加热消化，消煮时控制温度，使消煮液保持微沸，此时发生大量棕色NO₂气体；
d、当棕色气体不再发生时，液体呈淡黄色，滴加少量H₂O₂，同时防止烧干，当液体透明没有糊状时，取下冷却；
e、加入10g/L的CsCl₂溶液3ml，用水定容至20ml；
f、每个样品称3个平行样进行消化处理，同时做两个空白对照；测得结果根据校准溶液绘制的标准曲线计算样品中K⁺、Na⁺离子含量。
图7为5mmol/LH₂O₂胁迫下植物体内钾、钠离子含量的测定结果图，WT为野生型植株，tpx为突变株，RT为转基因恢复植株。图8为100mmol/L NaCl胁迫下植物体内钾、钠离子含量的测定结果图，WT为野生型植株，tpx为突变株，RT为转基因恢复植株。
K⁺离子含量的测定结果显示5mmol/L H₂O₂及100mmol/L NaCl胁迫处理前后K⁺离子含量没有明显变化，说明H₂O₂及NaCl并不影响K⁺的积累和运输；而Na⁺离子含量的测 定结果显示转基因拟南芥恢复植株中Na⁺离子含量与野生型拟南芥(WT)基本一致，均低于拟南芥突变株(tpx)中的Na⁺离子含量，说明BvM14-Tpx在转基因拟南芥恢复株中能够与拟南芥Tpx基因行使相同的功能，能够降低氧自由基以Na⁺离子在叶片中的积累。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。