用甲醇萃取法提取莫能霉素钠的方法 【技术领域】
用甲醇萃取法提取莫能霉素钠的方法，属于生物制药与工程领域。主要用于用发酵法生产的莫能霉素纯品(钠盐形式)的生产。
背景技术
莫能霉素属于聚醚类离子载体抗生素，亦称莫能菌素、肉桂霉素，是肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)产生的具有五环多醚结构的酸性抗生素，1967年发现有抗球虫作用，1971年在美国作为抗球虫剂批准生产上市，1984年又批准用作牛、羊的生长促进剂，在40多个国家和地区得到推广和应用，是70年代以来发展最快的一类畜禽专用抗生素，年使用量近三万吨，在防止球虫感染和提高反刍动物饲料转换率上取得了显著的经济效益，使用量逐年上升。聚醚类抗生素主要对革兰氏阳性菌有较高的抗菌活性，有的对某些真菌也有抗菌作用，但对革兰氏阴性菌作用很弱。对畜禽球虫具有广谱的活性。不仅对鸡的6种艾美耳球虫病有控制和预防效果，对犊牛、羔羊、仔猪、子兔等的球虫均有较高的活性，且耐药性发展缓慢。主要作用于球虫生活史早期(子胞子至第一代裂殖体)，聚醚类抗生素对反刍动物有明显的改进饲料效率的作用。目前，我国的畜牧养殖业正在向规模化、集约化发展，尤其是肉牛的养殖规模在不断扩大，必将进一步扩大莫能霉素的用量。
莫能霉素的主要生产厂家为美国礼来大药厂，其年产量约为2万吨，年销售额为1.72亿美元。中国近几年开始引进莫能霉素的生产技术和工艺，逐步形成了规模，但市场上均以莫能霉素预混剂的形式出现，没有莫能霉素钠产品生产和销售。莫能霉素在酸性含水环境中易失活，碱性条件下很稳定，其干燥结晶能长期保存稳定，在饲料中的稳定性也好。
国内企业目前没有莫能霉素钠纯品的批量生产，市场上几乎都是莫能霉素预混剂产品。研究一种产品萃取率高、成本低、产品质量好的莫能霉素钠纯品非常必要。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种产品萃取率高、成本低、产品质量好的用甲醇萃取法提取莫能霉素钠的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该用甲醇萃取法提取莫能霉素钠的方法，包括砂土菌种、斜面菌种、一级种子培养液、二级种子培养液、发酵液、滤饼、溶解释放、萃取、脱色，其特征在于：萃取采用菌丝体含湿量为20％，按重量比加入5-8倍的浓度在60-90％的甲醇，控制温度15-35℃，搅拌使充分溶解，再经活性炭脱色、过滤、结晶、分离、干燥、包装、制成成品。
上述用甲醇萃取法提取莫能霉素钠的方法的优选方案是：萃取采用含湿量为20％-25％的菌丝体，按重量比加入5-8倍的浓度为60-90％的甲醇，控制温度20-30℃，搅拌30分钟使充分溶解，再经活性炭脱色、过滤、结晶、分离、干燥、包装、制成成品。
本发明需要解决的关键技术问题是选择合适的溶剂/萃取剂和实际控制参数，该溶剂应确保：(1)将发酵后菌丝体中的莫能霉素尽可能地溶解释放出来，以提高收率；(2)所使用的溶剂/萃取剂应具有成本低、便于回收再利用等特点，以降低生产成本。
本发明在提取过程中首先用甲醇对发酵后菌丝体中的莫能霉素进行溶解萃取，然后通过脱色去杂、结晶分离、干燥等过程得到符合美国USP标准的莫能霉素钠纯品。
与现有技术相比，本发明的用甲醇萃取法提取莫能霉素钠的方法所具有的有益效果是：采用甲醇作为溶剂/萃取剂，甲醇价格适中，也便于进行蒸馏回收，母液中甲醇回收率可达到90％；而且甲醇属于三类溶剂，为低毒类，对环境污染小，对人员伤害低，能够更好的改善工作环境。溶解萃取过程在常温下操作，且易于控制，改善了操作环境。产品萃取率高：在90％以上；成本低、产品质量好：产品符合美国USP标准的莫能霉素钠纯品要求。经济效益高、可广泛应用于生物制药与工程工业领域。
【具体实施方式】
根据莫能霉素钠易溶于低级醇、低级醚、丙酮、苯等有机溶剂和不溶于水的特性，选择甲醇和乙醇进行对照试验，最终确定了用甲醇作为溶剂/萃取剂，操作的主要工艺步骤和控制参数为：发酵生产结束后，莫能霉素存在于菌丝体中，将发酵液用板框进行固液分离后得到湿的菌丝体，含湿量约为20％，按重量比加入5-8倍的甲醇，控制温度15-35℃(一般情况下不需加温，冬季可适当加温)，搅拌30分钟使充分溶解，达到彻底萃取释放的目的，然后固液分离得到莫能霉素的甲醇溶液，再经活性炭脱色、过滤、结晶、分离、干燥包装得到莫能霉素钠纯品。
具体工艺方法和参数要求的确定过程如下：
实施例1
1.斜面菌种培养：挑取少量砂土管孢子接种于灭菌后的斜面培养基上，32℃培养240小时，然后在1-6℃冰箱里保存。
2.一级种子和二级种子培养：将培养好的斜面菌种2支在无菌保护下接种于灭菌的500L一级种子培养基中，35℃培养26小时，然后通过蒸汽灭菌的无菌管道移入灭菌后的2000L二级种子培养基中，35℃培养24小时。
3.发酵培养：将二级种子培养液通过蒸汽灭菌的无菌管道移入灭菌后的25000L发酵培养基中，温度控制在35℃、PH控制在6.4-6.8，培养325小时。培养过程中根据代谢情况补加灭菌的葡萄糖、豆油等，以维持菌体地正常生长和代谢。发酵培养结束，发酵液中的莫能霉素含量在36500u/ml。
4.发酵液过滤分离：将发酵液用固体氢氧化钠调节PH至9.2，然后用板框进行固液分离、吹风，得到水分含量20-30％的菌丝体滤饼。
5.溶解：称取200公斤水分含量为25％的滤饼，在搅拌下慢慢加入已放入1200L浓度为80％甲醇的溶解罐中，甲醇温度控制在25℃，搅拌30分钟，让滤饼里的莫能霉素充分释放到甲醇中。停搅拌，静置15分钟。然后将甲醇溶液过滤到脱色罐中，得到甲醇溶液1170L。
6.脱色：在脱色罐中加入6公斤针用活性炭，吸附脱色30分钟，然后过滤，得到脱色液1160L，脱色液收集到不锈钢结晶罐中。
7.结晶、分离：开启结晶罐搅拌，慢慢加入纯化水2500L，莫能霉素会慢慢以晶体形态析出。纯化水加完后继续搅拌60分钟，用烧杯取样观察结晶情况，确认已结晶完全。然后将结晶液用离心机进行分离，离心30分钟，得到莫能霉素湿晶体66公斤。
8.干燥、包装：将莫能霉素湿晶体吸入双锥干燥机中，真空度控制在-0.07至-0.09MPa，温度85-95℃，干燥4.5小时，得到成品62.1公斤。成品经公司质量检验部取样检测，产品质量符合现行的USP标准。
经计算，从湿滤饼到成品的收率为92％。
实施例2
溶解：称取200公斤水分含量为20％的滤饼，在搅拌下慢慢加入已放入1000L浓度为70％甲醇的溶解罐中，甲醇温度控制在20℃，搅拌35分钟，让滤饼里的莫能霉素充分释放到甲醇中。停搅拌，静置15分钟。然后将甲醇溶液过滤到脱色罐中，得到甲醇溶液970L。
其余工艺过程同实施例1，得到成品65.5公斤。成品经公司质量检验部取样检测，产品质量符合现行的USP标准。经计算，从湿滤饼到成品的收率为91％。
实施例3
溶解：称取200公斤水分含量为30％的滤饼，在搅拌下慢慢加入已放入1400L浓度为90％甲醇的溶解罐中，甲醇温度控制在20℃，搅拌35分钟，让滤饼里的莫能霉素充分释放到甲醇中。停搅拌，静置15分钟。然后将甲醇溶液过滤到脱色罐中，得到甲醇溶液1360L。
其余工艺过程同实施例1，得到成品57.4公斤。成品经公司质量检验部取样检测，产品质量符合现行的USP标准。经计算，从湿滤饼到成品的收率为91％。