一种用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束及其制备方法技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种用于脊髓损伤修复的仿生纤维
蛋白水凝胶束及其制备方法。
背景技术
脊髓损伤是临床上常见的严重疾病之一，在全球已呈现高发生率、高致残率、高耗
费和低龄化的“三高一低”的局面，成为医学界待解决的重大医学问题。脊髓损伤将导致患
者中枢神经系统感觉运动功能的不可逆性损伤，严重影响患者的生存质量，且目前世界范
围内尚无对其有效的治疗手段和方法。
神经损伤后的修复是一系列复杂的病理过程，神经再生过程缓慢，疤痕组织的形
成、抑制微环境的产生，运动终端组织、功能退化等因素均制约损伤神经的修复。针对脊髓
损伤修复的多重困难，组织工程技术得到重视。其中，组织工程化支架复合功能细胞和活性
因子的联合策略是目前改善中枢神经再生修复的基本。而这其中构建组织工程支架系统是
有效促神经再生治疗方法中的关键一环。目前相关的神经桥接材料多为神经导管，起到在
神经的近远两端形成神经再生室的作用，提供神经纤维生长空隙。然而，这种神经导管因为
结构和材料的限制导致修复效果不佳。
因此，有必要提供一种改进型的神经桥接材料，能够在提供神经再生长入空间的
同时，有效引导神经轴突的定向再生，尤其是在脊髓损伤修复过程中起到神经桥连作用达
到一定修复效果，同时，又能保障材料的细胞亲和性、力学性能及降解速度满足脊髓损伤组
织的修复需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有神经桥连材料的修复效果不佳的缺陷，提
供一种用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束及其制备方法，通过静电纺丝生成多级
取向的仿生纤维蛋白水凝胶束来促进神经纤维定向生长。
本发明第一方面，提供了一种用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束，该纤
维蛋白水凝胶束由纤维蛋白通过静电纺丝技术制备而成。
在根据本发明所述的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束中，所述仿生纤
维蛋白水凝胶束具有多级取向性结构，由纳米纤维丝束构成，所述纳米纤维丝束构成微米
纤维丝束，再由微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。所述纳米纤维丝束的直径为100nm～
500nm，所述微米纤维丝束的直径为10μm～100μm。所述仿生纤维蛋白水凝胶束的直径为
0.5-5.0mm。
在根据本发明所述的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束中，所述仿生纤
维蛋白水凝胶束中复合有一种或多种多糖，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠
构成的组，且加入的多糖与所述纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1。
本发明第二方面，提供了一种如前所述的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝
胶束的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、将纤维蛋白原溶解于纯水或者生理盐水中，与聚氧化乙烯水溶液或者聚
氧化乙烯生理盐水溶液混合均匀，得到电纺原液，所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数
为4％～8％，聚氧化乙烯的质量分数为0.1％～0.8％，将所述电纺原液注入注射器中待用；
步骤S2、将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合得到交联溶液并在37℃保温，所述交联
溶液中CaCl2的质量分数为0.6％-3％，凝血酶的含量为20-50Units/ml，将所述交联溶液取
于金属旋转接收盘中待用；
步骤S3、注入注射器的电纺原液在推进泵的作用下进行静电纺丝，调整纤维蛋白
原的推注速度为3-3.5ml/h，加载电压3-5kV，使用金属旋转接收盘接收静电纺丝得到的纤
维蛋白原纺丝，调整旋转接收速度为200-300r/h，所述纤维蛋白原纺丝在交联溶液的作用
下得到仿生纤维蛋白水凝胶束；
步骤S4、收集得到所需直径的仿生纤维蛋白水凝胶束。
在根据本发明所述的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束的制备方法中，
所述步骤S1中所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为5％～6％；聚氧化乙烯的质量分数
为0.4％～0.6％。
在根据本发明所述的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束的制备方法中，
所述步骤S2中所述CaCl2的质量分数为1％-2％，凝血酶的含量为30-40Units/ml。
在根据本发明所述的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束的制备方法中，
所述步骤S1的电纺原液中还加入一种或多种多糖，所述多糖与所述纤维蛋白原的质量比为
1:2～2:1，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，所述壳聚糖、透明质酸
和海藻酸钠接枝甲基丙烯酰胺基团；所述步骤S2的交联溶液中加入质量分数为0.05～1％
的光引发剂，并在步骤S3中旋转接收时，采用紫外光照10-30分钟。
本发明第三方面，提供了如前所述的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束
在脊髓损伤修复中的应用。
本发明的上述技术方案具有如下有益效果：本发明通过单通道静电纺丝技术制备
的仿生纤维蛋白水凝胶束是一种高含水量的水凝胶材料，由具有高度模拟脊髓组织的多级
取向性纳米纤维构成，该多级取向的纤维蛋白水凝胶束表现出与天然脊髓组织相类似的成
分构成及细胞外基质环境，具有与天然神经相似的力学性能，能够有效促进神经纤维定向
生长，并且降解速度与脊髓损伤组织的修复速度相匹配。
附图说明
图1为根据本发明优选实施例的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束的制
备方法流程图；
图2为根据本发明实施例1制得的仿生纤维蛋白水凝胶束的实物照片图；
图3a-3d分别为根据本发明实施例1制得的仿生纤维蛋白水凝胶束中纤维蛋白水
凝胶束的外形图及电镜图；
图4为实施例1制得的仿生纤维蛋白水凝胶束接种雪旺细胞后4小时的细胞染色结
果图；
图5为实施例22制得的仿生纤维蛋白多糖复合水凝胶束电镜图；
图6a和6b分别为本发明实施例1制得的仿生纤维蛋白水凝胶束移植于动物脊髓缺
损部位前后的手术照片；
图7a和7b分别为本发明实施例制得的仿生纤维蛋白水凝胶束移植于动物脊髓损
伤部位后12周的苏木精-伊红(HE)染色结果图；
图8为本发明实施例制得的仿生纤维蛋白水凝胶束移植于动物脊髓损伤部位后12
周的核磁影像弥散张量成像(DTI)追踪结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例
对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不
是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的
前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束，该仿生纤维蛋白
水凝胶束由纤维蛋白通过静电纺丝技术制备而成。
在本发明一些优选的实施方式中，本发明设计的仿生纤维蛋白水凝胶束的设计思
路基于天然脊髓神经组织的特殊结构及性能。该仿生纤维蛋白水凝胶束具有多级取向性结
构，纤维尺寸从纳米级到微米级。该仿生纤维蛋白水凝胶束的结构由纳米纤维丝束构成，该
纳米微米纤维丝束先构成微米纤维丝束，再由微米纤维丝束构成宏观水凝胶束。优选地，纳
米纤维丝束的直径为100nm～500nm，微米纤维丝束的直径为10μm～100μm。最后制得的仿生
纤维蛋白水凝胶束的直径优选为0.5-5.0mm，更优选为1.0～5.0mm。
本发明的仿生纤维蛋白水凝胶束是一种高含水量的水凝胶材料，其组成、结构、力
学性能高度仿生天然脊髓组织细胞外基质，具有优异的促进神经纤维定向生长，诱导神经
再生的作用。
在本发明一些更优选的实施方式中，该仿生纤维蛋白水凝胶束的具体直径和长度
可以根据手术需要的缺损神经的直径和长度来确定。优选地，仿生纤维蛋白水凝胶束的长
度为0.1-1cm。
在本发明的另一些优选实施方式中，可选地，在纤维蛋白水凝胶束中复合一种或
多种多糖，所述多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，且加入的多糖与所述纤
维蛋白原的质量比为1:2～2:1。加入上述多糖可以增加材料的溶胀性能及降解性能，以便
于负载药物和调节材料不同的降解速度。
请参阅图1，为根据本发明优选实施例的用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝
胶束的制备方法流程图。如图1所示，该实施例提供了上述用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋
白水凝胶束的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、将纤维蛋白原溶解于纯水或者生理盐水中，与聚氧化乙烯(PEO)水溶液或
者聚氧化乙烯(PEO)生理盐水溶液混合均匀，得到电纺原液。该电纺原液中纤维蛋白原的质
量分数为4％～8％(例如4％、5％、6％、7％或8％)，聚氧化乙烯(PEO)的质量分数为0.1％～
0.8％(例如0.1％、0.2％、0.5％或0.8％)。随后将该电纺原液注入注射器中待用。优选地，
该步骤中所述电纺原液中纤维蛋白原的质量分数为5％～6％(例如5％、5.3％、5.5％、
5.8％、6％)，聚氧化乙烯(PEO)的质量分数为0.4％～0.6％(例如0.4％、0.5％或0.6％)。
步骤S2、将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合得到交联溶液并在37℃保温待用。该交
联溶液中CaCl2的质量分数为0.6％-3％(例如0.6％、0.8％、1％、2％或3％)，凝血酶的含量
为20-50Units/ml(例如20、30、40或50Units/ml)。随后将该交联溶液取于金属旋转接收盘
中待用。优选地，该步骤中CaCl2的质量分数为1％-2％(例如1％、1.2％、1.5％、1.8％或
2％)，凝血酶的含量为30-40Units/ml(例如30、35、38或40Units/ml)。
步骤S3、注入注射器的电纺原液在推进泵的作用下进行静电纺丝，调整纤维蛋白
原的推注速度为3-3.5ml/h(例如3、3.2或3.5ml/h)，加载电压3-5kV(例如3、3.5、4、4.5或
5kV)，使其得到连续的稳定的纤维蛋白原纺丝。使用金属旋转接收盘接收静电纺丝得到的
纤维蛋白原纺丝，调整旋转接收速度为200-300r/h(例如200、250、280或300r/h)，该纤维蛋
白原纺丝在交联溶液的作用下得到多级取向的仿生纤维蛋白水凝胶束。优选地，金属旋转
接收盘的直径为20-50cm，接收距离为5-10cm。
步骤S4、收集得到所需直径的纤维蛋白水凝胶束。由于静电纺丝过程中产生的纳
米级别的纤维蛋白原纺丝(例如直径为100nm～500nm)在落入金属旋转接受盘之后，在发生
交联反应的同时，纳米微米纤维丝束会自动组装构成微米纤维丝束，再由微米纤维丝束自
动组装构成宏观水凝胶束。因此，该步骤中可以通过手动缠绕使宏观的纤维蛋白水凝胶束
自然贴合在一起，达到所需直径，并修剪至预定长度，得到最终的仿生纤维蛋白水凝胶束。
在本发明一些更优选的实施方式中，可选地，在步骤S1的电纺原液中还可加入一
种或多种多糖，加入的多糖与纤维蛋白原的质量比为1:2～2:1(例如1:2、2:3、1:1、3:2或2:
1)。该多糖选自由壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠构成的组，所述壳聚糖、透明质酸和海藻酸
钠通过接枝甲基丙烯酰胺基团使其具有365nm紫外光照原位交联作用。所述壳聚糖优选为
羧甲基壳聚糖。相应地，在步骤S2的交联溶液中加入质量分数为0.05～1％(例如0.05％、
0.1％、0.2％、0.5％、0.8％或1％)的光引发剂，并在步骤S3中旋转接收时，采用紫外光照
10-30分钟(例如10、20、25或30)。通过该方式，可以构成具有蛋白多糖复合结构的纳米纤维
复合水凝胶，一方面加入的多糖可提高溶胀性能为负载药物增添可能及调节其降解速率，
另一方面多糖可以保护未受损神经细胞，降低继发性损伤。
本发明还提供了上述用于脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束在脊髓损伤修
复中的应用。本发明提供的仿生纤维蛋白水凝胶束具有显著促进脊髓损伤修复的能力，可
用于不同程度及损伤形式的脊髓损伤修复，尤其是产生缺损的脊髓损伤，可以得到比神经
导管更好地修复效果。
本发明的脊髓损伤修复的仿生纤维蛋白水凝胶束至少在如下方面进行了改进并
取得了相应的技术效果：
(1)本发明的仿生纤维蛋白水凝胶束为单通道静电纺丝技术，由单一纤维蛋白原
料或纤维蛋白与多糖的复合材料电纺制备得到的多级取向结构的纤维蛋白水凝胶束。该多
级取向结构模仿了天然神经组织的神经纤维、神经内膜内神经、神经束膜内神经组织等多
级神经纤维结构，表现出与天然脊髓组织相类似的成分构成，及细胞外基质环境，具有与天
然神经相似的力学性能。该类似神经组织基质的多级取向结构能够有效引导神经定向再
生，随着神经组织的长入有序降解，具有促进脊髓神经损伤再生修复的作用，是一种有前景
的仿生脊髓神经移植物，尤其适用于有缺损的修复。
(2)本发明材料的主要成分为纤维蛋白，与电纺生成的合成高分子类纤维相比，仿
生纤维蛋白水凝胶束具有较高含水量，是类似于细胞外基质的材料，且纤维蛋白作为水凝
胶的主要成分，具有高分子类材料所不能比拟的细胞亲和性。并且该纤维蛋白水凝胶束通
过单纯纤维蛋白电纺制备得到，得到的纤维蛋白纺丝结构是连续的，具有多级取向性结构，
纤维尺寸从纳米级到微米级。
(3)本发明选用的纤维蛋白和多糖均为天然高分子物质，纤维蛋白和多糖会随着
神经组织的长入时序性降解，其降解速度均与脊髓组织的修复速度相匹配。
(5)本发明的制备方法中使用电纺原液中采用的纤维蛋白原的质量分数为4％～
8％，并且其中聚氧化乙烯(PEO)的质量分数为0.1％～0.8％，上述两种物质的浓度是经过
大量实验及经验总结得到的，只有在上述浓度范围内才能够成功地纺出直径为100nm～
500nm的纳米纤维丝束，由此构成直径为10μm～100μm的微米纤维丝束，从而得到多级取向
结构的仿生纤维蛋白水凝胶束。如果纤维蛋白原的浓度过高，将导致纤维蛋白原不溶解，并
且在混合后会产生沉淀，如果纤维蛋白原的浓度过低，将导致静电纺丝时间速率慢，得到所
需直径的纤维蛋白水凝胶束的时间过长，结构不连续。如果PEO浓度太高，将导致溶液过于
粘稠，无法纺出纤维蛋白原丝，如果PEO浓度过低，将导致溶液粘度不够，纺出的纤维蛋白原
丝无法成形。
(6)本发明的制备方法中将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合配置交联溶液，其中
CaCl2的质量分数为0.6％-3％，凝血酶的含量为20-50Units/ml，并且将交联溶液置于金属
旋转接收盘中，可以在接收纤维蛋白原纺丝的同时进行交联，提高纤维蛋白的交联度。纤维
蛋白原是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体。纤维蛋白原由α、
β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。在凝血酶作用下，α链与β链分别释放
出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体。在此过程中，由于释放了酸性多肽，负电性降低，单体易于
聚合成纤维蛋白多聚体。但此时单体之间借氢键与疏水键相连，尚可溶于稀酸和尿素溶液
中，进一步在Ca2+作用下，单体之间以共价键相连，则变成稳定的仿生纤维蛋白水凝胶束。
(7)本发明的制备方法中使用的加载电压为3-5kV，推注速度为3-3.5ml/h，旋转接
收速度为200-300r/h，上述参数相互作用，能够达到最好的纺丝效果。例如加载电压如果太
高，不能形成稳定的泰勒锥，太低则不形成泰勒锥。并且旋转接收速度与推注速度相匹配，
能够保障纺出的纤维蛋白原纺丝不发生团聚或者断裂。
(8)本发明可选地在纤维蛋白水凝胶中复合壳聚糖、透明质酸或海藻酸钠中的一
种或者多种，构成具有蛋白多糖复合结构的纳米纤维复合水凝胶，一方面加入的多糖可提
高溶胀性能为负载药物增添可能，提高材料的降解性能，另一方面多糖可以保护未受损神
经细胞，降低继发性损伤。
需要特别指出的是，本说明书的数值范围表示该数值范围的上限值、下限值以及
处在该数值范围之内的任何数值或者子范围。因此，如果没有特别说明，在本说明书中涉及
数值范围时就不再详细列举包含在该数值范围内的具体数值。
实施例1
1、将纤维蛋白原溶解于纯水中，与PEO水溶液混合均匀，得到电纺原液。该电纺原
液中纤维蛋白原的质量分数为5.5％，PEO的质量分数为0.5％。随后将该电纺原液注入注射
器中待用。
2、将CaCl2水溶液与凝血酶溶液混合得到交联溶液并在37℃保温待用。该交联溶
液中CaCl2的质量分数为1.5％，凝血酶的含量为30Units/ml。随后将该交联溶液取于金属
旋转接收盘中待用。
3、注入注射器的电纺原液在推进泵的作用下进行静电纺丝，调整纤维蛋白原的推
注速度为3.2ml/h，加载电压4kV，使其得到连续的稳定的纤维蛋白原纺丝。使用金属旋转接
收盘接收静电纺丝得到的纤维蛋白原纺丝，调整旋转接收速度为250r/h，该纤维蛋白原纺
丝在交联溶液的作用下得到多级取向的纤维蛋白水凝胶束。
4、手动缠绕收集得到直径为2mm的纤维蛋白水凝胶束。
实施例2至21
除了下表1的内容之外，实施例2至21以与实施例1基本相同的方式进行。
实施例22
以与实施例1基本相同的方式实施，区别仅在于，在步骤1的电纺原液中加入接枝
了甲基丙烯酰胺基团的壳聚糖，使得电纺原液中包含有质量分数为5.5％的纤维蛋白原，质
量分数为5.5％的壳聚糖，以及质量分数为0.5％的PEO，其余为水。在步骤2的交联溶液中还
需要加入质量分数为0.05％的光引发剂I2959溶液，即2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯
丙酮，并在步骤4中旋转接收时，采用紫外光照30分钟。
实施例23
以与实施例22基本相同的方式实施，区别仅在于，在步骤1的电纺原液中加入接枝
了甲基丙烯酰胺基团的透明质酸，使得电纺原液中包含有质量分数为5.5％的纤维蛋白原，
质量分数为11％的透明质酸，以及质量分数为0.5％的PEO，其余为水。在步骤6的交联溶液
中加入质量分数为1％的光引发剂I2959溶液，即2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，
并在步骤4中旋转接收时，采用紫外光照10分钟。
实施例24
以与实施例22基本相同的方式实施，区别仅在于，在步骤5的电纺原液中加入接枝
了甲基丙烯酰胺基团的海藻酸钠，使得电纺原液中包含有质量分数为5.5％的纤维蛋白原，
质量分数为2.75％的透明质酸，以及质量分数为0.5％的PEO，其余为水。在步骤6的交联溶
液中加入质量分数为0.1％的光引发剂I2959溶液，即2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯
丙酮，并在步骤7中旋转接收时，采用紫外光照20分钟。
实验结果
本发明通过电镜、细胞实验和动物实验等手段对各实施例制得的仿生神经移植物
进行了评价。
(一)结构表征结果
请参阅图2，为根据本发明实施例1制得的仿生神经移植物的实物照片图。请参阅
图3a-3d，分别为根据本发明实施例1制得的仿生神经移植物中纤维蛋白水凝胶束的外形图
及电镜图。可以看到图3d中的纳米纤维丝束的直径为100nm～500nm。该纳米微米纤维丝束
构成的直径为10μm～20μm的微米纤维丝束如图3c所示，且进一步聚合成直径为80μm～100μ
m的微米纤维丝束，如图3b所示。该直径为80μm～100μm的微米纤维丝束会进一步聚合成直
径为0.5mm～1mm的宏观水凝胶束，再经过手动缠绕收集后得到更粗的纤维蛋白水凝胶束，
如图3a所示。从图中可以看到，该纤维蛋白水凝胶束分为多级，即从纳米到微米再至宏观，
并且纳米的纤维取向为同一方向，微米的纤维取向为同一方向，宏观的纤维取向也为同一
方向，因此实现了多级取向性结构。
请参阅图4，为根据本发明实施例22制得的仿生纤维蛋白与多糖复合水凝胶束电
镜照片，可见复合材料可实现较好的多级定向结构，且具有多级的纤维结构与孔结构。
(二)细胞实验结果
将雪旺细胞接种于各实施例和对比例的材料上培养，免疫荧光S100(绿色)染色雪
旺细胞，DAPI(蓝色)染色细胞核。请参阅图5，为实施例1制得的仿生神经移植物接种雪旺细
胞后4小时的细胞染色结果图。如图5所示，雪旺细胞(SCs)在取向纤维蛋白水凝胶上定向性
生长。
(三)动物实验结果
将麻醉的狗的脊髓神经暴露，切除5mm制造脊髓神经缺损后，本发明材料可实现很
好的移植入操作。如图6a和6b所示，分别为本发明实施例1制得的仿生纤维蛋白水凝胶束移
植于动物脊髓缺损部位前后的手术照片。手术后12周脊髓组织的HE染色结果如图7a和7b所
示，7a与7b分别为损伤修复部位放大200倍与放大400倍观察的组织切片结果，结果显示损
伤脊髓在病灶区能够形成定向的新生组织。此外，请参阅图8，在对植入材料后12周的核磁
成像DTI纤维追踪检测中观察到新生纤维在病灶区的贯穿，表明本发明材料能够促进脊髓
神经的纤维再生。