利用磷酸酮醇酶产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体和异戊二烯
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技术领域
本发明涉及包含磷酸酮醇酶多肽以及一种或多种能够产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯的甲羟戊酸(MVA)途径多肽的培养重组细胞以及包含这些培养细胞的组合物，以及产生和使用其的方法。
发明背景
R-甲羟戊酸是甲羟戊酸依赖性生物合成途径的中间体，该途径将乙酰辅酶A转化成异戊烯二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸。乙酰辅酶A向甲羟戊酸的转化可由上游甲羟戊酸依赖性生物合成途径(MVA途径)的硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶活性催化。商业上，甲羟戊酸已被用作化妆品中的添加剂、用于生产可生物降解的聚合物，并且可具有用于合成其他化学品的手性构造块的价值。下游甲羟戊酸依赖性生物合成途径利用甲羟戊酸作为底物用于生成异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，它们是甲羟戊酸依赖性途径的最终产物。IPP和DMAPP是异戊二烯以及类异戊二烯的前体。
异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是多种合成聚合物(最值得注意的是合成橡胶)的关键原料。异戊二烯可通过石油分馏获得；然而，该物质的纯化是昂贵和耗时的。C5烃流的石油裂解仅生成约15％的异戊二烯。每年 大约有800,000吨顺式聚异戊二烯由异戊二烯的聚合反应产生；这种聚异戊二烯大部分用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯还通过共聚反应用作其他产品中的合成弹性体，这些产品例如为鞋类、机械产品、医疗产品、体育用品和乳胶。也可以用多种微生物、植物和动物物种自然产生异戊二烯。具体地讲，已经发现了两种进行异戊二烯自然生物合成的途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径。甲羟戊酸和非甲羟戊酸途径的产物是异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。DMAPP可直接转化为异戊二烯。IPP和DMAPP可转化为类异戊二烯。
已鉴定了超过29,000种类异戊二烯化合物并且每年都发现新的类异戊二烯。类异戊二烯可分离自天然产物，例如将类异戊二烯前体分子用作基础构造块以形成类异戊二烯的相对复杂结构的微生物和植物物种。类异戊二烯对大多数活生物体和细胞是至关重要的，为维持细胞膜流动性和电子传递提供了手段。在自然界，类异戊二烯发挥的作用多种多样，从作为植物中的天然杀虫剂到促成与肉桂、丁香和生姜相关的香味。此外，制药和化学界将类异戊二烯用作药品、保健营养品、调味剂和农业害虫防治剂。鉴于它们在生物系统中的重要性以及在广泛应用中的有用性，类异戊二烯已成为倍受科学家重视的焦点。
获得甲羟戊酸和类异戊二烯的常规手段包括从生物材料(如植物、微生物和动物)提取以及在实验室中部分有机合成或全有机合成。然而，这类手段通常已证明差强人意。尤其对于类异戊二烯，鉴于通常其分子结构的复杂性，考虑到通常需要若干步骤来获得所需产物，因而有机合成是不切实际的。另外，这些化学合成步骤可涉及使用毒性溶剂，同样从生物材料提取类异戊二烯也可涉及使用毒性溶剂。此外，这些提取和纯化方法通常导致所需类异戊二烯产率相对较低，因为生物材料通常仅含有微量的这些分子。不幸的是，获得相对大量的类异戊二烯所涉及的困难已限制了它们的实际应用。
关于产生异戊二烯、类异戊二烯前体分子和类异戊二烯的最新进展公开了以可足以满足稳定商业过程的需求的速率、滴度和纯度产生异戊二烯和类异戊二烯的方法(参见，例如国际专利申请公布No.WO2009/076676 A2和美国专利No.7,915,026)；然而，仍然需要提高其产量和产率的可供选择的途径。
本文提供了培养重组细胞、这些细胞的组合物以及使用这些细胞增加作为甲羟戊酸依赖性生物合成途径中间体的甲羟戊酸的产量以及增加衍生自甲羟戊酸的分子，例如类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的产量的方法。
在整篇本说明书中，参考了多个专利、专利申请以及其他类型的出版物(如杂志文章)。特此将本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。
发明内容
本文提供的发明公开了特别是包含重组细胞的物质的组合物、重组细胞以及制备这些重组细胞并将其用于产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法。经工程改造的重组细胞可用于表达磷酸酮醇酶多肽。本发明的磷酸酮醇酶可使用各种底物，如下文更详细地描述。因此，在一个方面，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供异戊二烯的产生。在一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸选自：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galliniarum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutilicum)、点形念珠藻(Nostoc punctiforme)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、泛菌属(Pantoea)、梭状冻胶样杆菌(Mucilaginibacter paludis)、嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatili)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、除虫链霉 菌(Streptomyces avermitilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸选自：长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌和丙酮丁醇梭菌。在另一个实施例中，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸是植物异戊二烯合酶多肽。在另一个实施例中，该异戊二烯合酶多肽是来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂种银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremula)的多肽。在另一个实施例中，该异戊二烯合酶多肽选自：山葛(Pueraria montana)或野葛(Pueraria lobata)、美洲山杨(Populus tremuloides)、银白杨、黑杨(Populus nigra)和毛果杨(Populus trichocarpa)。在另一个实施例中，完整MVA途径的一种或多种多肽选自：(a)使两分子乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶；(b)缩合乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。在另一个实施例中，重组细胞还包含编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的一种或多种核酸。在另一个实施例中，将一种或多种核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在另一个实施例中，将一种或多种核酸克隆进一种或多种多拷贝质粒。在另一个实施例中，将一种或多种核酸整合进细胞的染色体中。在另一个实施例中，重组细胞是革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞或酵母细胞。在另一个实施例中，重组细胞选自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisieae)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
在另一个方面，本发明提供能够产生类异戊二烯前体的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供类异戊二烯前体的产生。在一个实施例 中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸选自：长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、丙酮丁醇梭菌、点形念珠藻、沼泽红假单胞菌、泛菌属、梭状冻胶样杆菌、嗜热裂孢菌、短双歧杆菌、水生拉恩氏菌、动物双歧杆菌、阴道加德纳菌、除虫链霉菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸选自：长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌和丙酮丁醇梭菌。在另一个实施例中，完整MVA途径的一种或多种多肽选自：(a)使两分子乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶；(b)缩合乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。在另一个实施例中，将一种或多种核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在另一个实施例中，将一种或多种核酸克隆进一种或多种多拷贝质粒。在另一个实施例中，将一种或多种核酸整合进细胞的染色体中。在另一个实施例中，重组细胞是革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞或酵母细胞。在另一个实施例中，重组细胞选自：枯草芽孢杆菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、大肠杆菌、柠檬泛菌、里氏木霉、米曲霉和黑曲霉、酿酒酵母和解脂耶氏酵母。
在另一个方面，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供类异戊二烯的产生。在一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸。在另一个实 施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸选自：长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、丙酮丁醇梭菌、点形念珠藻、沼泽红假单胞菌、泛菌属、梭状冻胶样杆菌、嗜热裂孢菌、短双歧杆菌、水生拉恩氏菌、动物双歧杆菌、阴道加德纳菌、除虫链霉菌、植物乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。在另一个实施例中，编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸选自：长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌和丙酮丁醇梭菌。在另一个实施例中，类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在另一个实施例中，类异戊二烯是倍半萜。在另一个实施例中，类异戊二烯选自：松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。在另一个实施例中，完整MVA途径的一种或多种多肽选自：(a)使两分子乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶；(b)缩合乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。在另一个实施例中，将一种或多种核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在另一个实施例中，将一种或多种核酸克隆进一种或多种多拷贝质粒。在另一个实施例中，将一种或多种核酸整合进细胞的染色体中。在另一个实施例中，重组宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞、革兰氏阴性细菌细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞、藻类细胞或酵母细胞。在另一个实施例中，重组宿主细胞选自：枯草芽孢杆菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、大肠杆菌、柠檬泛菌、里氏木霉、米曲霉和黑曲霉、酿酒酵母和解脂耶氏酵母。
在另一个方面，本发明提供了产生异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在适于产生异戊二烯的条件下培养上述列出的和本文描述的任何重组细胞以及(b)产生异戊二烯。在另一个方面，本发明提供了产生类异戊二烯前体的方法，所述方法包括：(a)在适于产生类异戊二烯前体的条件下培养上述列出的和本文描述的任何重组细胞以及(b)产生类异戊二烯前体。在另一个方面，本发明提供了产生类异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在适于 产生类异戊二烯的条件下培养上述列出的和本文描述的任何重组细胞以及(b)产生类异戊二烯。
在一些方面，重组细胞包含编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸和编码一种或多种MVA途径酶的一种或多种核酸。在一些方面，重组细胞包含编码能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的多肽的异源核酸，其中乙酰磷酸转化为甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯。在其他方面，重组细胞包含编码能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的多肽的异源核酸，其中乙酰磷酸转化为甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯。
因此，在某些方面，本发明提供能够提高甲羟戊酸产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及编码MVA上游途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽和甲羟戊酸的产生。在某些实施例中，与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产甲羟戊酸细胞相比，所述细胞产生的甲羟戊酸量增加。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌(Ferrimonas balearica)、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在其他方面，本发明提供能够产生类异戊二烯前体的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中所述重组 细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽和类异戊二烯前体的产生。在某些实施例中，与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯前体细胞相比，所述细胞产生的类异戊二烯前体量增加。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在其他方面，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽和异戊二烯的产生。在某些实施例中，本发明提供能够提高异戊二烯产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的异戊二烯量增加。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例 中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在其他方面，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽的产生，其中所述细胞能够产生可回收量的类异戊二烯。在某些实施例中，本发明提供能够提高类异戊二烯产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的类异戊二烯量增加。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在本文的任何方面，类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在一个方面，类异戊二烯是倍半萜。在另一个方面，类异戊二烯选自：松香二烯、紫穗槐二烯、 蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。
在某些实施例中，能够产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的重组细胞包含编码能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸。在一个方面，所述编码能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸是磷酸酮醇酶基因。在另一个方面，磷酸酮醇酶基因是来自乳杆菌(Lactobacillus)的基因。在另一个方面，磷酸酮醇酶基因来自罗伊氏乳杆菌属。在另一个方面，磷酸酮醇酶基因编码具有如下氨基酸序列的蛋白质：MAVDYDSKKYLESVDAYWRAANYLSVGTLYLMGDPLLRQPLKAEDVK PKPIGHWGTIVPQNFIYAHLNRVIKKYDLDMFYIEGSGHGGQVMVNNSY LDGSYTEIYPEYTQDTKGMAKLFKHFSFPGGTASHAAPETPGSIHEGGEL GYSLSHGVGAILDNPEVIAAVEIGDGEAETGPLMASWFSDKFINPIKDGA VLPIIQVNGFKISNPTILSWMSDEELTKYFEGMGWKPYFVSAYKEADRDG EFKGYKPHMEVHEEMAKTLDKVVEEIKAIQKNARENNDNSLPQWPMIIF RAPKGWTGPKTDLDGNPIENSFRAHQIPVPVSQDDMEHKDILVDWLKSY KPEELFDEDGHPVALVEENTPEGNRRMAMNPITNGGIDPKPLVLPNYRDF AIDVQNPGSVVKQDMLEWGKYLNKMAELNPTNFRGFGPDESKSNRLYA FLDGQKRQWMESVHEPNDEDVAPQGRMIDSQLSEHQAEGFLEGYTLTG RHGFFATYEAFGRVVDSMLTQHMKWLRKAKDLYWRHQYPALNFVDTS TVFQQDHNGYTHQDPGLLTHLFEKERPDLVKEYLPADTNSLMAVSNKAF RNQECINLFVTSKHPRAQWFSIDEATQLADNGLGYIDWASTDQGTEPDV VFASSGTEPTEEALAAIDILHDNFPELKIRYINIIEIMRLMNTDKNPEGLTD AEFNSYFTTDKPVIFAWHGFRDMIQALFFDRANRNVHIHSYEENGDITTPF DMRVLNELDRFHLAKDAIQSVPGYEQKSAAFVAKMDNMINKHNHYIRS EGKDLPEVTNWTWKGLK(SEQ ID NO:2)。
在其他实施例中，能够产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的重组细胞包含编码能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸。在一个方面，所述编码能够从 果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸是磷酸酮醇酶基因。在另一个方面，磷酸酮醇酶基因是来自双歧杆菌(Bifidobacterium)的基因。在另一个方面，磷酸酮醇酶基因来自长双歧杆菌属婴儿亚种。在另一个方面，磷酸酮醇酶基因编码具有如下氨基酸序列的蛋白质：
MTSPVIGTPWKKLSAPVSEEALEGVDKYWRVANYLSIGQIYLRSNPLMK EPFTREDVKHRLVGHWGTTPGLNFLIGHINRFIADHGQNTVIIMGPGHGG PAGTSQSYLDGTYTETFPKITKDEAGLQKFFRQFSYPGGIPSHFAPETPGSI HEGGELGYALSHAYGAIMDNPSLFVPAIVGDGEAETGPLATGWQSNKLV NPRTDGIVLPILHLNGYKIANPTILSRISDEELHEFFHGMGYEPYEFVAGFD DEDHMSIHRRFAELWETIWDEICDIKATAQTDNVHRPFYPMLIFRTPKGW TCPKYIDGKKTEGSWRSHQVPLASARDTEAHFEVLKNWLESYKPEELFD ANGAVKDDVLAFMPKGELRIGANPNANGGVIRDDLKLPNLEDYEVKEV AEFGHGWGQLEATRSLGAYTRDIIKNNPRDFRIFGPDETASNRLQASYEV TNKQWDAGYISDEVDEHMRVSGQVVEQLSEHQMEGFLEAYLLTGRHGI WSSYESFVHVIDSMLNQHAKWLEATVREIPWRKPIASMNLLVSSHVWRQ DHNGFSHQDPGVTSVLLNKCFHNDHVIGIYFATDANMLLAIAEKCYKST NKINAIIAGKQPAAT
WLTLDEARAELEKGAAAWDWASTAKTNDEAEIVLAAAGDVPTQEIMAA SDKLKELGIKFKVVNVVDLLSLQSAKENDEALSNEEFADIFTADKPVLFA YHSYAHDVRGLIYDRPNHDNFNVHGYEEEGSTTTPYDMVRVNRIDRYEL TAEALRMIDADKYADKIDELEKFRDEAFQFAVDKGYDHPDYTDWVYSG VNTGKKGAVTATAATAGDNE(SEQ ID NO:4)。
在一个方面，本文描述的发明提供能够产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的重组细胞，所述重组细胞包含编码能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种异源核酸以及编码如下肽的一种或多种核酸：(a)从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的肽；(b)一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽；其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽的产生以及甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的合成。在一个方面，所述编码能 够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸是磷酸酮醇酶基因。在一个方面，从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的肽是来源于链霉菌(Streptomyces sp.)CL190的肽。在一个方面，从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的肽是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的肽。
在另一个方面，本发明提供能够产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯异戊二烯的重组细胞，所述重组细胞包含编码能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种异源核酸以及编码如下肽的一种或多种核酸：(a)从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的肽；(b)一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽；其中所述重组细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽的产生以及甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的合成。在一个方面，所述编码能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸是磷酸酮醇酶基因。在一个方面，从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的肽是来源于链霉菌CL190的肽。在一个方面，从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的肽是具有SEQ ID NO:5的酸序列的肽。
在另一个方面，所述编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列并且具有从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的功能的多肽。在某些实施例中，所述编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸编码与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。在另一个方面，所述编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸编码具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有80％或更多同一性的氨基酸序列并且具有从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的功能的多肽。在某些实施例中，所述编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸编码与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。
在本文的任何方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸是植物异戊二烯合酶多肽。在本文的任何方面，该异戊二烯合酶多肽是来自葛属或杨属或杂种银白杨x欧洲山杨的多肽。在本文的任何方面，该异戊二烯合酶多肽选自：山葛或野葛、美洲山杨、银白杨、黑杨和毛果杨。在另一个方面，植物异戊二烯合酶多肽为葛(kudzu)异戊二烯合酶多肽。在另一个方面，异戊二烯合酶是经工程改造的异戊二烯合酶，例如美国专利公布No.2010/0003716和美国专利公布No.2011/0076743中描述的那些。
在本文的任何方面，本发明提供重组宿主细胞或其子代，其包括经工程改造以用于增加碳流向甲羟戊酸产生的细胞，其中对一个或多个选自如下的酶的活性进行调节：(a)柠檬酸合酶；(b)磷酸转乙酰酶；(c)乙酸激酶；(d)乳酸脱氢酶；(e)甘油醛-3-磷酸脱氢酶、(f)丙酮酸脱氢酶、(g)磷酸葡糖酸脱水酶、(h)2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶、(i)磷酸果糖激酶、(j)转酮醇酶、(k)转醛醇酶、(l)核酮糖-5-磷酸表异构酶和/或(m)核糖-5-磷酸表异构酶。
在本文的任何方面，细胞还可包含mvaE基因和mvaS基因，其选自：(a)来自格雷氏李斯特菌(L.grayi)的mvaE基因和mvaS基因；(b)来自屎肠球菌(E.faecium)的mvaE基因和mvaS基因；(c)来自鹑鸡肠球菌的mvaE基因和mvaS基因；(d)来自酪黄肠球菌(E.casseliflavus)的mvaE基因和mvaS基因；以及(e)来自粪肠球菌(E.faecalis)的mvaE基因和mvaS基因。
在某些方面，编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为异源核酸。在其他方面，编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为内源性核酸的拷贝。在本文的任何方面，一个或多个MVA途径多肽可以选自(a)使两分子的乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶：(b)缩合乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(d)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；(f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶；以及(g)将异戊烯焦磷酸转化成二甲基烯丙基二磷酸的酶。在本文的任何方面，一种或多种MVA途径多肽选自(a)缩合乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A以形成HMG-CoA的酶(如HMG合酶)；(b)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸 化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。
在本文的任何方面，使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶可以选自：马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌(Streptococcus)甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)甲羟戊酸激酶多肽以及链霉菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽或布氏拟甲烷球菌(M.burtonii)甲羟戊酸激酶。在本文的任何方面，使甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶为马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶。
在本文的任何方面，重组细胞还可以包含编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的一种或多种核酸。在一个方面，编码一种或多种DXP途径多肽的一种或多种核酸为异源核酸。在另一个方面，编码一种或多种DXP途径多肽的一种或多种核酸为内源性核酸的拷贝。在另一个方面，一种或多种DXP途径多肽选自(a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、(c)4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶(MCT)、(d)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)、(e)2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶(MCS)、(f)1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(HDS)和(g)1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(HDR)。在另一个方面，DXP途径多肽为DXS。
在本文的任何方面，将一种或多种异源核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在本文的任何方面，将一种或多种异源核酸克隆进一种或多种多拷贝质粒。在本文的任何方面，将一种或多种异源核酸整合进细胞的染色体中。
在本文的任何方面，重组宿主细胞是细菌、藻类、真菌、酵母或蓝细菌细胞。在一个方面，宿主细胞是细菌细胞。在另一个方面，细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在另一个方面，细菌细胞选自：大肠杆菌、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、白色链霉菌(S.albus)、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)和产碱假单胞菌(P.alcaligenes)细胞。在另一个方面，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在另一个方面，细菌细胞是嗜酸乳杆菌细胞。在另一个方面，是藻类细胞。在另一个方面，藻类细胞选自绿藻、红藻、灰藻、chlorarachniophyte、眼虫、色藻界或沟鞭藻类。在另一个方面，宿主细胞是真菌细胞。在另一个方面，真菌细胞是丝状真菌。在另一个方面，宿主细胞是酵母细胞。在另一个方面，酵母细胞选自酵母属(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)或假丝酵母属(Candida sp.)物种。在另一个方面，酵母细胞是酿酒酵母细胞。
在另一个方面，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸以及编码如下肽的一种或多种核酸：(a)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶的一种或多种核酸；以及(b)编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的一种或多种核酸，其中所述重组宿主细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽的产生和一种或多种类异戊二烯的合成。在一个方面，(b)编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为异源核酸。在本文的任何方面，一种或多种MVA途径多肽选自：(a)将乙酰乙酰辅酶A转化成HMG-Co-A的酶；(b)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。
在另一个方面，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的多肽的一种或多种核酸以及编码如下肽的一种或多种核酸：(a)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶的一种或多种核酸；以及(b)编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的一种或多种核酸，其中所述重组宿主细胞在合适培养基中的培养提供所述多肽的产生和一种或多种类异戊二烯的合成。在一个方 面，(b)编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为异源核酸。在本文的任何方面，一种或多种MVA途径多肽选自：(a)转化乙酰乙酰辅酶A以形成HMG-Co-A的酶；(b)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成异戊烯焦磷酸的酶。
在另一个方面，本发明提供产生甲羟戊酸的方法，所述方法包括：(a)培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含一种或多种异源核酸，所述核酸编码(i)具有磷酸酮醇酶活性的多肽；(ii)以及(b)产生甲羟戊酸。在一个方面，所述方法还包括回收由重组宿主细胞产生的甲羟戊酸。在某些实施例中，与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产甲羟戊酸细胞相比，所述方法提供产生量增加的甲羟戊酸。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在其他方面，本发明提供产生类异戊二烯前体的方法，所述方法包括：(a)培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含(i)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸；(ii)以及编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，以及(b)产生类异戊二烯前体。在一个方面，所述方法还包括回收由重组宿主细胞产生的类异戊二烯。在某些实施例中，所述方法包括与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯前体细胞相比，产生的类异戊二烯前体量增加的 重组细胞。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在其他方面，本发明提供产生异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：(i)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸；(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；以及(iii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，以及(b)产生异戊二烯。在一个方面，所述方法还包括回收由重组宿主细胞产生的类异戊二烯。在某些实施例中，所述方法包括能够提高异戊二烯产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的异戊二烯量增加。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离 的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在其他方面，本发明提供产生类异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)培养重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：(i)编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸；(ii)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸；以及(iii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，以及(b)产生类异戊二烯。在一个方面，所述方法还包括回收由重组宿主细胞产生的类异戊二烯。在某些实施例中，所述方法包括能够提高类异戊二烯产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的类异戊二烯量增加。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在本文的任何方面，类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。在一个方面，类异戊二烯是倍半萜。在另一个方面，类异戊二烯选自：松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢 醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。
在另一个方面，本发明提供使用本文所述的任何重组细胞产生甲羟戊酸的方法。在另一个方面，本发明提供使用本文所述的任何重组细胞产生类异戊二烯前体的方法。在另一个方面，本发明提供使用本文所述的任何重组细胞产生异戊二烯的方法。在另一个方面，本发明提供使用本文所述的任何重组细胞产生类异戊二烯前体的方法。在另一个方面，本发明提供使用本文所述的任何重组细胞产生类异戊二烯的方法。
附图说明
图1示出了大肠杆菌中葡萄糖代谢的代谢途径。其示出了ATP或NADH产生或使用相关的反应以及碳通量涉及的关键酶。缩写词‘P5P’表示由木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸组成的代谢物库。缩写词‘丙糖-3P’表示由甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸组成的代谢物库。
图2示出了磷酸酮醇酶(PKT)存在的工程改造代谢途径。PKT根据底物偏好性分为两种类型：木酮糖-5-磷酸(X5P)磷酸酮醇酶(EC4.1.2.9)，仅作用于X5P；以及木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸(F6P)磷酸酮醇酶(EC4.1.2.22)，作用于X5P和F6P二者，具有类似的活性。由PKT催化反应中的F6P和/或X5P形成的乙酰磷酸(Ac-P)随后转化为乙酰辅酶A，用于MVA途径。PKT催化反应的其他产物，即分别由X5P和F6P产生的甘油醛-3-磷酸(GAP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)可通过操纵代谢途径循环，以使产率最大化。
图3示出了涉及磷酸酮醇酶反应物和产物的反应。反应(1)和(2)示出了磷酸酮醇酶催化的反应。反应(3)示出了乙酰基-P至乙酰辅酶A的转化，其由磷酸转乙酰酶(pta)催化。
图4是包含磷酸酮醇酶多肽的代表性列表的表。该表仅仅是代表性的，而不旨在进行限制，因为可将木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸和/或将果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的任何磷酸酮醇酶多肽设想用于本发明。
图5示出了其中磷酸酮醇酶催化反应(PKT)中生成的赤藓糖-4-磷酸(E4P)和葡萄糖-3-磷酸(G3P)通过景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶/果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(SFA)和景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶/果糖-1,6-二磷酸磷酸酶(SFP)转化回PKT底物的工程改造途径。该图中使用的其他缩写词表示木酮糖-5-磷酸(X5P)、景天庚酮糖-1,7-二磷酸(S1,7BP)、景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)、果糖-1,6-二磷酸(F1,6BP)、果糖-6-磷酸(F6P)、二羟丙酮磷酸(DHAP)。X表示减弱或缺失的酶促反应。
图6示出了表达婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)磷酸酮醇酶的pCMP1090质粒图谱。
图7示出了表达罗伊氏乳杆菌磷酸酮醇酶的pCMP1029质粒图谱。
图8示出了表达来自婴儿双歧杆菌或罗伊氏乳杆菌以及对照菌株的磷酸酮醇酶的细胞内乙酰磷酸(mM)的结果。
图9示出了表达来自婴儿双歧杆菌或罗伊氏乳杆菌以及对照菌株的磷酸酮醇酶的菌株的生长曲线(测量作为时间函数的OD)。
图10示出了表达来自婴儿双歧杆菌或罗伊氏乳杆菌以及对照菌株的磷酸酮醇酶的菌株摇瓶中的甲羟戊酸浓度(g/L)。
图11示出了在15L发酵中与对照菌株(空心菱形)相比，磷酸酮醇酶表达菌株(实心黑方框)实现的从葡萄糖产生甲羟戊酸的产率随时间推移的变化。菌株在相同的条件下运行。使用下式计算总产率：从葡萄糖产生的％重量产率＝甲羟戊酸总量(t)/[(料Wt(0)-料Wt(t)+83)*0.59)]，其中0.59为葡萄糖料液中葡萄糖的重量％，83为在t＝0时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。
图12示出了在15L发酵中与对照菌株(空心菱形)相比，磷酸酮醇酶表达菌株(实心黑方框)实现的甲羟戊酸滴度随时间推移的变化。菌株在相同的条件下运行。使用下式计算滴度：滴度＝甲羟戊酸克数/整个发酵液升数。
图13示出了在15L发酵中与对照菌株(空心菱形)相比，磷酸酮醇酶表达菌株(实心黑方框)实现的细胞生产力指数(CPI)随时间推移的变化。菌株在相同的条件下运行。使用下式计算细胞生产力指数(CPI)：CPI＝甲羟戊酸总克数/干细胞重量总克数。
图14提供了曲线图，其示出了在15L发酵中与对照菌株(空心菱形)相比，使用磷酸酮醇酶表达菌株(实心黑方框)时，随时间推移发酵液中积聚的乙酸明显较低。菌株在相同的条件下运行。乙酸通过HPLC测量，并且使用下式报道浓度：[乙酸]＝乙酸克数/整个发酵液升数。
图15提供了编码来自罗伊氏乳杆菌的磷酸酮醇酶的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图16提供了来自罗伊氏乳杆菌的磷酸酮醇酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图17提供了编码来自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
图18提供了来自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图19提供了来自链霉菌CL190的乙酰乙酰辅酶A合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图20提供了编码来自格雷氏李斯特菌的mvaE的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。
图21提供了编码来自屎肠球菌的mvaE的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。
图22提供了编码来自鹑鸡肠球菌的mvaE的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。
图23提供了编码来自酪黄肠球菌的mvaE的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。
图24提供了编码来自格雷氏李斯特菌的mvaS的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。
图25提供了编码来自屎肠球菌的mvaS的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。
图26提供了编码来自鹑鸡肠球菌的mvaS的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:12)。
图27提供了编码来自酪黄肠球菌的mvaS的核酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。
图28提供了pCMP1090的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。
图29提供了pCMP1029的核苷酸序列(SEQ ID NO:16)。
图30提供了编码来自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:17)。
图31提供了编码来自点形念珠藻的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:18)。
图32提供了编码来自沼泽红假单胞菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:19)。
图33提供了编码来自泛菌属的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:20)。
图34提供了编码来自梭状冻胶样杆菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:21)。
图35提供了编码来自嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:22)。
图36提供了编码来自短双歧杆菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:23)。
图37提供了编码来自水生拉恩氏菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:24)。
图38提供了编码来自动物双歧杆菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:25)。
图39提供了编码来自阴道加德纳菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:26)。
图40提供了编码来自除虫链霉菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:27)。
图41提供了编码来自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:28)。
图42提供了编码来自类植物乳杆菌(L.paraplantarum)的磷酸酮醇酶的核酸序列(SEQ ID NO:29)。
图43是曲线图，其示出了在F6P底物的存在下来自长双歧杆菌和鹑鸡肠球菌的PKL的活性。
图44是曲线图，其示出了在F6P和X5P底物的存在下来自鹑鸡肠球菌的PKL的活性。
图45是曲线图，其示出了在S7P底物的存在下表达长双歧杆菌PKL的菌株形成的代谢物。
图46是曲线图组，其示出了与不表达PKL的对照菌株(CHL875)相比，表达长双歧杆菌PKL的菌株(EWL1319)、表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株(EWL1341)、表达点形念珠藻PKL的菌株(EWL1344)、表达沼泽红假单胞菌PKL的菌株(EWL1347)、表达泛菌属PKL的菌株(EWL1350)或表达嗜热裂孢菌PKL的菌株(EWL1353)的MVA产率。
图47是一系列SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶，其示出了表达磷酸酮醇酶的菌株中的蛋白质表达。A)不表达PKL的对照菌株CHL875和表达长双歧杆菌PKL的菌株EWL1319，B)表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株EWL1341和表达点形念珠藻PKL的菌株EWL1344，C)表达沼泽红假单胞菌PKL的菌株EWL1347和表达泛菌属PKL的菌株EWL1350，以及D)表达嗜热裂孢菌PKL的菌株EWL1353，其中IPTG诱导增加。
图48是曲线图，其示出了表达长双歧杆菌PKL的菌株的蛋白质表达和MVA产率。A)与不表达PKL的产MVA对照菌株(实心菱形)相比，表达长双歧杆菌PKL的产MVA菌株(实心方框)的MVA产率，其中IPTG诱导增加。B)来自菌株EWL1319的全细胞裂解物的可溶性级分中长双歧杆菌PKL的蛋白质表达。C)来自菌株EWL1319的全细胞裂解物的不溶性级分中长双歧杆菌PKL的蛋白质表达。
图49包含SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶以及示出表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株的蛋白质表达和MVA产率的曲线图。A)与不表达PKL的产MVA对照菌株(实心菱形)相比，表达鹑鸡肠球菌PKL的产MVA菌株(实心方框)的MVA产率，其中IPTG诱导增加。B)来自表达鹑鸡肠球菌的菌株EWL1341的全细胞裂解物中的蛋白质表达。
图50包含SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶以及示出表达丙酮丁醇梭菌PKL的菌株的蛋白质表达和MVA产率的曲线图。A)与不表达PKL的产MVA对照菌株(实心菱形)相比，表达丙酮丁醇梭菌PKL的产MVA菌 株(实心方框)的MVA产率，其中IPTG诱导增加。B)来自表达丙酮丁醇梭菌的菌株EWL1341的全细胞裂解物中的蛋白质表达。
图51是曲线图，其示出了每个15L发酵中表达丙酮丁醇梭菌PKL的菌株实现的从葡萄糖产生MVA的累积产率随时间推移的变化。实心圆圈表示运行20121058：EWL1359在400μM IPTG下诱导；x符号表示运行20121057：EWL1359在100μM IPTG下诱导；空心三角形表示运行20121056：EWL1359不添加IPTG；以及空心菱形表示运行20121059：CHL875在100μM IPTG下诱导。
图52是曲线图，其示出了每个15L发酵中表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株实现的从葡萄糖产生MVA的累积产率随时间推移的变化。实心方框表示运行20120979：EWL1341在100μM IPTG下诱导；x符号表示运行20120978：EWL1341在50μM IPTG下诱导；空心方框表示运行20120977：EWL1341不添加IPTG；空心菱形表示运行20120976：CHL875不添加IPTG；以及实心菱形表示运行20120821：CHL875不添加IPTG。
图53是示出表达鹑鸡肠球菌PKL或丙酮丁醇梭菌PKL的菌株实现的从葡萄糖产生MVA的累积产率对添加的IPTG量绘制的曲线图。实心三角形表示菌株EWL1359。实心方框表示菌株EWL1341。空心菱形表示菌株CHL875。
图54是示出表达鹑鸡肠球菌PKL或丙酮丁醇梭菌PKL的菌株实现的从葡萄糖产生MVA的累积产率对磷酸酮醇酶活性绘制的曲线图。实心三角形表示菌株EWL1359。实心方框表示菌株EWL1341。空心菱形表示菌株CHL875。
图55是曲线图，其示出了每个15L发酵中表达丙酮丁醇梭菌PKL的菌株实现的细胞性能指数随时间推移的变化。实心圆圈表示运行20121058：EWL1359在400μM IPTG下诱导；x符号表示运行20121057：EWL1359在100μM IPTG下诱导；空心三角形表示运行20121056：EWL1359不添加IPTG；以及空心菱形表示运行20121059：CHL875在100μM IPTG下诱导。
图56是曲线图，其示出了每个15L发酵中表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株实现的细胞性能指数随时间推移的变化。实心方框表示运行20120979：EWL1341在100μM IPTG下诱导；x符号表示运行20120978：EWL1341在50μM IPTG下诱导；空心方框表示运行20120977：EWL1341不添加IPTG；空心菱形表示运行20120976：CHL875不添加IPTG；以及实心菱形表示运行20120821：CHL875不添加IPTG。
图57示出了表达长双歧杆菌磷酸酮醇酶和银白杨异戊二烯合酶变体的pEWL1418质粒图谱。
图58示出了表达鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶和银白杨异戊二烯合酶变体的pEWL1421质粒图谱。
图59示出了表达鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶、银白杨异戊二烯合酶变体以及马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶的pEWL1438质粒图谱。
图60示出了表达丙酮丁醇梭菌磷酸酮醇酶和银白杨异戊二烯合酶变体的pEWL1436质粒图谱。
图61示出了表达丙酮丁醇梭菌磷酸酮醇酶、银白杨异戊二烯合酶变体以及马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶的pEWL1440质粒图谱。
图62是曲线图组，其示出了表达磷酸酮醇酶菌株的异戊二烯产率。A)表达长双歧杆菌PKL的菌株(菌株EWL1427)或表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株(菌株EWL1430)的异戊二烯产率。B)表达丙酮丁醇梭菌PKL的菌株(EWL1446)的异戊二烯产率。对照菌株MCM2158不表达PKL。
图63是一系列SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶，其示出了IPTG诱导的蛋白质表达。A)表达长双歧杆菌PKL的菌株(EWL1427)或表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株(EWL1430)。B)表达丙酮丁醇梭菌PKL的菌株(EWL1446)。对照菌株MCM2158不表达PKL。
图64包含SDS-PAGE考马斯亮蓝染色凝胶以及示出表达PKL的菌株的蛋白质表达和异戊二烯产率的曲线图。A)与不表达PKL的产MVA对照菌株(菌株DW719)相比，表达鹑鸡肠球菌PKL的产异戊二烯菌株(菌株EWL1449)或表达丙酮丁醇梭菌PKL的产异戊二烯菌株(EWL1452)的异戊二烯产率，其中IPTG诱导增加。B)来自菌株EWL1452和EWL1449的全细胞裂解物中的蛋白质表达。
图65是曲线图，其示出了每个15L发酵中表达长双歧杆菌PKL的菌株(菌株EWL1427)或表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株(菌株EWL1430)实现的从葡萄糖产生异戊二烯的累积产率随时间推移的变化。实心三角形表示运行20121136：EWL1430在100μM IPTG下诱导；实心方框表示运行20121135：EWL1427在100μM IPTG下诱导；以及空心菱形表示运行20121134：MCM2158在100μM IPTG下诱导。
图66是曲线图，其示出了每个15L发酵中表达长双歧杆菌PKL的菌株(菌株EWL1427)或表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株(菌株EWL1430)实现的从葡萄糖产生异戊二烯的瞬时产率随时间推移的变化。空心三角形表示运行20121136：EWL1430在100μM IPTG下诱导；空心方框表示运行20121135：EWL1427在100μM IPTG下诱导；以及空心菱形表示运行20121134：MCM2158在100μM IPTG下诱导。
图67是曲线图，其示出了每个15L发酵中表达长双歧杆菌PKL的菌株(菌株EWL1427)或表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株(菌株EWL1430)实现的细胞性能指数随时间推移的变化。实心三角形表示运行20121136：EWL1430在100μM IPTG下诱导；实心方框表示运行20121135：EWL1427在100μM IPTG下诱导；以及空心菱形表示运行20121134：MCM2158在100μM IPTG下诱导。gDCW表示干细胞重量总克数。
图68是一系列示出鹑鸡肠球菌PKL体外活性的曲线图。A)体外AcP比生产率。B)体外PKL比活性。
图69是一系列示出丙酮丁醇梭菌PKL体外活性的曲线图。A)体外AcP比生产率。B)体外PKL比活性。
图70是曲线图，其示出了表达长双歧杆菌PKL或鹑鸡肠球菌PKL的产异戊二烯菌株中的体外AcP比生产率。
图71是曲线图，其示出了表达长双歧杆菌PKL或鹑鸡肠球菌PKL的产异戊二烯菌株中的体外PKL活性。
图72是描述优选地上调以增加流过磷酸酮醇酶途径的碳的宿主突变的示意图。所关注的调节碳通量的基因包括核糖-5-磷酸异构酶A(rpiA)、D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶A(tktA)、转醛醇酶B(tal B)和/或磷酸乙酰转移酶(pta)。
图73是描述优选地下调以增加流过磷酸酮醇酶途径的碳的宿主突变的示意图。所关注的调节碳通量的基因包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA)、果糖二磷酸醛缩酶(fba)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(gapA)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)和/或pts操纵子。
具体实施方式
本文提供的发明公开了特别是在经工程改造以表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞中产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法。本发明的磷酸酮醇酶可使用各种底物，如下文更详细地描述。在某些实施例中，本发明提供在经工程改造以表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞中产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，所述多肽能够催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，本发明提供在经工程改造以表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞中产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，所述多肽能够催化果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，本发明提供在经工程改造以表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞中产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，所述多肽能够催化景天庚酮糖-7-磷酸转化为核糖-5-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，本发明提供在经工程改造以表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞中产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯的组合物和方法，所述多肽能够催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸和/或果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸和/或景天庚酮糖-7-磷酸转化为核糖-5-磷酸和乙酰磷酸。
重组表达的磷酸酮醇酶已用于工程改造宿主细胞中的代谢途径。参见U.S.7,785,858。Sonderegger等人(Applied and Environmental Microbiology,2004,70:5,2892-97(《应用和环境微生物学》，2004年，第70卷，第5期，第2892-2897页))描述了使用磷酸酮醇酶在酿酒酵母中超量产生乙醇。Fleige等人(Appl Microbial Biotechnol.,2011,91:3,769-76(《应用微生物学和生物技术》，2011年，第91卷，第3期，第769-776页))描述 了双歧杆菌磷酸酮醇酶基因(Meile等人，出处同上)在修饰的真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)菌株中的表达，其恢复了生物体利用果糖作为生长的唯一碳源的能力。然而，利用磷酸酮醇酶增加流入甲羟戊酸途径的碳未有所描述。
甲羟戊酸依赖性生物合成途径对于甲羟戊酸以及其他类异戊二烯前体分子，如二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)和异戊烯焦磷酸(IPP)的产生特别重要。甲羟戊酸上游途径的酶经由三个酶促反应将从葡萄糖产生的乙酰辅酶A转化成甲羟戊酸。不受理论的束缚，据信通过使用磷酸酮醇酶多肽提高乙酰辅酶A的生物合成可以使上游甲羟戊酸依赖性生物合成途径的生产率提高，这将显著提高甲羟戊酸的生物合成，并因此提高下游类异戊二烯前体分子(如DMAPP和IPP)的生物合成。该可供选择的途径产生的甲羟戊酸的产率增加因此对于商业应用是有利的。
理论上，在平衡反应中三分子乙酰辅酶A可来源于单分子葡萄糖。然而，生物体通常仅生成最多两分子乙酰辅酶A，其余质量以CO2损失。CO2的释放在丙酮酸脱氢酶催化的从丙酮酸形成乙酰辅酶A的反应期间进行。一个碳原子的损失导致甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯分子的产率降低。该反应损失的例外是Wood-Ljungdahl途径，其依赖于一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合酶以减少厌氧产乙酸菌中的二氧化碳至乙酰辅酶A转化。
本发明提供替代的代谢方法，该方法可以使用不依赖于Wood-Ljungdahl途径酶的途径，用一分子葡萄糖可能生成三分子乙酰辅酶A。相反，可以使用存在于某些生物体，特别是双歧杆菌中的磷酸酮醇酶[参见，例如，Biology of the Prokaryotes(ed.Lengeler,Drews and Schlegel)；Blackwell Science,New York,1999,p.299-301(《原核生物的生物学》，Lengeler、Drews和Schlegel编辑，布莱克韦尔科学出版社，纽约，1999年，第299-301页)；Meile et al.,J.of Bacteriology,2001,183:9,2929-36(Meile等人，《细菌学杂志》，2001年，第183卷，第9期，第2929-2936页)；Jeong et al.,J.Microbiol.Biotechnol.,2007,17:5,822-829(Jeong等人，《微生物学与生物技术杂志》，2007年，第17卷，第5期，第822-829页)]。磷酸酮醇酶允许用木酮糖5-磷酸或果糖6-磷酸(经由乙酰 磷酸)形成乙酰辅酶A，而不是通过典型代谢中的丙酮酸氧化形成乙酰辅酶A。
磷酸酮醇酶根据其底物偏好性分为两种类型：木酮糖-5-磷酸(X5P)磷酸酮醇酶，仅作用于X5P；以及X5P/果糖-6-磷酸(F6P)磷酸酮醇酶，可作用于X5P和F6P二者(Suzuki et al.,Acta Cryst.F66,2010,66:8,941-43(Suzuki等人，《晶体学报》，F66，2010年，第66卷，第8期，第941-943页))。磷酸酮醇酶催化利用无机磷酸(Pi)的X5P或F6P裂解，生成乙酰磷酸(乙酰基-P)、H2O和甘油醛-3-磷酸或赤藓糖-4-磷酸。高能代谢物乙酰基-P随后通过乙酸激酶转化为乙酸，在该途径中从ADP生成ATP。除乙酰磷酸之外，酶促反应生成的甘油醛-3-磷酸可通过操纵代谢途径循环，以实现每个葡萄糖3个乙酰辅酶A的最大产率。显著地，通过磷酸酮醇酶生成乙酰辅酶A消除了丙酮酸脱氢酶介导反应观察到的碳(如CO2)损失。
如本文进一步详述，磷酸酮醇酶还可作用于景天庚酮糖-7-磷酸，以将其转化为核糖-5-磷酸和乙酰磷酸。此类磷酸酮醇酶的非限制性例子是长双歧杆菌磷酸酮醇酶，其具有催化景天庚酮糖-7-磷酸的活性。
本发明涉及在甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的生成中使用磷酸酮醇酶，以提高产率。具体地讲，理论异戊二烯产率得以提高，如以下平衡方程所表示(假设生物体能够从1mol葡萄糖完全氧化为6mol CO2生成ATP)：
仅MVA途径
1.5葡萄糖+2.00O2→1.00异戊二烯+4.00CO2+5.00H2O
理论产率–0.252g异戊二烯/g葡萄糖
DXP途径
1.25葡萄糖+0.50O2→1.00异戊二烯+2.50CO2+3.50H2O
理论产率–0.302g异戊二烯/g葡萄糖
MVA+磷酸酮醇酶途径
1.22葡萄糖+0.33O2→1.00异戊二烯+2.33CO2+3.32H2O
理论产率–0.309g异戊二烯/g葡萄糖
因此，在某些方面，本发明提供能够提高甲羟戊酸产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及编码MVA上游途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，所述细胞产生的甲羟戊酸量增加。
在其他方面，本发明提供能够提高类异戊二烯前体产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，所述细胞产生的类异戊二烯前体量增加。
在其他方面，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞能够产生可回收量的异戊二烯。在某些实施例中，本发明提供能够提高异戊二烯产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的异戊二烯量增加。
在其他方面，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞能够产生可回收量的类异戊二烯。在某些实施例中，本发明提供能够提高类异戊二烯产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的类异戊二烯量增加。
在本文的任何方面，本发明提供重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽，并且可进一步工程改造以调节以下一种或多种基因的活性的一种或多种异源核酸以增加流过磷酸酮醇酶途径的碳，所述基因包括核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(talB)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一些实施例中，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，以及(iii)进一步经工程改造以调节一个或多个基因的活性以增加流过磷酸酮醇酶途径的碳，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的异戊二烯量增加。
在一些实施例中，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，(iii)进一步经工程改造以调节一个或多个基因的活性以增加流过磷酸酮醇酶途径的碳，以及(iv)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的类异戊二烯量增加。
通用技术
除非另外指明，否则对本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术，这些技术均为本领域的现有技术。这些技术在以下文献中有完整解释：“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook et al.,1989)(《分子克隆实验指南》，第二版，Sambrook等人，1989年)； “Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984)(《寡核苷酸合成》，M.J.Gait编辑，1984年)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,ed.,1987)(《动物细胞培养》，R.I.Freshney编辑，1987年)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)(《酶学方法》，美国学术出版社)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987,and periodic updates)(《分子生物学实验室指南》，F.M.Ausubel等人编辑，1987年，以及定期更新版本)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis et al.,eds.,1994)(《PCR：聚合酶链反应》，Mullis等人编辑，1994年)。Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)(Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》，第2版，约翰威利父子出版公司，纽约州纽约市，1994年)和March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)(March，《高等有机化学反应：机制和结构》，第4版，约翰威利父子出版公司，纽约州纽约市，1992年)为本领域技术人员提供了本专利申请使用的多个术语的一般指导。
定义
术语“异戊二烯”是指2-甲基-1,3-丁二烯(CAS#78-79-5)。其可以是由3,3-二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)消除焦磷酸所得的直接和最终的挥发性C5烃产物。其可能不涉及IPP分子与DMAPP分子的连接或聚合。除非本文中另外指明，否则术语“异戊二烯”通常不旨在受其产生方法的限制。
如本文所用，术语“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。
如本文所用，“分离的多肽”不属于多肽库的一部分，所述多肽库如2、5、10、20、50或更多不同多肽的库，分离的多肽与天然存在的多肽相差至少一种组分。分离的多肽可通过例如编码多肽的重组核酸的表达获得。
所谓“异源多肽”是指由其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞衍生的核酸序列编码的多肽。在一些实施例中，异源多肽不同于存在于自然界中相同宿主细胞内的野生型多肽。
如本文所使用，“核酸”是指以单股或双股形式共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
所谓“重组核酸”是指这样的所关注核酸，其缺少位于该所关注核酸旁侧、所关注核酸所源自的有机体的天然存在基因组中的一种或多种核酸(如，基因)。因此，该术语包括(例如)掺入载体中、掺入自主复制型质粒或病毒中、或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中，或者独立于其他序列作为单独分子(如，cDNA、通过PCR或限制性核酸内切酶消化制备的基因组DNA片段或cDNA片段)存在的重组DNA。
所谓“异源核酸”是指由其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞衍生的核酸序列。在一些实施例中，异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内的野生型核酸。例如，由来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌的磷酸酮醇酶基因编码并且用于转化大肠杆菌的核酸是异源核酸。
如本文所用，术语“磷酸酮醇酶”或“磷酸酮醇酶多肽”可互换使用，是指将5-磷酸转化成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸和/或将果糖-6-磷酸转化成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的多肽。一般来讲，磷酸酮醇酶作用于酮糖。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽催化果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽催化景天庚酮糖-7-磷酸转化为产物(如，核糖-5-磷酸)和乙酰磷酸。
如本文所用，“表达控制序列”意指引导所关注核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以为启动子(例如组成型或诱导型启动子)或增强子。表达控制序列可以是“天然的”或异源的。天然的表达控制序列衍生自与所表达基因相同的生物体、物种或株系。异源表达控制序列衍生自与所表达基因不同的生物体、物种或株系。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下具有活性的启动子。
所谓“有效连接的”意指核酸表达控制序列(例如启动子)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中该表达控制序列引导对应于该第二序列的核酸的转录。
如本文所用，术语“基本培养基”是指含有细胞生长可能所需的最少营养物、通常不存在氨基酸的生长培养基。基本培养基通常含有：(1)用于细菌生长的碳源；(2)各种盐，其可因细菌物种和生长条件而变动；和(3)水。从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的较复杂水解产物如酵母提取物，碳源可以有很大变化，如下文更详细论述的。盐通常提供必需元素如镁、氮、磷和硫以允许细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充有选择剂，例如抗生素，以针对某些质粒的维持等进行选择。例如，如果微生物对某一抗生素例如氨苄青霉素或四环素具有抗性，则可将该抗生素添加至培养基以便防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可在必要时补充有其他化合物以选择所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
如本文所用，术语“类异戊二烯”是指数量大且多样的一类天然存在的一类有机化合物，其由两个或更多个烃单元构成，每个单元由以特定模式排列的五个碳原子组成。如本文所用，明确地将“异戊二烯”从“类异戊二烯”的定义中排除。
如本文所用，术语“萜类化合物”是指数量大且多样的一类有机分子，该分子衍生自以多种方式组装和修饰并且根据组成员中所用的类异戊二烯单元的数目分组的五碳类异戊二烯单元。半萜类化合物具有一个类异戊二烯单元。单萜类化合物具有两个类异戊二烯单元。倍半萜类化合物具有三个类异戊二烯单元。二萜类化合物具有四个异戊二烯单元。二倍半萜类具有五个类异戊二烯单元。三萜类化合物具有六个类异戊二烯单元。四萜类化合物具有八个类异戊二烯单元。多萜类化合物具有超过八个类异戊二烯单元。
如本文所用，“类异戊二烯前体”是指生物体用于萜类化合物或类异戊二烯的生物合成的任何分子。类异戊二烯前体分子的非限制性例子包括例如甲羟戊酸(如，甲羟戊酸(MVA))、异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。
如本文所用，术语“质量产率”是指以百分比表示的由重组细胞产生的产物质量除以重组细胞消耗的葡萄糖的质量。
所谓“比生产率”，其意指重组细胞所生成的产物的质量除以产生产物的时间、细胞密度和培养物体积。
所谓“滴度”，其意指重组细胞所产生的产物的质量除以培养物的体积。
如本文所用，术语“细胞生产力指数(CPI)”是指重组细胞所产生的产物的质量除以培养物中产生的重组细胞的质量。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。
如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
在本说明书通篇中给出的每一个上限值旨在包括每一个下限值，就如同此类下限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个下限值将包括每一个上限值，就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
表达磷酸酮醇酶多肽和MVA途径的一种或多种多肽的重组细胞
甲羟戊酸依赖性生物合成途径(MVA途径)是所有高等真核生物和某些细菌中存在的关键代谢途径。除了对蛋白质异戊二烯化、细胞膜维持、蛋白质锚定和N-糖基化等各种各样的过程中所用的分子的产生是重要的外，甲羟戊酸途径还提供类异戊二烯前体分子DMAPP和IPP的主要来源，这些分子充当萜烯、萜类化合物、类异戊二烯和异戊二烯的生物合成的基础。
完整MVA途径可分为两组：上游和下游途径。在MVA途径的上游部分，细胞代谢期间产生的乙酰辅酶A经由具有下列任一活性的多肽的作用转化为甲羟戊酸：(a)(i)硫解酶活性或(ii)乙酰乙酰辅酶A合酶活性，(b)HMG-CoA还原酶，以及(c)HMG-CoA合酶酶活性。首先，通过硫解酶或乙酰乙酰辅酶A合酶(其使用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)的作用将乙酰 辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A。接下来，通过HMG-CoA合酶的酶促作用将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)。该辅酶A衍生物通过HMG-CoA还原酶还原成甲羟戊酸，这是产生类异戊二烯的甲羟戊酸途径的限速步骤。在MVA下游途径中，甲羟戊酸然后经由甲羟戊酸激酶的作用转化为甲羟戊酸-5-磷酸，其随后通过磷酸甲羟戊酸激酶的酶活性转化为5-二磷酸甲羟戊酸。最后，通过甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶的酶活性由5-二磷酸甲羟戊酸形成IPP。
因此，在某些实施例中，本发明的重组细胞是能够经由MVA途径产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯的重组细胞，其中所述重组细胞包含：(i)编码能够从木酮糖-5-磷酸合成甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸的磷酸酮醇酶的异源基因，(ii)编码一种或多种MVA多肽的一个或多个异源基因，以及(iii)涉及甲羟戊酸、类异戊二烯前体或异戊二烯或类异戊二烯生物合成的一个或多个异源基因，其允许在宿主细胞中从乙酰乙酰辅酶A合成甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯。在其他实施例中，本发明的重组细胞是能够产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯的重组细胞，其中所述重组细胞包含：(i)编码能够从果糖-6-磷酸合成赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸的磷酸酮醇酶的异源基因，(ii)编码一种或多种MVA多肽的一个或多个异源基因，以及(iii)涉及甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯生物合成的一个或多个异源基因，其允许在宿主细胞中从乙酰乙酰辅酶A合成甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯或类异戊二烯。
示例性磷酸酮醇酶多肽和核酸
磷酸酮醇酶催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸和/或催化果糖-6-磷酸转化为赤藓糖4-磷酸和乙酰磷酸。在某些实施例中，磷酸酮醇酶能够催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶能催化果糖-6-磷酸转化为赤藓糖4-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽催化景天庚酮糖-7-磷酸转化为产物(如，核糖-5-磷酸)和乙酰磷酸。因而，不受理论的约束，本文所示的磷酸酮醇酶的表达可导致从碳水化合物源产生的乙酰磷酸的量增加。该乙酰磷酸可转化成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A然后可被MVA途径的酶活性利用 来产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯。因而可以增加从碳水化合物底物产生的这些化合物的量。或者，乙酰基-P和乙酰辅酶A的产量可以增加而该增加不反映在较高的细胞内浓度方面。在某些实施例中，细胞内乙酰基-P或乙酰辅酶A浓度将保持不变或甚至降低，尽管磷酸酮醇酶反应正在进行。
示例性的磷酸酮醇酶核酸包括编码具有磷酸酮醇酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性磷酸酮醇酶多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然多肽和核酸以及来源于本文所述的任何来源生物体的突变多肽和核酸(参见例如图4)。另外，表1提供了可用于本发明的实施例的某些示例性磷酸酮醇酶的物种和生物化学特性的非限制性列表。
示例性磷酸酮醇酶的生物化学特性包括但不限于蛋白质表达、蛋白质溶解度和活性。磷酸酮醇酶也可根据其他特性选择，包括但不限于在不同类型生物体(如，革兰氏阳性菌、蓝细菌、放线菌)中的多样性，兼性低温需氧微生物、与所需物种(如，大肠杆菌)的密切亲缘关系以及耐热性。
如本文所提供，磷酸酮醇酶活性可增加类异戊二烯前体(如，甲羟戊酸)、异戊二烯和/或类异戊二烯的产量。本文提供了包含磷酸酮醇酶的重组宿主，其中所述细胞显示出至少一种所关注的特性，以增加类异戊二烯前体(如，甲羟戊酸)、异戊二烯和/或类异戊二烯的产量。在一些方面，至少一种所关注的特性选自但不限于：比生产率、产率、滴度和细胞性能指数。
在某些实施例中，本文所用的合适磷酸酮醇酶包括可溶性磷酸酮醇酶。测量蛋白质溶解度的技术是本领域熟知的。测量蛋白质溶解度的技术包括本文实例中公开的那些。在一些实施例中，本文所用的磷酸酮醇酶包括溶解度为至少20％的那些。在一些实施例中，磷酸酮醇酶溶解度在约5％至约100％的任何一者之间，在约10％至约100％之间、在约15％至约100％之间、在约20％至约100％之间、在约25％至约100％之间、在约30％至约100％之间、在约35％至约100％之间、在约40％至约100％之间、在约45％至约100％之间、在约50％至约100％之间、在约55％至约 100％之间、在约60％至约100％之间、在约65％至约100％之间、在约70％至约100％之间、在约75％至约100％之间、在约80％至约100％之间、在约85％至约100％之间或在约90％至约100％之间，在一些实施例中，磷酸酮醇酶溶解度在约5％至约100％之间。在一些实施例中，溶解度在5％和100％之间。在一些实施例中，磷酸酮醇酶溶解度小于约100、90、80、70、60、50、40、30、20或10的任何一者，但不小于约5％。在一些实施例中，溶解度大于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％的任何一者。
具有所需动力学特性的磷酸酮醇酶增加了异戊二烯的产量。动力学特性包括但不限于比活性Kcat、Ki和Km。在一些方面，kcat为至少约0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.1、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、20.0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700或800。在其他方面，kcat为至少约0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.1、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4或16.6。
在一些方面，Km为至少约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5或56。在其他方面，km为至少约2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、16、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5或22。
所关注的性质包括但不限于：与不包含磷酸酮醇酶多肽的重组细胞相比，细胞内活性、比生产率、产率和细胞性能指数增加。在一些实施例中，比生产率增加至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多。在一个实施例中，比生产率为约40mg/L/OD/hr。在一些实施例中，产率增加至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍或更多。在其他实施例中，MVA产率增加至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍或更多。在其他实施例中，异戊二烯产率增加至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍或更多。在其他实施例中，细胞性能指数增加至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍或更多。在其他实施例中，细胞内活性增加至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多。
表1：文献中报道的磷酸酮醇酶的动力学特性
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其他可使用的磷酸酮醇酶包括但不限于：长双歧杆菌、植物乳杆菌、丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、类植物乳杆菌、沼泽红假单胞菌、点形念珠藻、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、阴道加德纳菌、鹑鸡肠球菌、梭状冻胶样杆菌、泛菌属、水生拉恩氏菌、点形念珠藻、除虫链霉菌和嗜热裂孢菌。
可以用标准方法通过测量肽将D-果糖6-磷酸或D-木酮糖5-磷酸转化成乙酰基-P的能力来确定多肽是否具有磷酸酮醇酶肽活性。然后可以将乙酰基-P转化成二茂铁乙酰基氧肟酸(ferryl acetyl hydroxamate)，可以用分光光度法对其进行检测(Meileet al.，J.Bact.183:2929-2936,2001(Meile等人，《细菌学杂志》，第183卷，第2929-2936页，2001年))。如本文所述的鉴定为具有磷酸酮醇酶肽活性的任何多肽均适合用于本发明。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽催化果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽能够催化景天庚酮糖-7-磷酸转化为核糖-5-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽催化木酮糖-5-磷酸转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸和/或果糖-6-磷酸转化为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸和/或景天庚酮糖-7-磷酸转化为核糖-5-磷酸和乙酰磷酸。
本文提供从微生物分离的磷酸酮醇酶。在一些方面，磷酸酮醇酶从选自革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、需氧细菌、厌氧细菌、嗜热细菌、嗜冷细菌、嗜盐细菌或蓝细菌的微生物分离。在一些方面，磷酸酮醇酶从真菌分离。在其他方面，示例性磷酸酮醇酶核酸包括例如分离自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌的磷酸酮醇酶。在其他方面，示例性磷酸酮醇酶核酸包括例如分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德 纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶。在其他方面，示例性磷酸酮醇酶核酸包括例如分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶。在本文描述的任何方面，磷酸酮醇酶核酸可具有与本文描述的任何磷酸酮醇酶核酸序列至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。罗伊氏乳杆菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:1至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。长双歧杆菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:3至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:17至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。点形念珠藻磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:18至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。沼泽红假单胞菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:19至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。泛菌属磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:20至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。梭状冻胶样杆菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:21至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。嗜热裂孢菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:22至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。短双歧杆菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:23至少约99％、98％、 97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。水生拉恩氏菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:24至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。动物双歧杆菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:25至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。阴道加德纳菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:26至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。除虫链霉菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:27至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。丙酮丁醇梭菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:28至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。类植物乳杆菌磷酸酮醇酶基因编码的磷酸酮醇酶核酸可具有与SEQ ID NO:29至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。
在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与罗伊氏乳杆菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:1编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与长双歧杆菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:3编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:17编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与点形念珠藻磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:18编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、 91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与沼泽红假单胞菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:19编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与泛菌属磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:20编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与梭状冻胶样杆菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:21编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与嗜热裂孢菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:22编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与短双歧杆菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:23编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与水生拉恩氏菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:24编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与动物双歧杆菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:25编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与阴道加德纳菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:26编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与除虫链霉菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:27编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有 与丙酮丁醇梭菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:28编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在一些实施例中，磷酸酮醇酶多肽可具有与类植物乳杆菌磷酸酮醇酶核酸序列SEQ ID NO:29编码的磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。在本文描述的任何方面，磷酸酮醇酶多肽可具有与本文描述的任何磷酸酮醇酶核酸序列编码的任何磷酸酮醇酶多肽至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。
本文可使用的磷酸酮醇酶的另外例子在U.S.7,785,858和WO2011/159853中有所描述，这些专利以引用方式并入，尤其是针对关于磷酸酮醇酶的所有公开内容。
MVA上游途径多肽
MVA途径的上游部分使用在细胞代谢过程中产生的乙酰辅酶A作为初始底物，通过具有下列任一活性的多肽的作用转化成甲羟戊酸：(a)(i)硫解酶活性或(ii)乙酰乙酰辅酶A活性，(b)HMG-CoA还原酶，以及(c)HMG-CoA合酶酶活性。首先，通过硫解酶或乙酰乙酰辅酶A合酶(其使用乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)的作用将乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A。接下来，通过HMG-CoA合酶的酶促作用将乙酰乙酰辅酶A转化成3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)。该辅酶A衍生物通过HMG-CoA还原酶还原成甲羟戊酸，这是产生类异戊二烯的甲羟戊酸途径的限速步骤。
MVA上游途径多肽的非限制性例子包括乙酰辅酶A乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、乙酰乙酰辅酶A合酶多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽。MVA上游途径多肽可以包括具有MVA上游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA上游途径核酸包括编码具有MVA上游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括 来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸。因此，本文设想编码MVA上游途径多肽的任何基因都可用于本发明。
在某些实施例中，设想单独来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS基因，或所述基因与编码来自MVA上游途径的蛋白质的一个或多个其他mvaE和mvaS基因相结合的多种选择在本发明范围内。在其他实施例中，设想与编码下列多肽的一个或多个其他基因相结合的乙酰乙酰辅酶A合酶基因在本发明范围内：(i)3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽。因此，在某些方面，可以用本文所述的任何方式在重组细胞中表达设想的任何基因组合。
本文可以使用的MVA上游途径多肽的其他非限制性例子在国际专利申请公布No.WO2009/076676；WO2010/003007和WO2010/148150中有所描述。
编码mvaE和mvaS多肽的基因
在某些实施例中，设想单独来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS基因，或所述基因与编码来自MVA上游途径的蛋白质的一个或多个其他mvaE和mvaS基因相结合的多种选择在本发明范围内。在格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和粪肠球菌中，mvaE基因编码同时具有硫解酶和HMG-CoA还原酶活性的多肽。事实上，mvaE基因产物代表存在于真细菌中的IPP生物合成的第一双功能酶和融合到另一种天然蛋白质上的HMG-CoA还原酶的第一例子(Hedl,et al.,J Bacteriol.2002April；184(8):2116–2122(Hedl等人，《细菌学杂志》，2002年4月，第184卷，第8期，第2116-2122页))。另一方面，mvaS基因编码具有HMG-CoA合酶活性的多肽。
因此，可将重组细胞(如，大肠杆菌)经工程改造以表达来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的一个或多个mvaE和mvaS基因，以产生甲羟戊酸。可以在多拷贝质粒上表达一个或多个mvaE和mvaS基因。质粒可以是高拷贝质粒、低拷贝质粒或中等拷贝质粒。或者，可以将一个或多个mvaE和mvaS基因整合到宿主细胞的染色 体中。对于一个或多个mvaE和mvaS基因在质粒上或作为宿主细胞染色体的整合部分的两种异源表达而言，可以用诱导型启动子或组成型表达启动子驱使基因的表达。启动子可以是一个或多个mvaE和mvaS基因的表达的强驱动子，可以是表达的弱驱动子，或可以是表达的中驱动子。
示例性的mvaE多肽和核酸
mvaE基因编码同时具有硫解酶活性和HMG-CoA还原酶活性的多肽。由mvaE基因编码的多肽的硫解酶活性将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A，而该多肽的HMG-CoA还原酶酶活性将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸。示例性的mvaE多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及衍生自本文所述任何来源生物体的具有mvaE多肽的至少一种活性的突变多肽和核酸。
突变mvaE多肽包括其中一个或多个氨基酸残基已经历氨基酸置换而仍保持mvaE多肽活性(即将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A的能力以及将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸的能力)的那些。氨基酸置换可以是保守的或非保守的，并且此类置换的氨基酸残基可以为或可以不为由遗传密码编码的残基。标准的二十种氨基酸的“字母表”已经根据其侧链的相似性而划分成为化学家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有化学相似侧链的氨基酸残基替换(即，将具有碱性侧链的氨基酸替换为具有碱性侧链的另一种氨基酸)的置换。“非保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有化学不同侧链的氨基酸残基替换(即，将具有碱性侧链的氨基酸替换为具有芳族侧链的另一种氨基酸)的置换。
可在mvaE多肽中引入氨基酸置换以改善该分子的功能性。例如，可将增加mvaE多肽对其底物的结合亲和力或改善其将乙酰辅酶A转化为乙 酰乙酰辅酶A的能力和/或将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸的能力的氨基酸置换引入mvaE多肽中。在一些方面，突变mvaE多肽含有一个或多个保守氨基酸置换。
在一个方面，不被降解或较不易降解的mvaE蛋白可用于产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯。可使用的不被降解或较不易降解的mvaEs的基因产物的例子包括但不限于来自生物体屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌、粪肠球菌和格雷氏李斯特菌的那些。本领域技术人员可通过任何标准分子生物学技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达mvaE蛋白并且寻找片段的缺失。例如，可使用本文所述的检测方法在Hig标签介导的纯化后或当在产甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的大肠杆菌BL21中表达时在Safestain染色的SDS-PAGE凝胶上鉴定片段的缺失。
标准方法例如Hedl等人(J Bacteriol.2002,April；184(8):2116–2122(《细菌学杂志》，2002年4月，第184卷，第8期，第2116-2122页))描述的那些，可用于通过测量乙酰乙酰辅酶A硫解酶以及HMG-CoA还原酶活性确定多肽是否具有mvaE活性。在示例性的测定法中，通过分光光度计监测302nm下的吸光度变化来测量乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性，该吸光度变化伴随着乙酰乙酰辅酶A的形成或硫解。测定乙酰乙酰辅酶A的合成的每个反应的标准测定法条件是1mM乙酰辅酶A、10mM MgCl2、50mM Tris,pH10.5，并且通过添加酶引发反应。测定法可利用200μL的最终体积。对于测定，1个酶单位(eu)代表1μmol乙酰乙酰辅酶A在1min内的合成或硫解。在另一示例性测定法中，HMG-CoA还原酶活性可在340nm下通过分光光度计根据NADP(H)的出现和消失来监测。对于测量以显示HMG-CoA还原脱酰基为甲羟戊酸的每个反应的标准测定条件为0.4mM NADPH、1.0mM(R,S)-HMG-CoA、100mM KCl和100mM KxPO4，pH6.5。测定法利用200μL的最终体积。通过添加酶引发反应。对于该测定法，1eu代表1分钟内周转1μmol的NADP(H)。这对应于0.5μmol的HMG-CoA或甲羟戊酸的周转。
或者，重组细胞中甲羟戊酸的产生可通过但不限于气相色谱法(参见美国专利申请公布No.:US2005/0287655A1)或HPLC(参见美国专利申请公布No.:2011/0159557A1)测量。作为示例性测定法，可将培养物接 种于容纳有补充有一种或多种抗生素的LB发酵液的摇管中并在34℃下以250rpm温育14小时。接着，可将培养物稀释进容纳有TM3培养基的孔板中至最终OD为0.2，该培养基补充有1％葡萄糖、0.1％酵母提取物和200μM IPTG。然后用Breath Easier膜(Diversified Biotech公司(Diversified Biotech))密封该板并在摇动器/温育箱中以600rpm在34℃下温育24小时。然后将1mL的每份培养物以3,000x g离心5分种。然后将上清液添加至20％硫酸并在冰上温育5分钟。然后将混合物以3000x g离心5分钟，收集上清液用于HPLC分析。通过与甲羟戊酸(西格玛公司(Sigma))的标准曲线进行比较来测定样品中甲羟戊酸的浓度。另外可通过根据本领域已知的任何方法进行葡萄糖氧化酶测定法测量葡萄糖浓度。利用HPLC，可通过将每份样品的折射率响应与通过运行已知浓度的多种含甲羟戊酸溶液所产生的校准曲线相比较来定量甲羟戊酸的水平。
示例性的mvaE核酸包括编码具有mvaE多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的mvaE多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸以及衍生自本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸。示例性mvaE核酸包括例如分离自格雷氏李斯特菌DSM20601、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌EG2、粪肠球菌和/或酪黄肠球菌的mvaE核酸。由格雷氏李斯特菌DSM20601mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQ ID NO:6至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由屎肠球菌mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQ ID NO:7至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由鹑鸡肠球菌EG2mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQ ID NO:8至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由酪黄肠球菌mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与SEQ ID NO:9至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由粪肠球菌mvaE基因编码的mvaE核酸可具有与前述公开的在大肠杆菌中产生甲羟戊酸的mvaE基因至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、 89％、88％、87％、86％或85％序列同一性(参见US2005/0287655A1；Tabata,K.and Hashimoto,S.-I.Biotechnology Letters26:1487–1491,2004(Tabata,K.和Hashimoto,S.-I.，《生物技术通讯》，第26卷，第1487-1491页，2004年))。
mvaE核酸可在重组细胞中在多拷贝质粒上表达。质粒可以是高拷贝质粒、低拷贝质粒或中等拷贝质粒。或者，mvaE核酸可整合进宿主细胞的染色体中。对于mvaE核酸在质粒上或作为宿主细胞染色体的整合部分的两种异源表达而言，可以用诱导型启动子或组成型表达启动子驱动核酸的表达。启动子可以是mvaE核酸的表达的强驱动子，可以是表达的弱驱动子，或可以是表达的中等驱动子。
示例性的mvaS多肽和核酸
mvaS基因编码具有HMG-CoA合酶活性的多肽。该多肽可将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)。示例性的mvaS多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及衍生自本文所述任何来源生物体的具有mvaS多肽的至少一种活性的突变多肽和核酸。
突变mvaS多肽包括其中一个或多个氨基酸残基已经历氨基酸置换而仍保持mvaS多肽活性(即将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的能力)的那些。可在mvaS多肽中引入氨基酸置换以改善该分子的功能性。例如，可将增加mvaS多肽对其底物的结合亲和力或改善其将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的能力的氨基酸置换引入mvaS多肽中。在一些方面，突变mvaS多肽含有一个或多个保守氨基酸置换。
可使用标准方法例如Quant等人(Biochem J.1989,262:159-164(《生物化学杂志》，1989年，第262卷，第159-164页))中所述的那些，通过测量HMG-CoA合酶活性，来确定多肽是否具有mvaS活性。在示例性的测定法中，HMG-CoA合酶活性可通过监测在303nm下的吸光度改变以分光光度法测量乙酰乙酰辅酶A的烯醇形式的消失来测定。标准的1mL测定体系包含30℃下50mm-Tris/HCl,pH8.0、10mM-MgCl2和0.2mM-二硫苏糖醇；5mM-乙酰磷酸、10M-乙酰乙酰辅酶A，并且可加入5μl提取物 样品，然后同时加入乙酰辅酶A(100μM)和10个单位PTA。然后将HMG-CoA合酶活性测量为在添加乙酰辅酶之前和之后的速率差值。乙酰乙酰辅酶A在所用的条件(pH8.0,10mM-MgCl2)下的吸收系数为12.2×103M-1cm-1。通过定义，1单位酶活性引起每分钟转化1μmol乙酰乙酰辅酶A。
或者，重组细胞中甲羟戊酸的产生可通过但不限于气相色谱法(参见美国专利申请公布No.:US2005/0287655A1)或HPLC(参见美国专利申请公布No.:2011/0159557A1)测量。作为示例性测定法，可将培养物接种于容纳有补充有一种或多种抗生素的LB发酵液的摇管中并在34℃下以250rpm温育14小时。接着，可将培养物稀释进容纳有TM3培养基的孔板中至最终OD为0.2，该培养基补充有1％葡萄糖、0.1％酵母提取物和200μM IPTG。然后用Breath Easier膜(Diversified Biotech公司(Diversified Biotech))密封该板并在摇动器/温育箱中以600rpm在34℃下温育24小时。然后将1mL的每份培养物以3,000x g离心5分种。然后将上清液添加至20％硫酸并在冰上温育5分钟。然后将混合物以3000x g离心5分钟，收集上清液用于HPLC分析。通过与甲羟戊酸(西格玛公司(Sigma))的标准曲线进行比较来测定样品中甲羟戊酸的浓度。另外可通过根据本领域已知的任何方法进行葡萄糖氧化酶测定法测量葡萄糖浓度。利用HPLC，可通过将每份样品的折射率响应与通过运行已知浓度的多种含甲羟戊酸溶液所产生的校准曲线来定量甲羟戊酸的水平。
示例性的mvaS核酸包括编码具有mvaS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的mvaS多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸以及衍生自本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸。示例性mvaS核酸包括例如分离自格雷氏李斯特菌DSM20601、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌EG2、粪肠球菌和/或酪黄肠球菌的mvaS核酸。由格雷氏李斯特菌DSM20601mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与SEQ ID NO:10至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由屎肠球菌mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与SEQ ID NO:11至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由鹑鸡肠球菌EG2mvaS基因编码的 mvaS核酸可具有与SEQ ID NO:12至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由酪黄肠球菌mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与SEQ ID NO:13至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性。由粪肠球菌mvaS基因编码的mvaS核酸可具有与前述公开的在大肠杆菌中产生甲羟戊酸的mvaE基因至少约99％、98％、97％、96％、95％、95％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％或85％序列同一性(参见US2005/0287655A1；Tabata,K.and Hashimoto,S.-I.Biotechnology Letters26:1487–1491,2004(Tabata,K.和Hashimoto,S.-I.，《生物技术通讯》，第26卷，第1487-1491页，2004年))。
mvaS核酸可在重组细胞中在多拷贝质粒上表达。质粒可以是高拷贝质粒、低拷贝质粒或中等拷贝质粒。或者，mvaS核酸可整合进宿主细胞的染色体中。对于mvaS核酸在质粒上或作为宿主细胞染色体的整合部分的两种异源表达而言，可以用诱导型启动子或组成型表达启动子驱动核酸的表达。启动子可以是mvaS核酸的表达的强驱动子，可以是表达的弱驱动子，或可以是表达的中等驱动子。
乙酰乙酰辅酶A合酶基因
乙酰乙酰辅酶A合酶基因(aka nphT7)为编码具有下列活性的酶的基因：具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的活性并具有由两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的最小活性(如，没有活性)。参见，如，Okamura et al.,PNAS Vol107,No.25,pp.11265-11270(2010)(Okamura等人，《美国国家科学院院刊》，第107卷，第25期，第11265-11270页，2010年)，其内容作为关于nphT7的教导内容明确地并入本文中。来自链霉菌属(Streptomyces)CL190菌株的放线菌的乙酰乙酰辅酶A合酶基因在日本专利公布(Kokai)No.2008-61506A和US2010/0285549中有所描述。乙酰乙酰辅酶A合酶还可被称为乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶。可以使用的代表性的乙酰乙酰辅酶A合酶(或乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶)为Genbank AB540131.1。
在本文所述任何方面或实施例中，可以使用具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的能力的酶。此类酶的非限制性例子在本文中有所描述。在本文所述的某些实施例中，可以使用来源于链霉菌属(Streptomyces)的放线菌、具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的能力的乙酰乙酰辅酶A合酶基因。此类乙酰乙酰辅酶A合酶基因的例子是编码具有氨基的蛋白质的基因。此类具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质对应于具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的活性并且不具有由两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的活性的乙酰乙酰辅酶A合酶。
在一个实施例中，编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的基因可通过核酸扩增方法(如，PCR)使用得自链霉菌CL190菌株的放线菌的基因组DNA作为模板和一对可参照日本专利公布(Kokai)No.2008-61506A设计的引物获得。
如本文所述，本发明使用的乙酰乙酰辅酶A合酶基因不限于得自链霉菌CL190菌株的放线菌的编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的蛋白质的基因。任何编码能够从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A，并且不能从两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的蛋白质的基因可用于本发明描述的方法。在某些实施例中，乙酰乙酰辅酶A合酶基因可以是编码与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有高度相似性或基本上相同的氨基酸序列的蛋白质并且具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能的基因。“高度相似的”或“基本上相同的”表述是指例如至少约80％同一性、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和至少约99％同一性。如上文所用，同一性值对应于不同氨基酸序列和SEQ ID NO:5的氨基酸序列中氨基酸残基之间的同一性百分比，其通过使用序列相似性搜索程序进行SEQ ID NO:5的氨基酸序列和不同氨基酸序列的比对来计算。
在其他实施例中，乙酰乙酰辅酶A合酶基因可以是编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列通过置换、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸而衍生的氨基酸序列并且具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A 的功能的蛋白质的基因。此处，“多个氨基酸”的表述是指例如2至30个氨基酸，优选地2至20个氨基酸，更优选地2至10个氨基酸以及最优选地2至5个氨基酸。
在其他实施例中，乙酰乙酰辅酶A合酶基因可由能够在严格条件下与具有编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸的一部分或全部杂交，并且能够编码具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能的蛋白质的多核苷酸组成。此处，在严格条件下杂交对应于在60℃用SSC洗涤两次的条件下维持结合。杂交可通过常规的已知方法，例如J.Sambrook et al.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory(2001)(J.Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第3版，冷泉港实验室，2001年)中描述的方法进行。
如本文所述，编码具有的氨基酸序列不同于SEQ ID NO:5的氨基酸序列的乙酰乙酰辅酶A合酶的基因可分离自任何可能的生物体，例如并非得自链霉菌CL190菌株的放线菌。此外，本文使用的乙酰乙酰辅酶A合酶基因可通过本领域已知的方法修饰编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多核苷酸获得。核苷酸序列的诱变可通过已知的方法例如Kunkel方法或缺口双链体方法或通过类似于其任何一者的方法进行。例如，诱变可使用诱变试剂盒(如，产品名称；Mutant-K和Mutant-G(TAKARA Bio公司(TAKARA Bio)))，用于定点突变，产品名称；LA PCR体外诱变系列试剂盒(TAKARA Bio)等等进行。
具有的氨基酸序列不同于SEQ ID NO:5的氨基酸序列的乙酰乙酰辅酶A合酶的活性可如下文所述评估。具体地讲，首先将编码待评估蛋白质的基因引入宿主细胞，使得基因可在其中表达，然后通过例如色谱的技术纯化蛋白质。丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A作为底物添加到包含所获得的待评估蛋白质的缓冲液中，然后例如在所需温度(如，10℃至60℃)下温育。在反应完成后，确定底物的消耗量和/或产物(乙酰乙酰辅酶A)的生成量。因此，评估测试的蛋白质是否具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能，以及评估合成的程度是可能的。在这种情况下，通过将单独乙酰辅酶A作为底物添加到包含所获得的待评估蛋白质的缓冲 液中，并且以类似的方式确定底物的消耗量和/或产物的生成量来检验蛋白质是否具有由两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的活性是可能的。
能够增加甲羟戊酸产量的重组细胞
本文所述的重组细胞(如，重组细菌细胞)可以大于对本文所述的各种酶促途径无任何操纵的相同细胞的量和/或浓度产生甲羟戊酸。因此，经工程改造以用于调节本文所述的各种途径的重组细胞(如，细菌细胞)可用于提高甲羟戊酸的产量。
因此，在某些方面，本发明提供能够提高甲羟戊酸产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及编码MVA上游途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，所述细胞产生的甲羟戊酸量增加。
在某些方面，本文所述的重组细胞包含编码分离自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他方面，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个方面，本文所述的重组 细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在一个实施例中，重组细胞还包含编码来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS多肽的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞还包含乙酰乙酰辅酶A合酶和编码MVA上游途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸。
在一个实施例中，重组细胞可进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所述基因选自：核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(tal B)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，重组细胞可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一个方面，本文所述的重组细胞可产生体积生产率高于缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞的甲羟戊酸。在某些实施例中，重组细胞可产生高于2.00g/L/h的甲羟戊酸。或者，重组细胞可产生大于约1.0g/L/h、1.2g/L/h、1.4g/L/h、1.6g/L/h、1.8g/L/h、2.0g/L/h、2.2g/L/h、2.4g/L/h、2.6g/L/h、2.8g/L/h、3.0g/L/h、3.2g/L/h、3.4g/L/h、3.6g/L/h、3.8g/L/h、4.0g/L/h、4.2g/L/h、4.4g/L/h、4.6g/L/h、4.8g/L/h、5.0g/L/h、5.2g/L/h、5.4g/L/h、5.6g/L/h、5.8g/L/h、6.0g/L/h的甲羟戊酸，包括这些数以及这些数之间的任何数值。
在一个方面，本文所述的重组细胞可产生滴度高于缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞的甲羟戊酸。在48小时发酵后，这些重组细胞可产生高于约100g/L峰值滴度的甲羟戊 酸。或者，在48小时发酵后，重组细胞可产生高于约50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、240g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L、300g/L的峰值滴度的甲羟戊酸，包括这些数以及这些数之间的任何数值。
在其他实施例中，本文所述的重组细胞还包含增加流向MVA途径的碳、从而可产生与未经相似工程改造的细胞相比甲羟戊酸滴度更高的一个或多个突变。在此类实施例中，本文所述的重组细胞产生峰值滴度高于缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的磷酸酮醇酶多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞的甲羟戊酸。在一个实施例中，重组细胞可进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所述基因选自：核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(tal B)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，重组细胞可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一个方面，本文所述的重组细胞可产生甲羟戊酸细胞生产力指数(CPI)高于缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞的甲羟戊酸。重组细胞可具有至少约3.0(g/g)的甲羟戊酸CPI。或者，重组细胞可具有至少约1(g/g)、2(g/g)、3(g/g)、4(g/g)、5(g/g)、6(g/g)、7(g/g)、8(g/g)、9(g/g)、10(g/g)、11(g/g)、12(g/g)、13(g/g)、14(g/g)、15(g/g)、20(g/g)、25(g/g)或30(g/g)的甲羟戊酸CPI，包括这些数以及这些数之间的任何数值。
在某些实施例中，本文所述的重组细胞还包含增加流向MVA途径的碳、从而导致与未经相似工程改造的细胞相比甲羟戊酸细胞生产力指数(CPI)更高的一个或多个突变。另外，本文所述的重组细胞具有的CPI高于缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的磷酸酮醇酶多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞。在一个实施例中，重组细胞可进一步工程改造以增加以 下一种或多种基因的活性，所述基因选自：核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(tal B)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
另外，本文所述的细胞具有的从葡萄糖产生的甲羟戊酸的质量产率高于缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的磷酸酮醇酶多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞。重组细胞可产生至少约28％的从葡萄糖产生的甲羟戊酸的质量产率。或者，重组细胞可产生的从葡萄糖产生的甲羟戊酸的质量产率为至少约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或55％，包括这些数以及这些数之间的任何数值。
在某些实施例中，本文所述的重组细胞还包含增加流向MVA途径的碳、从而导致与未经相似工程改造的细胞相比甲羟戊酸质量产率更高的一个或多个突变。另外，本文所述的重组细胞具有的甲羟戊酸的质量产率高于缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的磷酸酮醇酶多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞。在一个实施例中，重组细胞可进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所述基因选自：核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(tal B)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在一个方面，本文所述的重组细胞产生甲羟戊酸，而与缺乏编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的异源核酸的一个或多个拷贝的相同细胞相比，发酵液中乙酸积聚较少。重组细胞可产生水平增加的甲羟戊酸，而在48小时发酵后发酵液中积聚的乙酸小于4.5g/L。或者，重组细胞可产生水平增加的甲羟戊酸，而在48小时发酵后发酵液中积聚的乙酸小于约8.0g/L、7.5g/L、7.0g/L、6.5g/L、6.0g/L、5.5g/L、5.0g/L、4.5g/L、4.0g/L、3.5g/L、3.0g/L、2.5g/L、2.0g/L或1.5g/L，包括这些数以及这些数之间的任何数值。在某些实施例中，发酵液中乙酸积聚减少可提高发酵运行期间的细胞活力。
在某些实施例中，本文所述的重组细胞还包含增加流向MVA途径的碳、从而导致与未经相似工程改造的细胞相比、甲羟戊酸水平增加而发酵液中乙酸积聚较少的一个或多个突变。在某些实施例中，发酵液中乙酸积聚减少可提高发酵运行期间的细胞活力。
使用重组细胞产生增加量的甲羟戊酸的方法
本文还提供产生甲羟戊酸的方法。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法包括：(a)培养包含重组细胞的组合物，所述细胞经工程改造以如本文所述增加碳通量(包括上述任何重组细胞)或其能够产生甲羟戊酸的子代；以及(b)产生甲羟戊酸。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法包括在适于产生甲羟戊酸的条件下培养任何本文所述的重组细胞并让所述重组细胞产生甲羟戊酸的步骤。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
如本文所述，产生甲羟戊酸的方法包括如下步骤：(a)培养不内源性表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述细胞异源性表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生甲羟戊酸。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施 例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。或者，当重组细胞在基本培养基中培养时，细胞可产生的甲羟戊酸浓度大于缺乏编码来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌的磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸的相同细胞。在某些实施例中，编码来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌的磷酸酮醇酶多肽的异源核酸的一个或多个拷贝是整合进宿主细胞的染色体的异源核酸。
在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。另外，当重组细胞在基本培养基中培养时，细胞可产生的甲羟戊酸浓度大于缺乏编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫 链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸的相同细胞。在某些实施例中，编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的异源核酸的一个或多个拷贝是整合进宿主细胞的染色体的异源核酸。
用于产生甲羟戊酸的本发明方法可利用甲羟戊酸的体积生产率大于2.00g/L/h的细胞产生甲羟戊酸。或者，重组细胞可产生大于约1.0g/L/h、1.2g/L/h、1.4g/L/h、1.6g/L/h、1.8g/L/h、2.0g/L/h、2.2g/L/h、2.4g/L/h、2.6g/L/h、2.8g/L/h、3.0g/L/h、3.2g/L/h、3.4g/L/h、3.6g/L/h、3.8g/L/h、4.0g/L/h、4.2g/L/h、4.4g/L/h、4.6g/L/h、4.8g/L/h、5.0g/L/h、5.2g/L/h、5.4g/L/h、5.6g/L/h、5.8g/L/h、6.0g/L/h的甲羟戊酸，包括这些数以及这些数之间的任何数值。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
在其他实施例中，甲羟戊酸产生方法可包括如下步骤：(a)培养不内源性表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述细胞异源性表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生甲羟戊酸，其中在48小时发酵后，重组细胞产生甲羟戊酸的峰值滴度大于缺乏编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源拷贝的相同细胞。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans 分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
用于产生甲羟戊酸的本发明方法可利用可在48小时发酵后产生峰值滴度大于约100g/L的甲羟戊酸峰值滴度的细胞产生甲羟戊酸。或者，在48小时发酵后，重组细胞可产生高于约50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L、200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、240g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L、300g/L的峰值滴度的甲羟戊酸，包括这些数以及这些数之间的任何数值。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
在其他实施例中，甲羟戊酸产生方法可包括如下步骤：(a)培养不内源性表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述细胞异源性表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生甲羟戊酸，其中重组细胞具有的甲羟戊酸CPI大于缺乏编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源拷贝的相同细胞。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽 来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
用于产生甲羟戊酸的本发明方法可利用针对甲羟戊酸的CPI为至少约3.0(g/g)的细胞产生甲羟戊酸。或者，重组细胞可具有至少约1(g/g)、2(g/g)、3(g/g)、4(g/g)、5(g/g)、6(g/g)、7(g/g)、8(g/g)、9(g/g)、10(g/g)、11(g/g)、12(g/g)、13(g/g)、14(g/g)、15(g/g)、20(g/g)、25(g/g)或30(g/g)的甲羟戊酸CPI，包括这些数以及这些数之间的任何数值。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
在某些实施例中，甲羟戊酸产生方法可包括如下步骤：(a)培养不内源性表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述细胞异源性表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生甲羟戊酸，其中与缺乏编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源性拷贝的相同细胞相比，重组细胞显示出氧吸收率(OUR)减少。在某些实施例中，与不表达磷酸酮醇酶的重组细胞相比，表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源拷贝的重组细胞显示出OUR减少至多1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或7倍。
本发明提供的是使用任何上述细胞来提高甲羟戊酸产量的方法。由细胞产生的甲羟戊酸产量可通过编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的表达提高。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个 拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
与不表达编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的产甲羟戊酸细胞的甲羟戊酸产量相比，甲羟戊酸的产量可提高约1,000,000倍(如，约1至约500,000倍、约1至约50,000倍、约1至约5,000倍、约1至约1,000倍、约1至约500倍、约1至约100倍、约1至约50倍、约5至约100,000倍、约5至约10,000倍、约5至约1,000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50,000倍、约50至约10,000倍、约100至约5,000倍、约200至约1,000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞进一步经工程改造以增加流向MVA产生的碳。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在其他方面，与不表达编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的产甲羟戊酸细胞的甲羟戊酸产量相比，本文所述的方法可提供的甲羟戊酸产量提高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、 1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍或1,000,000倍中的任何一者。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞进一步经工程改造以增加流向MVA产生的碳。
此外，可将更具体的细胞培养条件用于培养本文所述方法中的细胞。例如，在一些方面，用于产生甲羟戊酸的方法包括如下步骤：(a)在基本培养基中34℃下培养不内源性具有磷酸酮醇酶基因的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述重组细胞异源性表达在低至中等拷贝质粒上并且在强启动子的调控下的编码磷酸酮醇酶多肽的异源基因的一个或多个拷贝；以及(b)产生甲羟戊酸。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷 贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收甲羟戊酸的步骤。
能够产生异戊二烯的重组细胞
异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是在大量应用中使用的重要有机化合物。例如，异戊二烯在多种化学组合物和聚合物的合成中，包括在合成橡胶的制备中用作中间体或原料。异戊二烯还是由许多植物和动物天然合成的重要生物材料。
异戊二烯通过异戊二烯合酶的酶促作用从DMAPP产生。因此，不受理论的束缚，据认为通过任何上述组合物和方法增加重组细胞中甲羟戊酸的细胞产量将类似地导致产生较高量的异戊二烯。当与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯二磷酸异构酶(如，MVA下游途径)和用于异戊二烯和类异戊二烯产生的其他适当酶的适当酶活性水平组合时，增加从葡萄糖产生甲羟戊酸的摩尔产率转化成较高的从葡萄糖产生类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的摩尔产率。
如本文所述，本发明提供能够产生异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径(即，MVA上游途径和MVA下游途径)的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞能够产生可回收量的异戊二烯。在某些实施例中，本发明提供能够提高异戊二烯产量的重组细胞，其中所述细胞包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸以及(i)编码完整MVA途径的一种或多种多肽的一种或多种核酸以及(ii)编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中与不包含编码具有磷酸酮醇酶活性的多肽的一种或多种异源核酸的产异戊二烯细胞相比，所述细胞产生的异戊二烯量增加。
异戊二烯的产生也可使用本文所述的任何重组宿主细胞进行，所述细胞还包括一个或多个酶促途径操纵，其中酶活性受到调节以增加流向甲羟戊酸产生的碳流。本文所述的具有各种酶促途径的重组细胞可用于产生异戊二烯，所述途径的操纵用于增加流向甲羟戊酸产生的碳流。在一个实施例中，重组细胞可进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所 述基因选自：核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(tal B)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
编码MVA下游途径的多肽的核酸
在本发明的一些方面，任何本文所述组合物或方法中描述的细胞还包含一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)下游途径多肽的核酸。在一些方面，MVA下游途径多肽为内源多肽。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至强启动子。在一特定方面，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源MVA下游途径多肽。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至弱启动子。
甲羟戊酸下游生物合成途径包含甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)。在一些方面，MVA下游途径可还包含异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。本文提供的细胞可包含至少一种编码异戊二烯合酶、一种或多种MVA上游途径多肽和/或一种或多种MVA下游途径多肽的核酸。MVA下游途径的多肽可以是(a)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸；(b)将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸；和(c)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的任何酶。更具体地讲，将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶可来自：马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、沙克乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽和布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶多肽。在另一方面，将 甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。
在一些方面，MVA下游途径多肽为异源多肽。在一些方面，该细胞包含不止一个拷贝的编码MVA下游途径多肽的异源核酸。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至弱启动子。在一些方面，异源MVA下游途径多肽为来自酿酒酵母、粪肠球菌或马氏甲烷八叠球菌的多肽。
编码MVA下游途径多肽的核酸可整合进细胞的基因组中或可在细胞中稳定表达。编码MVA下游途径多肽的核酸另外可位于载体上。
还在下面提供了示例性的MVA下游途径多肽：(i)甲羟戊酸激酶(MVK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；以及(iv)异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)。具体地讲，下游MVK多肽可以来自甲烷八叠球菌属，并且更具体地讲，下游MVK多肽可以来自马氏甲烷八叠球菌。在一些实施例中，下游MVK多肽可来自布氏拟甲烷球菌。MVA下游途径多肽的另外的例子可见于美国专利申请公布2010/0086978，将上述专利公布关于MVK下游途径多肽和MVK下游途径多肽变体的内容明确地以引用的方式全文并入本文。
MVA下游途径多肽包括具有MVA下游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA下游途径核酸包括编码具有MVA下游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的MVA下游途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸。此外，也还可使用能获得更好异戊二烯产量的MVA下游途径多肽的变体。
在一些方面，MVA下游途径多肽是来自酿酒酵母、粪肠球菌或马氏甲烷八叠球菌的多肽。在一些方面，MVK多肽选自乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、沙克乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶 多肽、链霉菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽、马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶多肽和布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶多肽。本文所述启动子中的任一者(如本文所述的以及在本公开的实例中所鉴定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)均可用于驱动任何本文所述MVA多肽的表达。
本文所述的细胞中的任一者可包含IDI核酸(如编码IDI的内源或异源核酸)。异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯基-二磷酸δ-异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)与二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化(如将IPP转化为DMAPP和/或将DMAPP转化为IPP)。示例性的IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准方法(例如本文所述的那些)通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内使IPP和DMAPP互变的能力来确定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的IDI多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸以及衍生自本文所述任何来源生物体的突变多肽和核酸。
编码异戊二烯合酶多肽的核酸
在本发明的一些方面，本文所述的任何组合物和方法中描述的细胞(包括经工程改造以用于增加流向MVA途径的碳的宿主细胞，如本文所述)还包含编码异戊二烯合酶多肽或具有异戊二烯合酶活性的多肽的一种或多种核酸。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为内源多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至强启动子。在一特定方面，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源异戊二烯合酶途径多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至弱启动子。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或杂种例如银白杨x欧洲山杨的多肽。
在一些方面，异戊二烯合酶多肽为异源多肽。在一些方面，细胞包含不止一个拷贝的编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面，编码异 戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至弱启动子。
编码异戊二烯合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组中，或者可在细胞中稳定表达。编码异戊二烯合酶多肽的核酸另外可位于载体上。
示例性异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸。此外，异戊二烯合酶的变体可具有改善的活性例如改善的酶活性。在一些方面，异戊二烯合酶变体具有其他改善的特性，诸如改善的稳定性(如热稳定性)和/或改善的可溶性。
可使用标准的方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转化为异戊二烯的能力，来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性可例如按以下文献中所述进行测量：Silver et al.,J.Biol.Chem.270:13010-13016,1995(Silver等人，《生物化学杂志》，第270卷，第13010-13016页，1995年)。在一个示例性的测定法中，可在氮气流下将DMAPP(西格玛公司(Sigma))蒸发至干燥并在100mM磷酸钾缓冲液(pH8.2)中将其再水化至100mM的浓度，并保存于-20℃下。为了进行该测定法，可将5μL的1M MgCl2、1mM(250μg/mL)DMAPP、65μL的植物提取缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl,pH8.0、20mM MgCl2、5％甘油和2mM DTT)的溶液添加至20mL顶空小瓶中的25μL的细胞提取物中并在振动下于37℃培养15分钟，其中该小瓶具有金属旋盖和涂有特氟龙的硅隔膜(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))。反应可通过加入200μL的250mM EDTA进行淬灭并通过GC/MS进行定量。
在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属的异戊二烯合酶或其变 体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自杨属的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为杨树异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为葛异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或杂种银白杨x欧洲山杨的多肽或它们的变体。
在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，诸如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸为来自山葛(葛)(Sharkey et al.,Plant Physiology137:700-712,2005(Sharkey等人，《植物生理学》，第137卷，第700-712页，2005年))、野葛、杨树(诸如银白杨、黑杨、毛果杨或银白杨x欧洲山杨(CAC35696))(Miller et al.,Planta213:483-487,2001(Miller等人，《植物》，第213卷，第483-487页，2001年))、白杨(诸如美洲山杨)(Silver et al.,JBC270(22):13010-1316,1995(Silver等人，《生物化学杂志》，第270卷，第22期，第13010-1316页，1995年))、英国栎(Quercus robur)(Zimmer等人，WO98/02550)的多肽或核酸或它们的变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自山葛、野葛、美洲山杨、银白杨、黑杨或毛果杨的异戊二烯合酶或它们的变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自银白杨的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，编码异戊二烯合酶(如来自银白杨的异戊二烯合酶或其变体)的核酸经密码子优化。
在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是天然存在的多肽或核酸(例如，来自杨属的天然存在的多肽或核酸)。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型或天然存在的多肽或核酸。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核酸的变体(例如，来自杨属的野生型或天然存在的多肽或核酸的变体)。
在一些方面，异戊二烯合酶多肽为变体。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的活性，例如改善的催化活性。活性(如催化活性)的增加可为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任意一者。在一些方面，诸如催化活性之类的活性的增加为至少约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30 倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任一者。在一些方面，诸如催化活性之类的活性的增加为约10％至约100倍(如，约20％至约100倍、约50％至约50倍、约1倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍至约20倍)。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的溶解性。溶解性的增加可为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。溶解性的增加可为至少约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任一者。在一些方面，溶解性的增加为约10％至约100倍(如，约20％至约100倍、约50％至约50倍、约1倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍至约20倍)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为天然存在的异戊二烯合酶的变体，并与天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的稳定性(如热稳定性)。
在一些方面，变体具有野生型或天然存在的异戊二烯合酶的活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约120％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约170％、至少约180％、至少约190％、至少约200％。变体可与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体可与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％中的任一者的氨基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有约70％至约99.9％、约75％至约99％、约80％至约98％、约85％至约97％或约90％至约95％中的任一者的氨基酸序列同一性。
在一些方面，变体在野生型或天然存在的异戊二烯合酶中包含突变。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸置换。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶之间的不同氨基酸残基的数量可为一个或多个，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或 更多个氨基酸残基。天然存在的异戊二烯合酶可包括来自植物的任何异戊二烯合酶，例如葛异戊二烯合酶、杨树异戊二烯合酶、英国栎异戊二烯合酶和柳树异戊二烯合酶。在一些方面，变体为来自银白杨的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，来自银白杨的异戊二烯合酶的变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些方面，变体为截短的银白杨异戊二烯合酶。在一些方面，编码变体(如来自银白杨的异戊二烯合酶的变体)的核酸为密码子优化的(例如，基于在其中表达异源异戊二烯合酶的宿主细胞而进行密码子优化的)。
本文提供的异戊二烯合酶多肽可以是WO2009/132220、WO2010/124146和美国专利申请公布No.2010/0086978中所述的异戊二烯合酶或异戊二烯合酶变体中的任何一种，这些专利关于异戊二烯合酶和异戊二烯合酶变体的内容明确地以引用方式全文并入本文。
本文所述的启动子中的任何一种(例如，本文所述的以及在本公开的实例中所鉴定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)均可用于驱动本文所述的任何异戊二烯合酶的表达。
合适的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登录号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所标示的那些。可用于本文所述的组合物或方法(包括制备编码异戊二烯合酶的细胞的方法)的任一者中的异戊二烯合酶的类型还在国际专利申请公布No.WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220、WO2010/031062、WO2010/031068、WO2010/031076、WO2010/013077、WO2010/031079、WO2010/148150、WO2010/124146、WO2010/078457、WO2010/148256、WO2012/058494和美国专利No.8,173,410中描述。
编码DXP途径多肽的核酸
在本发明的一些方面，本文所述的任何组合物和方法中描述的细胞(包括经工程改造以用于增加流向MVA途径的碳的宿主细胞，如本文所述)还包含编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的一种或多种异源核酸。在一些方面，细胞还包含编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面，大肠杆菌细胞还包含一种或多种编码IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽的核酸。在一些方面，一种核酸编码 异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽。在一些方面，一个质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽。在一些方面，多个质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽。
示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。标准方法(例如本文所述的那些)可用于通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法在国际专利公布No.WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220和美国专利公布No.US2009/0203102、2010/0003716和2010/0048964中更详细地描述。
示例性的DXP途径多肽包括但不限于下列多肽中的任一者：DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽和具有DXP途径多肽中的一种、两种或更多种的活性的多肽(如融合多肽)。具体地讲，DXP途径多肽包括具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的DXP途径核酸包括编码具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途径多肽和核酸包括来自本文所述的任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及由本文所述的任何来源生物体衍生的突变型多肽和核酸。示例性的DXP途径多肽和核酸以及测量DXP途径多肽活性的方法在国际公布No.WO2010/148150中进行了更详细的描述。
示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。标准方法(例如本文所述的那些)可用于通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法在国际专利公布No.WO2009/076676、WO2010/003007、WO2009/132220和美国专利公布No.US2009/0203102、2010/0003716和2010/0048964中更详细地描述。
具体地讲，DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物 内或体内转化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力，确定多肽是否具有DXS多肽活性。
DXR多肽将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化DXP的能力来确定多肽是否具有DXR多肽活性。
MCT多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)转化为4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化MEP的能力来确定多肽是否具有MCT多肽活性。
CMK多肽将4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)转化为2-二磷酸4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化CDP-ME的能力来确定多肽是否具有CMK多肽活性。
MCS多肽将2-磷酸-4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化CDP-MEP的能力来确定多肽是否具有MCS多肽活性。
HDS多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸转化为(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸(HMBPP或HDMAPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化ME-CPP的能力来确定多肽是否具有HDS多肽活性。
HDR多肽将(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸转化为异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化HMBPP的能力来确定多肽是否具有HDR多肽活性。
MVA下游途径、异戊二烯合酶、IDI和DXP途径多肽的来源生物体
异戊二烯合酶、IDI、DXP途径和/或MVA下游途径核酸(以及它们所编码的多肽)可从天然含有异戊二烯合酶、IDI、DXP途径和/或MVA下游途径核酸的任何生物体获得。异戊二烯由多种生物体(例如细菌、酵母、植物和动物)天然地形成。一些生物体含有产生异戊二烯的MVA途 径。异戊二烯合酶核酸可例如从任何含有异戊二烯合酶的生物体获得。MVA途径核酸可例如从任何含有MVA途径的生物体获得。IDI和DXP途径核酸可例如从含有IDI和DXP途径的任何生物体获得。
异戊二烯合酶、DXP途径、IDI和/或MVA途径核酸的核酸序列可分离自细菌、真菌、植物、藻类或蓝细菌。示例性的来源生物体包括例如：酵母如酵母菌属的物种(如酿酒酵母)、细菌如埃希氏杆菌属的物种(如大肠杆菌)或甲烷八叠球菌属的物种(如马氏甲烷八叠球菌)、植物如葛或杨树(如银白杨或银白杨x欧洲山杨CAC35696)或山杨(如美洲山杨)。可使用的异戊二烯合酶、IDI和/或MVA途径多肽的示例性来源也在国际专利公布No.WO2009/076676、No.WO2010/003007、No.WO2009/132220、No.WO2010/031062、No.WO2010/031068、No.WO2010/031076、No.WO2010/013077、No.WO2010/031079、No.WO2010/148150、No.WO2010/078457和No.WO2010/148256中描述。
在某些方面，来源生物体是酵母，如酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、毕赤酵母属物种或假丝酵母属物种。
在一些方面，来源生物体为细菌，例如芽孢杆菌属的菌株如地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、泛菌属的菌株如柠檬泛菌、假单胞菌属的菌株如产碱假单胞菌、链霉菌属的菌株如变铅青链霉菌或锈赤链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、埃希氏杆菌属的菌株如大肠杆菌、肠杆菌属的菌株、链球菌属的菌株或古细菌(Archaea)的菌株如马氏甲烷八叠球菌。
如本文中所用，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。已经认识到，芽孢杆菌属还在继续进行分类学整理。因此，意在使该属包括已经重新分类的种，包括但不限于诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌”的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在存在氧气的情况下抗性内生孢子的产生被视为芽孢杆菌属的定义性特征，但该特性还适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属 (Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在某些方面，来源生物体是革兰氏阳性菌。非限制性例子包括链霉菌属的菌株(例如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌或灰色链霉菌)和芽孢杆菌。在一些方面，来源生物体为革兰氏阴性细菌如大肠杆菌或假单胞菌属物种。
在一些方面，来源生物体是植物，例如豆科植物，例如蝶形花亚科。在一些方面，来源生物体是葛、杨树(例如欧洲山杨与银白杨的杂种CAC35696)、白杨(例如美洲山杨)或英国栎。
在某些方面，源生物体是藻类，例如绿藻、红藻、灰藻、chlorarachniophyte、鞭毛虫、色藻界或沟鞭藻类。
在一些方面，来源生物体为蓝细菌，例如基于形态分类成如下任何组的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。
能够增加异戊二烯产量的重组细胞
本文所述的重组细胞(包括本文所述的经工程改造以用于增加碳通量的宿主细胞)具有产生异戊二烯的能力，当在相同条件下培养时，所产生的异戊二烯的浓度高于缺乏磷酸酮醇酶多肽的异源核酸的一个或多个拷贝、编码MVA途径多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸的相同细胞。该细胞可还包含一种或多种编码IDI多肽的异源核酸。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌 分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在一些方面，编码磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝、编码MVA途径多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸为整合进宿主细胞的染色体核苷酸序列的异源核酸。在其他方面，将一种或多种异源核酸整合进质粒。在其他方面，将一种或多种异源核酸中的至少一种整合进细胞的染色体核苷酸序列，而将一种或多种异源核酸序列中的至少一种整合进质粒。与不包含磷酸酮醇酶多肽的产异戊二烯细胞相比，重组细胞可产生的异戊二烯量高出至少5％。或者，重组细胞可产生高出约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的异戊二烯，包括这些数以及这些数之间的任何数值。
在本发明的一个方面，本文提供了包含编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸、编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽的一种或多种异源性核酸、 编码DXP途径多肽的一种或多种异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸的重组细胞。该细胞可还包含编码IDI多肽的一种或多种异源核酸。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。该一种或多种异源核酸的任何一种可有效连接至组成型启动子、可有效连接至诱导型启动子或可有效连接至诱导型启动子和组成型启动子的组合。该一种或多种异源核酸可另外有效连接至强启动子、弱启动子和/或中等启动子。编码磷酸酮醇酶、甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXP途径多肽和异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸可整合进宿主细胞的基 因组中，或者可在细胞中稳定表达。该一种或多种异源核酸另外可位于载体上。
可提高(如通过编码磷酸酮醇酶多肽、异戊二烯合酶多肽、MVA途径多肽和/或DXP途径多肽的一种或多种异源核酸的表达来提高)根据任何本文所述组合物或方法的细胞的异戊二烯产量。如本文所用，“提高的”异戊二烯产量是指与不具有编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，任何本文所述组合物和方法所描述的细胞增加的针对异戊二烯的细胞生产力指数(CPI)、增加的异戊二烯滴度、增加的异戊二烯质量产率和/或增加的异戊二烯比生产率。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞进一步经工程改造以增加流向MVA产生的碳。
本文所述的重组细胞产生的异戊二烯产量可提高约5％至约1,000,000倍。在某些方面，与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸的细胞的异戊二烯产量相比，异戊二烯的产量可提高约10％至约1,000,000倍(如，约1至约500,000倍、约1至约50,000倍、约1至约5,000倍、约1至约1,000倍、约1至约500倍、约1至约100倍、约1至约50倍、约5至约100,000倍、约5至约10,000倍、约5至约1,000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50,000倍、约50至约10,000倍、约100至约5,000倍、约200至约1,000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞进一步经工程改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的细胞的异戊二烯产量相比，产量提高的异戊二烯。
在其他方面，与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸的细胞的异戊二烯产量相比，本文所述的重组细胞的异戊二烯产量也可提高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍或1,000,000倍中的任何一者。在本文所述的某些实施例中，宿主细胞进一步经工程改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以 用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的细胞的异戊二烯产量相比，产量提高的异戊二烯。
使用重组细胞来产生异戊二烯的方法
本文还提供产生异戊二烯的方法，所述方法包括培养任何本文所述的重组细胞。在一个方面，异戊二烯可通过培养包含编码磷酸酮醇酶多肽、一种或多种MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸的重组细胞产生。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自罗伊氏乳杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在另一个方面，异戊二烯可通过培养重组细胞产生，所述细胞包含调节本文所述的任何酶促途径以及编码磷酸酮醇酶肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。异戊二烯可从任何本文所述的和根据任何本文所述方法的细胞产生。可将任何所述细胞用于从碳水化合物(包括但不限于六碳糖如葡萄糖)产生异戊二烯的目的。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
因此，本文提供产生异戊二烯的方法，所述方法包括在产生异戊二烯的合适条件下培养包含编码磷酸酮醇酶多肽和异戊二烯合酶的一种或多种异源核酸的细胞以及(b)产生异戊二烯。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细 胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
该细胞可还包含编码上述MVA途径多肽(如，完整MVA途径)和任何上述异戊二烯合酶多肽(如，葛属异戊二烯合酶)的一种或多种核酸分子。在一些方面，重组细胞可以是任何本文所述的细胞。任何本文所述异戊二烯合酶或其变体、任何本文所述宿主细胞菌株、任何本文所述启动子和/或任何本文所述载体也可用于利用任何本文所述的可用于本文所述的方法的能量来源(如葡萄糖或任何其他六碳糖)来产生异戊二烯。在一些方面，产生异戊二烯的方法还包括回收异戊二烯的步骤。在其他实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异 源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。
在某些方面，本文提供制备异戊二烯的方法，所述方法包括在产生异戊二烯的合适条件下培养重组细胞，所述重组细胞包含编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽、来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS多肽的一种或多种异源核酸以及(b)产生异戊二烯。该细胞可还包含编码上述MVA下游途径多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述异戊二烯合酶多肽的一种或多种核酸分子。在一些方面，重组细胞可以是任何本文所述的细胞。
在某些方面，本文提供制备异戊二烯的方法，所述方法包括在产生异戊二烯的合适条件下培养重组细胞，所述重组细胞包含编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸以及(b)产生异戊二烯。该细胞可还包含编码上述MVA下游途径多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述异戊二烯合酶多肽的一种或多种核酸分子。在一些方面，重组细胞可以是任何本文所述的细胞。本文所述的具有各种酶促途径的重组细胞可用于产生异戊二烯，所述途径的操纵用于增加流向甲羟戊酸产生的碳流。在一些方面，重组细胞可进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所述基因选自：核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)、 转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(tal B)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)。在另一个实施例中，这些重组细胞可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)和/或HPr(ptsH)。
在某些方面，本文提供制备异戊二烯的方法，所述方法包括在产生异戊二烯的合适条件下培养重组细胞，所述重组细胞包含编码来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸以及(b)产生异戊二烯。该细胞可还包含编码上述MVA下游途径多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述异戊二烯合酶多肽的一种或多种核酸分子。在一些方面，重组细胞可以是任何本文所述的细胞。本文所述的具有各种酶促途径的重组细胞可用于产生异戊二烯，所述途径的操纵用于增加流向甲羟戊酸产生的碳流。在一些方面，重组细胞可进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所述基因选自：rpiA、rpe、tktA、tal B、pta和/或eutD。在另一个方面，这些菌株可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：zwf、pfkA、fba、gapA、ackA、gltA和/或pts。
在一些方面，在峰值绝对生产率时间点测量所产生的异戊二烯的量。在一些方面，细胞的峰值绝对生产率为大约任何本文公开的异戊二烯量。在一些方面，在峰值比生产率时间点测量所产生的异戊二烯的量。在一些方面，细胞的峰值比生产率为大约任何本文公开的每细胞异戊二烯量。在一些方面，测量所产生的异戊二烯的累积总量。在一些方面，细胞的累积总生产率为大约任何本文所公开的异戊二烯量。
在一些方面，任何本文所述的细胞(例如培养物中的细胞)以大于约如下中的任一者或以约如下中的任一者产生异戊二烯：1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000或更多纳摩尔的异戊二烯/克细胞湿重/小时(nmol/gwcm/hr)。在一些方面，异戊二烯的量为约 2至约5,000nmol/gwcm/hr，例如约2至约100nmol/gwcm/hr、约100至约500nmol/gwcm/hr、约150至约500nmol/gwcm/hr、约500至约1,000nmol/gwcm/hr、约1,000至约2,000nmol/gwcm/hr或约2,000至约5,000nmol/gwcm/hr。在一些方面，异戊二烯的量为约20至约5,000nmol/gwcm/hr、约100至约5,000nmol/gwcm/hr、约200至约2,000nmol/gwcm/hr、约200至约1,000nmol/gwcm/hr、约300至约1,000nmol/gwcm/hr或约400至约1,000nmol/gwcm/hr。
在一些方面，培养物中的细胞以大于如下的量或以约如下的量产生异戊二烯：1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000或更多纳克的异戊二烯/克细胞湿重/hr(ng/gwcm/h)。在一些方面，异戊二烯的量在约2至约5,000ng/gwcm/h之间，例如在约2至约100ng/gwcm/h、约100至约500ng/gwcm/h、约500至约1,000ng/gwcm/h、约1,000至约2,000ng/gwcm/h或约2,000至约5,000ng/gwcm/h之间。在一些方面，异戊二烯的量在约20至约5,000ng/gwcm/h、约100至约5,000ng/gwcm/h、约200至约2,000ng/gwcm/h、约200至约1,000ng/gwcm/h、约300至约1,000ng/gwcm/h或约400至约1,000ng/gwcm/h之间。
在一些方面，培养物中的细胞以大于约如下量中的任一者或以约如下量中的任一者产生累积滴度(总量)的异戊二烯：1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000或更多毫克的异戊二烯/L发酵液(mg/L发酵液，其中发酵液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些方面，异戊二烯的量在约2至约5,000mg/L发酵液之间，例如在约2至约100mg/L发酵液、约100至约500mg/L发酵液、约500至约1,000mg/L发酵液、约1,000至约2,000mg/L发酵液或约2,000至约5,000mg/L发酵液之间。在一些方面，异戊二烯的量在约20至约5,000mg/L发酵液、约100至约5,000mg/L发酵液、约200至约2,000mg/L发酵液、约200至约1,000mg/L发酵液、约300至约1,000mg/L发酵液或约400至约1,000mg/L发酵液之间。
在一些方面，培养物中的细胞所产生的异戊二烯包含至少约1、2、5、10、15、20或25体积％的发酵废气。在一些方面，异戊二烯包含约1至约25体积％的废气，例如约5至约15％、约15至约25％、约10至约20％或约1至约10％。
在某些实施例中，异戊二烯产生方法可包括如下步骤：(a)培养不内源性表达磷酸酮醇酶多肽的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述细胞异源性表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝以及(i)表达一种或多种MVA途径肽和(ii)异戊二烯合酶的一种或多种核酸以及(b)产生异戊二烯，其中与缺乏编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源拷贝的相同细胞相比，所述重组细胞显示出氧吸收率(OUR)减少。在某些实施例中，与不表达磷酸酮醇酶的重组细胞相比，表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个异源拷贝的重组细胞显示出OUR减少至多1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或7倍。
本文还提供制备具有增强的异戊二烯产生能力的产异戊二烯细胞的方法。本文所述细胞的异戊二烯产量可通过编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸、编码完整MVA途径多肽的一种或多种多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸的表达来提高。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆 菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。如本文所用，“提高的”异戊二烯产量是指与不具有编码磷酸酮醇酶多肽、MVA途径多肽和异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，任何本文所述组合物和方法所描述的细胞增加的针对异戊二烯的细胞生产力指数(CPI)、增加的异戊二烯滴度、增加的异戊二烯质量产率和/或增加的异戊二烯比生产率。异戊二烯的产量可提高约5％至约1,000,000倍。与不内源性表达磷酸酮醇酶的产异戊二烯细胞的异戊二烯产量相比，异戊二烯的产量可提高约10％至约1,000,000倍(如，约50％至约1,000,000倍、约1至约500,000倍、约1至约50,000倍、约1至约5,000倍、约1至约1,000倍、约1至约500倍、约1至约100倍、约1至约50倍、约5至约100,000倍、约5至约10,000倍、约5至约1,000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50,000倍、约50至约10,000倍、约100至约5,000倍、约200至约1,000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，本文所述的方法包括宿主细胞，所述宿主细胞进一步经工程改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的产异戊二烯细胞的异戊二烯产量相比，产量提高的异戊二烯。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌。
在其他方面，本文所述的方法涉及通过本文所述的细胞提高异戊二烯产量(如，通过编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的表达提 高)。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。异戊二烯的产量可提高约5％至约1,000,000倍。与不表达编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的产异戊二烯细胞的异戊二烯产量相比，异戊二烯的产量可提高约10％至约1,000,000倍(如，约50％至约1,000,000倍、约1至约500,000倍、约1至约50,000倍、约1至约5,000倍、约1至约1,000倍、约1至约500倍、约1至约100倍、约1至约50倍、约5至约100,000倍、约5至约10,000倍、约5至约1,000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50,000倍、约50至约 10,000倍、约100至约5,000倍、约200至约1,000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。与不表达编码磷酸酮醇酶的一种或多种异源核酸的产异戊二烯细胞的异戊二烯产量相比，异戊二烯的产量还可提高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍或1,000,000倍中的任何一者。在本文所述的某些实施例中，本文所述的方法包括宿主细胞，所述宿主细胞进一步经工程改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的细胞的异戊二烯产量相比，产量提高的异戊二烯。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌。
此外，可将更具体的细胞培养条件用于培养本文所述方法中的细胞。例如，在一些方面，用于产生异戊二烯的方法包括如下步骤：(a)在34℃下基本培养基中培养不内源性具有磷酸酮醇酶基因的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述重组细胞异源性表达(i)在低至中等拷贝质粒上并且在强启动子的调控下的编码磷酸酮醇酶多肽的异源基因的一个或多个拷贝，(ii)编码MVA途径多肽(MVA上游途径和MVA下游途径)的一种或多种多肽的异源核酸的一个或多个拷贝以及(iii)编码异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸；以及(b)产生异戊二烯。在某些实施例中，磷酸酮醇酶多肽来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的 磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一些方面，产生异戊二烯的方法还包括回收异戊二烯的步骤。
能够增加类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量的重组细胞
类异戊二烯可在多个生物体中由作为MVA途径的最终产物的类异戊二烯前体分子的合成产生。如上所述，类异戊二烯代表重要的一类化合物并且包括例如食品和饲料补充剂、风味和气味化合物以及抗癌化合物、抗疟疾化合物、抗真菌化合物和抗细菌化合物。
类异戊二烯作为一类分子，根据化合物中所包含的异戊二烯单位数对其进行分类。单萜包含十个碳或两个异戊二烯单位，倍半萜包含15个碳或三个异戊二烯单位，二萜包含20个碳或四个异戊二烯单位，二倍半萜包含25个碳或五个异戊二烯单位等等。类固醇(通常包含约27个碳)为裂解或重排的类异戊二烯产物。
类异戊二烯可由类异戊二烯前体分子IPP和DMAPP产生。这些各式各样的化合物衍生自这些相当简单的通用前体并且由成组的保守聚异戊二烯焦磷酸合酶合成(Hsieh et al.,Plant Physiol.2011Mar；155(3):1079-90(Hsieh等人，《植物生理学》，2011年3月，第155卷，第3期，第1079-1090页))。这些直链异戊二烯焦磷酸的各种链长(反映它们独特的生理学功能)通常由聚异戊二烯焦磷酸合酶高度发达的活性位点经由烯 丙基底物(二甲基烯丙基二磷酸(C5-DMAPP)、香叶基焦磷酸(C10-GPP)、法尼基焦磷酸(C15-FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(C20-GGPP))与对应数目的异戊烯焦磷酸(C5-IPP)的缩合反应决定(Hsieh et al.,Plant Physiol.2011Mar；155(3):1079-90(Hsieh等人，《植物生理学》，2011年3月，第155卷，第3期，第1079-1090页))。
类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产生可通过使用包含编码磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝、以增加类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量的任何重组宿主细胞来进行。在一些方面，这些细胞还包含一种或多种编码如上所述的MVA途径、IDI和/或DXP途径的多肽的异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸。不受理论的束缚，据认为通过任何上述组合物和方法增加重组细胞中甲羟戊酸的细胞产量将类似地导致产生较高量的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。当与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯二磷酸异构酶和用于异戊二烯和类异戊二烯产生的其他适当酶的适当酶活性水平组合时，增加从葡萄糖产生甲羟戊酸的摩尔产率转化成较高的从葡萄糖产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯(包括异戊二烯)的摩尔产率。本文所述的具有各种酶促途径的重组细胞可用于产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯，所述途径的操纵用于增加流向甲羟戊酸产生的碳流。在一些方面，重组细胞可进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所述基因选自：rpiA、rpe、tktA、tal B、pta和/或eutD。在另一个方面，这些菌株可进一步工程改造以降低以下基因的一种或多种基因的活性，所述基因包括：zwf、pfkA、fba、gapA、ackA、gltA和/或pts。
类异戊二烯的类型
本发明的重组细胞能够增加类异戊二烯和类异戊二烯前体分子DMAPP和IPP的产量。类异戊二烯的例子包括(不限于)半萜类化合物、单萜类化合物、倍半萜类化合物、二萜类化合物、二倍半萜类化合物、三萜类化合物、四萜类化合物和更高级的多萜类化合物。在一些方面，半萜类化合物为戊二烯醇(即3-甲基-2-丁烯-1-醇)、异戊二烯醇(即3-甲基-3-丁烯-1-醇)、2-甲基-3-丁烯-2-醇或异戊酸。在一些方面，单萜类化合物可以为(不限于)香叶基焦磷酸、桉叶素、柠檬烯或蒎烯。在一些 方面，倍半萜类化合物为法尼基焦磷酸、青蒿素或没药醇。在一些方面，二萜类化合物可以为(不限于)香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醛、植醇、紫杉醇、毛喉素(forskolin)或阿非迪霉素(aphidicolin)。在一些方面，三萜类化合物可以为(不限于)角鲨烯或羊毛甾醇。类异戊二烯还可以选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。
在一些方面，四萜类化合物为番茄红素或胡萝卜素(类胡萝卜素)。如本文所用，术语“类胡萝卜素”是指一组天然存在的有机色素，其在植物、一些其他光合生物体如藻类的叶绿体和色质体中、在某些类型的真菌以及在某些细菌中产生。类胡萝卜素类包括含氧叶黄素类和非含氧胡萝卜素类。在一些方面，类胡萝卜素类选自叶黄素类和胡萝卜素类。在一些方面，叶黄素类为叶黄素或玉米黄质。在一些方面，类胡萝卜素为α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ胡萝卜素、β-隐黄质或番茄红素。
编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸
在本发明的一些方面，任何本文组合物或方法中所述的细胞还包含编码如上所述的甲羟戊酸(MVA)途径多肽的一种或多种核酸以及编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸。该聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽可以为内源多肽。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可有效连接至组成型启动子或可类似地有效连接至诱导型启动子。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可另外有效连接至强启动子。或者，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可有效连接至弱启动子。具体地讲，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽。
在一些方面，聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽为异源多肽。本发明的细胞可包含不止一个拷贝的编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核 酸有效连接至强启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至弱启动子。
编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组中，或者可在细胞中稳定表达。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸另外可位于载体上。
示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸包括编码具有聚异戊二烯焦磷酸合酶的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽将类异戊二烯前体分子转化成更复杂的类异戊二烯化合物。示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然存在的多肽和核酸。此外，聚异戊二烯焦磷酸合酶的变体可具有改善的活性如改善的酶活性。在一些方面，聚异戊二烯焦磷酸合酶变体具有其他改善的特性，例如改善的稳定性(如，热稳定性)和/或改善的溶解性。示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸可包括编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽例如(不限于)香叶基二磷酸(GPP)合酶、法尼基焦磷酸(FPP)合酶和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶或任何其他已知聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸。
在本发明的一些方面，任何本文组合物或方法中所述的细胞还包含一种或多种编码法尼基焦磷酸(FPP)合酶的核酸。FPP合酶多肽可以为内源基因编码的内源多肽。在一些方面，FPP合酶多肽由大肠杆菌中的内源ispA基因编码。编码FPP合酶多肽的内源核酸可有效连接至组成型启动子或可类似地有效连接至诱导型启动子。编码FPP合酶多肽的内源核酸可另外有效连接至强启动子。具体地讲，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源FPP合酶多肽。
在一些方面，FPP合酶多肽为异源多肽。本发明的细胞可包含不止一个拷贝的编码FPP合酶多肽的异源核酸。在一些方面，编码FPP合酶多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码FPP合酶多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至强启动子。
编码FPP合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组中，或者可在细胞中稳定表达。编码FPP合酶的核酸另外可位于载体上。
可使用标准的方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将IPP转化为更高级的类异戊二烯的能力，来确定该多肽是否具有聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽活性。这些方法是本领域所熟知的并且例如在如下参考文献中进行描述：美国专利No.7,915,026；Hsieh et al.,Plant Physiol.2011Mar；155(3):1079-90(Hsieh等人，《植物生理学》，2011年3月，第155卷，第3期，第1079-1090页)；Danner et al.,Phytochemistry.2011Apr12[Epub ahead of print](Danner等人，《植物化学》，2011年4月12日[印刷版之前的电子出版物])；Jones et al.,J Biol Chem.2011Mar24[Epub ahead of print](Jones等人，《生物化学杂志》，2011年3月24日[印刷版之前的电子出版物])；Keeling et al.,BMC Plant Biol.2011Mar7；11:43(Keeling等人，《BMC植物生物学》，2011年3月7日；第11卷，第43页)；Martin et al.,BMC Plant Biol.2010Oct21；10:226(Martin等人，《BMC植物生物学》，2010年10月21日；第10卷，第226页)；Kumeta&Ito,Plant Physiol.2010Dec；154(4):1998-2007(Kumeta和Ito，《植物生理学》，2010年12月，第154卷，第4期，第1998-2007页)；以及![]()
&Boland,J Org Chem.2010Aug20；75(16):5590-600(![]()
和Boland，《有机化学杂志》，2010年8月20日，第75卷，第16期，第5590-5600页)。
能够增加类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量的重组细胞
本文所述的重组细胞(如，重组细菌细胞)具有产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的能力，当在相同条件下培养时，所产生的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的量和/或浓度高于缺乏编码磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝、编码MVA途径多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸的相同细胞。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自罗伊氏乳杆菌的磷酸酮醇酶的异源性核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施 例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一些方面，编码磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝、编码MVA途径多肽的异源核酸的一个或多个拷贝和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸为整合进宿主细胞的染色体的异源核酸。重组细胞可产生的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的量比不包含磷酸酮醇酶多肽的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体的重组细胞高至少5％。或者，与不表达编码磷酸酮醇酶的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体的细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产量相比，重组细胞可产生的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯高约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，包括这些数以及这些数之间的任何数值。在本文所述的某些实施例中，本文的方法包括宿主细胞，所述宿主细胞进一步经工程 改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产量相比，产量提高的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体。
在本发明的一个方面，提供了包含编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸、编码一种或多种完整MVA途径多肽(即，MVA上游途径和MVA下游途径)的一种或多种异源核酸、编码聚异戊二烯焦磷酸合酶的一种或多种异源核酸和/或编码DXP途径多肽的一种或多种异源核酸的重组细胞。该细胞可还包含一种或多种编码IDI多肽的异源核酸。另外，该聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽可以为FPP合酶多肽。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从达松维尔拟诺卡氏菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异 源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。该一种或多种异源核酸可有效连接至组成型启动子、可有效连接至诱导型启动子或可有效连接至诱导型启动子和组成型启动子的组合。该一种或多种异源核酸可另外有效连接至强启动子、弱启动子和/或中等启动子。编码磷酸酮醇酶多肽、一种或多种完整MVA途径多肽(即，MVA上游途径和MVA下游途径)、聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸和/或编码DXP途径多肽的一种或多种异源核酸可整合进宿主细胞的基因组中，或者可在细胞中稳定表达。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。一种或多种异源核酸另外可位于一个或多个载体上。
本文提供可提供类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量提高的重组细胞。细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量可通过编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸、编码完整MVA途径(即，MVA上游途径和MVA下游途径)的一种或多种多肽的一种或多种异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸的表达提高。在某些实施例中，编码磷酸酮醇酶肽的异源核酸的一个或多个拷贝来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达 松维尔拟诺卡氏菌。在一个实施例中，重组细胞包含编码从罗伊氏乳杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从巴利阿里铁单胞菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码从Pedobactor saltans分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码从灰色链霉菌分离的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自达松维尔拟诺卡氏菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在其他实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，本文所述的重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在一个实施例中，重组细胞包含编码分离自丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在另一个实施例中，重组细胞包含编码分离自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。在又一个实施例中，重组细胞包含编码分离自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的异源核酸的一个或多个拷贝。如本文所用，“提高的”类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量是指与不具有编码磷酸酮醇酶、完整MVA途径的一种或多种多肽和聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，任何本文所述组合物和方法所描述的细胞增加的针对类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量的细胞生产力指数(CPI)、增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯滴度、增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯质量产率和/或增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯比生产率。类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量可提高约5％至约1,000,000倍。与不表达编码磷酸酮醇酶的一种或多种异源核酸的细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体 产量相比，类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量可提高约10％至约1,000,000倍(如，约1至约500,000倍、约1至约50,000倍、约1至约5,000倍、约1至约1,000倍、约1至约500倍、约1至约100倍、约1至约50倍、约5至约100,000倍、约5至约10,000倍、约5至约1,000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50,000倍、约50至约10,000倍、约100至约5,000倍、约200至约1,000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，重组宿主细胞进一步经工程改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产量相比，产量提高的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体。
本文所述的细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量可提高(如，通过编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸、编码MVA下游途径多肽的一种或多种异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸的表达来提高)。类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量可提高约5％至约1,000,000倍。与天然存在的细胞(如，不表达编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的细胞)的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量相比，类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量可提高约10％ 至约1,000,000倍(如，约1至约500,000倍、约1至约50,000倍、约1至约5,000倍、约1至约1,000倍、约1至约500倍、约1至约100倍、约1至约50倍、约5至约100,000倍、约5至约10,000倍、约5至约1,000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50,000倍、约50至约10,000倍、约100至约5,000倍、约200至约1,000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。
在其他实施例中，与不表达编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯前体和/或类异戊二烯重组细胞的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量相比，本文所述的重组细胞可提供的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量还可提高至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍或1,000,000倍中的任何一者。
使用重组细胞生成类异戊二烯和/或类异戊二烯前体分子的方法
本文还提供产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，所述方法包括培养包含编码磷酸酮醇酶和聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸的重组细胞(如，重组细菌细胞)。在某些实施例中，重组细胞还包含编码MVA上游途径多肽和MVA下游途径多肽的一种或多种异源核酸。类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯可由任何本文所述的细胞并且根据本文所述的任何方法产生。任何细胞可用于从碳水化合物(包括六碳糖如葡萄糖)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的目的。
在某些方面，本文提供制备类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，所述方法包括在产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的合适条件下培养重组细胞，所述重组细胞包含编码来自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌的磷酸酮醇酶多肽、来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS多肽的一种或多种异源核酸，以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。该细胞可还包含一种或多种编码上述MVA下游途径多肽(如MVK、PMK、MVD和/或 IDI)和任何上述聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸分子。在一些方面，重组细胞可以是任何本文所述的细胞。任何本文所述聚异戊二烯焦磷酸合酶或其变体、任何本文所述宿主细胞菌株、任何本文所述启动子和/或任何本文所述载体也可用于利用任何本文所述能量来源(如葡萄糖或任何其他六碳糖)来产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
在某些方面，本文提供制备类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，所述方法包括在产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的合适条件下培养重组细胞，所述重组细胞包含编码来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌、和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶多肽、来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS多肽的一种或多种异源核酸，以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。该细胞可还包含一种或多种编码上述MVA下游途径多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸分子。在一些方面，重组细胞可以是任何本文所述的细胞。任何本文所述聚异戊二烯焦磷酸合酶或其变体、任何本文所述宿主细胞菌株、任何本文所述启动子和/或任何本文所述载体也可用于利用任何本文所述能量来源(如葡萄糖或任何其他六碳糖)来产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法可相似地包括如下步骤：(a)培养不内源性具有磷酸酮醇酶的重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中所述重组细胞异源性表达编码磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝；以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯，其中与不包含磷酸酮醇酶多肽的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体细胞相比，所述重组细胞产生的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的量更高。
与不包含磷酸酮醇酶多肽的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体重组细胞相比，本发明的产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法可产生类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的量高至少5％。或者，所述重组细胞可 产生高约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯，包括这些百分数。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
本文提供使用任何上述细胞提高类异戊二烯和/或类异戊二烯前体分子产量的方法。可通过编码磷酸酮醇酶和/或来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS多肽的一种或多种异源核酸、编码MVA下游途径多肽的一种或多种异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸的表达来提高细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产量。如本文所述，“提高的”类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量是指与不具有编码磷酸酮醇酶、聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽、MVA下游途径多肽、来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌的mvaE和mvaS多肽的一种或多种异源核酸的细胞相比，本文所述的任何组合物和方法所描述的细胞增加的针对类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量的细胞生产力指数(CPI)、增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯滴度、增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯质量产率和/或增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯比生产率。类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量可提高约5％至约1,000,000倍。与不表达编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产量相比，类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量可提高约10％至约1,000,000倍(如，约1至约500,000倍、约1至约50,000倍、约1至约5,000倍、约1至约1,000倍、约1至约500倍、约1至约100倍、约1至约50倍、约5至约100,000倍、约5至约10,000倍、约5至约1,000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50,000倍、约50至约10,000倍、约100至约5,000倍、约200至约1,000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。在本文所述的某些实施例中，所述方法包括重组宿主细胞，所述重组宿主细胞进一步经工程改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的产类异戊 二烯和/或类异戊二烯前体细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产量相比，产量提高的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体。
与不表达编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源核酸的产类异戊二烯前体和/或类异戊二烯细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产量相比，类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量也可通过本文所述的方法提高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍、10,000倍、20,000倍、50,000倍、100,000倍、200,000倍、500,000倍或1,000,000倍中的任何一者。在本文所述的某些实施例中，所述方法包括重组宿主细胞，所述重组宿主细胞进一步经工程改造以用于增加流向MVA产生的碳，从而提供与不表达编码磷酸酮醇酶肽的一种或多种异源核酸并且未经工程改造以用于增加流向甲羟戊酸产生的碳的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体细胞的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体产量相比，产量提高的类异戊二烯和/或类异戊二烯前体。
此外，可将更具体的细胞培养条件用于培养本文所述方法中的细胞。例如，在一些方面，用于产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法包括如下步骤：(a)在基本培养基中34℃下培养重组细胞(包括但不限于大肠杆菌细胞)，所述重组细胞包含编码磷酸酮醇酶多肽的异源核酸并且不内源性具有来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE基因和mvaS基因，其中所述重组细胞异源性表达在低至中等拷贝质粒上并且在强启动子的调控下的编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝；以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。在一些方面，所述方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。在一些方面，其中重组细胞异源性表达编码来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶多肽的基因的一个或多个拷贝。
载体
可将合适的载体用于任何本文所述组合物和方法。例如，合适的载体可用于在特定宿主细胞(如，大肠杆菌)中优化编码磷酸酮醇酶、MVA上游途径多肽(包括但不限于mvaE和mvaS多肽)、MVA下游途径多肽、异戊二烯合酶或聚异戊二烯焦磷酸合酶的基因的一个或多个拷贝的表达。在某些方面，载体包含选择性标记。可选标记的例子包括(但不限于)抗生素抗性核酸(如，卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博莱霉素、新霉素或氯四环素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(诸如营养优势)的核酸。在一些方面，将磷酸酮醇酶、MVA上游途径多肽(包括但不限于mvaE和mvaS多肽)、MVA下游途径多肽、来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS核酸、异戊二烯合酶或聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸的一个或多个拷贝整合进无选择性标记的宿主细胞的基因组中。
本文表征的或本公开的实例所用的载体中的任何一者均可用于本发明。
转化方法
编码磷酸酮醇酶、MVA上游途径多肽(包括但不限于mvaE和mvaS多肽)、一个MVA下游途径多肽和/或多个MVA下游途径多肽的一个或多个拷贝的核酸可使用合适的技术插入细胞。另外，可使用将DNA构建体或载体引入宿主细胞中的标准技术，例如转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(如脂质转染介导的或DEAE-糊精介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)、使用磷酸钙-DNA沉淀进行温育、用DNA包被的微粒进行高速轰击以及原生质体融合，将异戊二烯合酶、IDI、DXP途径和/或聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸或含有它们的载体插入宿主细胞(如本文所述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)中。通用的转化技术是本领域已知的(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.(eds.)Chapter9,1987(《分子生物学实验室指南》，F.M.Ausubel等人编辑，第9章，1987年)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor,1989(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，冷泉港，1989年)；以及Campbell et al., Curr.Genet.16:53-56,1989(Campbell等人，《当代遗传学》，第16卷，第53-56页，1989年)。所引入的核酸可整合进染色体DNA中或作为染色体外复制型序列维持。可以通过本领域中已知的任何方法选择转化体。合适的选择转化体的方法在国际专利公布No.WO2009/076676、美国专利公布No.2009/0203102、WO2010/003007、美国专利公布No.2010/0048964、WO2009/132220以及美国专利公布No.2010/0003716中进行了描述。
示例性的宿主细胞
本领域的技术人员将认识到，可对表达载体进行设计，以包含优化某些宿主菌株的基因表达的某些元件。此类优化元件包括但不限于复制起点、启动子和增强子。本文提及的载体和元件仅出于示例性目的进行描述，且不旨在缩小本发明的范围。
可用于异源性表达基因的任何细胞或其子代可用于表达分离自罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌、巴利阿里铁单胞菌、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌的一种或多种磷酸酮醇酶，以及表达一种或多种MVA途径肽、异戊二烯合酶、IDI、DXP途径多肽和/或聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸。在一些实施例中，宿主细胞为革兰氏阳性细菌。非限制性例子包括链霉菌属的菌株(如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌或灰色链霉菌)、芽孢杆菌属的菌株、李斯特氏菌属的菌株(如单核细胞增生李斯特菌)或乳杆菌属的菌株(如L.spp)。在一些实施例中，来源生物体为革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌、假单胞菌或幽门螺旋杆菌。
包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的细菌细胞可用于表达上文所述的任何异源基因。具体而言，mvaE和mvaS基因可在如下细胞中的任一者中表达：柠檬泛菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、耐盐芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、灿烂芽孢杆菌细胞、苏云金芽孢杆菌细胞、白色链霉菌细胞、变铅青链霉菌细胞、天蓝 色链霉菌细胞、灰色链霉菌细胞、假单胞菌属物种细胞和产碱假单胞菌细胞。
存在许多类型的可在本发明的组合物和方法中用作宿主细胞的厌氧细胞。在本发明的一个方面，在本文所述的任何组合物或方法中所述的细胞为专性厌氧细胞及其子代。专性厌氧菌在存在氧的条件下通常生长不良，或根本不生长。应当理解，可以存在少量的氧，也就是说，存在专性厌氧菌对低水平氧的一定耐受度。在一个方面，经工程改造以产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯的专性厌氧菌可作为本文所述的任何方法和/或组合物的宿主细胞，并在基本上无氧的条件下生长，其中氧的存在量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害。
在本发明的另一方面，在本文所述的任何组合物或方法中所述和/或所用的宿主细胞为兼性厌氧细胞及其子代。兼性厌氧菌可在存在氧时通过有氧呼吸(例如利用TCA循环)生成细胞ATP。然而，兼性厌氧菌也可在不存在氧的情况下生长。这与在存在较高氧含量下死亡或生长不良的专性厌氧菌形成对照。在一个方面，因此，兼性厌氧菌可作为本文提供的任何组合物和/或方法的宿主细胞，并可经工程改造以产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯。兼性厌氧宿主细胞可在基本上无氧的条件下生长，其中氧的存在量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害，或者作为另外一种选择可在存在较高氧含量的情况下生长。
宿主细胞另外可以为丝状真菌细胞及其子代。(参见例如Berka&Barnett,Biotechnology Advances,(1989),7(2):127-154(Berka和Barnett，《生物技术进展》，1989年，第7卷第2期，127-154页))。在一些方面，丝状真菌细胞可以为以下任何一者：长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(T.viride)、康宁木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum)、青霉属(Penicillium sp.)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(H.lanuginose)、灰腐质霉(H.grisea)、金孢霉属(Chrysosporium sp.)、勒克瑙金孢菌(C.lucknowense)、粘帚霉属(Gliocladium sp.)、曲霉菌(Aspergillus sp.)(诸如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori))、镰孢属(Fusarium sp.)(诸如粉红镰孢(F.roseum)、禾赤镰孢(F.graminum)、F. cerealis、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)或镰孢霉(F.venenatum))、脉孢菌属(Neurospora sp.)(诸如粗糙脉孢菌(N.crassa))、肉座菌属(Hypocrea sp.)、毛霉属(Mucor sp.)(诸如米黑毛霉(M.miehei))、根霉属(Rhizopus sp.)或裸胞壳属。在一些方面，真菌为构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌或腐皮镰孢霉。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利公布No.US2011/0045563中描述的那些。
宿主细胞也可以为酵母，诸如酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属或假丝酵母属。在一些方面，酵母属为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(参见例如Romanos et al.,Yeast,(1992),8(6):423-488(Romanos等人，《酵母》，1992年，第8卷第6期，第423-488页))。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利No,7,659,097和美国专利公布No.US2011/0045563中描述的那些。
宿主细胞还可以为藻类物种，例如绿藻、红藻、灰藻、chlorarachniophyte、眼虫、色藻界或沟鞭藻类。(参见例如Saunders&Warmbrodt,“Gene Expression in Algae and Fungi,Including Yeast,”(1993),National Agricultural Library,Beltsville,MD(Saunders和Warmbrodt，《藻类和真菌(包括酵母)中的基因表达》，1993年，马里兰州贝尔茨维尔美国国家农业图书馆))。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利公布No.US2011/0045563中描述的那些。在一些方面，宿主细胞为蓝细菌，例如基于形态学分类成以下任何组的蓝细菌：色球藻目、宽球藻目、颤藻目、念珠藻目或真枝藻目(参见例如Lindberg et al.,Metab.Eng.,(2010)12(1):70-79(Lindberg等人，《代谢工程》，2010年，第12卷第1期，第70-79页))。在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利公布No.US2010/0297749、US2009/0282545和国际专利申请No.WO2011/034863中所述的那些。
大肠杆菌宿主细胞可用于表达来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏 菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的一种或多种磷酸酮醇酶以及编码一种或多种MVA途径多肽、异戊二烯合酶、IDI、DXP途径多肽和/或聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种异源核酸。在一个方面，宿主细胞是能够产生甲羟戊酸的大肠杆菌菌株或其子代的重组细胞，所述重组细胞表达编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶的一种或多种核酸以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸。大肠杆菌宿主细胞可产生的甲羟戊酸的量、峰值滴度和细胞生产力高于缺乏编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸的相同细胞。此外，大肠杆菌中的编码来自丙酮丁醇梭菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、类植物乳杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、阴道加德纳菌、巴利阿里铁单胞菌、梭状冻胶样杆菌、点形念珠藻、点形念珠藻PCC73102、泛菌属、Pedobactor saltans、水生拉恩氏菌、沼泽红假单胞菌、灰色链霉菌、除虫链霉菌、达松维尔拟诺卡氏菌和/或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸以及表达一种或多种MVA途径肽的一种或多种异源核酸可以是染色体拷贝(如，整合进大肠杆菌染色体中)。在其他方面，大肠杆菌细胞正在培养中。在一些方面，一种或多种磷酸酮醇酶来自丙酮丁醇梭菌、长双歧杆菌和/或鹑鸡肠球菌。在任何方面，一种或多种磷酸酮醇酶是如本文公开的任何磷酸酮醇酶。
示例性宿主细胞修饰
柠檬酸合酶途径
柠檬酸合酶催化草酰乙酸和乙酰辅酶A的缩合以形成柠檬酸，其为三羧酸(TCA)循环的代谢物(Ner,S.et al.1983.Biochemistry,22:5243-5249(Ner,S.等人，1983年，《生物化学》，第22卷，第5243-5249页)；Bhayana,V.and Duckworth,H.1984.Biochemistry23:2900-2905(Bhayana,V.和Duckworth,H.，1984年，《生物化学》，第23卷，第2900-2905页))。在大肠杆菌中，这种由gltA编码的酶在表现上与二聚亚基的三聚体相似。该六聚体形式允许该酶由NADH别构调节。该酶已得到了广泛研究(Wiegand,G.,and Remington,S.1986.Annual Rev.Biophysics Biophys.Chem.15:97-117(Wiegand,G.和Remington,S.，1986年，《生物物理学和生物物理化学年评》，第15卷，第97-117页)；Duckworth et al.1987.Biochem Soc Symp.54:83-92(Duckworth等人，1987年，《生物化学学会论文集》，第54卷，第83-92页)；Stockell,D.et al.2003.J.Biol.Chem.278:35435-43(Stockell,D.等人，2003年，《生物化学杂志》，第278卷，第35435-35443页)；Maurus,R.et al.2003.Biochemistry.42:5555-5565(Maurus,R.等人，2003年，《生物化学》，第42卷，第5555-5565页))。为了避免NADH产生的别构抑制，已考虑了通过枯草芽孢杆菌NADH非敏感性柠檬酸合酶进行替换或补充(Underwood et al.2002.Appl.Environ.Microbiol.68:1071-1081(Underwood等人，2002年，《应用和环境微生物学》，第68卷，第1071-1081页)；Sanchez et al.2005.Met.Eng.7:229-239(Sanchez等人，2005年，《代谢工程》，第7卷，第229-239页)。
由柠檬酸合酶催化的反应直接与催化甲羟戊酸途径第一步的硫解酶竞争，因为它们都以乙酰辅酶A作为底物(Hedl et al.2002.J.Bact.184:2116-2122(Hedl等人，2002年，《细菌学杂志》，第184卷，第2116-2122页))。因此，本领域的技术人员可以调节柠檬酸合酶的表达(如，降低酶活性)以允许更多的碳流入甲羟戊酸途径，从而增加甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。柠檬酸合酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、 20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些方面，柠檬酸合酶的活性通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性而进行调节。这可通过用编码NADH非敏感性柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换或通过使用衍生自枯草芽孢杆菌的编码NADH非敏感性柠檬酸合酶的转基因来实现。还可通过用合成的组成型低表达启动子代替内源柠檬酸合酶基因启动子来调节(如降低)柠檬酸合酶的活性。还可缺失编码柠檬酸合酶的基因。柠檬酸合酶活性的降低可导致与柠檬酸合酶的表达不降低的细胞相比，更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸，并且进一步工程改造以降低柠檬酸合酶(gltA)活性的重组细胞。本文还设想了柠檬酸合酶同功酶的活性调节(如，降低)。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低柠檬酸合酶同功酶活性的重组细胞。
涉及磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的途径
磷酸转乙酰酶(在大肠杆菌中由(i)pta(Shimizu et al.1969.Biochim.Biophys.Acta191:550-558(Shimizu等人，1969年，《生物化学和生物物理学学报》，第191卷，第550-558页)或(ii)eutD(Bologna et al.2010.J of Microbiology.48:629-636(Bologna等人，2010年，《微生物学杂志》，第48卷，第629-636页)编码)催化乙酰辅酶A和乙酰磷酸(乙酰基-P)之间的可逆转化，而乙酸激酶(在大肠杆菌中由ackA编码)(Kakuda,H.et al.1994.J.Biochem.11:916-922(Kakuda,H.等人，1994年，《生物化学杂志》，第11卷，第916-922页))则使用乙酰基-P形成乙酸。这些基因可在大肠杆菌中作为操纵子而转录。它们一起催化乙酸的异化，同时释放ATP。因此，通过提高磷酸转乙酰酶的活性增加走向乙酰辅酶A的乙酰基-P的量是可能的。在某些实施例中，提高可通过在染色体中基因的上游放置上调启动子，或将基因的拷贝置于质粒上的适当启动子之后实现。为了减少走向乙酸的乙酰辅酶A的量，可降低或减弱乙酸激酶基因(如，内源乙酸激酶基因)的活性。在某些实施例中，减弱通过乙酸激酶(ackA)缺失 实现。这通过如下实现：用氯霉素盒置换基因，然后将该盒环出。在一些方面，乙酸激酶的活性通过降低内源乙酸激酶的活性来调节。这可通过用合成的组成型低表达启动子代替内源乙酸激酶基因启动子来实现。在某些实施例中，乙酸激酶基因的减弱应通过中断磷酸转乙酰酶(pta)基因的表达进行。乙酸由大肠杆菌因多种原因而产生(Wolfe,A.2005.Microb.Mol.Biol.Rev.69:12-50(Wolfe,A.，2005年，《微生物学和分子生物学评论》，第69卷，第12-50页))。不受理论的约束，ackA的缺失可导致转向乙酸产生的碳减少(因为ackA使用乙酰辅酶A)，从而增加甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的产率。
在一些方面，与不具有减弱的内源乙酸激酶基因表达或提高的磷酸转乙酰酶的细胞相比，本文所述的重组细胞产生的乙酸量减少。所产生乙酸的量的减少可通过本领域技术人员已知的常规测定法进行测量。与不对内源乙酸激酶基因表达或磷酸转乙酰酶基因表达进行分子操纵时相比，乙酸减少的量为至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
磷酸转乙酰酶(pta和/或eutD)的活性可通过酶的其他分子操纵增加。酶活性增加可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性增加任何量。在某些情况下，酶活性增加为增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施例中，pta的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs，或通过使其从质粒表达而增加。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加磷酸转乙酰酶(pta和/或eutD)的活性的重组细胞。本文还设想了磷酸转乙酰酶同功酶的活性调节(如，增加)。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加磷酸转乙酰酶(pta和/或eutD)同功酶的活性的重组细胞。
乙酸激酶(ackA)的活性还可通过对酶进行其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低乙酸激酶(ackA)活性的重组细胞。本文还设想了乙酸激酶同功酶的活性调节(如，降低)。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低乙酸激酶同功酶活性的重组细胞。
在一些情况下，与内源乙酸基因表达不减弱的细胞相比，减弱内源乙酸激酶基因的活性导致更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
涉及乳酸脱氢酶的途径
在大肠杆菌中，D-乳酸通过乳酸脱氢酶(由ldhA编码–图1)由丙酮酸产生(Bunch,P.et al.1997.Microbiol.143:187-195(Bunch,P.等人，1997年，《微生物学》，第143卷，第187-195页))。乳酸的产生伴随NADH的氧化，因此，当氧被限制并且无法适应所有还原当量时，将产生乳酸。因此，乳酸的产生可能是碳消耗源。这样，为了改善通向甲羟戊酸产生(以及异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯产生，如果需要的话)的碳流量，本领域技术人员可调节乳酸脱氢酶的活性，例如通过降低该酶的活性来调节。
因此，在一个方面，乳酸脱氢酶的活性可通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性而进行调节。这种减弱可以通过使内源乳酸脱氢酶基因缺失来实现。也可以使用本领域技术人员已知的减弱乳酸脱氢酶基因活性的其他方式。通过操纵涉及乳酸脱氢酶的途径，重组细胞与内源乳酸脱氢酶基因表达不减弱的细胞相比产生量减少的乳酸。所产生乳酸的量的减少可通过本领域技术人员已知的常规测定法测量。乳酸减少的量与未进行分子操纵时相比为至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、 15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
乳酸脱氢酶的活性还可以通过对酶进行其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
因此，在一些情况下，减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因表达不减弱细胞相比，更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
涉及甘油醛-3-磷酸的途径
甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)是催化甘油醛-3-磷酸转化为1,3-二磷酸-D-甘油酸的糖酵解关键酶(Branlant G.and Branlant C.1985.Eur.J.Biochem.150:61-66(Branlant G.和Branlant C.，1985年，《欧洲生物化学杂志》，第150卷，第61-66页))。
为了将碳导向磷酸酮醇酶，可调节甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达(如，降低酶活性)以允许更多的碳流向果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸，从而增加甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些方面，甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性通过降低内源甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性调节。这可通过用合成的组成型低表达启动子置换内源甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子实现。也可缺失编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因也可被催化相同反应但产生NADPH而不是NADH的芽孢杆菌属酶置换。与不具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶表达降低的细胞相比，甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性降低可导致更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在本发明的任何方面，本 文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)的活性的重组细胞。本文还设想了甘油醛-3-磷酸脱氢酶同功酶的活性调节(如，降低)。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)同功酶的活性的重组细胞。
涉及恩特纳－杜德洛夫(Entner-Doudoroff)途径的途径
恩特纳－杜德洛夫(ED)途径为埃姆登-迈耶霍夫-帕那斯途径(Emden-Meyerhoff-Parnass)(EMP–糖酵解)途径的替代选择。某些生物体(像大肠杆菌)带有ED途径和EMP途径二者，而其他生物体仅具其中一者。枯草芽孢杆菌仅具有EMP途径，而运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)仅具有ED途径(Peekhaus and Conway.1998.J.Bact.180:3495-3502(Peekhaus和Conway，1998年，《细菌学杂志》，第180卷，第3495-3502页)；Stulke and Hillen.2000.Annu.Rev.Microbiol.54,849–880(Stulke和Hillen，2000年，《微生物学年评》，第54卷，第849–880页)；Dawes et al.1966.Biochem.J.98:795-803(Dawes等人，1996年，《生物化学杂志》，第98卷，第795-803页))。果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)与恩特纳－杜德洛夫途径相互作用，并且可逆催化果糖1,6-二磷酸转化为二羟基丙酮磷酸(DHAP)和甘油醛-3-磷酸(GAP)(Baldwin S.A.,et.al.,Biochem J.(1978)169(3):633-41(Baldwin S.A.等人，《生物化学杂志》，1978年，第169卷，第3期，第633-641页))。
磷酸葡糖酸脱水酶(edd)从6-磷酸-D-葡糖酸移除一分子H2O而形成2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸6-磷酸，而2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)催化醛醇裂解(Egan et al.1992.J.Bact.174:4638-4646(Egan等人，1992年，《细菌学杂志》，第174卷，第4638-4646页))。这两个基因均在一个操纵子内。
可导进磷酸酮醇酶途径的代谢物也可转入ED途径。为了避免代谢物损失于ED途径，将磷酸葡糖酸脱水酶基因(如，内源磷酸葡糖酸脱水酶基因)和/或2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因(如，内源2-酮-3-脱氧 葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因)活性减弱。实现减弱的一种方式是通过缺失磷酸葡糖酸脱水酶(edd)和/或2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)。这可通过如下实现：用氯霉素或卡那霉素盒代替一个基因或者两个基因，然后将该盒环出。没有这些酶活性，更多的碳可流过磷酸酮醇酶，因而增加甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的产率。
磷酸葡糖酸脱水酶(edd)和/或2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)的活性也可通过对该酶的其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些情况下，减弱内源磷酸葡糖酸脱水酶基因和/或内源2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因的活性导致与内源磷酸葡糖酸脱水酶基因和/或内源乙酸激酶2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶基因的表达不减弱的细胞相比，更多的碳流进甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
可导进磷酸酮醇酶途径的代谢物也可转入ED途径或EMP途径。为了避免代谢物损失以及增加果糖-6-磷酸(F6P)浓度，将果糖二磷酸醛缩酶(如，内源果糖二磷酸醛缩酶)活性减弱。在一些情况下，减弱内源果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)基因的活性导致与不减弱内源果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)基因表达的细胞相比，更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。在一些方面，减弱通过果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)的缺失实现。缺失可通过如下实现：用氯霉素或卡那霉素盒置换基因，然后将该盒环出。在一些方面，果糖二磷酸醛缩酶的活性通过降低内源果糖二磷酸醛缩酶的活性来调节。这可通过用合成的组成型低表达启动子置换内源果糖二磷酸醛缩酶基因启动子来实现。没有这些酶活性，更多的碳可流过磷酸酮醇酶，从而增加甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的产率。果糖二磷酸醛缩酶的活性也可通过对该酶的其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、 20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)活性的重组细胞。本文还设想了果糖二磷酸醛缩酶同功酶的活性调节(如，降低)。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低果糖二磷酸醛缩酶同功酶活性的重组细胞。
涉及磷酸戊糖途径的氧化分支的途径
大肠杆菌利用磷酸戊糖途径来分解己糖和戊糖以及给细胞提供用于多个合成代谢途径的中间体。其也是NADPH的主要产生者。磷酸戊糖途径由氧化分支(具有像葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)、6-磷酸葡糖酸内酯酶(pgl)或6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gnd)的酶)和非氧化分支(具有诸如转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶(talA或talB)、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和/或核糖-5-磷酸表异构酶、核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)和/或核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)之类的酶)构成(Sprenger.1995.Arch.Microbiol.164:324-330(Sprenger，1995年，《微生物学档案》，第164卷，第324-330页))。
为了将碳导向磷酸酮醇酶、磷酸戊糖途径的非氧化分支(转酮醇酶、转醛缩酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和/或核糖-5-磷酸表异构酶、核糖-5-磷酸异构酶A、核糖-5-磷酸异构酶B和/或核酮糖-5-磷酸3-表异构酶)，可调节表达(如，增加酶活性)以允许更多的碳流向果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸，从而增加甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶活性的增加可以是与在尚未实现任何操纵时相比，比活性或总活性的任何增加量。在某些情况下，该酶活性增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些方面，通过增加内源转酮醇酶、 转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶的活性来调节转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶的活性。这可通过用合成的组成型高表达启动子代替内源转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶基因启动子来实现。可将编码转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶的基因克隆于质粒上处于适当启动子后面。转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和/或核糖-5-磷酸表异构酶的活性增加可导致与转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和/或核糖-5-磷酸表异构酶的表达不增加的细胞相比，更多的碳流进甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加转酮醇酶(tktA和/或tktB)的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低转酮醇酶(tktA和/或tktB)的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加转醛醇酶(talA或talB)的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)的活性的重组细胞。本文还设想了葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)、6-磷酸葡糖酸内酯酶(pgl)、6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gnd)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶(talA或talB)、核酮糖-5-磷酸-表异构酶、核糖-5-磷酸表异构酶、核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)和/或核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)同功酶的活性调节(如，降低或增加)。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)同功酶的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含 如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加转酮醇酶(tktA和/或tktB)同功酶的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低转酮醇酶(tktA和/或tktB)同功酶的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加转醛醇酶(talA或talB)同功酶的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)同功酶的活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)同功酶的活性的重组细胞。
为了将碳导向磷酸酮醇酶，可调节葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(如，降低酶活性)。在一些方面，葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)的活性(如，内源葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶基因)可降低或减弱。在某些实施例中，减弱通过葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶缺失实现。在一些方面，葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶的活性通过降低内源葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶的活性调节。这可通过用合成的组成型低表达启动子置换内源葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶基因启动子实现。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶(zwf)的活性的重组细胞。本文还设想了葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶同功酶的活性调节(如，降低)。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低葡萄糖6-磷酸1-脱氢酶同功酶的活性的重组细胞。
涉及磷酸果糖激酶的途径
磷酸果糖激酶是糖酵解的关键酶，其催化果糖-6-磷酸的磷酸化。大肠杆菌具有由pfkA和pfkB编码的两种同功酶。细胞中的大部分磷酸果糖激酶活性是由于pfkA(Kotlarz et al.1975Biochim.Biophys.Acta381:257-268 (Kotlarz等人，1975年，《生物化学与生物物理学报》，第381卷，第257-268页))。
为了将碳导向磷酸酮醇酶，可调节磷酸果糖激酶表达(如，降低酶活性)以允许更多的碳流向果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸，从而增加甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。磷酸果糖激酶活性的降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些方面，通过降低内源磷酸果糖激酶的活性来调节磷酸果糖激酶的活性。这可通过用合成的组成型低表达启动子代替内源磷酸果糖激酶基因启动子来实现。还可缺失编码磷酸果糖激酶的基因。磷酸果糖激酶活性的降低可导致与磷酸果糖激酶的表达不降低的细胞相比，更多的碳流进甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低果糖-6-磷酸(pfkA和/或pfkB)的活性的重组细胞。本文还设想了果糖-6-磷酸同功酶的活性调节(如，降低)。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低果糖-6-磷酸同功酶活性的重组细胞。
涉及丙酮酸脱氢酶复合物的途径
催化丙酮酸脱羧成乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶复合物由基因aceE、aceF和lpdA编码的蛋白质构成。那些基因的转录由数种调节因子调节。因此，本领域的技术人员可通过调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性来增加乙酰辅酶A。调节可以是增加丙酮酸脱氢酶复合物的活性和/或表达(例如，恒定表达)。这可通过不同的方式实现，例如通过在操纵子前设置强组成型启动子如PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactgg cggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg-λ启动子，GenBank NC_001416，SEQ ID NO:14)，或使用一个或多个合成的组成型表达启动子。
因此，在一个方面，丙酮酸脱氢酶的活性通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一个或多个酶的活性来调节，所述丙酮酸脱氢酶复合物由如下组成：(a)丙酮酸脱氢酶(E1)，(b)二氢硫辛酸转乙酰酶和(c)二氢硫辛酸脱氢酶。应当理解可操纵编码这些酶的基因中的任何一者、二者或三者以增加丙酮酸脱氢酶的活性。在另一个方面，丙酮酸脱氢酶复合物的活性可通过如下文进一步详述降低内源丙酮酸脱氢酶复合物抑制因子的活性而进行调节。内源丙酮酸脱氢酶复合物抑制因子的活性可通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物抑制因子基因来减弱。
在一些情况下，编码丙酮酸脱氢酶复合物的一个或多个基因为内源基因。增加丙酮酸脱氢酶复合物活性的另一种方式是通过向细胞引入编码选自如下的一种或多种多肽的一种或多种异源核酸：(a)丙酮酸脱氢酶(E1)，(b)二氢硫辛酸转乙酰酶和(c)二氢硫辛酸脱氢酶。
通过使用任何这些方法，重组细胞与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的细胞相比可产生增加量的乙酰辅酶A。调节丙酮酸脱氢酶活性可导致与未调节丙酮酸脱氢酶表达的细胞相比有更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
涉及磷酸转移酶系统的途径
磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统(PTS)是在依赖于糖酵解中间体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)提供的能量的过程中同时跨膜转运和磷酸化其碳水化合物底物的多组分系统。调节PTS的基因大部分聚集于操纵子。例如，大肠杆菌的pts操纵子(ptsHIcrr)由编码以磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统(PTS)为中心的三个蛋白：HPr(ptsH)、酶I(ptsI)和EIIIGlc(crr)蛋白的ptsH、ptsI和crr基因构成。这三个基因组织于复合物操纵子中，其中远侧基因crr表达的主要部分从ptsI内启动子区起始。除编码磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性转运蛋白的pts操纵子基因ptsG之外，从该启动子区的ptsG转录处于分解代谢物激活蛋白(CAP)-环AMP(cAMP)的正调控下，并且在葡萄糖(PTS底物)存在下的生长期间增强。此外，ppsA基因编码用于产生磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，所 述生成需要磷酸转移酶系统(PTS)活性。碳通量由磷酸烯醇式丙酮酸合成酶引导通过丙酮酸脱氢酶途径或PTS途径。参见Postma,P.W.,et al.,Microbiol Rev.(1993),57(3):543-94)(Postma,P.W.等人，《微生物学综述》，1993年，第57卷，第3期，第543-594页)，该文献以引用方式全文并入本文。
在本文所述的某些实施例中，pts操纵子的下调(如，减弱)可提高宿主细胞的乙酸利用率。PTS操纵子活性下调可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，复合物活性的降低为降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施例中，减弱通过pts操纵子缺失实现。在一些方面，PTS系统的活性通过降低内源pts操纵子的活性调节。这可通过用合成的组成型低表达启动子替换pts操纵子内的内源启动子实现。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低pts操纵子活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低EI(ptsI)活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低EIICBGlc(ptsG)活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低EIIAGlc(crr)活性的重组细胞。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低HPr(ptsH)活性的重组细胞。为了减少通过丙酮酸脱氢酶的碳损失，同时增加用于葡萄糖吸收的PEP库，可增加磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)的活性。在本发明的任何方面，本文提供包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以增加磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)的活性的重组细胞。在本发明的任何其他方面，PTS下调并且葡萄糖转运途径上 调。葡萄糖转运途径包括但不限于半乳糖(galP)和葡糖激酶(glk)。在一些实施例中，pts操纵子下调，半乳糖(galP)基因上调，并且葡糖激酶(glk)基因上调。本文还设想了PTS同功酶的活性调节(如，降低)。在本发明的任何方面，本文提供了包含如本文所公开的编码磷酸酮醇酶多肽的一种或多种异源性表达核酸、并且进一步工程改造以降低PTS同功酶活性的重组细胞。
涉及木糖利用的途径
在本文所述的某些实施例中，期望利用木糖将来源于植物生物质的糖转化为所需产物，例如甲羟戊酸，如类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯。在一些生物体中，木糖利用需要使用戊糖磷酸途径转化用于代谢的果糖-6-磷酸。生物体可经工程改造以用于通过灭活葡萄糖对分解代谢物的抑制、或通过异源性表达可见于其他生物体中的木糖操纵子基因来提高木糖利用率。木酮糖途径可如下所述经工程改造以经由磷酸酮醇酶途径提高甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的产量。
提高木糖吸收率以及向木酮糖-5-磷酸的转化率然后直接进入磷酸酮醇酶途径可为有益的。不受理论的约束，这允许碳绕过戊糖磷酸途径流动(但一些甘油醛-3-磷酸可根据需要循环进入PPP)。木酮糖激酶表达的提高可用于增加木酮糖-5-磷酸的总体产量。木酮糖激酶表达和活性的优化可用于提高具有磷酸酮醇酶途径的菌株中的木糖利用率。所需的木酮糖激酶可以是内源宿主的酶或与宿主相容的任何异源木酮糖激酶。在一个实施例中，可过表达木糖操纵子的其他组分来增加有益效果(如，木糖异构酶)。在另一个实施例中，可能需要减弱(如，降低或缺失活性)其他木糖途径酶(如，木糖还原酶)。
因此，经工程改造以具有如本文所述的磷酸酮醇酶的宿主细胞可进一步经工程改造以过表达内源形式或异源形式的木酮糖异构酶和/或木酮糖激酶，以增提高甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的总产率和生产率。
涉及戊糖磷酸途径的转醛醇酶和转酮醇酶酶的途径
一些能够厌氧或异型发酵生长的微生物包含磷酸酮醇酶途径，以代替或补充糖酵解途径。该途径依赖于戊糖磷酸途径酶转醛醇酶和转酮醇酶的 活性。因此，经工程改造以具有本文所述的磷酸酮醇酶的宿主细胞可进一步经工程改造以过表达内源形式或异源形式的转酮醇酶和转醛醇酶，以增加途径流量、降低潜在毒性中间体的水平、减少中间体至非产物途径的分化以及提高甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和/或类异戊二烯的总产率和生产率。
突变的组合
应当理解，对于本文所述的任何酶和/或酶途径，可明确地设想调节本文所述的酶和/或酶途径的任何组合(两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个或十四个)的分子操纵。为方便组合的表述，柠檬酸合酶(gltA)以A表示、磷酸转乙酰酶(pta)以B表示、乙酸激酶(ackA)以C表示、乳酸脱氢酶(ldhA)以D表示、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gap)以E表示、丙酮酸脱羧酶(aceE、aceF和/或lpdA)以F表示、磷酸葡糖酸脱水酶(edd)以G表示、2-酮-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)以H表示、磷酸果糖激酶以I表示、转醛醇酶以J表示、转酮醇酶以K表示、核酮糖-5-磷酸-表异构酶以L表示、核糖-5-磷酸表异构酶以M表示、木酮糖激酶以N表示、木糖异构酶以O表示、木糖醇还原酶以P表示、核糖-5-磷酸异构酶(rpi)以Q表示、D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(rpe)以R表示、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(pps)以S表示、果糖二磷酸醛缩酶(fba)以T表示、EI(ptsI)以U表示、EIICBGlc(ptsG)以V表示、EIIAGlc(crr)以W表示、HPr(ptsH)以X表示、半乳糖(galP)以Y表示、葡糖激酶(glk)以Z表示、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)以AA表示。如上所述，丙酮酸脱羧酶复合物的aceE、aceF和/或lpdA酶可单个地使用、或三种酶中的两种或三种酶中的三种一起使用，以增加丙酮酸脱羧酶活性。因此，明确地设想了本文以A-M表示的酶的任何和所有组合，以及以A-AA表示的酶的任何和所有组合。此外，上述任何组合可与本文所述的任何酶和/或酶途径(如，磷酸酮醇酶、MVA途径多肽、异戊二烯合酶、DXP途径多肽)组合使用。
用于增加产量的其他调节因子和因素
可将其他分子操纵用于增加碳流向甲羟戊酸产生。一种方法是减少、降低或消除负调节因子对进入甲羟戊酸途径的途径的影响。例如，在一些 情况下，基因aceEF-lpdA处于具有pdhR上游的第四基因的操纵子中。基因pdhR是其操纵子转录的负调节因子。在不存在丙酮酸的情况下，它结合其靶启动子并抑制转录。它还以相同的方式调节ndh和cyoABCD(Ogasawara,H.et al.2007.J.Bact.189:5534-5541(Ogasawara,H.等人，2007年，《细菌学杂志》，第189卷，第5534-5541页))。在一个方面，pdhR调节因子的缺失可增加丙酮酸的供应量，从而增加甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯的产量。
在其他实施例中，可将上述所得菌株的任何一种进一步进行工程改造以调节恩特纳－杜德洛夫途径的活性。可减弱或缺失编码磷酸葡糖酸脱水酶或醛缩酶的基因。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以降低或去除乙酸激酶或柠檬酸合酶的活性。在其他实施例中，还可将所得菌株的任何一种菌株进行工程改造以降低或去除磷酸果糖激酶的活性。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以调节甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性。甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性可通过降低其活性来调节。在其他实施例中，来自磷酸戊糖途径的非氧化分支的酶，例如转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶可以过表达。
在其他方面，宿主细胞可进一步经工程改造以通过引入编码景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶/果糖-1,6-二磷酸醛缩酶和景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶/果糖-1,6-二磷酸磷酸酶的异源核酸来增加细胞内乙酰磷酸的浓度。在某些实施例中，具有这些分子操纵的宿主细胞可与减弱或缺失的转醛醇酶(talB)和磷酸果糖激酶(pfkA和/或pfkB)基因结合，从而允许赤藓糖-4-磷酸、二羟基丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸快速转化为景天庚酮糖7-磷酸和果糖1-磷酸(参见图5)。
在其他方面，将6-磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)引入缺乏PGL的细胞(例如各种大肠杆菌菌株)可用于增加甲羟戊酸、类异戊二烯前体、异戊二烯和类异戊二烯的产量。PGL可通过使用染色体整合或染色体外载体例如质粒引入编码基因来引入。
除调节本文所述的增加流向甲羟戊酸产生的碳的各种酶促途径的宿主细胞(如，细菌宿主细胞)突变之外，本文所述的宿主细胞包含编码磷酸 酮醇酶多肽、以及来自MVA上游和下游途径的其他酶的基因，包括但不限于mvaE和mvaS基因产物。MVA途径多肽的非限制性例子包括乙酰辅酶A乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽，以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(如，融合多肽)。MVA途径多肽可以包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸。
可使用的MVA途径多肽的非限制性例子在国际专利申请公布No.WO2009/076676、WO2010/003007和WO2010/148150中有所描述。
示例性的细胞培养基
如本文所用，术语“基本培养基”是指含有细胞生长所需的可能的最少营养物的培养基，通常但并非总如此，不存在一种或多种氨基酸(如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种氨基酸)。基本培养基通常含有：(1)用于细菌生长的碳源；(2)各种盐，其可因细菌物种和生长条件而变动；和(3)水。从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的较复杂水解产物如酵母提取物，碳源可以有很大变化，如下文更详细论述的。盐通常提供必需元素如镁、氮、磷和硫以允许细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充有选择剂，例如抗生素，以针对某些质粒的维持等进行选择。例如，如果微生物对某一抗生素例如氨苄青霉素或四环素具有抗性，则可将该抗生素添加至培养基以便防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可在必要时补充有其他化合物以选择所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
任何基本培养基制剂均可用于培养宿主细胞。示例性的基本培养基制剂包括例如M9基本培养基和TM3基本培养基。每升M9基本培养基含有(1)200ml无菌M9盐(每升64g Na2HPO4-7H2O、15g KH2PO4、2.5g NaCl和5.0g NH4Cl)；(2)2ml1M MgSO4(无菌)；(3)20ml20％(重量/体积)葡 萄糖(或其他碳源)；和(4)100μL1M CaCl2(无菌)。每升TM3基本培养基含有(1)13.6g K2HPO4；(2)13.6g KH2PO4；(3)2g MgSO4*7H2O；(4)2g柠檬酸一水合物；(5)0.3g柠檬酸铁铵；(6)3.2g(NH4)2SO4；(7)0.2g酵母提取物；和(8)1ml1000X痕量元素(Trace Elements)溶液；将pH调节至约6.8并将该溶液过滤灭菌。每升1000X痕量元素含有：(1)40g柠檬酸一水合物；(2)30g MnSO4*H2O；(3)10g NaCl；(4)1g FeSO4*7H2O；(4)1g CoCl2*6H2O；(5)1g ZnSO4*7H2O；(6)100mg CuSO4*5H2O；(7)100mg H3BO3；和(8)100mg NaMoO4*2H2O；将pH调节至约3.0。
另外的示例性基本培养基包含(1)磷酸钾K2HPO4、(2)硫酸镁MgSO4*7H2O、(3)柠檬酸一水合物C6H8O7*H2O、(4)柠檬酸铁铵NH4FeC6H5O7、(5)酵母提取物(来自思宾格公司(biospringer))、(6)1000X改良痕量金属溶液、(7)硫酸50％重量/体积、(8)foamblast882(艾默罗德性能材料公司(Emerald Performance Materials))和(9)宏量盐溶液3.36mL。将所有组分一起添加并溶解于去离子H2O中，然后加热灭菌。冷却至室温后，用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0，然后定容。灭菌和pH调节后添加维生素溶液和壮观霉素。
任何碳源均可用于培养宿主细胞。术语“碳源”是指一种或多种能够被宿主细胞或生物体代谢的含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可包含任何适于维持生活力或培养宿主细胞的碳源。在一些方面，碳源为碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)或转化糖(如，酶处理过的蔗糖糖浆)。
在一些方面，碳源包含酵母提取物或酵母提取物的一种或多种组分。在一些方面，酵母提取物的浓度为0.1％(重量/体积)、0.09％(重量/体积)、0.08％(重量/体积)、0.07％(重量/体积)、0.06％(重量/体积)、0.05％(重量/体积)、0.04％(重量/体积)、0.03％(重量/体积)、0.02％(重量/体积)或0.01％(重量/体积)酵母提取物。在一些方面，碳源既包含酵母提取物(或其一种或多种组分)又包含另一碳源，例如葡萄糖。
示例性的单糖包括葡萄糖和果糖；示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(如，果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(如木糖或阿拉伯糖)。
在一些方面，本文所述的细胞能够使用合成气作为能源和/或碳源。在一些实施例中，合成气包含至少一氧化碳和氢气。在一些实施例中，合成气还包含二氧化碳、水或氮气中的一者或多者。在一些实施例中，合成气中氢气与一氧化碳的摩尔比为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0或10.0。在一些实施例中，合成气包含10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％的一氧化碳。在一些实施例中，合成气包含10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％的氢气。在一些实施例中，合成气包含10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％的二氧化碳。在一些实施例中，合成气包含10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％的水。在一些实施例中，合成气包含10、20、30、40、50、60、70、80或90体积％的氮气。
合成气可来源于天然或合成来源。合成气的来源称为“原料”。在一些实施例中，合成气来源于生物质(如，木材、柳枝稷、农业垃圾、城市垃圾)或碳水化合物(如，糖)。在其他实施例中，合成气来源于煤、石油、油母质、焦油砂、油页岩或天然气。在其他实施例中，合成气来源于橡胶，例如来源于橡胶轮胎。
合成气可通过各种工艺，包括甲烷重整、煤的液化、混烧、发酵反应、酶促反应和生物质气化从原料来源。生物质气化通过使生物质在低于化学计量的氧气的存在下，在反应器中高于约700℃的温度下经受部分氧化而实现。氧气以空气、纯氧或蒸气的形式引入生物反应器。气化可以三个主要步骤进行：1)初始加热以干燥嵌入生物质的任何水分；2)高温分解，其中生物质在不存在氧化剂的情况下加热至300-500℃，生成煤气、焦油、油和固体碳残留物；以及3)固体碳、焦油和煤气气化生成合成气的主要组分。混烧通过煤/生物质混合物的气化实现。合成气的组成，例如合成气组分的成分和摩尔比，可根据其来源的原料以及原料转化为合成气的方法而变化。
合成气可包含杂质，该杂质的性质和量可根据原料和制备所用的工艺而变化。发酵可耐受一些杂质，但仍需要从合成气物质移除，例如可堵塞发酵罐和相关设备的焦油和颗粒。移除可污染异戊二烯产物的化合物，例 如挥发性有机化合物、酸性气体、甲烷、苯、甲苯、乙苯、二甲苯、H2S、COS、CS2、HCl、O3、有机硫化合物、氨气、氮氧化物、含氮有机化合物和重金属蒸气也是可取的。从合成气移除杂质可通过多种方式中的一种实现，包括气体洗涤、用固相吸附剂处理以及使用气体渗透膜纯化。
示例性的细胞培养条件
下文，例如在实例部分中描述了适于本发明重组细胞维持和生长的材料和方法。适于细菌培养物的维持和生长的其他材料和方法是本领域所熟知的。示例性技术可以参见国际专利公布No.WO2009/076676、美国专利公布No.2009/0203102、WO2010/003007、美国专利公布No.2010/0048964、WO2009/132220、美国专利公布No.2010/0003716，Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al.,eds,American Society for Microbiology,Washington,D.C.(1994)(《普通细菌学方法手册》，Gerhardt等人编辑，美国微生物学会，华盛顿，1994年)或Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(Brock，《生物技术：工业微生物学教材》，第二版(1989年)，Sinauer Associates公司，马萨诸塞州桑德兰)。在一些方面，细胞在允许磷酸酮醇酶多肽以及MVA上游和下游途径的其他酶，包括但不限于mvaE和mvaS基因产物、异戊二烯合酶、DXP途径(如，DXS)、IDI或插入宿主细胞的核酸编码的PGL多肽表达的条件下在培养基中培养。
可将标准的细胞培养条件用于培养细胞(参见例如，WO2004/033646及其中所引用的参考文献)。在一些方面，细胞在合适的温度、气体混合物和pH下生长和维持(例如约20℃至约37℃，约6％至约84％的CO2和介于约5至约9之间的pH)。在一些方面，细胞在35℃下在合适的细胞培养基中生长。在一些方面，发酵的pH范围介于约pH5.0至约pH9.0之间(例如，约pH6.0至约pH8.0或约pH6.5至约7.0)。细胞可以根据宿主细胞的需要在需氧、缺氧或厌氧条件下生长。此外，可使用更具体的细胞培养条件培养细胞。例如，在一些实施例中，重组细胞(例如大肠杆菌细胞)包含在强启动子的调控下在低至中等拷贝质粒上的编码磷酸酮醇酶多肽、以及来自上游、包括但不限于来自格雷氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑 鸡肠球菌、酪黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaE和mvaS基因产物mvaE和mvaS多肽的酶的一种或多种异源核酸，并且在34℃下培养。
可使用的标准培养条件和发酵方式(如分批发酵、分批补料发酵或连续发酵)在国际专利公布No.WO2009/076676、美国专利公布No.2009/0203102、WO2010/003007、美国专利公布No.2010/0048964、WO2009/132220、美国专利公布No.2010/0003716中进行了描述。分批发酵和分批补料发酵是通用的并为本领域所熟知，其实例可在如下文献中找到：Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.(Brock，《生物技术：工业微生物学教材》，第二版，1989年，Sinauer Associates,Inc.出版社)。
在一些方面，将细胞在限制葡萄糖条件下培养。所谓“限制葡萄糖条件”意指添加的葡萄糖的量低于细胞消耗的葡萄糖的量或约细胞消耗的葡萄糖的量的105％(例如约100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％)。具体地讲，在具体的一段时间，添加至培养基的葡萄糖的量与细胞所消耗的葡萄糖的量大致相同。在一些方面，通过限制所添加的葡萄糖的量使得细胞以细胞培养基中的葡萄糖的量可支持的速率生长来控制细胞生长的速率。在一些方面，在培养细胞期间葡萄糖不积聚。在多个方面，将细胞在限制葡萄糖条件下培养超过或约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60或70小时。在多个方面，将细胞在限制葡萄糖条件下培养超过或约培养该细胞的总时长的5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、95或100％。虽然无意于受任何特定理论束缚，但据信限制葡萄糖条件可允许对细胞进行更有利的调节。
在一些方面，重组细胞进行分批培养。还可将重组细胞进行分批补料培养或连续培养。另外，可将重组细胞在基本培养基(包括但不限于任何上述基本培养基)中培养。基本培养基可还补充有1.0％(重量/体积)葡萄糖或任何其他六碳糖或更少。具体地讲，基本培养基可补充有1％(重量/体积)、0.9％(重量/体积)、0.8％(重量/体积)、0.7％(重量/体积)、0.6％(重量/体积)、0.5％(重量/体积)、0.4％(重量/体积)、0.3％(重量/体积)、0.2％(重量/体积)或0.1％(重量/体积)葡萄糖。另外，基本培养基可补充0.1％(重量/体积)或更少的酵母提取物。具体地讲，基本培养基可补充有0.1％(重量/ 体积)、0.09％(重量/体积)、0.08％(重量/体积)、0.07％(重量/体积)、0.06％(重量/体积)、0.05％(重量/体积)、0.04％(重量/体积)、0.03％(重量/体积)、0.02％(重量/体积)或0.01％(重量/体积)酵母提取物。或者，基本培养基可补充有1％(重量/体积)、0.9％(重量/体积)、0.8％(重量/体积)、0.7％(重量/体积)、0.6％(重量/体积)、0.5％(重量/体积)、0.4％(重量/体积)、0.3％(重量/体积)、0.2％(重量/体积)或0.1％(重量/体积)葡萄糖以及补充有0.1％(重量/体积)、0.09％(重量/体积)、0.08％(重量/体积)、0.07％(重量/体积)、0.06％(重量/体积)、0.05％(重量/体积)、0.04％(重量/体积)、0.03％(重量/体积)、0.02％(重量/体积)或0.01％(重量/体积)酵母提取物。
示例性的纯化方法
在一些方面，任何本文所述方法还包括回收所产生的化合物的步骤。在一些方面，任何本文所述方法还包括回收异戊二烯的步骤。在一些方面，异戊二烯通过吸附解吸回收(参见例如美国专利公布No.2011/0178261)。在一些方面，任何本文所述方法还包括回收异源多肽的步骤。在一些方面，任何本文所述方法还包括回收萜类化合物或类胡萝卜素的步骤。
合适的纯化步骤在美国专利申请公布US2010/0196977A1中有更详细描述。
在整篇本说明书中，参考了多个专利、专利申请以及其他类型的出版物(如杂志文章)。特此将本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。
通过参照以下实例能进一步理解本发明，这些实例以举例说明的方式提供而非旨在进行限制。
实例
实例1：对编码来自婴儿双歧杆菌的磷酸酮醇酶的基因的克隆
婴儿双歧杆菌的染色体DNA可得自ATCC(ATCC#15697D-5，弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA))。使用引物CMP283：5’-ctgtatTCATGAcgagtcctgttattggcacc-3’(SEQ ID NO:30)和CMP284：5’-ctctatGAATTCTCACTCGTTGTCGCCAGCG-3’(SEQ ID NO:31)、作为模板的100ng DNA以及聚合酶Herculase II Fusion，根据制 造商(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦公司(Agilent,Santa Clara,CA))所述扩增编码磷酸酮醇酶(PKL)的基因。纯化后，将2798bp片段用BspHI和EcoRI消化，并与NcoI/EcoRI消化的pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))连接以形成质粒pCMP1090(SEQ ID NO:15–图6)。
实例2：来自罗伊氏乳杆菌菌株F275的磷酸酮醇酶的克隆
罗伊氏乳杆菌菌株F275的染色体DNA可得自ATCC(ATCC#23272D-5，弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA))。使用引物CMP34：5’-taaggaggaataaacATGGCAGTAGATTACGATTCCAAG-3’(SEQ ID NO:32)和CMP335：5’-ttctagaaagcttcgttacttaagacccttccaagtccag-3’(SEQ ID NO:33)、作为模板的100ng DNA以及聚合酶Herculase II Fusion，根据制造商(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦公司(Agilent,Santa Clara,CA))所述扩增编码磷酸酮醇酶(PKL)的基因。纯化后，使用GENEART无缝克隆试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))将2442bp片段组装到NcoI/EcoRI消化的pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1029(SEQ ID NO:16–图7)。
实例3：菌株CMP451、CMP674、CMP1015和CMP1047(BL21GI1.2gltA ldhA)的构建
大肠杆菌菌株BL21(Novagen公司)中柠檬酸合酶基因(gltA)前面的启动子之前被组成型低表达启动子即GI1.2替换(美国专利7,371,558)。gltA的两种野生型启动子已有所描述(Wilde,R,and J.Guest.1986.J.Gen.Microbiol.132:3239-3251(Wilde,R和J.Guest.，《普通微生物学杂志》，第132卷，第3239-3251页))。合成启动子恰好插在远侧启动子的-35区之后。使用引物UpgltACm-F(5’-TATTTAATTTTTAATCATCTAATTTGACAATCATTCAACAAAGTTGTTA CAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG-3’(SEQ ID NO:34))和DngltA1.xgiCm-R(5’-TCAACAGCTGTATCCCCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCC ATATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGTGGTTGAATTATTT GCTCAGGATGTGGCATHGTCAAGGGCTAATACGACTCACTATAGGGC TCG-3’(SEQ ID NO:35))，并将来自德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges(Heidelberg,Germany))的质粒FRT-gb2-Cm-FRT作为模板，来获得PCR产物。如制造商(德国海德堡的基因桥公司)所述将PCR产物纯化并将其用于λ-Red介导的重组。选择若干菌落用于进一步的表征。使用引物gltAPromSeqF：5’-GGCAGTATAGGCTGTTCACAAAATC-3’(SEQ ID NO:36)和gltApromSeqR：5’-CTTGACCCAGCGTGCCTTTCAGC-3’(SEQ ID NO:37)以及作为模板的DNA来对启动子区进行PCR扩增，该DNA通过将菌落重悬浮于30μL H2O中、在95℃下加热4分钟、短暂离心来提取，并且在50μL反应物中使用2μL该材料作为模板。在观察所得PCR产物的测序结果之后，将带有GI1.2启动子的菌落(美国专利7,371,558)命名为CMP141。
通过用来自菌株MCM521(参见美国专利申请No.12/978,324)的P1裂解物转导CMP258(参见美国专利申请No.12/978,324)并在含有20μg/ml卡那霉素的Luriα-Bertani平板上选择菌落而构建菌株MD09-313。P1裂解物根据Ausubel,et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(Ausubel等人，《分子生物学实验室指南》，约翰·威利父子出版公司)中所述的方法制备而得。用制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))建议的方案移除卡那霉素标记，形成菌株MD09-314。
使用由菌株CMP141制成的P1裂解物转导菌株MD09-314以形成CMP440。用制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))建议的方案移除氯霉素标记，形成菌株CMP451。
使用作为模板的质粒pKD3(Datsenko,K.,and Wanner,B.2000.PNAS97:6640-6645(Datsenko,K.和Wanner,B.，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第6640-6645页))以及引物CMP171(5’-AAAATTTTCATTCTGTGACAGAGAAAAAGTAGCCGAAGATGACGGTTT GTCACATGGAGTTGGCAGGATGTTTGATTACATGGGAATTAGCCATGG TCC-3’(SEQ ID NO:38))和CMP172(5’- GACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAAT GGATGCCCTGCGTAAG CGG GGCATT TTTCTTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’(SEQ ID NO:39))，通过PCR扩增DNA片段，所述DNA片段包含氯霉素标记，氯霉素标记旁侧有与λ附着点attB的上游和下游区同源的DNA。按制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))的建议将所获得的PCR产物用于BL21(Novagen公司)中的重组反应以在l附着点attB处整合该PCR产物。从而产生菌株CMP646，并在LB+5μg/mL氯霉素上进行选择。制备CMP646的P1裂解物并将其用于菌株CMP451上的转导反应，从而从该菌株的染色体移除甲羟戊酸下游途径基因(编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶和异戊烯二磷酸异构酶)。将该转导反应物涂布接种于LB+5μg/mL氯霉素上，每次转导挑取一个菌落并命名为CMP674。
表2：大肠杆菌菌株的描述
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使用得自庆应大学保藏中心(Keio collection)的作为模板的菌株JW1375(Baba et al.2006.Mol.Syst.Biol.2:2006.0008(Baba等人，2006年，《分子系统生物学》，第2卷，第2006.0008页))以及引物ldhAseqR(5’-GGCTTACCGTTTACGCTTTCCAGC-3’(SEQ ID NO:40))和ldhAseqF2(5’-CTAATGCAATACGTGTCCCGAGC-3’(SEQ ID NO:41))，通过PCR扩增DNA片段，所述DNA片段包含其间插入了卡那霉素标记的ldhA基因。按照制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))的建议将所获得的PCR产物用于重组反应以在菌株CMP674的ldhA基因座位处整合该PCR产物。将该菌株命名为CMP1015。通过如下方式同时环出氯霉素和卡那霉素标记：电穿孔菌株中的pCP20(Datsenko andWanner.2000.PNAS97:6640-6645(Datsenko和Wanner，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第6640-6645页))，在LB+50μg/mL羧苄青霉素上于30℃下选择两个菌落，然后在42℃下将这些菌落重新划线于LB平板上。从那些平板选择CmS和KanS菌落并命名为CMP1047。
实例4：菌株CMP1036、1038和1040的构建
在存在质粒pTrcHis2B、pCMP1090(来自婴儿双歧杆菌的PKL)和pCMP1029(来自罗伊氏乳杆菌的PKL)的情况下将菌株CMP674电穿孔。在LB+50μg/mL羧苄青霉素上分离菌落。挑取每次转化的一个菌落并分别命名为CMP1036、CMP1038和CMP1040。
实例5：菌株CMP1036、1038和1040中的乙酰磷酸的测量
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、酵母提取物0.2g、1000X痕量金属溶液1ml。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在调节pH和灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)
柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次一种的方式将每种组分溶解于去离子水中。用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
(ii)实验程序
将细胞在Luriα-Bertani肉汤+抗生素中培养过夜。次日，将它们在含有50μg/ml羧苄青霉素的20mL TM3培养基(250mL带挡板的Erlenmeyer烧瓶)中稀释至OD600为0.05，并在34℃和200rpm下温育。培养2小时后，测量OD600并添加200μM IPTG。再过3.5小时后，将1.5mL样品离心，弃去上清液，并将沉淀物重悬于100μL干冰冷却的甲醇中。
(iii)细胞内乙酰磷酸测定。
为了提取乙酰磷酸，将培养至OD0.57-2.26的1.5mL大肠杆菌细胞短暂离心，并将100μL干冰冷却的甲醇添加至沉淀物。将甲醇淬灭的样品在-20℃下保存若干天。进一步的样品处理包括温和的细胞重悬，在-9℃下离心5分钟，以及将上清液抽吸到干净小瓶中。用含有2％乙酸的75μL水重新提取沉淀物两次。在每次提取后，通过在-9℃下离心将细胞碎片沉淀，将所有三次提取的上清液合并在一起并且以1μL三丁胺加标。使用Thermo Finnigan TSQ系统(加利福尼亚州圣何塞的热电公司(Thermo Electron Corporation,San Jose,CA))通过LCMS对乙酰磷酸进行质谱分析。所有体系对照、数据采集和质谱数据评价均用XCalibur和LCQuan软件(热电公司(Thermo Electron Corp))进行。将流动相梯度以0.4mL/min的流速应用于Synergi MAX-RP5μM HPLC柱(150×2mm，菲罗门公司(Phenomenex))。所应用的梯度曲线是t＝0-1分钟时为99％A和1％B；t＝11分钟时为80％A和20％B；t＝12-14分钟时为75％B和25％C；t＝15-16分钟时为99％A和1％B，其中溶剂A是水中的15mM三丁胺/10mM乙酸，溶剂B是甲醇，并且溶剂C是水。使用电喷雾电离(ESI-MS/MS)在负离子模式下(ESI喷雾电压为2.5-3.0kV，离子传输管温度390℃)进行乙酰磷酸的质谱检测，其中前体离子的质荷比值为138.9。基于PO3-产物离 子(质荷比＝79.0，碰撞能量20V，碰撞气体压力1.7毫托，Rt＝13.2分钟)所产生的峰的积分强度测定乙酰磷酸的浓度。使用通过进样乙酰磷酸标准品(西格玛奥德里奇公司(Sigmα-Aldrich))所获得的校准曲线来计算细胞提取物中的代谢物的浓度。基于如下假设来测定乙酰磷酸的细胞内浓度：在OD＝200的1mL培养物中，所有细胞的积分体积为50Μl(图8)。
(iv)结果
表达磷酸酮醇酶的菌株具有比不表达磷酸酮醇酶的对照菌株更高细胞内浓度的乙酰磷酸(CMP1040和CMP1038)。
实例6：菌株CMP1053、1055和1057的构建
将质粒pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))、pCMP1090(来自婴儿双歧杆菌的PKL)或pCMP1029(来自罗伊氏乳杆菌的PKL)与质粒pMCM82(表达载体MCM82(美国专利申请公布No.US2010/0196977))一起用于转化CMP1047。将宿主CMP1047在LB中于34℃下培养至对数中期并通过在一个培养体积的冰冷重蒸水中洗涤2次并重悬于十分之一培养体积的冰冷重蒸水中准备进行电穿孔。将100μL的细胞悬液与1μL的每种质粒DNA合并，移至2mm电穿孔比色管，在25uFD、200Ω、2.5kV下电穿孔，并立即用1mL LB淬灭。在34℃下振荡1小时使细胞恢复，然后在34℃下在含50μg/mL壮观霉素+50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上过夜选择转化株。挑取每次转化的一个菌落并分别命名为CMP1053、1055和1057。
在其他实施例中，可将上述所得菌株的任何一种进一步进行工程改造以调节恩特纳－杜德洛夫途径的活性。可减弱或缺失编码磷酸葡糖酸脱水酶或醛缩酶的基因。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以降低或去除乙酸激酶或柠檬酸合酶的活性。在其他实施例中，还可将所得菌株的任何一种菌株进行工程改造以降低或去除磷酸果糖激酶的活性。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以调节甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性。甘油醛3-磷酸脱氢酶的活性可通过降低其活性来调节。在其他实施例中，来自磷酸戊糖途径的非氧化分支的酶，例如转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶可以过表达。
实例7：通过菌株CMP1053、1055和1057产生甲羟戊酸
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、酵母提取物0.2g、1000X痕量金属溶液1ml。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在调节pH和灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)
柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次一种的方式将每种组分溶解于去离子水中。用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
(ii)实验程序
将细胞在Luriα-Bertani肉汤+抗生素中培养过夜。次日，将它们在含有50μg/ml的壮观霉素和50μg/mL羧苄青霉素的20mL TM3培养基(在250mL带挡板的Erlenmeyer烧瓶中)中稀释至OD600为0.05，并在34℃和200rpm下温育。培养2小时后，测量OD600并添加200μM IPTG。在发酵过程中定期取样。在每个时间点，测量OD600。24小时后，通过HPLC分析甲羟戊酸。以如下方式进行HPLC分析：将54μL的10％(w/v)H2SO4添加至300μL的肉汤中，并将混合物在冰上温育5分钟。接着，将样品在14,000′g下离心5分钟，并将收集用于HPLC分析的上清液在如下条件下运行：(1)BioRad-Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm×7.8mm)(目录号125-0140)(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRad,Hercules,California))；(2)柱温＝50℃；(3)BioRad-Microguard Cation H保护柱柱芯(30mm×4.6mm)(目录号125-0129)(伯乐公司(BioRad))；(4)运行缓冲液＝0.01N H2SO4；(5)运行缓冲液流速＝0.6mL/min；(6)近似运行压力＝约950psi；(7)进样体积＝20微升；(8)运行时间＝26分钟。
(iii)结果：
表达磷酸酮醇酶的菌株生长速度慢于对照菌株(图9)。CMP1057(表达罗伊氏乳杆菌磷酸酮醇酶基因)产生比含有对照空质粒或来自婴儿双歧杆菌的磷酸酮醇酶的菌株更多的甲羟戊酸(图10)。
实例8：产生异戊二烯并表达磷酸酮醇酶的菌株的构建
通过用来自MCM521的裂解物转导进CMP674中引入甲羟戊酸下游途径(参见表2)。根据制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))环出卡那霉素标记。可通过利用替代基因修饰每个基因前面的rbs来改变操纵子上游的启动子而修饰来自MCM521的下游途径。将表达lacI、异戊二烯合酶和马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶的表达质粒、质粒pMCM82(表达载体MCM82(美国专利申请公布No.US2010/0196977))和质粒pCMP1090(来自婴儿双歧杆菌的PKL)、pCMP1029(来自罗伊氏乳杆菌的PKL)或pTrcHis2B通过电穿孔(以两个步骤)进入CMP1047中。在LB+壮观霉素50μg/mL+羧苄青霉素50μg/mL+氯霉素25μg/mL上选择菌落。
在其他实施例中，可将上述所得菌株的任何一种进一步进行工程改造以调节恩特纳－杜德洛夫途径的活性。可减弱或缺失编码磷酸葡糖酸脱水酶或醛缩酶的基因。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以降低或去除乙酸激酶或柠檬酸合酶的活性。在其他实施例中，还可将所得菌株的任何一种菌株进行工程改造以降低或去除磷酸果糖激酶的活性。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以调节甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性。甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性可通过降低其活性来调节。在其他实施例中，来自磷酸戊糖途径的非氧化分支的酶，例如转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶可以过表达。
实例9：与带有表达甲羟戊酸上游途径的质粒、表达lacI、异戊二烯合酶和甲羟戊酸激酶的质粒、以及空质粒(pTrcHis2B)的细胞相比，通过带有表达甲羟戊酸上游途径的质粒、表达lacI、异戊二烯合酶和甲羟戊酸激酶的质粒、以及表达磷酸酮醇酶的质粒的菌株产生异戊二烯
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、酵母提取物0.2g、1000X痕量金属溶液1ml。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在调节pH和灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)
柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次一种的方式将每种组分溶解于去离子水中。用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
(ii)实验程序
将细胞在Luriα-Bertani肉汤+抗生素中培养过夜。次日，将它们在含有50μg/ml的壮观霉素、25μg/mL氯霉素和50μg/mL羧苄青霉素的20mL TM3培养基(在250mL带挡板的Erlenmeyer烧瓶中)中稀释至OD600为0.1，并在34℃和200rpm下温育。培养2小时后，测量OD600并添加200μM IPTG。在发酵过程中定期取样。在每个时间点，测量OD600。另外，对异戊二烯的废气分析用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(安捷伦公司(Agilent))顶空测定法来进行。将100微升全部肉汤置于密封的GC小瓶中并在34℃和200rpm下温育30分钟的固定时间。在由在70℃下温育7分钟组成的加热杀灭步骤后，将样品上样至GC上。所报道的比生产率为由GC读出的单位为μg/L的异戊二烯量除以温育时间(30分钟)和所测得的OD600。
(iii)结果：
表达磷酸酮醇酶的菌株生长速度比不表达磷酸酮醇酶的对照菌株更慢。与含有对照空质粒的菌株(即，不表达磷酸酮醇酶的菌株)相比，表达磷酸酮醇酶多肽的菌株显示出提高的异戊二烯产量，这是由于在表达磷酸酮醇酶多肽的菌株中观察到增加的异戊二烯比生产率、产率、CPI和/或滴度。
实例10：表达磷酸酮醇酶并产生紫穗槐二烯或金合欢烯的菌株的构建
通过用来自MCM521的裂解物转导进CMP674中引入甲羟戊酸下游途径(参见表2)。根据制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))环出卡那霉素标记。可通过利用替代基因修饰每个基因前面的rbs来改变操纵子上游的启动子而修饰来自MCM521的下游途径。法尼基二磷酸合酶(ispA)通过改变染色体上的启动子和/或rbs、或通过从质粒表达该酶来过表达。
对来自实例8的表达lacI、异戊二烯合酶和马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶的表达质粒进行修饰以将编码异戊二烯合酶的基因替换成编码金合欢烯合酶或紫穗槐二烯合酶的密码子优化基因。如下表达质粒通过电穿孔(以两个步骤)进入感受态宿主细胞：(i)具有lacI、金合欢烯合酶或紫穗槐二烯合酶和马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶的质粒，(ii)pMCM82(表达载体MCM82(美国专利申请公布No.US2010/0196977))和(iii)pCMP1090(来自婴儿双歧杆菌的PKL)或pCMP1029(来自罗伊氏乳杆菌的PKL)或pTrcHis2B。在LB+壮观霉素50μg/mL+羧苄青霉素50μg/mL+氯霉素25μg/mL上选择菌落。
在其他实施例中，可将上述所得菌株的任何一种进一步进行工程改造以调节恩特纳－杜德洛夫途径的活性。可减弱或缺失编码磷酸葡糖酸脱水酶或醛缩酶的基因。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以降低或去除乙酸激酶或柠檬酸合酶的活性。在其他实施例中，还可将所得菌株的任何一种菌株进行工程改造以降低或去除磷酸果糖激酶的活性。在其他实施例中，还可将上述所得菌株的任何一种进行工程改造以调节甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性。甘油醛-3-磷酸脱氢酶的活性可通过降低其活性来调节。在其他实施例中，来自磷酸戊糖途径的非氧化分支的酶，例如转酮醇酶、转醛醇酶、核酮糖-5-磷酸-表异构酶和(或)核糖-5-磷酸表异构酶可以过表达。
实例11：与对照菌株相比，含有表达磷酸酮醇酶的质粒的菌株中的紫穗槐二烯或金合欢烯的产生
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、酵母提取物0.2g、1000X痕量金属溶液1ml。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。然后用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在灭菌和调节pH后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)：
柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次一种的方式将每种组分溶解于去离子水中。用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
(ii)实验程序
将细胞在Luriα-Bertani肉汤+抗生素中培养过夜。次日，将它们在含有50μg/ml的壮观霉素、25μg/mL氯霉素和50μg/mL羧苄青霉素的20mL TM3培养基(在250mL带挡板的Erlenmeyer烧瓶中)中稀释至OD600为0.05，并在34℃和200rpm下温育。在接种前，如此前所述(Newman等人，2006)将20％(体积/体积)十二烷(西格玛奥德里奇公司(Sigmα-Aldrich))的覆盖层添加至每个培养瓶以捕集挥发性的倍半萜产物。
培养2小时后，测量OD600并添加0.05-0.40mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。在发酵过程中定期取样。在每个时间点，测量OD600。另外，通过将十二烷覆盖层稀释进乙酸乙酯中来测定有机层中的紫穗槐二烯或金合欢烯浓度。采用之前所述的GC–MS方法(Martin et.al.,Nat.Biotechnol.2003,21:96–802(Martin等人，《自然生物技术》，2003年，第21卷，第96–802页))通过监测紫穗槐二烯的分子离子(204质荷比)和189质荷比碎片离子或金合欢烯的分子离子(204质荷比)来分析十二烷/乙酸乙酯提取物。注入已知浓度的紫穗槐二烯或金合欢烯样品以产生分别用于紫穗槐二烯或金合欢烯的标准曲线。分别使用紫穗槐二烯或金合欢烯标准曲线，计算样品中紫穗槐二烯或金合欢烯的量。
(iii)结果
将表达磷酸酮醇酶多肽的菌株与含有具有相同骨架的空质粒(即，缺少磷酸酮醇酶多肽)的菌株进行比较。与含有对照空质粒的菌株(即，不表达磷酸酮醇酶的菌株)相比，表达磷酸酮醇酶多肽的菌株显示出提高的紫穗槐二烯或金合欢烯的产量，这是由于在表达磷酸酮醇酶多肽的菌株中观察到增加的紫穗槐二烯或金合欢烯比生产率、产率、CPI和/或滴度。
(iv)参考文献
Newman,J.D.,Marshal,J.L.,Chang,M.C.Y.,Nowroozi,F.,Paradise,E.M.,Pitera,D.J.,Newman,K.L.,Keasling,J.D.,2006.High-level production of amorphα-4,11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of metabolically engineered E.coli.Biotechnol.Bioeng.95,684–691(Newman,J.D.、Marshal,J.L.、Chang,M.C.Y.、Nowroozi,F.、Paradise,E.M.、Pitera,D.J.、Newman,K.L.、Keasling,J.D.，2006年，在代谢工程改造的大肠杆菌的两相分配生物反应器中紫穗槐-4,11-二烯的高水平产生，《生物技术与生物工程》，第95卷，第684–691页)。
Martin,V.J.,Pitera,D.J.,Withers,S.T.,Newman,J.D.,Keasling,J.D.,2003.Engineering a mevalonate pathway in E.coli for production of terpenoids.Nat.Biotechnol.21,796–802(Martin,V.J.、Pitera,D.J.、Withers,S.T.、Newman,J.D.、Keasling,J.D.，2003年，对用于产生萜类化合物的大肠杆菌中的甲羟戊酸途径进行工程改造，《自然生物技术》，第21卷，第796–802页)。
实例12：在表达磷酸酮醇酶的重组宿主细胞中以15L规模产生甲羟戊酸(MVA)
在表达编码磷酸酮醇酶多肽的异源基因以及来自甲羟戊酸途径的基因并且以15L规模生长于补料分批培养物中的大肠杆菌中评估甲羟戊酸产生。
产MVA菌株SHG0863(CMP1053-HMB GI1.2gltA attB ldhA,pTrcHis2B,pCLPtrcUpperEfaecalis)在标准MVA产生过程中运行。在此将性能度量(葡萄糖的MVA生产率和MVA产率)与实验菌株SHG0864(CMP1057-HMB GI1.2gltA attB ldhA,pTrcPKL_Lreuteri,pCLPtrcUpperEfaecalis)进行比较，所述实验菌株在相同条件下运行以测定由磷酸酮醇酶多肽表达所引起的产率提高。
方法：
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g、50％硫酸1.6mL、1000X改良痕量金属溶液1mL。将所有组分一起加入并溶解于去离子水中。将该溶液加热灭菌(123℃，20分钟)。用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0，然后定容。灭菌和pH调节后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
维生素溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g、D-(+)-生物素1.0g、烟酸1.0g、盐酸吡哆醇4.0g。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
料液(每千克)：
葡萄糖0.590kg、Di H2O0.393kg、K2HPO47.4g和100％Foamblast8828.9g。将所有组分混合并进行高压消毒。
宏量盐溶液(每升)：
MgSO4*7H2O296g、一水柠檬酸296g、柠檬酸铁铵49.6g。用水溶解所有组分，定容并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。在灭菌前直接添加16.8mls罐培养基，不再另外添加。
进行该实验以监测所需的发酵pH7.0和温度34℃下从葡萄糖形成甲羟戊酸。将一冷冻小瓶的大肠杆菌菌株解冻并接种进装有胰蛋白胨-酵母提取物培养基和适当抗生素的烧瓶中。当接种物生长至在550nm下测量的光密度(OD550)为1.0时，将500mL用于接种15L生物反应器并使初始罐体积为5L。
分批供料的培养基具有以9.7g/L分批供料的葡萄糖。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来实现诱导。当细胞处于OD550为6时，将一注IPTG添加至罐中以使浓度为250μM。当细胞处于OD550为100时，将第二注IPTG添加至罐中以使浓度为500μM。一旦培养物消耗了葡萄糖(由pH升高指示)，就以低于或等于10g/min的速率供应葡萄糖料液以满足代谢要求。发酵运行足以测定从葡萄糖产生的最大甲羟戊酸质量产率的时长，用去的总发酵时间为48小时。
分析：
通过HPLC分析测定以4小时的间隔提取的发酵液样品中甲羟戊酸在发酵液中的浓度。通过折射率响应与此前产生的校准曲线的比较来测定发酵液样品中的甲羟戊酸浓度。
HPLC信息
系统：Waters Alliance2695
柱：BioRad-Aminex HPX-87H离子排阻柱300mm×7.8mm目录号125-0140
柱温：50C
保护柱：BioRad-Microguard Cation H柱芯30mm×4.6mm目录号125-0129
运行缓冲液：0.01N H2SO4
运行缓冲液流速：0.6mL/min
近似运行压力：约1100-1200psi
进样体积：20微升
检测器：折射率检测器(Knauer K-2301)
运行时间：26分钟
结果：
对于具有同表达磷酸酮醇酶的菌株(CMP1057)的发酵，从葡萄糖产生甲羟戊酸的产率比空质粒对照菌株(CMP1053)更高。参见图11-13和下表3。另外，含表达磷酸酮醇酶的菌株(CMP1057)的发酵液与空质粒对照菌株(CMP1053)相比在发酵液中具有更低的乙酸积聚。参见图14。
表3.MVA生产率度量
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实例13-由表达磷酸酮醇酶的酿酒酵母产生异戊二烯
使用来自生命技术公司(Life Technologies)的酵母表达系统(包括感受态、野生型酿酒酵母(INVSc1(目录号C810-00))和质粒pYES2/CT(目录号V8251-20)来制备用于表达异戊二烯合酶、MVA上游途径、MVA下游途径和磷酸酮醇酶的上述基因构建体的变型形式。
首先将编码异戊二烯合酶、MVA上游途径、MVA下游途径和磷酸酮醇酶的基因亚克隆进pYES2/CT载体中。然后在大肠杆菌细胞中扩增质粒。再用纯化的质粒DNA转化酿酒酵母(INVSc1)。在含2％葡萄糖且补充有所指示选择性标记的SC基本培养基上选择和维持带有该质粒的酵母菌株。选择带有该质粒的分离菌落进行进一步实验。
测定工程改造的酵母菌株的异戊二烯的比生产率。为了诱导质粒所编码的基因的表达，将培养物在补充有选择性标记的液体SC基本培养基中培养过夜。然后将培养物稀释至OD600为大约0.2并生长2-3小时。将100μL发酵液样品在2mL顶空小瓶中于34℃下温育30分钟，然后在70℃下加热杀灭12分钟。顶空中的异戊二烯的水平例如通过耦合至气相色谱仪(型号G1562A，安捷伦科技公司(Agilent Technologies))的火焰离子化检测器测定(Mergen et al.,LC GC North America,28(7):540-543,2010(Mergen等人，《北美液相气相色谱法》，第28卷，第7期，第540-543页，2010年))。
实例14：来自多种不同细菌的磷酸酮醇酶的克隆
菌株ATCC15697即长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的染色体DNA可得自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC(Manassas,VA))。使用引物CMP283：5’- ctgtatTCATGAcgagtcctgttattggcacc-3’(SEQ ID NO:42)和CMP284：5’-ctctatGAATTCTCACTCGTTGTCGCCAGCG-3’(SEQ ID NO:43)和聚合酶Herculase，根据制造商的方案(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))，通过聚合酶链反应(PCR)从该染色体DNA扩增编码长双歧杆菌PKL的基因(SEQ ID NO:3)。纯化前，将PCR产物用EcoRI和BspHI限制性酶进行消化。纯化后，使用GENEART无缝克隆试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))将大约2500bp片段组装到EcoRI/NcoI消化的pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1090(SEQ ID NO:15，图6)。
罗伊氏乳杆菌菌株F275的染色体DNA可得自ATCC(ATCC#23272D-5，弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA))。使用引物CMP34：5’-taaggaggaataaacATGGCAGTAGATTACGATTCCAAG-3’(SEQ ID NO:44)和CMP335：5’-ttctagaaagcttcgttacttaagacccttccaagtccag-3’(SEQ ID NO:45)、作为模板的100ng DNA以及聚合酶Herculase II Fusion，根据制造商(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦公司(Agilent,Santa Clara,CA))所述扩增编码罗伊氏乳杆菌PKL的基因(SEQ ID NO:1)。纯化后，使用GENEART无缝克隆试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))将2442bp片段组装到NcoI/EcoRI消化的pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1029(SEQ ID NO:16，图7)。
鹑鸡肠球菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将鹑鸡肠球菌PKL基因(SEQ ID NO:17)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1321。
菌株ATCC27893即点形念珠藻的染色体DNA可得自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC(Manassas,VA)。使用引物NostocpTrcHis2BF：5’-taaggaggaataaaccatgacattagccagtcctctacaaac-3’(SEQ ID NO:46)和NostocpTrcHis2BR：5’-TTCTAGAAAGCTTCGTTAATAGGGCCACTTCCAGTCACG-3’(SEQ ID NO:47)和聚合酶Herculase，根据制造商的方案(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))，通过聚合酶链反应(PCR)从该染色体DNA扩增编码点形念珠藻PKL的基因(SEQ ID NO:18)。纯化前，将PCR产物用EcoRI和BspHI限制性酶进行消化。纯化后，使用GENEART无缝克隆试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))将大约2500bp片段组装到EcoRI/NcoI消化的pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1305。
菌株ATCC BAA-98即沼泽红假单胞菌的染色体DNA可得自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC(Manassas,VA))。使用引物RpalpTrcHis2BF：5’-taaggaggaataaaccatgtccgacgtgttgtccaacgatc-3’(SEQ ID NO:48)和RpalpTrcHis2BR：5’TTCTAGAAAGCTTCGTCAGGCCGACCAGCGCCAG-3’(SEQ ID NO:49)和聚合酶Herculase，根据制造商的方案(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))，通过聚合酶链反应(PCR)从该染色体DNA扩增编码沼泽红假单胞菌PKL的基因(SEQ ID NO:19)。纯化前，将PCR产物用EcoRI和BspHI限制性酶进行消化。纯化后，使用GENEART无缝克隆试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))将大约2500bp片段组装到EcoRI/NcoI消化的pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1306。
泛菌属物种PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将泛菌属物 种PKL基因(SEQ ID NO:20)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1324。
梭状冻胶样杆菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将梭状冻胶样杆菌PKL基因(SEQ ID NO:21)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1323。
嗜热裂孢菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将嗜热裂孢菌PKL基因(SEQ ID NO:22)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1326。
短双歧杆菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将短双歧杆菌PKL基因(SEQ ID NO:23)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1322。
水生拉恩氏菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将水生拉恩氏菌PKL基因(SEQ ID NO:24)亚克隆进BspHI/SacI消化的 pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1325。
动物双歧杆菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将动物双歧杆菌PKL基因(SEQ ID NO:25)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1320。
阴道加德纳菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将阴道加德纳菌PKL基因(SEQ ID NO:26)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1309。
除虫链霉菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。在PKL基因之前添加两个碱基对以形成NcoI位点，并恰好在终止密码子之后插入SacI位点。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后将除虫链霉菌PKL基因(SEQ ID NO:27)亚克隆进BspHI/SacI消化的pTrcHis2B载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))中以形成质粒pEWL1362。
菌株ATCC BAA-98即丙酮丁醇梭菌的染色体DNA可得自弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC(Manassas,VA))。使用引物CacetpTrcHisBF：5’-taaggaggaataaaccatgcaaagtataataggaaaacataaggatgaagg-3’(SEQ ID NO:50)和CacetpTrcHisBR：5’-ttctagaaagcttcgttatacatgccactgccaattagttatttc-3’(SEQ ID NO:51)和聚合酶Herculase，根据制造商的方案(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))，通过聚合酶链反应(PCR)从该染色体 DNA扩增编码丙酮丁醇梭菌PKL的基因(SEQ ID NO:28)。纯化前，将PCR产物用EcoRI和BspHI限制性酶进行消化。纯化后，使用GENEART无缝克隆试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))将大约2500bp片段组装到EcoRI/NcoI消化的pTrcHis2B(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中以形成质粒pCMP1364。
类植物乳杆菌PKL的氨基酸序列可得自基因库(GeneBank)和Jeong等人(J.Microbiol.Biotechnol.2007,17:822-829(《微生物学与生物技术杂志》，2007年，第17卷，第822-829页))，并在GeneArt优化软件中处理以实现大肠杆菌中的最佳表达。将合成的PKL基因克隆进GeneArt卡那霉素抗性克隆质粒中。然后使用引物SML_NcoI_PhosphokLplantF(taaggaggaataaacatgaccaccgattatagcagtcc)和v2SML_EcoRI_PhosphokLplantR(ttctagaaagcttcgTTA TTT CAG ACC TTT CCA CTG CC)以及作为聚合酶的Herculase(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))，根据制造商的方案扩增类植物乳杆菌PKL基因(SEQ ID NO:29)。然后使用GeneArt？无缝克隆与组装试剂盒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))将所获得的PCR产物与EcoRI/NcoI消化的pTrcHis2B质粒(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))组装以形成质粒pCMP1184。
实例15：菌株CMP1183、CMP1328、CMP1366、CMP1182、CMP1308、CMP1309、CMP1331、CMP1330、CMP1333、CMP1329、CMP1184和CMP1332的构建。
通过转化菌株CMP1133(BL21,Dpgl PL.2mKKDyl,GI1.2gltA,yhfSFRTPyddVIspAyhfS,thiFRTtruncIspA)并在含有20μg/mL卡那霉素的Luriα-Bertani平板上选择菌落，来构建表达PKL的菌株。用制造商(德国海德堡的基因桥公司(Gene Bridges,Heidelberg,Germany))建议的方案移除卡那霉素标记，形成所指示的菌株(表4)。
表4：大肠杆菌菌株的描述
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实例16：从多种不同细菌分离的磷酸酮醇酶的表达、溶解度和酶活性的比较。
将表达pTrcPKL长双歧杆菌的菌株(菌株CMP1183)、表达pTrcPKL鹑鸡肠球菌的菌株(菌株CMP1328)、表达pTrcPKL丙酮丁醇梭菌的菌株(菌株CMP1328)、表达pTrcPKL罗伊氏乳杆菌的菌株(菌株CMP1182)、表达pTrcPKL点形念珠藻的菌株(菌株CMP1308)、表达pTrcPKL沼泽红假单胞菌的菌株(CMP1309)、表达pTrcPKL泛菌属的菌株(CMP1331)、表达pTrcPKL梭状冻胶样杆菌的菌株(CMP1330)、以及表达pTrcPKL嗜热裂孢菌的菌株(CMP1333)生长于LB培养基中，在OD600为约0.5时用200μM IPTG诱导，在30℃或34℃的温度下诱导4小时。通过将4mL培养发酵液在3000rpm下离心10分钟来收获细胞。将细胞沉淀物 重悬于2mL的含0.1％DNA酶和0.5mM AEBSF的50mM MES、50mM NaCl pH6.0。使用弗氏细胞压碎器以14,000psi(美国仪器公司(American Instrument Company))裂解细胞悬液。然后将裂解物在Eppendorf5804R离心机中在4℃下以15,000RPM离心10分钟。分离上清液和沉淀物。将沉淀物重悬于50mM MES、50mM NaCl pH6.0裂解缓冲液中。通过4-12％SDS-PAGE凝胶电泳分析上清液和沉淀物样品。通过比较可溶性与沉淀(不溶性)磷酸酮醇酶级分来评估溶解度。
结果表明，长双歧杆菌PKL、鹑鸡肠球菌PKL、丙酮丁醇梭菌PKL、罗伊氏乳杆菌PKL、点形念珠藻PKL、沼泽红假单胞菌PKL和嗜热裂孢菌PKL在30℃温度下的溶解度大于70％。泛菌属PKL和梭状冻胶样杆菌PKL在34℃温度下的溶解度增加至约50％(表5)。
表5.生化分析的结果
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实例17：从长双歧杆菌和从鹑鸡肠球菌分离的磷酸酮醇酶的动力学分析。
将来自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶(PKL)纯化以用于后续的动力学实验。在pTrc His2B质粒的BL21菌株(CMP1183)中表达来自长双歧杆菌的PKL。在诱导之前使细胞在34℃下生长于含50μg/mL羧苄青霉素的Luriα-Bertani培养基中。在用200μM IPTG诱导之后，将培养物转移到室温摇动器中持续5小时。通过在4℃下以10,000rpm离心10分钟来收获细胞。在纯化前将细胞沉淀物保存在-80℃下。对于纯化，将长双歧杆菌PKL细胞沉淀物重悬于20mM HEPES pH7.0、60mM NaCl、0.5mM AEBSF、0.5mM MgCl2、0.1mg/mL DNA酶I中。通过反复通过弗氏细胞压碎器来裂解细胞并以50,000rpm超速离心30分钟使之澄清。首先将含有来自长双歧杆菌的PKL的澄清裂解物上样于在50mM Tris、50mM NaCl，pH7中平衡的MonoQ10/100GL柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))，然后用最终为50mM Tris、1M NaCl，pH7的梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析所得级分。使用在50mM Tris、50mM NaCL，pH7中平衡的Superdex20010/300GL和采用从50mM MES、50mM NaCl至1M NaCl缓冲液梯度的pH6.0下的MonoQ10/300GL进一步纯化长双歧杆菌PKL。使用A280和测定为149550的摩尔消光系数(由VectorNTI测定)并且另外通过凝胶光密度测量法来定量长双歧杆菌PKL。使用离子交换和凝胶过滤色谱法进行的纯化产生>95％表观均质性的PKL。合并含有长双歧杆菌PKL的级分以用于通过使用异羟肟酸铁测定法来测定PKL活性。
将来自鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶(PKL)纯化以用于后续的动力学实验。在pTrc His2B质粒的BL21菌株(CMP1328)中表达来自鹑鸡肠球菌的PKL。在诱导之前使细胞在37℃下生长于含50μg/mL羧苄青霉素的LB培养基中。在用200μM IPTG诱导之后，将培养物转移到30℃摇动器中持续5小时。通过在4℃下以10,000rpm离心10分钟来收获细胞。在纯化前将细胞沉淀物保存在-80℃下。对于纯化，将鹑鸡肠球菌PKL细胞沉淀物重悬于50mM MES pH6.0、50mM NaCL、0.5mM AEBSF、0.1mg/mL DNA酶I中。通过反复通过弗氏压碎器来裂解细胞并以50,000rpm超速离心60分钟使之澄清。首先将含有来自鹑鸡肠球菌的PKL的澄清裂解物上样于在50mM MES、50mM NaCl，pH6中平衡的DEAE HiTrap FF柱，然后用最终为50mM MES、1M NaCl，pH6的梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析所得 级分。合并含有PKL的级分并使用G25脱盐柱将其脱盐到50mM MES、50mM NaCL pH6.0中。使用在50mM MES、50mM NaCL，pH6中平衡的MonoQ10/100GL柱且最终为1M NaCl的盐梯度实现进一步纯化。合并含有PKL的级分并通过SDS PAGE分析，使用A280、由Vector NTI测定的136980的摩尔消光系数来实现定量。使用离子交换和凝胶过滤色谱法进行的纯化产生>95％表观均质性的PKL。合并含有鹑鸡肠球菌PKL的级分以用于通过使用异羟肟酸铁测定法来测定PKL活性。
使用异羟肟酸铁测定法测定含有长双歧杆菌PKL或鹑鸡肠球菌PKL的合并级分的PKL活性。使用L.Meile et.al.,Bacteriol.,2001,183:2929-2936(L.Meile等人，《细菌学》，2001年，第183卷，第2929-2936页)和Frey et.al.,Bioorganic Chem.,2008,36:121-127(Frey等人，《生物有机化学》，2008年，第36卷，第121-127页)中所述的异羟肟酸测定法的缩小版来测量PKL的催化活性，所述文献在此全文以引用方式并入本文。在96孔板(Costar目录号9017)格式中在37℃下进行该测定。每种300μL反应物含有1mM TPP、10mM磷酸钾pH6.0、50mM MES pH6、10mM MgCl2、5mM F6P以及浓度为250nM的PKL。在多个时间间隔处选取时间点。为了终止该反应，将60μL的反应混合物与60μL的pH6.5下的2M羟胺混合，并在室温下温育10分钟。采用添加40μL的15％TCA、40μL的4M HCl和40μL的在0.1M HCl中的5％FeCl3来沉淀蛋白质并允许AcP检测。然后将样品以3000rpm离心10分钟。将200μL上清液样品转移到微量滴定板，并使用读板机测量A505。建立范围在12.5与0.2mM之间的AcP标准曲线以便定量。在Pi饱和浓度(20mM)且范围为0.3mM至20mM的F6P浓度下测定来自长双歧杆菌和鹑鸡肠球菌的PKL的米氏常数KM。通过添加250nM(7μg)的纯化长双歧杆菌PKL或500nM(4μg)的鹑鸡肠球菌PKL，使反应开始。在505nm下监测与所形成的AcP的量相关的吸光度变化并对时间绘图以测定PKL反应的速率。
评估在Pi饱和浓度下长双歧杆菌和鹑鸡肠球菌PKL相对于F6P、以及在Pi饱和浓度下鹑鸡肠球菌PKL相对于X5P的动力学参数。将反应速率拟合到米氏方程以计算动力学常数(表6、图43和图44)。长双歧杆菌PKL对于F6P底物具有21.16mM的较大KM，而鹑鸡肠球菌PKL对于F6P 底物具有2.86mM的KM并且对于X5P底物为5.81mM。长双歧杆菌PKL的kcat为16.6s-1，并且鹑鸡肠球菌PKL的kcat相对于F6P为1.4s-1并且相对于X5P为4.4s-1。
表6.动力学参数汇总
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实例18：从长双歧杆菌分离的磷酸酮醇酶具有景天庚酮糖-7-磷酸催化活性。
使表达果糖-6-磷酸的细胞(阳性对照)、表达核糖-5-磷酸的细胞(阴性对照)、或单独表达景天庚酮糖-7-磷酸或与长双歧杆菌磷酸酮醇酶一起表达的细胞生长并通过LC-MS检测测定代谢物生成。
通过LC-MS对代谢物检测的分析表明，在仅表达果糖-6-磷酸(F6P)、核糖-5-磷酸(R5P)或景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的细胞中，分别主要检测到F6P、R5P或S7P(图45)。共表达R5P和长双歧杆菌磷酸酮醇酶的细胞显示其主要保留为R5P，同时有一些AcP产生。相比之下，共表达F6P和长双歧杆菌磷酸酮醇酶的细胞显示F6P检测不到，但检测到AcP形成(图45)。相似地，共表达S7P和长双歧杆菌磷酸酮醇酶的细胞显示S7P检测不到，但检测到AcP形成(图45)。
实例19：在表达磷酸酮醇酶的重组宿主细胞中以小规模产生甲羟戊酸(MVA)
产甲羟戊酸(MVA)大肠杆菌菌株通过表达来自长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、丙酮丁醇梭菌、念珠藻属、沼泽红假单胞菌、泛菌属、或嗜热裂孢菌的磷酸酮醇酶以及编码硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶的基因来构建(表7)。将不表达磷酸酮醇酶的产MVA菌株用作对照(表7)。在小规模实验中在葡萄糖中生长时针对与不表达磷酸酮醇酶的对照菌株相比的磷酸酮醇酶表达和甲羟戊酸产率来筛选表达磷酸酮醇酶的菌株。
表7.表达磷酸酮醇酶的产MVA菌株
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(i)材料
不含酵母提取物和MgSO4的改良TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、1000X痕量金属溶液1mL。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在调节pH和灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
(ii)实验程序
生长速率测量
用甘油培养物储液接种装有3mL含适当抗生素的LB培养基的摇管。将培养物在30℃、220rpm下温育大约15小时。通过将TM3培养基(不含MgSO4和酵母提取物)、1％葡萄糖、8mM MgSO4、0.02％酵母提取物和适当抗生素混合，来制备补充TM3培养基。将2mL的补充TM3接种在48孔无菌板的每个孔中，使最终OD600为0.2。将板用Breathe Easier膜密封并在34℃、600rpm下温育2小时。生长2小时后，在微量滴定板中测量OD600并用多种浓度的IPTG诱导细胞。在IPTG诱导4小时后的每小时获取OD600读数。使用SpectraMax Plus190(分子仪器公司(Molecular Devices))进行OD600测量。使细胞生长过夜并测量OD600。
葡萄糖测量
通过对锥形底96孔板中的300μL细胞培养物离心来收集葡萄糖样品并在4℃、3000rpm下离心10分钟。将上清液以10倍稀释于去离子水中并使用购自波音特科技公司(Pointe Scientific)的葡萄糖氧化酶测定试剂盒来测量葡萄糖浓度。
甲羟戊酸测量
通过在冰上混合和温育34μL的10％硫酸和300μL的细胞培养物10分钟，来处理甲羟戊酸样品。处于4℃下10分钟后，将混合物在4℃、3000rpm下离心10分钟。将250μL的上清液收集在锥形底96孔板中并用Zone-FreeTM封板膜密封以便在HPLC中测量甲羟戊酸。通过计算针对所利用的葡萄糖的量产生的总甲羟戊酸的量，来确定甲羟戊酸产率。
蛋白质表达分析
将诱导后4小时的全发酵液细胞培养物的50μL样品与50μL的2XSDS样品缓冲液一起在95℃下煮沸5分钟，并将10μL的样品上样于4– 12％Bis-Tris凝胶中以用于表达分析。将纯化的磷酸酮醇酶和预染标准品添加在每块凝胶中。凝胶用SimplyBlue![]()
G-250染料染色并用去离子水脱色。
磷酸酮醇酶表达和溶解度分析
通过将4mL培养发酵液在3000rpm下离心10分钟来收获细胞。将细胞沉淀物重悬于2mL的含0.1％DNA酶和0.5mM AEBSF的100mM Tris、100mM NaCl pH7.6。使用弗氏细胞压碎器以14,000psi(美国仪器公司(American Instrument Company))裂解细胞悬液。然后将裂解物在Eppendorf5804R离心机中在4℃下以15,000RPM离心10分钟。分离上清液和沉淀物。将沉淀物重悬于裂解缓冲液中。为沉淀物和上清液制备凝胶样品以进行电泳。使用![]()
干式转印系统，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中，然后用1:10,000稀释率的兔长双歧杆菌磷酸酮醇酶抗血清作为一抗以及2μg/mL浓度的Alexa Fluor488山羊抗兔IgG作为检测抗体，根据制造商方案进行免疫检测。通过采用蓝色荧光扫描仪屏幕的Storm860分子成像仪(分子动力公司(Molecular Dynamics))检测蛋白质带，并使用ImageQuant软件计算蛋白质浓度。
(iii)结果
由表达长双歧杆菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(EWL1319)、表达鹑鸡肠球菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(EWL1341)、表达念珠藻属PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(EWL1344)、表达沼泽红假单胞菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(EWL1347)、表达泛菌属PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(EWL1350)、或表达嗜热裂孢菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(EWL1353)所产生的MVA的分析证实，甲羟戊酸产率增加与IPTG诱导增强相关(图46)。由表达PKL的经工程改造的菌株制备的全细胞裂解物中的蛋白质表达的分析表明，IPTG诱导了蛋白质表达(图47A-D)。这些发现表明，甲羟戊酸产率增加是磷酸酮醇酶蛋白质表达增加的结果。与不表达PKL的产MVA对照菌株(CHL875)相比，还在表达长双歧杆菌PKL的菌株(EWL1319)、表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株(EWL1341)、或表达丙酮丁醇梭菌PKL的菌株(EWL1359)中观察到甲羟戊酸产率增加。表达长双歧杆菌PKL(图48A)、表达鹑鸡肠球菌PKL(图 49A)、或表达丙酮丁醇梭菌PKL(图50A)的菌株中增加的甲羟戊酸产率与增强的IPTG诱导相关。与对照菌株CHL875所产生的最大甲羟戊酸产率相比，长双歧杆菌PKL、鹑鸡肠球菌PKL、和表达磷酸酮醇酶的丙酮丁醇梭菌菌株的最大甲羟戊酸产率显示出产率增加。由表达PKL的经工程改造的菌株制备的细胞裂解物中的蛋白质表达的分析证实，IPTG诱导了长双歧杆菌PKL(图48B和C)、鹑鸡肠球菌PKL(图49B)或丙酮丁醇梭菌PKL(图50B)表达。从表达长双歧杆菌PKL的菌株分离的上清液和沉淀物级分的进一步分析表明，与不溶性级分(图48C)相比，磷酸酮醇酶主要在可溶性级分中(图48B)。这些结果与甲羟戊酸产率增加是磷酸酮醇酶表达增加的结果的结论一致。
实例20：在表达磷酸酮醇酶的重组宿主细胞中以15L规模产生甲羟戊酸(MVA)
在15升规模实验中，将表达来自鹑鸡肠球菌(菌株EWL1341)和丙酮丁醇梭菌(菌株EWL1359)的磷酸酮醇酶的产甲羟戊酸(MVA)菌株与不表达磷酸酮醇酶的产MVA菌株(菌株CHL875)进行比较。测量和分析了从葡萄糖产生的累积MVA产率、从葡萄糖产生的瞬时产率、MVA的体积生产率、MVA比生产率和细胞性能指数(CPI)。
(i)材料
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g、50％硫酸1.6mL、1000X改良痕量金属溶液1mL。将所有组分一起加入并溶解于去离子水中。将该溶液加热灭菌(123℃，20分钟)。用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0，然后定容。灭菌和pH调节后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
维生素溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g、D-(+)-生物素1.0g、烟酸1.0g、盐酸吡哆醇4.0g。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
宏量盐溶液(每升)：
MgSO4*7H2O296g、一水柠檬酸296g、柠檬酸铁铵49.6g。用水溶解所有组分，定容并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
料液(每千克)：
葡萄糖0.590kg、Di H2O0.393kg、K2HPO47.4g和100％Foamblast8828.9g。将所有组分混合并进行高压消毒。在对料液进行高压灭菌后，将营养补充物添加至无菌罩中的料瓶中。灭菌后向进料中添加的是(每千克料液)宏量盐溶液5.54ml、维生素溶液6.55ml、1000X改良痕量金属溶液0.82mL。
(ii)实验程序
通过使菌株生长于15L规模的补料分批培养物中，评估由表达来自甲羟戊酸途径的引入基因和从鹑鸡肠球菌(菌株EWL1341)或丙酮丁醇梭菌(菌株EWL1359)分离的PKL的改良大肠杆菌(BL21)宿主(CMP1133)产生的甲羟戊酸(MVA)产量(表9)。将MVA产量与表达来自甲羟戊酸途径的引入基因但不表达PKL(菌株CHL875)的改良大肠杆菌(BL21)宿主(CMP1133)进行比较，以确定任何产率改善是否可归因于磷酸酮醇酶的使用。
表9.对MVA产量进行测定的菌株的列表
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测定在所需的发酵pH(7.0)和温度(34℃)下由葡萄糖形成的甲羟戊酸(MVA)。为开始每个实验，将适当冷冻小瓶的大肠杆菌(BL21)菌株解冻并接种进装有胰蛋白胨-酵母提取物(LB)培养基和适当抗生素的烧瓶中。当接种物生长至在550nm下测量的光密度(OD550)为大约1.0时，将500mL用于接种15L生物反应器并使初始罐体积为5L。
将产甲羟戊酸菌株在若干产生过程条件中运行(表10)。分批供料的培养基具有以9.7g/L分批供料的葡萄糖。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来实现诱导。当细胞处于OD550为6时，将一注IPTG添加至罐中以使浓度达指定水平。一旦培养物消耗了葡萄糖(由pH升高指示)，就以低于或等于10g/min的速率供应葡萄糖料液以满足代谢要求。发酵运行足以测定从葡萄糖产生的最大累积甲羟戊酸质量产率的时长，用去的总发酵时间为60至64小时。
将对照菌株(CHL875)的性能度量与实验菌株EWL1341、EWL1359进行比较。相关的性能度量是从葡萄糖产生的累积MVA产率、从葡萄糖产生的瞬时MVA产率、MVA的体积生产率、MVA比生产率和细胞性能指数。将实验菌株(具有磷酸酮醇酶)在与对照(不表达磷酸酮醇酶)的相同条件中运行，以确定任何产率改善是否可归因于磷酸酮醇酶的使用。
使用下式计算总产率：
从葡萄糖产生的重量％产率＝MVA总量(t)/[(进料重量(0)-进料重量(t)+83.5)*0.59)]，
其中0.59为葡萄糖料液中葡萄糖的重量％，83.5为在t＝0时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。独立地对每次进料测量其重量％。
使用下式计算CPI：
CPI＝MVA总克数/干细胞重量总克数
独立地通过两台质谱仪，即iSCAN(汉胜公司(Hamilton Sundstrand))和Hiden HPR20(海德公司(Hiden Analytical))质谱仪，测定废气中的氧气、氮气和二氧化碳水平。通过带有汉密尔顿公司(Hamilton Company)提供的光学传感器的清洁可灭菌探针来测量发酵液中的溶氧。通过HPLC分析测定以4小时的间隔提取的发酵液样品中柠檬酸、葡萄糖、乙酸和甲羟戊酸在发酵液中的浓度。通过折射率响应与此前用已知浓度的标准品产生的校准曲线的比较来测定发酵液样品中的浓度。
HPLC信息
系统：Waters Alliance2695
柱：BioRad-Aminex HPX-87H离子排阻柱300mm×7.8mm目录号125-0140
柱温：50℃
保护柱：BioRad-Microguard Cation H柱芯30mm×4.6mm目录号125-0129
运行缓冲液：0.01N H2SO4
运行缓冲液流速：0.6mL/min
近似运行压力：约1100-1200psi
进样体积：20微升
检测器：折射率检测器(Knauer K-2301)
运行时间：26分钟
表10.制备工艺条件
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(iii)结果
表达丙酮丁醇梭菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1359，运行20121056、201201057、20121058)实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(CHL875，运行20120821、20120976、20121059)更高的从葡萄糖产生MVA的累积产率％(表11和图51)。当将至少100μM IPTG添加至罐时(20121057和20121058)注意到MVA产率增加。
表达鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1341，运行20120977、201200978、20120979)实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(CHL875，运行20120821、20120976、20121059)更高的从葡萄糖产生MVA的累积产率％(表11和图52)。当将至少50μM IPTG添加至罐时(20120978和20120979)注意到MVA产率增加。
表11.MVA生产率度量
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所有情况下的MVA产率都与所添加的IPTG的量相关(图53)。为了进行直接比较，在添加了100μM IPTG的运行中，表达磷酸酮醇酶的两 种菌株(20120979和20121057)都实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(CHL875，运行201201059)显著更高的从葡萄糖产生MVA的累积产率％(表12和图53)。累积MVA产率(在表达磷酸酮醇酶的两种情况下)与各自运行中测量的磷酸酮醇酶活性良好相关(表12和图54)。
表12.MVA产率/磷酸酮醇酶活性
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表达丙酮丁醇梭菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1359，运行20121057，在100μM IPTG下诱导)实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(CHL875，运行20121059，在100μM IPTG下诱导)略高的细胞性能指数(MVA克数/干细胞重量克数)。当用400μM IPTG诱导时(EWL1359，运行20121058)，CPI高于对照(CHL875，运行20121059，在100μM IPTG下诱导)(图55)。
表达鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1341，运行20120978和20120979，分别在50μM IPTG和100μM下诱导)实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(CHL875，运行20120976，不添加IPTG)更高的细胞性能指数(MVA克数/干细胞重量克数)。当不添加IPTG时(EWL1341，运行20120977)，CPI仅比对照(CHL875，运行20120976，不添加IPTG)略高(图56)。
实例21：在表达磷酸酮醇酶的重组宿主细胞中以小规模产生异戊二烯
构建表达来自长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌或丙酮丁醇梭菌的磷酸酮醇酶的产异戊二烯大肠杆菌菌株。将不表达磷酸酮醇酶的产异戊二烯菌株用作 对照(表13)。在小规模实验中在葡萄糖中生长时针对与不表达磷酸酮醇酶的对照菌株相比的磷酸酮醇酶表达和异戊二烯产率来筛选表达磷酸酮醇酶的菌株。
产异戊二烯菌株通过引入质粒pEWL1418(图57)产生菌株EWL1427(表13)而在表达长双歧杆菌PKL的改良大肠杆菌(BL21)宿主(MCM2065)中制备。为了产生表达鹑鸡肠球菌PKL的菌株，将质粒pEWL1421(图58)或pEWL1438(图59)引入改良大肠杆菌(BL21)宿主(MCM2065)中以分别生成菌株EWL1430和菌株EWL1449(表13)。为了产生表达丙酮丁醇梭菌PKL的菌株，使用质粒pEWL1436(图60)和质粒pEWL1440(图61)分别产生菌株EWL1446和菌株EWL1452(表13)。
表13.表达磷酸酮醇酶的产异戊二烯菌株
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bMVK表示布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶
mMVK表示马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、酵母提取物0.2g、1000X痕量金属溶液1ml。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在调节pH和灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
不含酵母提取物和MgSO4的改良TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、1000X痕量金属溶液1mL。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在调节pH和灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
(ii)实验程序
生长速率测量
用甘油培养物储液接种装有3mL含适当抗生素的LB培养基的摇管。将培养物在30℃、220rpm下温育大约15小时。通过将TM3培养基(不含MgSO4和酵母提取物)、1％葡萄糖、8mM MgSO4、0.02％酵母提取物和适当抗生素混合，来制备补充TM3培养基。将2mL的补充TM3接种在48孔无菌板的每个孔中，使最终OD600为0.2。将板用Breathe Easier膜密封并在34℃、600rpm下温育2小时。生长2小时后，在微量滴定板中测量OD600并用多种浓度的IPTG诱导细胞。在IPTG诱导4小时后的每小时获 取OD600读数。使用SpectraMax Plus190(分子仪器公司(Molecular Devices))进行OD600测量。使细胞生长过夜并测量OD600。
葡萄糖测量
通过对锥形底96孔板中的300μL细胞培养物离心来收集葡萄糖样品并在4℃、3000rpm下离心10分钟。将上清液以10倍稀释于去离子水中并使用购自波音特科技公司(Pointe Scientific)的葡萄糖氧化酶测定试剂盒来测量葡萄糖浓度。
异戊二烯比生产率测量
在IPTG诱导4小时后的每小时将100μL异戊二烯样品收集在96孔玻璃板中。将该玻璃板用铝箔密封并使用恒温混匀器(Thermomixer)在34℃下温育同时在450rpm下振荡30分钟。30分钟后，将该板保持在70℃水浴下2分钟，并使用气相色谱-质谱联用仪测定顶空中的异戊二烯的水平。
蛋白质表达分析
将诱导后4小时的全发酵液细胞培养物的50μL样品与50μL的2XSDS样品缓冲液一起在95℃下煮沸5分钟，并将10μL的样品上样于4–12％Bis-Tris凝胶中以用于表达分析。将纯化的磷酸酮醇酶和预染标准品添加在每块凝胶中。凝胶用SimplyBlue Coomassie？G-250染料染色并用去离子水脱色。
(iii)结果
由在存在布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶表达的情况下表达长双歧杆菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(菌株EWL1427)、在存在布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶表达的情况下表达鹑鸡肠球菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(菌株EWL1430)、或在存在布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶表达的情况下表达丙酮丁醇梭菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(菌株EWL1446)从葡萄糖产生的异戊二烯的分析证实，与不表达PKL的对照菌株(菌株MCM2158)相比，异戊二烯产率增加与IPTG诱导增强相关(图62A和B)。由表达PKL的经工程改造的菌株制备的全细胞裂解物中的蛋白质表达的分析表明，IPTG诱导了蛋白质表达(图63A和B)。这些发现表明，异戊二烯产率增加是磷酸酮醇酶蛋白质表达增加的结果。
由在存在马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶表达的情况下表达鹑鸡肠球菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(菌株EWL1449)或在存在马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶表达的情况下表达丙酮丁醇梭菌PKL的经工程改造的大肠杆菌菌株(菌株EWL1452)从葡萄糖产生的异戊二烯的分析证实，与不表达PKL的对照菌株(菌株DW719)相比，异戊二烯产率增加与IPTG诱导增强相关(图64A)。由表达PKL的经工程改造的菌株制备的全细胞裂解物中的蛋白质表达的分析表明，IPTG诱导了蛋白质表达(图64B)。这些发现表明，异戊二烯产率增加是磷酸酮醇酶蛋白质表达增加的结果。
总体而言，这些结果证实，在存在不同甲羟戊酸激酶基因的情况下表达从不同细菌例如长双歧杆菌、鹑鸡肠球菌、和丙酮丁醇梭菌分离的PKL基因的菌株从葡萄糖产生了异戊二烯。
实例22：在表达磷酸酮醇酶的重组宿主细胞中以15L规模产生异戊二烯
在用于产生异戊二烯的15升规模实验中，将表达来自长双歧杆菌的磷酸酮醇酶的产异戊二烯菌株(菌株EWL1427)或鹑鸡肠球菌的磷酸酮醇酶的产异戊二烯菌株(菌株EWL1430)与不表达磷酸酮醇酶的产异戊二烯菌株(菌株MCM2158)进行比较。测量并分析了从葡萄糖产生的累积异戊二烯产率、从葡萄糖产生的瞬时异戊二烯产率和细胞性能指数(CPI)。
(i)材料
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g、50％硫酸1.6mL、1000X改良痕量金属溶液1mL。将所有组分一起加入并溶解于去离子水中。将该溶液加热灭菌(123℃，20分钟)。用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0，然后定容。灭菌和pH调节后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次溶解一种物质的方式用去离子水 溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
维生素溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g、D-(+)-生物素1.0g、烟酸1.0g、盐酸吡哆醇4.0g。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
宏量盐溶液(每升)：
MgSO4*7H2O296g、一水柠檬酸296g、柠檬酸铁铵49.6g。用水溶解所有组分，定容并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
料液(每千克)：
葡萄糖0.590kg、Di H2O0.393kg、K2HPO47.4g和100％Foamblast8828.9g。将所有组分混合并进行高压消毒。在对料液进行高压灭菌后，将营养补充物添加至无菌罩中的料瓶中。灭菌后向进料中添加的是(每千克料液)宏量盐溶液5.54ml、维生素溶液6.55ml、1000X改良痕量金属溶液0.82mL。
(ii)实验程序
通过使菌株生长于15L规模的补料分批培养物中，评估由表达来自甲羟戊酸途径的引入基因和从长双歧杆菌(菌株EWL1427)或鹑鸡肠球菌(菌株EWL1430)分离的PKL的改良大肠杆菌(BL21)宿主(MCM2065)产生的异戊二烯产量(表14)。将异戊二烯产量与表达来自甲羟戊酸途径的引入基因但不表达PKL的改良大肠杆菌(BL21)宿主(MCM2065)(菌株MCM2158)进行比较，以确定任何产率改善是否可归因于磷酸酮醇酶的使用。
表14.产异戊二烯菌株的列表
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bMVK表示布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶
将产异戊二烯菌株在标准产生过程中运行(表15)。在发酵pH7.0和34℃的温度下监测从葡萄糖产生的异戊二烯产量。为开始该实验，将一冷冻小瓶的大肠杆菌(BL21)菌株解冻并接种进装有胰蛋白胨-酵母提取物(LB)培养基和适当抗生素的烧瓶中。当接种物生长至在550nm下测量的光密度(OD550)为大约1.0时，将500mL用于接种15L生物反应器并使初始罐体积为5L。分批供料的培养基具有以9.7g/L分批供料的葡萄糖。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来实现诱导。当细胞处于OD550为6时，将一注IPTG添加至罐中以使浓度达指定水平。一旦培养物消耗了葡萄糖(由pH升高指示)，就以低于或等于10g/min的速率供应葡萄糖料液以满足代谢要求。发酵运行足以测定从葡萄糖产生的最大累积异戊二烯质量产率的时长，用去的总发酵时间为60至64小时。
表15.制备工艺条件
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将对照菌株(MCM2158)的性能度量与实验菌株EWL1427和EWL1430进行比较。性能度量是从葡萄糖产生的累积异戊二烯产率、从葡萄糖产生 的瞬时异戊二烯产率和细胞性能指数(CPI)。将实验菌株(具有磷酸酮醇酶)在与对照(不表达磷酸酮醇酶)的相同条件中运行。
使用下式计算总异戊二烯产率：
从葡萄糖产生的重量％产率＝异戊二烯总量(t)/[(进料重量(0)-进料重量(t)+83.5)*0.59)]，
其中0.59为葡萄糖料液中葡萄糖的重量％，83.5为在t＝0时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。独立地对每次进料测量其重量％。
使用下式计算异戊二烯瞬时产率：
异戊二烯瞬时产率(g/g％)＝所产生异戊二烯(t1-t0)/所消耗葡萄糖(t1-t0)*100
使用下式计算CPI：
CPI＝异戊二烯总克数/干细胞重量总克数
独立地通过两台质谱仪，即iSCAN(汉胜公司(Hamilton Sundstrand))和Hiden HPR20(海德公司(Hiden Analytical))质谱仪，测定废气中的异戊二烯、氧气、氮气和二氧化碳水平。通过带有汉密尔顿公司(Hamilton Company)提供的光学传感器的清洁可灭菌探针来测量发酵液中的溶氧。通过HPLC分析测定以4小时的间隔提取的发酵液样品中柠檬酸、葡萄糖、乙酸和甲羟戊酸在发酵液中的浓度。通过折射率响应与此前用已知浓度的标准品产生的校准曲线的比较来测定发酵液样品中的浓度。
HPLC信息
系统：Waters Alliance2695
柱：BioRad-Aminex HPX-87H离子排阻柱300mm×7.8mm目录号125-0140
柱温：50℃
保护柱：BioRad-Microguard Cation H柱芯30mm×4.6mm目录号125-0129
运行缓冲液：0.01N H2SO4
运行缓冲液流速：0.6mL/min
近似运行压力：约1100-1200psi
进样体积：20微升
检测器：折射率检测器(Knauer K-2301)
运行时间：26分钟
(iii)结果
表达鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1430,20121136)实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(MCM2158,20121134)更高的从葡萄糖产生异戊二烯的累积产率％(表16和图65)。表达鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1430,20121136)实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(MCM2158,20121134)更高的从葡萄糖产生异戊二烯的瞬时产率％(表16和图66)，并且该高产率保持更长时间段，从而得到更高累积产率(表16和图65)。虽然表达长双歧杆菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1427,20121135)在运行晚期具有较高峰值瞬时产率(图66)，但该菌株需要更长时间才能达到峰值产率，并且最终以与对照菌株(MCM2158,20121134)大约相同的从葡萄糖产生异戊二烯的累积产率结束(表16和图65)。
表达鹑鸡肠球菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1430,20121136)实现了比不表达磷酸酮醇酶的菌株(MCM2158,20121134)略高的CPI(图67)。表达长双歧杆菌磷酸酮醇酶的菌株(EWL1427,20121135)具有比不表达磷酸酮醇酶的菌株(MCM2158,20121134)略低的CPI(图67)。峰值累积产率的时间(60小时EFT)为比较CPI的时间点。
表16.异戊二烯生产率度量
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表17.异戊二烯产率汇总
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表18.以来自长双歧杆菌和鹑鸡肠球菌的PKL的AcP形成和比活性为单位的PKL比生产率的汇总。
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实例23：以14L规模生长的重组宿主细胞表达细胞中的磷酸酮醇酶的体外比活性分析
在动力学实验中分析表达来自鹑鸡肠球菌(表19和表21)、丙酮丁醇梭菌(表20)或长双歧杆菌(表21)的磷酸酮醇酶(PKL)的菌株。为了制备样品，在14L发酵运行过程期间从1mL培养物中获得细胞沉淀物并保存在-80℃下。将沉淀物样品在含1mg/mL溶菌酶、0.2mg/mL DNA酶I和0.5mM AEBSF的50mM MES，pH6中重悬并归一化至OD(600)＝20。将OD归一化的细胞沉淀物在设置为中等比率的700psi下的弗氏微型细胞压 碎器中反复通过，从而裂解所述细胞沉淀物。然后通过在4℃以14,000rpm离心10分钟，使裂解的样品澄清。对可溶性裂解物级分进行活性测定和蛋白质测量。使用通过滴定浓度在0.5与0.05mg/mL之间范围的BSA所建立的标准曲线，按照Bradford Bio Rad方法测定总蛋白质。
使用L.Meile et.al.,Bacteriol.,2001,183:2929-2936(L.Meile等人，《细菌学》，2001年，第183卷，第2929-2936页)和Frey et.al.,Bioorganic Chem.,2008,36:121-127(Frey等人，《生物有机化学》，2008年，第36卷，第121-127页)中所述的异羟肟酸测定法的缩小版来测量PKL的催化活性，所述文献全文以引用方式并入本文。在96孔板(Costar目录号9017)格式中在37℃下进行该测定。在标准测定中，反应混合物由5mM F6P、1mM TPP、10mM磷酸钾、pH6的50mM MES缓冲液、和10mM MgCl2、20mM氟化钠、8mM碘乙酰胺和1mM DTT组成。通过添加F6P使反应开始并在温育30分钟后终止反应。总反应体积通常为300μL(在必要时使用较小的量)。AcP用作浓度在15-0.23mM之间范围的标准曲线。为了终止该反应，将60μL的反应混合物与60μL的pH6.5下的2M羟胺混合，并在室温下温育10分钟。采用添加40μL的15％TCA、40μL的4M HCl和40μL的在0.1M HCl中的5％FeCl3来沉淀蛋白质并允许AcP检测。然后将样品以3000rpm离心10分钟。将200μL的上清液转移到微量滴定板中以便以505nm的吸光度测量AcP形成的速率。
表19.鹑鸡肠球菌PKL在组成型甲羟戊酸背景中表达时的14L规模运行
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表20.丙酮丁醇梭菌PKL在组成型上游途径菌株中表达时的14L规模运行
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表21.鹑鸡肠球菌PKL或长双歧杆菌PKL在具有完整甲羟戊酸途径和异戊二烯合酶的菌株中表达时的14L规模运行
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带有鹑鸡肠球菌PKL的EWL1341菌株的AcP形成的体外比生产率在0.75至1.77mmol/L/h/OD的范围内，具体取决于诱导的水平(表22和图68A)。此外，带有鹑鸡肠球菌PKL的EWL1341菌株的AcP形成的体外比活性在7.1E-02至1.1E-01μmol/mg/min的范围内，具体取决于诱导的水平(表22和图68B)。
表22.以鹑鸡肠球菌PKL的AcP形成和比活性为单位的鹑鸡肠球菌PKL比生产率的汇总。
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带有丙酮丁醇梭菌PKL的EWL1359菌株的AcP形成的体外比生产率在0.12至0.74mmol/L/h/OD的范围内，具体取决于诱导的水平(表23和图69A)。此外，带有丙酮丁醇梭菌PKL的EWL1359菌株的AcP形成的体外比活性在1.1E-02至7.6E-02μmol/mg/min的范围内，具体取决于诱导的水平(表23和图69B)。
表23.以丙酮丁醇梭菌PKL的AcP形成和比活性为单位的丙酮丁醇梭菌PKL比生产率的汇总。
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带有长双歧杆菌PKL并用100μM IPTG诱导的EWL1427菌株的AcP形成的体外比生产率在7.30至10.01mmol/L/h/OD的范围内(表23和图70)。带有鹑鸡肠球菌PKL的EWL1430菌株当用100μM IPTG诱导时AcP形成的体外比生产率在0.98至1.13mmol/L/h/OD的范围内，并且当用200μM IPTG诱导时在1.30至1.38mmol/L/h/OD的范围内(表24和图70)。
带有长双歧杆菌PKL并用100μM IPTG诱导的EWL1427菌株的AcP形成的体外比活性在7.1E-01至8.7E-01μmol/mg/min的范围内(表23和图71)。带有鹑鸡肠球菌PKL的EWL1430菌株当用100μM IPTG诱导时AcP形成的体外比生产率在8.0E-02至1.0E-01μmol/mg/min的范围内，并且当用200μM IPTG诱导时在1.1E-01至1.2E-01μmol/mg/min的范围内(表24和图71)。
总体而言，这些发现表明，磷酸酮醇酶活性存在于所有菌株中。
表24.以来自长双歧杆菌和鹑鸡肠球菌的PKL的AcP形成和比活性为单位的PKL比生产率的汇总。
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实例24：带有宿主突变的表达磷酸酮醇酶的菌株的构建以用于产生异戊二烯。
可对包含如上所述的活性磷酸酮醇酶多肽的产异戊二烯菌株进一步工程改造以增加以下一种或多种基因的活性，所述基因包括核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)、D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶(rpe)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、转醛醇酶B(tal B)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)，以改善通过磷酸酮醇酶途径的碳通量(图72)。在某些方面，下列基因rpiA、rpiB、rpe、tktA、tktB、tal B、ppsA、eutD和/或pta的活性可通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。在一个实施例中，核糖-5-磷酸异构酶(rpiA和/或rpiB)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。在另一个实施例中，D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶(rpe)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。在另一个实施例中，转酮醇酶(tktA和/或tktB)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。在又一个实施例中，转醛醇酶B(tal B)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。在另一个实施例中，磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。在其他实施例中，磷酸乙酰转移酶(pta和/或eutD)的活性通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。在某些方面，下 列基因rpiA、rpiB、rpe、tktA、tktB、tal B、ppsA、eutD和/或pta的同功酶可通过改变染色体上的启动子和/或rbs或者通过使其从质粒表达而增加。
可对这些菌株进一步工程改造以降低以下一种或多种基因的活性，所述基因包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、6-磷酸果糖激酶-1(pfkA和/或pfkB)、果糖二磷酸醛缩酶(fba、fbaA、fbaB和/或fbaC)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA和/或gapB)、乙酸激酶(ackA)、柠檬酸合酶(gltA)、转酮醇酶(tktA和/或tktB)、EI(ptsI)、EIICBGlc(ptsG)、EIIAGlc(crr)、和/或HPr(ptsH)，以增加进入磷酸酮醇酶途径的碳通量(图73)。在一个实施例中，编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因下调。在另一个实施例中，编码6-磷酸果糖激酶-1A的pfkA基因下调。在另一个实施例中，编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶A的gapA基因下调。在另一个实施例中，编码果糖二磷酸醛缩酶的fba基因下调。在又一个实施例中，编码柠檬酸合酶的gltA基因下调。在一个实施例中，编码乙酸激酶的ackA基因下调。在另一个实施例中，编码EI的ptsI基因下调。在一个实施例中，编码HPr的ptsH基因下调。在另一个实施例中，编码EIICBGlc的ptsG基因下调。在又一个实施例中，编码EIIAGlc的crr基因下调。pts操纵子编码磷酸转移酶系统的基因。在一些实施例中，可对菌株进行工程改造以降低磷酸转移酶系统(PTS)的活性，从而增加进入磷酸酮醇酶途径的碳通量。在一些实施例中，通过下调pts操纵子来下调PTS。在某些方面，PTS下调并且葡萄糖转运途径上调。葡萄糖转运途径包括但不限于半乳糖(galP)和葡糖激酶(glk)基因。在一些实施例中，pts操纵子下调，半乳糖(galP)基因上调，并且葡糖激酶(glk)基因上调。在某些方面，由以下基因zwf、pfkA、fba、gapA、ackA、gltA、tktA、ptsG、ptsH、ptsI、和/或crr编码的蛋白质的同功酶可下调以增加进入磷酸酮醇酶途径的碳通量。在一些实施例中，pfkB基因下调。在一些实施例中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶B(gapB)基因下调。在一些实施例中，转酮醇酶B(tktB)基因下调。
实例25：由带有宿主突变的表达磷酸酮醇酶的菌株以小规模产生异戊二烯。
(i)材料
TM3培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g、KH2PO413.6g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、(NH4)2SO43.2g、酵母提取物0.2g、1000X痕量金属溶液1ml。将所有组分一起添加并溶解于去离子水中。用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。用0.22微米过滤器对培养基进行过滤灭菌。在调节pH和灭菌后加入葡萄糖10.0g和抗生素。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)
柠檬酸*H2O40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO4*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次一种的方式将每种组分溶解于去离子水中。用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后将溶液定容，并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
(ii)实验程序
将细胞在Luriα-Bertani肉汤+抗生素中培养过夜。次日，将它们在含有50μg/ml的壮观霉素、25μg/mL氯霉素和50μg/mL羧苄青霉素的20mL TM3培养基(在250mL带挡板的Erlenmeyer烧瓶中)中稀释至OD600为0.1，并在34℃和200rpm下温育。培养2小时后，测量OD600并添加200μM IPTG。在发酵过程中定期取样。在每个时间点，测量OD600。另外，对异戊二烯的废气分析用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(安捷伦公司(Agilent))顶空测定法来进行。将100微升全部肉汤置于密封的GC小瓶中并在34℃和200rpm下温育30分钟的固定时间。在由在70℃下温育7分钟组成的加热杀灭步骤后，将样品上样至GC上。所报道的比生产率为由GC读出的单位为μg/L的异戊二烯量除以温育时间(30分钟)和所测得的OD600。
实例26：由带有宿主突变的表达磷酸酮醇酶的菌株以15L规模产生异戊二烯。
(i)材料
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g、MgSO4*7H2O2g、柠檬酸一水合物2g、柠檬酸铁铵0.3g、酵母提取物0.5g、50％硫酸1.6mL、1000X改良痕量金属溶液1mL。 将所有组分一起加入并溶解于去离子水中。将该溶液加热灭菌(123℃，20分钟)。用氢氧化铵(28％)将pH调节至7.0，然后定容。灭菌和pH调节后加入葡萄糖10g、维生素溶液8mL和抗生素。
1000X改良痕量金属溶液(每升)：
一水柠檬酸40g、MnSO4*H2O30g、NaCl10g、FeSO4*7H2O1g、CoCl2*6H2O1g、ZnSO*7H2O1g、CuSO4*5H2O100mg、H3BO3100mg、NaMoO4*2H2O100mg。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
维生素溶液(每升)：
盐酸硫胺素1.0g、D-(+)-生物素1.0g、烟酸1.0g、盐酸吡哆醇4.0g。以每次溶解一种物质的方式用去离子水溶解每种组分，使用HCl/NaOH将pH调节至3.0，然后对溶液定容，并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
Macro盐溶液(每升)：
MgSO4*7H2O296g、一水柠檬酸296g、柠檬酸铁铵49.6g。用水溶解所有组分，定容并使用0.22微米过滤器过滤灭菌。
料液(每千克)：
葡萄糖0.590kg、Di H2O0.393kg、K2HPO47.4g和100％Foamblast8828.9g。将所有组分混合并进行高压消毒。在对料液进行高压消毒后，将营养补充物添加至无菌罩中的料瓶中。灭菌后向进料中添加的是(每千克料液)宏量盐溶液5.54ml、维生素溶液6.55ml、1000X改良痕量金属溶液0.82mL。
(ii)分析
独立地通过两台质谱仪，即iSCAN(汉胜公司(Hamilton Sundstrand))和Hiden HPR20(海德公司(Hiden Analytical))质谱仪，测定废气中的异戊二烯、氧气、氮气和二氧化碳水平。
通过带有汉密尔顿公司(Hamilton Company)提供的光学传感器的清洁可灭菌探针来测量发酵液中的溶氧。
通过HPLC分析测定以4小时的间隔提取的发酵液样品中柠檬酸、葡萄糖、乙酸和甲羟戊酸在发酵液中的浓度。通过折射率响应与此前用已知浓度的标准品产生的校准曲线的比较来测定发酵液样品中的浓度。