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1、10申请公布号CN104045725A43申请公布日20140917CN104045725A21申请号201410287909X22申请日20140625C08B37/0020060171申请人聊城大学地址252059山东省聊城市东昌府区湖南路1号72发明人杜秀菊张扬刘珊54发明名称采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法57摘要本发明公开了一种采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其特征是，包括如下步骤A原料的脱脂预处理；B热水浸提制备粗多糖；C粗多糖酶解；D大孔吸附树脂D301G处理；E超滤去除小分子；F真空冷冻干燥；制备桦褐孔菌多糖。使用该工艺最终得到脱色的并去除大部。
2、分蛋白和小分子杂质的桦褐孔菌精制多糖，多糖保留率为582以上，脱色率为877，蛋白脱除率高达737。本方法适合产业化规模化生产桦褐孔菌精制多糖。51INTCL权利要求书1页说明书6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页10申请公布号CN104045725ACN104045725A1/1页21采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其特征是，包括如下步骤A原料的脱脂预处理；B热水浸提制备粗多糖；C粗多糖酶解；D大孔吸附树脂D301G处理；E超滤去除小分子；F真空冷冻干燥；制备桦褐孔菌多糖。2根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤A原料的脱脂预处理是。
3、指，取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于48倍体积的6095乙醇溶液中浸泡1624H（优选的，置于67倍体积的7090乙醇溶液中浸泡1820H，更加优选的，置于65倍体积的80乙醇溶液中浸泡20H），以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。3根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤B热水浸提制备粗多糖是指，预处理后的残渣风干后，加1020倍蒸馏水（V/W），沸水提取13H，80120目纱布过滤（优选的，加1318倍蒸馏水（V/W），沸水提取1525H，85100目纱布过滤，更加优选的，加15倍蒸馏水（V/W），沸水提取2H，100目纱布过滤），滤渣重复提取13次，合并滤液，浓缩，离。
4、心，喷雾干燥得粗多糖。4根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤C粗多糖酶解是指，将粗多糖加水溶解，加入木瓜蛋白酶，3545反应2040MIN（优选的，3642反应2535MIN，更加优选的，40反应30MIN），得粗多糖的酶解液。5根据权利要求4所述的方法，其特征是，粗多糖加水溶解后配制为0520（W/W）的水溶液（优选的，配制为0618（W/W）的水溶液，更加优选的，配制为15（W/W）的水溶液）。6根据权利要求4所述的方法，其特征是，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的35（W/W）（优选的，加入量为粗多糖水溶液的3545（W/W），更加优选的，加入量为粗多糖水溶液的40（W/W）。7根据权。
5、利要求1所述的方法，其特征是，步骤D大孔吸附树脂D301G处理是指，粗多糖的酶解液加入经预处理的D301G树脂层析柱中，按照D301G树脂粗多糖酶解液12201（W/V），流速控制在13ML/MIN（优选的，按照D301G树脂粗多糖酶解液15181（W/V），流速控制在152ML/MIN，更加优选的，按照D301G树脂粗多糖酶解液161（W/V），流速控制在18ML/MIN），收集流出液。8根据权利要求7所述的方法，其特征是，所述的预处理是指，大孔吸附树脂D301G先用水浸泡24H，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24H，水洗至中性，加1MNAOH溶液浸泡24H，用水洗至中性。9。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤E超滤去除小分子是指，采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得桦褐孔菌多糖样品。10根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤F真空冷冻干燥是指，先将桦褐孔菌多糖样品放置于20下3H，然后转入80下冷冻6H以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。权利要求书CN104045725A1/6页3采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法。背景技术0002桦褐孔菌INONOTUSOBLIQUUSFRPILAT。
7、是一著名的民间野生药用真菌。研究表明，桦褐孔菌多糖是重要的活性成分之一，具有增强免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖及抗病毒等多种药理活性，已成为国内外研究的热点领域之一。但目前对桦褐孔菌多糖的分离纯化的研究报道相对较少。0003由于多糖的组成复杂性，多糖粗提物的分子量分布较广，多糖种类也很多，而且前期实验表明，提取后的桦褐孔菌粗多糖中含有一定量的蛋白、色素和小分子物质，影响多糖的生物活性的发挥和化学结构的进一步研究，因此有必要对粗多糖进一步分离纯化，但去除粗多糖中的蛋白和色素等杂质，一直是多糖分离纯化中的一大难题，传统的去蛋白以SEVAGE法为主，方法操作繁琐，效率低，采用的有机溶剂有毒性因而影。
8、响多糖的生物活性；活性炭法去除色素效果较好，但后期的活性炭粉末不易去除，过氧化氢法因为较强的抗氧化活性去除色素效果很好，但对多糖的活性影响较大，因此急需探索一种新的精制方法。0004大孔树脂具有大孔立体三维网状结构和较大的比表面积，因此具有良好的交换吸附活性，近年来广泛用于天然产物的活性成分的精制，有些大孔树脂已经用以去除植物和真菌多糖中的蛋白和色素，并取得了很好的效果。采用大孔树脂去除桦褐孔菌粗多糖中色素和蛋白的研究尚未见有文献报道。0005申请公布号CN102603906A（申请号2011104616358）的中国专利文献公开了一种桦褐孔菌多糖水溶液的制备方法一种桦褐孔菌多糖水溶液的制备方。
9、法，包括以下步骤三氯乙酸脱蛋白向桦褐孔菌提取物中加入三氯乙酸，静置，然后固液分离，取分离得到的固体物质；活性炭脱色向步骤所得固体物质按体积加入50100倍的水，然后加入活性炭脱色，然后固液分离，取所得上清液；用天然澄清剂澄清所得上清液加入天然澄清剂澄清。发明内容0006本发明的目是提供一种精制桦褐孔菌粗多糖的工艺，本发明的核心技术是应用生物酶和阴离子交换吸附树脂替代传统的SEVAGE法、活性炭法和过氧化氢法去除蛋白和色素，克服了现有技术的缺陷，提供了一种新型的适合规模化制备桦褐孔菌精制多糖的方法。0007本发明的技术方案如下采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步骤A原料。
10、的脱脂预处理；B热水浸提制备粗多糖；C粗多糖酶解；D大孔树脂D301G处理；E超滤去除小分子；F真空冷冻干燥；制备得到桦褐孔菌精制多糖。说明书CN104045725A2/6页40008前面所述的方法，优选的方案是，步骤A原料的脱脂预处理是指，取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于48倍体积的6095乙醇溶液中浸泡1624H（优选的，置于67倍体积的7090乙醇溶液中浸泡1820H，更加优选的，置于65倍体积的80乙醇溶液中浸泡20H），以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。0009前面所述的方法，优选的方案是，步骤B热水浸提制备粗多糖是指，预处理后的残渣风干后，加1020倍蒸馏水（。
11、V/W），沸水提取13H，80120目纱布过滤（优选的，加1318倍蒸馏水（V/W），沸水提取1525H，85100目纱布过滤，更加优选的，加15倍蒸馏水（V/W），沸水提取2H，100目纱布过滤），滤渣重复提取13次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。0010前面所述的方法，优选的方案是，步骤C粗多糖酶解是指，将粗多糖加水溶解，加入木瓜蛋白酶，3545反应2040MIN（优选的，3642反应2535MIN，更加优选的，40反应30MIN），得粗多糖的酶解液。更加优选的，粗多糖加水溶解后配制为0520（W/W）的水溶液（优选的，配制为0618（W/W）的水溶液，更加优选的，配制为15（W。
12、/W）的水溶液）。更加优选的，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的35（W/W）（优选的，加入量为粗多糖水溶液的3545（W/W），更加优选的，加入量为粗多糖水溶液的40（W/W）。0011前面所述的方法，优选的方案是，步骤D大孔吸附树脂D301G处理是指，粗多糖的酶解液加入经预处理的D301G树脂层析柱中，按照D301G树脂粗多糖酶解液12201W/V，流速控制在13ML/MIN（优选的，按照D301G树脂粗多糖酶解液15181W/V，流速控制在152ML/MIN，更加优选的，按照D301G树脂粗多糖酶解液161W/V，流速控制在18ML/MIN），收集流出液。更加优选的，所述的预处理是指，大孔。
13、吸附树脂D301G先用水浸泡24H，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24H，水洗至中性，加1MNAOH溶液浸泡24H，用水洗至中性。0012前面所述的方法，优选的方案是，步骤E超滤去除小分子是指，采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。0013前面所述的方法，优选的方案是，步骤F真空冷冻干燥是指，先将桦褐孔菌多糖样品放置于20下3H，然后转入80下冷冻6H以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。0014本发明公开了一种桦褐孔菌精制多糖及其制备工艺，制备工艺如下1、原料的预处理；2、桦褐孔菌粗多糖的溶出；3、蛋白酶水解；4、阴离子树脂。
14、处理；5、超滤，然后干燥。使用该工艺最终得到脱色的并去除大部分蛋白和小分子杂质的桦褐孔菌精制多糖，多糖保留率为582以上，脱色率为877，蛋白脱除率高达737。本方法适合产业化规模化生产桦褐孔菌精制多糖。0015除此在外，本发明的技术优势还体现在1、采用木瓜蛋白酶处理粗多糖，提高了蛋白杂质的去除率（去除率高达到737），提高了多糖的纯度；2、采用大孔树脂处理制备的精制多糖，无毒副作用，操作更加简便，纯化效果好，多糖保留率和得率高（分别高达582和624）。而SEVAGE法，所用氯仿有毒性，且回收不便，得率仅为489；活性炭吸附法和过氧化氢法去除色素，均存在一定的缺陷，活性炭吸附法脱色时间长且多。
15、糖损失率较大（得率仅为486），而且活性炭难以除去，过氧化氢脱色，对多糖的化学结构和生物活性破坏性极大。说明书CN104045725A3/6页5具体实施方式0016下面结合实施例对本发明技术方案详加描述，但保护范围不被此限制。实施例中所用的材料为桦褐孔菌野生菌核，购自黑龙江微生物研究所；采用的大孔树脂为弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，型号为D301G，购自光复精细化工研究所，粒度直径为060160MM，奶白色；本发明所用的蛋白酶为木瓜蛋白酶，购自北京鼎国生物技术有限公司。0017实施例1采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步骤A原料的脱脂预处理取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置。
16、于4倍体积的60乙醇溶液中浸泡16H，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。0018B热水浸提制备粗多糖预处理后的残渣风干后，加10倍蒸馏水（V/W），沸水提取1H，80目纱布过滤，滤液浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。0019C粗多糖酶解将粗多糖加水溶解，配制为05（W/W）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的3（W/W），35反应20MIN，得粗多糖的酶解液。0020D大孔树脂D301G处理粗多糖的酶解液加入经预处理大孔吸附树脂D301G先用水浸泡24H，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24H，水洗至中性，加1MNAOH溶液浸泡24H，用水。
17、洗至中性的D301G树脂层析柱中，按照D301G树脂粗多糖酶解液121（W/V），流速控制在1ML/MIN，收集流出液。0021E超滤去除小分子采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质，得桦褐孔菌多糖样品。0022F真空冷冻干燥先将桦褐孔菌多糖样品放置于20下3H，然后转入80下冷冻6H以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。0023实施例2采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步骤A原料的脱脂预处理取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于8倍体积的95乙醇溶液中浸泡24H，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。002。
18、4B热水浸提制备粗多糖预处理后的残渣风干后，加20倍蒸馏水（V/W），沸水提取3H，120目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。0025C粗多糖酶解将粗多糖加水溶解，配制为20（W/W）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的5（W/W），45反应40MIN，得粗多糖的酶解液。0026D大孔树脂D301G处理大孔吸附树脂D301G预处理，先用水浸泡24H，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24H，水洗至中性，加1MNAOH溶液浸泡24H，用水洗至中性。0027粗多糖的酶解液加入经预处理的D301G树脂层析柱中，按照D301G树脂粗多。
19、糖酶解液201W/V，流速控制在3ML/MIN，收集流出液。0028E超滤去除小分子采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。0029F真空冷冻干燥先将桦褐孔菌多糖样品放置于20下3H，然后转入80下冷冻6H以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。0030实施例3采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步骤说明书CN104045725A4/6页6A原料的脱脂预处理取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于7倍体积的90乙醇溶液中浸泡20H，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。0031B热水浸提制备粗多糖预处理后的残渣风。
20、干后，加18倍蒸馏水（V/W），沸水提取25H，100目纱布过滤，滤渣重复提取3次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。0032C粗多糖酶解将粗多糖加水溶解，配制为18（W/W）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的45（W/W），42反应35MIN，得粗多糖的酶解液。0033D大孔树脂D301G处理粗多糖的酶解液加入经预处理（预处理方式与是实施例13相同）的D301G树脂层析柱中，按照D301G树脂粗多糖酶解液181W/V，流速控制在2ML/MIN，收集流出液。0034E超滤去除小分子采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。0035F真。
21、空冷冻干燥先将桦褐孔菌多糖样品放置于20下3H，然后转入80下冷冻6H以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。0036实施例4采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，包括如下步骤A原料的脱脂预处理取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于6倍体积的70乙醇溶液中浸泡18H，以除去脂肪、部分单（寡）糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。0037B热水浸提制备粗多糖预处理后的残渣风干后，加13倍蒸馏水（V/W），沸水提取15H，85目纱布过滤，提取1次，滤液浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。0038C粗多糖酶解将粗多糖加水溶解，配制为05（W/W）的水溶液，加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为。
22、粗多糖水溶液的35（W/W），36反应25MIN，得粗多糖的酶解液。0039D大孔树脂D301G处理粗多糖的酶解液加入经预处理（大孔吸附树脂D301G先用水浸泡24H，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24H，水洗至中性，加1MNAOH溶液浸泡24H，用水洗至中性）的D301G树脂层析柱中，按照D301G树脂粗多糖酶解液151（W/V），流速控制在15ML/MIN，收集流出液。0040E超滤去除小分子采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。0041F真空冷冻干燥先将桦褐孔菌多糖样品放置于20下3H，然后转入80下冷冻6H以上，然后转入真空冷冻干燥机干。
23、燥，得精制的桦褐孔菌多糖。0042实施例5采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，其包括如下步骤A原料的脱脂预处理取干燥的桦褐孔菌菌核，粉碎，置于65倍体积的80乙醇（质量浓度）溶液中浸泡20H，以除去脂肪、部分寡糖及脂溶性色素，残渣阴凉处风干。0043B热水浸提制备粗多糖预处理后的残渣风干后，加15倍蒸馏水（V/W），沸水提取2H，100目纱布过滤，滤渣重复提取2次，合并滤液，浓缩，离心，喷雾干燥得粗多糖。0044C粗多糖酶解将粗多糖加水溶解，配制为15（W/W）的水溶液,加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶加入量为粗多糖水溶液的40W/W,40反应30MIN，得粗多糖的酶解液。0045D大。
24、孔树脂D301G处理粗多糖的酶解液加入经预处理（所述的预处理是指，大孔吸附树脂D301G先用水浸泡24H，用水洗至水液澄清，倾去水后加1MHC1溶液浸泡24H，水洗至中性，加1MNAOH溶液浸泡24H，用水洗至中性）的D301G树脂层析柱中，按照D301G树说明书CN104045725A5/6页7脂粗多糖酶解液161W/V，流速控制在18ML/MIN，收集流出液。0046E超滤去除小分子采用超滤膜分子量为1万的中空纤维素膜进行超滤，去除1万以下的小分子物质。0047F真空冷冻干燥先将桦褐孔菌多糖样品放置于20下3H，然后转入80下冷冻6H以上，然后转入真空冷冻干燥机干燥，得精制的桦褐孔菌多糖。。
25、0048试验例实施例5所得桦褐孔菌多糖多糖含量和蛋白含量的测定，以及蛋白脱除率、色素脱除率和多糖保留率的计算。其中多糖含量总糖的含量还原糖的含量。0049总糖含量测定采用苯酚硫酸法；还原糖含量测定采用DNS法；蛋白含量测定采用BRADFORD法。0050式中A0、A1分别为脱色前和脱色后溶液在波长450NM处的吸光度。式中C0、C1分别为脱色前和脱色后溶液在波长450NM处的吸光度。0051式中M0、M1分别为处理前后的多糖含量。0052下面是大孔树脂D301G（本发明实施例5）与SEVAGE法、活性炭法和过氧化氢法精制桦褐孔菌粗多糖的结果比较，由此可以看出，大孔树脂D301G，兼具去除蛋白和。
26、色素的能力。见下表本发明采用D301G阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法，不仅可以去除蛋白，还兼具去除色素的能力，因此制备的多糖纯度较高，与处理之前的粗多糖相比较，色素脱除率为说明书CN104045725A6/6页8877、蛋白脱除率为737，多糖保留率582。0053本申请由山东省自然科学基金项目（ZR2010CL008）资助。0054最后应说明的是，实施例只是本发明最优的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104045725A。