一种烟草复合抗性种质的高通量筛选方法.pdf

本发明提供了一种烟草复合抗性种质的高通量筛选方法，遵循高通量、快速、简易的筛选原则，本发明从筛选乙烯不敏感突变体着手，通过仅需要一周时间就可完成的乙烯“三重反应”，对大量材料进行快速、高通量的初步筛选；在此基础上进行耐寒与耐旱的复合种质的筛选。特别是在耐寒性的筛选上，本发明采用普通家用冰箱就可以满足的4℃条件，无需光照培养，经过暗处理培养后，通过观测分析幼苗的下胚轴和根的长度来判断其的耐寒性，区别于一般对实验仪器要求较高的零下低温筛选的方法，开创了新的简易的耐寒种质的筛选方法。烟草复合种质的筛选方法对抗逆育种以及研究乙烯对抗逆的影响提供了简易的基础材料筛选方法。

权利要求书1.  一种烟草复合抗性种质的高通量筛选方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）烟草乙烯不敏感种质的筛选a、表面消毒：取待筛选的烟草种子与烟草野生型种子用次氯酸钠消毒后用无菌水冲洗；b、低温处理：将已消毒的所述烟草种子点播在1/2 MS+100 μM ACC的培养基上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d；c、光照催芽与暗培养：于25℃光照培养10 h；之后将其于25℃下避光暗培养5-6 d；d、乙烯不敏感种质的鉴别：烟草野生型种子出现“三重反应”的表型：幼苗的主根变短、下胚轴缩短变粗、子叶形成顶钩；“三重反应”呈现不明显表型的为乙烯不敏感种质；（2）乙烯不敏感-耐寒复合种质的筛选以所述筛选出的乙烯不敏感种质的烟草种子为测试材料，以烟草野生型种子为对照，按以下步骤进行筛选：a、表面消毒：取所述烟草乙烯不敏感种质与野生型种子用次氯酸钠消毒后用无菌水冲洗；b、低温处理：将已消毒的烟草种子点播在1/2 MS的培养基平板上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d；c、处理前光照培养：于25℃光照条件下培养3 d至种子萌发；d、低温筛选：选取萌发一致的幼苗转移到1/2 MS的培养基平板上，然后用锡箔纸包起来在4℃低温下暗培养60 d；e、乙烯不敏感-耐寒种质的鉴别：烟草野生型在低温条件下根长及下胚轴生长受抑制变短，而“乙烯不敏感-耐寒”抗性种质的根长及下胚轴生长不受抑制或抑制较轻，筛选出乙烯不敏感-耐寒抗性种质。2.  根据权利要求1所述的烟草复合抗性种质的高通量筛选方法，其特征在于：在筛选出的乙烯不敏感-耐寒种质的基础上再进行耐旱抗性种质的筛选，步骤如下：a、表面消毒：取上述筛选出的乙烯不敏感-耐寒抗性种质与野生型种子用次氯酸钠消毒后用无菌水冲洗；b、低温处理：将已消毒的烟草种子点播在1/2 MS的培养基平板上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d；c、处理前光照培养：于25℃光照条件下培养7-10 d至真叶刚刚出现；d、模拟干旱处理：选取出芽一致的幼苗转移到1/2 MS+200 mM甘露醇培养基平板上，于25℃光照培养30 d；e、乙烯不敏感-耐寒-耐旱复合抗性种质的鉴别：烟草野生型在模拟干旱的条件下出现植株变黄、矮小症状，生长不受抑制或抑制较轻的为“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”复合抗性种质。3.  根据权利要求1所述的烟草复合抗性种质的高通量筛选方法，其特征在于：所述1/2 MS+100 μM ACC的培养基的配制方法为：不加蔗糖的PH为5.8的1/2 MS培养基经灭菌后冷却至50-60℃，加入过滤除菌的ACC使其终浓度达到100 μM。4.  根据权利要求2所述的烟草复合抗性种质的高通量筛选方法，其特征在于：所述1/2 MS+200 mM甘露醇培养基的配制方法为：向1/2 MS培养基加入甘露醇终浓度达到200 μM，使其PH为5.8，经高压灭菌后冷却。

说明书一种烟草复合抗性种质的高通量筛选方法
技术领域
本发明属于选育技术领域，具体涉及一种烟草复合抗性种质的高通量筛选方法。
背景技术
烟草性喜温暖湿润。我国烟区分布广泛，南方烟区的早春低温与北方烟区的夏季干旱对烟叶的产量和品质造成很大影响。乙烯作为重要的植物激素在植物应对生物胁迫和非生物胁迫过程中起到了至关重要的作用，一些乙烯突变体常表现出抗逆性。在水稻中表达乙烯响应因子JERF1/3可以提高转基因植物的耐旱性。在烟草和番茄中分别过表达乙烯响应因子TERF2/LeERF2提高了转基因植物的耐寒性。拟南芥的乙烯不敏感突变体如etr1-1，ein4-1，ein3-1提高了耐冻性。但是，利用乙烯“三重反应”筛选具有复合抗性的新种质材料尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种烟草复合抗性种质的高通量筛选方法，具体包括：乙烯不敏感种质的筛选、乙烯不敏感-耐寒种质的筛选以及乙烯不敏感-耐寒-耐旱复合抗性种质的筛选。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种烟草复合抗性种质的高通量筛选方法，它包括以下步骤：
（1）烟草乙烯不敏感种质的筛选
a、表面消毒：取待筛选的烟草种子与烟草野生型种子用次氯酸钠消毒后用无菌水冲洗；
b、低温处理：将已消毒的所述烟草种子点播在1/2 MS+100 μM ACC的培养基上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d；
c、光照催芽与暗培养：于25℃光照培养10 h；之后将其于25℃下避光暗培养5-6 d；
d、乙烯不敏感种质的鉴别：烟草野生型种子出现“三重反应”的表型：幼苗的主根变短、下胚轴缩短变粗、子叶形成顶钩；“三重反应”呈现不明显表型的为乙烯不敏感种质；
（2）乙烯不敏感-耐寒复合种质的筛选
以所述筛选出的乙烯不敏感种质的烟草种子为测试材料，以烟草野生型种子为对照，按以下步骤进行筛选：
a、表面消毒：取所述烟草乙烯不敏感种质与野生型种子用次氯酸钠消毒后用无菌水冲洗；
b、低温处理：将已消毒的烟草种子点播在1/2 MS的培养基平板上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d；
c、处理前光照培养：于25℃光照条件下培养3 d至种子萌发；
d、低温筛选：选取萌发一致的幼苗转移到1/2 MS的培养基平板上，然后用锡箔纸包起来在4℃低温下暗培养60 d；
e、乙烯不敏感-耐寒种质的鉴别：烟草野生型在低温条件下根长及下胚轴生长受抑制变短，而“乙烯不敏感-耐寒”抗性种质的根长及下胚轴生长不受抑制或抑制较轻，筛选出乙烯不敏感-耐寒抗性种质。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明建立了烟草“乙烯不敏感-耐寒”与“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”复合抗性种质的高通量筛选方法。筛选烟草乙烯不敏感种质资源主要依据黑暗条件下萌发的幼苗呈现特有的“三重反应”：在无光照的培养条件下，外源乙烯处理会使萌发的幼苗的主根生长受到抑制，下胚轴缩短变粗，子叶形成特别的顶钩。基于这个特点，可快速筛选出乙烯不敏感种质。在含有乙烯前体物ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid）的培养基上无光照培养，野生型幼苗表现出典型的“三重反应”，而乙烯不敏感种质的“三重反应”则表现不明显。对于乙烯不敏感-耐寒种质的筛选，本发明本着采用高通量、简易、快捷的原则，采用了最简单的条件以及简明的评价判别方法，进行了独创性改进。本发明所述烟草复合抗性种质的筛选方法对抗逆育种以及研究乙烯对抗逆的影响提供了简易的基础材料筛选途径。
附图说明
图1枚举本发明利用“三重反应”于100 μM ACC培养基上筛选烟草乙烯不敏感种质。
图2枚举本发明利用烟草乙烯不敏感种质于4℃处理60 d进一步筛选耐寒种质。
图3枚举本发明利用烟草乙烯不敏感-耐寒种质继续进行耐旱筛选，即在200 mM甘露醇浓度下野生型与抗性种质的生长情况。
具体实施方式
为使本发明实施目的、技术方案和优点更加清楚，如下结合本发明实施个例中的附图，对本发明实施中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本发明烟草复合抗性种质的筛选方法的具体步骤如下：
1、烟草乙烯不敏感种质的高通量初步筛选
本发明以通过EMS诱变获得的自交二代种子为筛选和鉴定材料，也可以以其它诱变或未经诱变的烟草为待筛选的原材料，以烟草野生型种子（野生型为烟草在野生环境下正常生长形成的种子）为对照，按以下步骤进行筛选：
（1）表面消毒：分别取大约50粒每种待筛选的烟草种子与野生型材料的种子于1.5 ml离心管中，加900 μl的无菌水、100 μl 10%的次氯酸钠，37℃ 200 rpm 震荡1 h后用无菌水冲洗6次。
（2）低温处理：将已消毒的烟草种子点播在1/2 MS+100 μM ACC的培养基平板上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d。
ACC培养基的配制方法：不加蔗糖的1/2MS培养基（PH为5.8）经高压灭菌（121℃，15-20 min）后冷却至50-60℃，加入过滤除菌的ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸，Sigma Aldrich）使其终浓度达到100 μM。
（3）光照催芽与暗培养：结束低温处理后，于25℃光照培养10 h，以促使种子整齐萌发；之后将其于此温度下避光暗培养5-6 d。
（4）乙烯不敏感种质的鉴别：烟草野生型出现典型的“三重反应”的表型，即幼苗的主根变短，下胚轴缩短变粗，子叶形成特别的顶钩。观察烟草不敏感种质，其“三重反应”呈现不明显的表型特征：顶钩缺失，下胚轴变长，主根有所生长，如图1所示 （野生型WT，待筛选株系#1304，1244, 1594，1329）。
2、“乙烯不敏感-耐寒”复合种质的筛选
以筛选出的乙烯不敏感种质的烟草种子为测试材料，以烟草野生型种子为对照，按以下步骤进行筛选：
（1）表面消毒：分别取大约50粒上述烟草乙烯不敏感种质与野生型材料的种子于1.5 ml离心管中，加900 μl的无菌水、100 μl 10%的次氯酸钠，37℃200 rpm 震荡1 h后用无菌水冲洗6次。
（2）低温处理：将已消毒的烟草种子点播在1/2 MS的培养基平板上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d。
（3）筛选前光照培养：结束低温处理后，于正常光照培养条件下（25℃；光/暗：16 h/8 h）培养3 d至种子萌发。
（3）低温筛选：选取萌发一致的幼苗转移到1/2 MS的培养基平板上，然后用锡箔纸包起来在4℃低温下暗培养60 d。
（4）“乙烯不敏感-耐寒”种质的鉴别：烟草野生型在低温条件下根长及下胚轴生长受抑制变短，而“乙烯不敏感-耐寒”种质的根长及下胚轴生长不受抑制或抑制较轻，如图2所示（野生型WT，待筛选株系#1304，1244, 1594，1392）。
实施例2
1、烟草乙烯不敏感种质的高通量初步筛选，步骤如实施例1。
2、“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”复合种质的筛选
以筛选出的乙烯不敏感-耐寒种质的烟草种子为测试材料，以烟草野生型种子为对照，按以下步骤进行筛选：
（1）表面消毒：分别取大约50粒乙烯不敏感-耐寒烟草种质与野生型材料的种子于1.5 ml离心管中，加900 μl的无菌水、100 μl 10%的次氯酸钠，37℃ 200 rpm 震荡1 h后用无菌水冲洗6次。
（2）低温处理：将已消毒的烟草种子点播在1/2 MS的培养基平板上，并将其置于4℃，黑暗培养3 d。
（3）筛选前光照培养：结束低温处理后，于正常光照培养条件下（25℃；光/暗：16 h/8 h）生长7-10 d至真叶刚刚出现。
（3）模拟干旱筛选：选取出芽一致的幼苗转移到1/2 MS+200 mM甘露醇的培养基平板上，于25℃光照培养30 d。
甘露醇培养基的配置：1/2 MS培养基加入甘露醇终浓度达到200 μM使其（PH为5.8），经高压灭菌（121℃，15-20 min）后冷却。
（4）“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”复合抗性种质的鉴别：烟草野生型在模拟干旱的条件下出现植株变黄、矮小等生长受抑制等形态特征，而“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”复合抗性植株生长不受抑制或抑制较轻（如图3所示，野生型WT，待筛选株系#1304，1244, 1594，1392）。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。