基于ABCC3基因的小菜蛾对BT杀虫蛋白CRY1AC抗性的检测方法及其试剂盒.pdf

本发明公开了一种基于ABCC3基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，所述试剂盒包含以下靶标基因特异引物序列：正向引物如SEQIDNO.2所示，反向引物如SEQIDNO.3所示。本发明方法，需人力及样品量少，检测数量大，而且灵敏度高、特异性强、快速简便和准确可靠，因而能有效的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac的抗性水平，适合于小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的早期快速诊断，同时可用于田间小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时监控和预警预报，应用前景广泛。

1.  一种用于检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR引物对，其特征在于：
所述引物对的序列为：正向引物如SEQ ID NO.2所示，反向引物如 SEQ ID NO.3所示。

2.  一种用于检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对。

3.  一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，其特征在于：
其采用如权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的试剂盒进行PCR。

4.  如权利要求3所述的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，具体包括以下步骤：
(1)提取待测小菜蛾的RNA样品，并反转录为cDNA模板；
(2)将所述cDNA模板加入到含有所述引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；
(3)进行实时荧光定量PCR检测。

5.  如权利要求4所述的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，其中，所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：94℃预变性15 min，94℃变性15 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸32 sec，40个循环。

6.  如权利要求4所述的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，其中，PCR过程完成后，按0.l℃·s^-1的升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15 s，然后60℃进行1 min，接着95℃进行30 s，最后再在60℃进行15 s；
若所述待测小菜蛾的样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰融解曲线，且△Ct值[Ct值_{(目的基因ABCC3}-_{内参基因L32)}]≥7，则说明所述小菜蛾待测的样品对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；若△Ct值[Ct值_{(目的基因ABCC3}-_{内参基因L32)}]≤6，则说明待测小菜蛾的样品未对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性。

7.  根据权利要求4至6任一项所述的方法，其特征在于：所述待测小菜蛾的RNA样品为小菜蛾4龄幼虫中肠的RNA样品。

基于ABCC3基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。
背景技术
小菜蛾Plutella xylostella (L.)，属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一种世界性危害的重要蔬菜害虫，寄主多达40种以上，现已成为世界范围内十字花科蔬菜生产的重大障碍。小菜蛾主要以幼虫在十字花科蔬菜的整个生长期危害叶片，大大降低了蔬菜的产量和质量，个别田块严重发生时能减产90%以上，甚至绝产。小菜蛾之所以危害如此严重主要是因为对化学农药具有超强的适应性。目前，它几乎对用于防治其危害的各类杀虫剂都产生了不同程度的抗药性，这主要包括有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、昆虫生长发育调节剂以及生物源农药阿维菌素、多杀菌素和苏云金芽孢杆菌Bt等五十多种杀虫剂 (唐振华和周成理，1992)。
苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis，简称Bt) 是一种可产生杀虫晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs，又被称为δ-内毒素) 的革兰氏阳性细菌。Bt很早即作为生物杀虫剂被广泛用于田间害虫防治，Bt制剂现已成为世界上应用最广的一类微生物杀虫剂。但是Bt制剂大量及不合理的使用最终造成了害虫产生Bt抗性。目前在世界范围内至少已有7种害虫被报道已经在田间产生Bt抗性，这其中包括2种害虫对Bt制剂产生抗性以及5种害虫对Bt作物产生抗性 (Tabashnik et al., 2011; Tabashnik et al., 2013)。由此可知，小菜蛾的Bt抗性问题已非常突出，因此为了更有效的使用Bt生物农药防治小菜蛾，开发有效地小菜蛾Bt抗性早期快速分子诊断技术就显得尤为重要。目前，尽管一些基于PCR方法的分子标记技术如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性) 已经用于小菜蛾抗性相关基因的寻找上，但这些标记并未直接用于小菜蛾抗性检测，小菜蛾Bt抗性检测仍局限于生物测定方法。然而，传统的生物测定方法有一些缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；(2)周期长：小菜蛾的Bt生物测定结果一般需要2天 (48小时) 以上；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线完成一次生测至少需要约200头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高。(4)操作麻烦且标准性不强：方法比较繁琐，操作起来比较复杂，从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，尤其要求试虫的大小一致，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会影响生测结果；(5)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的LC₅₀和 LC₉₀值的重复性和精确性较低；(6)传统的生物测定方法对供试昆虫测得的抗性水平往往具有滞后性。
随着分子生物学技术进一步的飞速发展，人们已经将实时荧光定量PCR 技术 (Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR) 广泛应用于多种病毒、细菌的抗药性检测，并开始应用于转录水平上昆虫Bt抗药性靶标基因的表达量检测。实时荧光定量PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。相对于生测等常规Bt抗性检测手段，实时荧光定量PCR具有操作简单，灵敏度高，重复性好等优点，因而已开始成为昆虫抗药性靶标基因转录水平表达量检测的首选方法，在抗药性检测上日益显示出强大的优势。
目前，利用PCR技术对Bt杀虫蛋白受体基因---类钙粘蛋白基因 (cadherin-like gene) 在对Bt杀虫蛋白抗性的棉红铃虫 (Pectinophora gossypiella) 及烟芽夜蛾 (Heliothis virescens) 中缺失突变位点来检测这两种害虫对Bt杀虫蛋白抗性情况已经被报道，但是田间害虫种群检测效果并不理想 (Morin et al., 2004; Gahan et al., 2007)。而且，研究表明，形成Bt杀虫蛋白抗性小菜蛾的类钙粘蛋白基因并未发生突变，小菜蛾Bt杀虫蛋白抗性与该基因无关 (Baxter et al., 2005)。最近，却有研究表明，ABC转运蛋白 (ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)超家族中ABCC亚家族的ABCC2基因发生突变并导致小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性 (Baxter et al., 2011)，而且，该实验中所用的小菜蛾种群是田间进化的Bt杀虫蛋白Cry1Ac高抗种群，这说明ABCC2基因发生突变的小菜蛾可以在田间存活，这就为田间小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测提供了很好的靶标基因。然而，我们随后的实验并未发现ABCC2基因突变与Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性相关，然而，我们最近利用实时荧光定量PCR技术研究发现，ABC转运蛋白超家族中ABCC亚家族的ABCC3基因表达量显著上调与小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性密切相关，那么，利用实时荧光定量PCR技术检测ABCC3表达量的下降水平是一种有效检测田间害虫Bt Cry类杀虫毒素抗性的好方法。毫无疑问，小菜蛾早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗性治理措施的评价以及抗药性风险预警提供技术手段，在减少害虫危害损失、减少农药对环境的污染、保障蔬菜产品的质量和保障人民身体健康等方面具有重要的意义。因此，建立一种准确、简便、快速、可靠的小菜蛾Bt抗性检测手段尤为迫切。所以为了更好的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性，开发出更有效地小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测手段，我们开展了该研究内容。
发明内容
本发明针对现有小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测技术中存在的灵敏度低、周期长、重复性差及材料要求高等问题，拟通过特异性荧光定量PCR引物筛选及其反应体系的优化等步骤，建立一种快速准确的实时荧光定量PCR分子检测方法及快速、简便、准确、高效的检测小菜蛾Bt抗性的检测试剂盒，为小菜蛾Bt抗性有效检测提供有效工具。
本发明的一个目的是提供了一种用于检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR引物对，所述引物对的序列：正向引物如SEQ ID NO.2所示，反向引物如 SEQ ID NO.3所示。
所述特异性引物对包括以小菜蛾中肠ABC转运蛋白超家族中ABCC亚家族ABCC3基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对以及已报道的小菜蛾持家基因核糖体蛋白L32基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的内参基因L32特异性引物序列。
本发明还提供一种用于检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含所述的引物对。进一步的，本试剂盒中还包括本实验室已发表的 (Fu et al., 2013) 以小菜蛾持家基因核糖体蛋白L32基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的内参基因L32特异性引物序列（正向引物：5′-CCAATTTACCGCCCTACC-3′；反向引物：5′-TACCCTGTTGTCAATACCTCT-3′），用于校正样品间实验误差。本试剂盒中含有的逆转录酶，DNase，RNase抑制剂，dNTP混合物，特异性引物，MgCl₂溶液，热启动Taq DNA聚合酶，荧光定量反应液，Buffer缓冲液，RNase-free水等实验组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据自身需要选用。此外，本试剂盒还包括符合该试剂盒要求的阳性对照及阴性对照样品。
本发明进而提供一种检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，其特征在于：其采用如所述的引物对或所述的试剂盒进行PCR。
具体包括以下步骤：
(1)提取待测小菜蛾的RNA样品，并反转录为cDNA模板；
(2)将所述cDNA模板加入到含有所述引物对的PCR反应液中得到PCR反应体系；
(3)进行实时荧光定量PCR检测；
其中优选地，所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：94℃预变性15 min，94℃变性15 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸32 sec，40个循环。
PCR过程完成后，按0.l℃·s^-1的升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15 s，然后60℃进行1 min，接着95℃进行30 s，最后再在60℃进行15 s。
优选地，所述待测小菜蛾的RNA样品为小菜蛾4龄幼虫中肠的RNA样品。
优选的，本发明使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。
本发明使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。
ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，样品、阴性及阳性对照的所有扩增曲线的阈值均设定为0.50153 (位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。
对上述步骤中荧光定量PCR反应产物进行荧光定量检测，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因ABCC3与内参基因L32之间的Ct值差值（即△Ct值）判断结果，若所述待测小菜蛾样品产生典型的“S”型扩增曲线及单峰融解曲线，且△Ct值≥7，则说明所述小菜蛾待测样品对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性；若△Ct值≤6，则说明待测小菜蛾样品未对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性。若△Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对Bt杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。
所述待测小菜蛾的RNA样品为小菜蛾4龄幼虫中肠的RNA样品。
本发明系选择小菜蛾中肠ABCC3基因的保守片段区为靶目标序列，根据该基因特点和实时荧光定量PCR引物的设计原则，设计了一对特异性引物，再配合已发表的内参基因L32特异性引物，建立了一种用于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测的实时荧光定量PCR试剂盒及其检测方法。较之现有生物测定技术而言，本发明所提供的小菜蛾Bt杀虫蛋白抗性检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其使用方法，具有如下效果及优点：
(1)特异性更强。本发明是利用小菜蛾中肠ABCC3基因的保守片段区为靶目标序列，设计了一对特异性引物，从而在PCR过程中可以对靶目标序列进行特异性扩增，通过将未知样品和阳性对照间的ABCC1基因表达量差异进行比对即可测定未知样品是否产生抗性；而传统的生测方法是通过观察判断试虫在不同Bt杀虫蛋白Cry1Ac浓度下死亡情况来粗略判断小菜蛾是否对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性，其判断较之基因检测特异性差得多。
(2)灵敏度和准确度更高。本发明中涉及的小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性检测方法是通过检测PCR实时荧光强度确定抗性相关基因表达量来判断小菜蛾是否产生抗性，而实时荧光强度的仪器检测，相对于传统的通过人为观察判断试虫在不同Bt杀虫蛋白Cry1Ac浓度下死亡情况来粗略判断小菜蛾是否对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性这种误判率及重复性较差的生测方法，抗性检测的灵敏度和准确度大大提高。
(3)检测周期短。生测过程至少需要48小时的时间，而本发明方法仅需3小时即可完成判断，一次可以同时检测多个样品，特别适合于大批量样品的快速检测。
(4)材料要求少。小菜蛾毒力生物测定中测定一个标准曲线至少需要约200头标准试虫，这些试虫的饲养及挑取需要花费一定的人力、物力和财力。而本发明对一个种群的检测只需要几十头左右的4龄试虫，甚至可以检测单头4龄试虫。
综上所述，本发明的方法可替代传统的生物测定方法，它可以准确、快速、特异、方便的检出供试小菜蛾是否具有Bt抗性，对田间小菜蛾Bt抗性的监测监控具有重要意义。
尤其需要指出的是，本发明人之前研究认为利用PCR技术检测小菜蛾中肠膜结合形式的碱性磷酸酶基因 (mALP)表达量变化可作为小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的好方法（已申请国家发明专利，专利号201210273591.0），然而，与mALP相比，ABCC3基因表达量变化与小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性性状的连锁程度更高，那么在不同抗性倍数小菜蛾中ABCC3基因表达量变化要比mALP表达量变化更为灵敏，因此，与该发明专利内容相比，本发明专利所利用的检测ABCC3基因表达量变化的方法更能反应不同抗性基因频率水平与抗性倍数之间的关系，从而能更好的检测形成不同程度抗性的田间小菜蛾种群。
本发明所提供的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的PCR检测方法，需人力及样品量少，检测数量大的特点，而且灵敏度高、特异性强、快速简便和准确可靠，因而能有效的检测小菜蛾对Bt杀虫蛋白的抗性，适合于小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的早期快速诊断，同时可用于田间小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的实时监控和预警预报，应用前景广泛。
附图说明
图1 为本发明中所用特异性引物对扩增小菜蛾中肠ABCC3基因cDNA片段序列。
图2 为图1中目的基因ABCC3和内参基因L32在Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感的4龄小菜蛾幼虫中肠cDNA样品PCR扩增片段的2%琼脂糖凝胶电泳图。其中，1：目的基因ABCC3的PCR扩增片段 (111bp)；2：内参基因L32的PCR扩增片段 (120bp)；M：MarkerⅠ。
图3 为标准品梯度稀释进行实时荧光定量PCR所得到的标准扩增曲线。其中，横坐标代表循环数 (Cycle)，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度 (Rn)，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，字母代表样品cDNA的5个2×梯度稀释浓度。
图4 是根据图3中得出的数据绘制的荧光定量PCR所得到的标准曲线。其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。
图5 为实施例1的检测小菜蛾Bt杀虫蛋白抗性的荧光定量PCR检测结果。其中，A：对Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA样品；B：对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA的样品。
图6 为实施例2的检测小菜蛾Bt抗性的荧光定量PCR检测结果。其中，A：实施例1中对Bt敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B：实施例1中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C：对Btk制剂产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D：对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的近等基因系小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E：对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。
 
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述与说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实验前材料样品准备：
(1) 小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)：该小菜蛾种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内用无虫甘蓝苗进行继代饲养，期间未接触任何有毒杀虫剂，对Bt制剂及其产生的毒素敏感；记载过小菜蛾Bt敏感种群(DBM1Ac-S)的非专利文献是：Yang, Z.X., Wu, Q.J., Wang, S.L., Chang, X.L., Wang, J.H., Guo, Z.J., Lei, Y.Y., Xu, B.Y., Zhang, Y.J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in Cry1Ac-susceptible and Cry1Ac-resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539–548.
(2) 小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性种群(DBM1Ac-R)：该种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内用Bt杀虫蛋白Cry1Ac (提取方法参考Luo, K., Banks, D., Adang, M.J. (1999) Toxicity, binding, and permeability analyses of four Bacillus thuringiensis Cry1 δ-endotoxins using brush border membrane vesicles of Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda. Applied and Environmental Microbiology, 65, 457–464.)进行抗性汰选，连续饲养至今；记载过小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性种群(DBM1Ac-R)的非专利文献是：Yang, Z.X., Wu, Q.J., Wang, S.L., Chang, X.L., Wang, J.H., Guo, Z.J., Lei, Y.Y., Xu, B.Y., Zhang, Y.J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in Cry1Ac-susceptible and Cry1Ac-resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539–548.
(3) 小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)：该种群在敏感种群DBM1Ac-S和抗性种群DBM1Ac-R经过多达7次的多组单对杂交、回交及汰选后建立的与DBM1Ac-S敏感种群遗传背景高度相似的近等基因系Cry1Ac抗性种群。该种群建成后在本实验室内用Bt杀虫蛋白Cry1Ac进行持续抗性汰选，连续饲养至今；记载过该小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)的非专利文献是：Zhu, X., Lei, Y., Yang, Y., Baxter, S.W., Li, J., Wu, Q., Wang, S., Xie, W., Guo, Z., Fu, W., Zhang, Y. (2014) Construction and characterisation of near-isogenic Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) strains resistant to Cry1Ac toxin. Pest Management Science, DOI: 10.1002/ps.3785. 
(4) 深圳汰选种群(SZ-R, 又叫T₂-R)：该种群是2003年在广东省深圳田间采集的小菜蛾种群，在本实验室内用Bt Cry1Ac杀虫蛋白浸叶汰选至今；
(5) 上海汰选种群(SH-R)：该种群是2005年在上海田间采集的小菜蛾种群，在本实验室内用Btk制剂(购自湖北省农科院Bt研究开发中心)浸叶进行抗性选育至今。
以上所用的5个种群：小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)、小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性种群(DBM1Ac-R)、小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)、深圳汰选种群(SZ-R)和上海汰选种群(SH-R)，本实验室均有保存，可向公众发放用于实验研究。
上述五个小菜蛾种群均在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10 cm，L=40 cm），笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60%-70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。
实施例1
利用实时荧光定量PCR技术对DBM1Ac-S及SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA样品的检测及本检测试剂盒和其使用方法的建立。
1. 以小菜蛾中肠ABCC3基因的保守片段区为靶目标序列（SEQ ID NO.1），根据实时荧光定量PCR引物设计原则，设计特异性荧光定量引物序列如下：
正向引物 (qCC3-F)：5′-TCAACCGCTTCACCAAGGACAT-3′（SEQ ID NO.2）；
反向引物 (qCC3-R)：5′-CGGCGTTCAGCACCAGGAT-3′（SEQ ID NO.3）；
该特异性引物扩增片段序列如图1所示，其扩增特异性如图2（其中，1：目的基因ABCC3的PCR扩增片段；2：内参基因L32的PCR扩增片段；M：MarkerⅠ。）所示，从图中可看出该引物扩增特异性高，扩增条带单一，大小为111bp，符合实时荧光定量PCR反应要求。此外，从图中也可看出本实验中使用的内参基因L32的引物扩增特异性也很高，扩增条带单一，大小为120bp，也符合实时荧光定量PCR反应要求。
2. 提取两种群4龄小菜蛾中肠RNA样品，然后反转录为cDNA模板，在包括步骤1所述特异性引物的实时荧光定量PCR反应体系中进行反应；
(1)小菜蛾中肠RNA的提取步骤如下：
①取敏感、抗性种群小菜蛾4龄幼虫，使用解剖镊冰上取出中肠组织，并使用0.7% NaCl溶液漂洗干净；
②将中肠组织放入玻璃匀浆器内，并向匀浆器中加入l ml的Trizol试剂充分匀浆，匀浆后将液体倒入1.5ml离心管内，室温放置5min；
③向离心管中加入0.2 ml的氯仿，剧烈振荡15 s，然后室温放置3 min；
④在4℃条件下12,000 rpm离心15 min；
⑤吸取上清液转入到一个新的离心管中，加入0.5 ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10 min；
⑥在4℃条件下12,000 rpm离心10 min；
⑦弃上清，然后加入l ml 75% 的乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7,500 rpm离心5 min，弃上清；
⑧RNA沉淀自然干燥后，加入约50μl DEPC水溶解，冰上保存，测OD₂₆₀/OD₂₈₀值，电泳检测条带，选择符合条件的RNA样品进行以下反转录实验或-80℃保存备用。
(2)反转录合成cDNA模板：
下面以日本TaKaRa公司去基因组的PrimeScript^? RT试剂盒为例，实验过程如下：
①使用前将试剂盒各组分解冻并离心混匀；
②基因组DNA的去除反应：

③反转录反应(冰上进行)：

(3) 实时荧光定量PCR标准曲线的建立：
    对样品cDNA进行5个梯度稀释（稀释倍数分别为A：1×、B：2×、C：4×、D：8×、E：16×），然后采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR：
①荧光定量PCR反应体系25μl组成如下：

*该产品为北京天根生物科技有限公司SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒。
②荧光定量PCR反应条件为：
94℃预变性15 min，94℃变性15 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸32 sec，40个循环。
PCR过程完成后，按0.l℃·s^-1的升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15 s，然后60℃进行1 min，接着95℃进行30 s，最后再在60℃进行15 s。
最终得到的标准扩增曲线如图3所示；其中，横坐标代表循环数，纵坐标代表第n次PCR循环时的荧光信号强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，A、B、C、D、E字母代表样品cDNA的5个稀释浓度。
最终得到的标准曲线如图4所示；其中，横坐标代表标准样品cDNA浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即Ct值。
(4) 实时荧光定量PCR反应过程：
实时荧光定量PCR反应过程的体系及条件如上面步骤(3)所述。
3. 检测：
本发明使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行检测。
4. 结果分析：
ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，样品（供试小菜蛾种群4龄幼虫中肠cDNA样品）、阴性对照（对Bt杀虫蛋白敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA为阴性对照样品）及阳性对照（对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA为阳性对照样品）的所有扩增曲线的阈值均设定为0.50153 (位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。
对上述步骤中荧光定量PCR反应产物进行荧光定量检测，如图5中所示，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因ABCC3与内参基因L32之间的Ct值差值（即△Ct值）判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且 DBM1Ac-S的样品的△Ct值为6.12±0.12(SEM)，SZ-R的样品的△Ct值为7.48±0.11(SEM)，通过统计学分析，两者之间的表达量差异达到了极显著水平，由此，通过Bt抗敏样品间该基因的表达量差异可知，可以很明显的区分出两者，那么区分标准可初步设定为：△Ct值≥7，则说明待测样品已对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值≤6，则说明待测样品为敏感种群，尚未对Bt杀虫蛋白产生抗性；若△Ct值位于两者中间，则建议重做，样品对Bt杀虫蛋白抗性产生与否视重做结果而定。
实施例2
通过其他三个Bt抗性小菜蛾种群DBM1Ac-R，NIL-R及SH-R验证实施例1中的试剂盒及检测方法的可用性，具体实验过程如实施例1所示。
最终的荧光定量PCR反应检测结果如图6中所示，其中，A：实施例1中对Bt杀虫蛋白敏感的小菜蛾种群DBM1Ac-S的4龄幼虫中肠cDNA阴性对照样品；B：实施例1中对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群SZ-R的4龄幼虫中肠cDNA阳性对照样品；C：对Btk产生抗性的小菜蛾种群SH-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；D：对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾种群DBM1Ac-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品；E：对Bt杀虫蛋白Cry1Ac产生抗性的小菜蛾近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠cDNA待测样品。
在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自△Ct值判断结果，可知两样品产生了典型的“S”型扩增曲线，且 SH-R样品的△Ct值为8.25±0.13(SEM)， DBM1Ac-R样品的△Ct值为8.46±0.28(SEM)，NIL-R样品的△Ct值为8.61±0.31(SEM)，通过分析，相对于DBM1Ac-S阴性对照，三者的表达量均以达到了极显著水平，与SZ-R阳性对照水平相当，由此可知，该区分标准设定合理，通过该实时荧光定量PCR检测试剂盒，可以很明显的区分出Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性及敏感小菜蛾。
<110>  中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120>  基于ABCC3基因的小菜蛾对Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性的检测方法及其试剂盒
<160>  3
 
<210>  1
<211>  111
<212>  DNA
<213>  小菜蛾
<400> 1
TCAACCGCTTCACCAAGGACATCGGCTCCCTGGACGAGATCCTGCCGCGGACGCTCCTGGACGTGTTCCAGATCTACAGCACCCTGCTGGCGATCCTGGTGCTGAACGCCG  111
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<400> 2
TCAACCGCTTCACCAAGGACAT   22
 
<210>  3
<211>  19
<212>  DNA
<400>  3
CGGCGTTCAGCACCAGGAT  19