三聚氰胺半抗原与抗原及其制备方法与应用.pdf

三聚氰胺半抗原与抗原及其制备方法与应用
    【技术领域】

    本发明涉及三聚氰胺半抗原与抗原及其制备方法与应用。

    背景技术

    三聚氰胺(Melamine)，分子式C₃N₆H₆，简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。三聚氰胺呈弱碱性，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。三聚氰胺是重要的氮杂环有机化工原料，在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性环境中(pH5.5～6.5)与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。三聚氰胺的主要用途是一种用途广泛的基本有机化工中间产品，最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料。该树脂硬度比脲醛树脂高，不易燃，耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀，有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。

    三聚氰胺目前被认为毒性轻微，大鼠口服的半数致死量大于3g/kg体重。动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。

    蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30％，而三聚氰胺分子中含氮量为66％左右。常用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量乘以6.25来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量虚高，从而使劣质食品和饲料在检验机构只做粗蛋白质简易测试时蒙混过关。食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，加之三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，食品与饲料中掺杂了三聚氰胺后也不易被发现，为此三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此三聚氰胺也被人们称为“蛋白精”。因此，需要灵敏、准确、快速的检测方法。

    【发明内容】

    本发明的一个目的是提供一种可用作三聚氰胺半抗原和三聚氰胺抗原的化合物及其制备方法。

    本发明所提供的可用作三聚氰胺半抗原的化合物，具有式I所示分子结构。

     (式I)。

    本发明所提供的可用作三聚氰胺抗原的化合物，是式I所示化合物与载体蛋白的偶联物。其分子结构示意图如图4所示。

    所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白，最优选为牛血清白蛋白。

    本发明所提供的制备式I所示化合物的方法，包括如下步骤：将三聚氰胺与马来酸酐混合，在温度为60℃-70℃的条件下反应12-18小时，得到式I所示化合物；温度优选为66℃，时间优选为12小时；

    所述三聚氰胺与马来酸酐的投料物质的量比为1∶(1-2)，优选为1∶1。

    本发明所提供的制备三聚氰胺抗原化合物的方法，包括如下步骤：

    1)将式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合，在温度为20℃-30℃的条件下，反应12-18小时，得到溶液I；其中，温度优选为25℃，时间优选为12小时；

    2)将载体蛋白加入所述溶液I中，在温度为20℃-30℃的条件下，反应4-6小时，得到所述偶联物(即三聚氰胺抗原)；其中，温度优选为25℃，时间优选为4小时；

    所述步骤1)中，式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的投料物质的量比为1∶(1-1.5)∶1，优选为1∶1.2∶1；

    所述载体蛋白与式I所示化合物的投料物质的量比为(8-10)∶1，优选为8∶1；

    其中，载体蛋白可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兰素蛋白或卵清白蛋白，最优选为牛血清白蛋白。

    上述三聚氰胺半抗原化合物或三聚氰胺抗原化合物在制备三聚氰胺抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

    由上述任一所述化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体具体为单克隆抗体。

    上述任一所述化合物和/或抗体在检测三聚氰胺中的应用也属于本发明的保护范围。

    鉴于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，本发明依靠免疫学，免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。

    实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1∶2×10⁵，最低检测限为12ng/mL，半抑制浓度为75ng/mL，产生的抗体的特异性高、灵敏度高、准确度高。本发明的抗原和/或抗体，可用于建立竞争酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测食品中的三聚氰胺残留，较现有的色谱法比，具有成本低廉、操作简单、样品前处理简便、方便快捷的特点，还减少由于采用HPLC、GC检测而使用的甲醇、乙腈等有机溶剂对环境的污染，适合于大规模检测。本发明的制备方法的产率高。因此，本发明的抗原及抗体及方法具有广阔的应用前景。

    【附图说明】

    图1为三聚氰胺抗原的合成图。

    图2为三聚氰胺半抗原质谱图。

    图3为三聚氰胺抗原的紫外光谱图。

    图4为三聚氰胺抗原的分子结构示意图。

    【具体实施方式】

    下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

    下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

    马来酸酐的分子C₄H₂O₃。

    实施例1、三聚氰胺半抗原与三聚氰胺抗原的制备与鉴定

    三聚氰胺半抗原及抗原的合成如图1所示。

    一、三聚氰胺半抗原的合成与鉴定

    1、三聚氰胺半抗原的合成

    称取三聚氰胺与马来酸酐置于50mL三角烧瓶中(三聚氰胺与马来酸酐的投料物质的量的比为1∶1)，并加入5mL二甲亚砜(DMSO)，置于66℃水浴锅中，反应12小时，得到溶液I，其中含有目的产物。计算目的产物的产率。产率的计算公式为：产率＝实际得到的产物的质量/理论上得到产物的质量×100％。实验设3次重复，目的产物的产率为46.7％。

    2、三聚氰胺半抗原的鉴定

    取上述目的产物经ESI质谱测定其结构，发现其分子离子峰为223(M-1)(见图2)。半抗原化合物的元素分析结果(％)：C，37.50；H，3.60；N，37.49；O，21.41。由上可知，化合物的分子量为224，分子中含有三个O，四个C。初步说明三聚氰胺半抗原合成成功，目的产物的分子结构式如式I所示：

     (式I)。

    (二)三聚氰胺抗原的合成与鉴定

    1、三聚氰胺抗原的合成

    称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入到实验一得到的溶液I中(式I所示化合物、EDC.HCl、NHS的投料物质的量比为1∶1.2∶1。)，搅拌混匀，置25℃反应12小时，得到溶液II；

    称取牛血清白蛋白50mg溶解于3mL碳酸溶液中，在磁力搅拌下，逐滴加入到溶液II中(牛血清白蛋白与式I所示化合物的摩尔数比为为8∶1)，25℃继续搅拌4h；待反应完毕，将反应液装入透析袋，在4℃用生理盐水溶液透析72h，换水6次，即得到目的产物三聚氰胺抗原；分装于安培瓶中，-20℃保存。计算产率，产率＝实际得到的产物的质量/理论上得到产物的质量×100％。实验设3次重复，结果取平均数。目的产物三聚氰胺抗原的产率为41.4％。

    2、三聚氰胺抗原的鉴定

    按合成三聚氰胺抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。结果如图3所示。实验设3次重复。

    由图3紫外光谱图可知，产物的紫外光谱图与牛血清蛋白(BSA)相比发生了明显变化，说明半抗原已经与BSA成功偶联制得三聚氰胺抗原。经计算，三聚氰胺半抗原与BSA的结合摩尔比为22∶1。三聚氰胺抗原的分子结构示意图如图4所示。

    实施例2、三聚氰胺半抗原及抗原的制备

    一、三聚氰胺半抗原的合成与鉴定

    1、三聚氰胺半抗原的合成

    称取三聚氰胺与马来酸酐置于50mL三角烧瓶中(三聚氰胺与马来酸酐的投料物质的量比为1∶1.5)，并加入5mL二甲亚砜(DMSO)，置于60℃水浴锅中，反应14小时，得到溶液I，其中含有目的化合物。实验设3次重复。目的产物(即式I所示化合物)的产率为46％。

    2、三聚氰胺半抗原的鉴定：鉴定方法同实施例1中所述一致。鉴定得到的产物的结构式如式I所示。

    二、三聚氰胺抗原的合成与鉴定

    1、三聚氰胺抗原的合成

    称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入到上述得到的溶液I中(步骤一得到的化合物、EDC.HCl与NHS的投料物质的量比为1∶1∶1)，搅拌混匀，置20℃反应14小时，得到溶液II；称取牛血清白蛋白50mg溶解于3mL碳酸溶液中，在磁力搅拌下，逐滴加入到溶液II中(牛血清白蛋白与步骤一得到的化合物的投料物质的量比为9∶1)，20℃继续搅拌5h；待反应完毕，将反应液装入透析袋，在4℃用生理盐水溶液透析72h，换水6次，即得到目的产物(三聚氰胺抗原)；分装于安培瓶中，-20℃保存。实验设3次重复，目的产物三聚氰胺抗原的产率为41％。

    2、三聚氰胺抗原的鉴定

    按合成三聚氰胺抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。实验设3次重复。结果产物的紫外光谱图与牛血清蛋白(BSA)相比发生了明显变化，说明半抗原已经与BSA成功偶联制得三聚氰胺抗原。经计算，三聚氰胺半抗原与BSA的结合摩尔比为22∶1。

    实施例3、三聚氰胺半抗原及抗原的制备

    一、三聚氰胺半抗原的合成与鉴定

    1、三聚氰胺半抗原的合成

    称取三聚氰胺与马来酸酐置于50mL三角烧瓶中(三聚氰胺与马来酸酐的投料物质的量比为1∶2)，并加入5mL二甲亚砜(DMSO)，置于70℃水浴锅中，反应18小时，得到溶液I，其中含有目的化合物。实验设3次重复。目的产物的产率为46.2％。

    2、三聚氰胺半抗原的鉴定：鉴定方法同实施例1中所述一致。鉴定得到的产物的结构式如式I所示。

    二、三聚氰胺抗原的合成与鉴定

    1、三聚氰胺抗原的合成

    称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)加入到上述得到的溶液I中(步骤一得到的化合物、EDC.HCl与NHS的投料物质的量比为1∶1.5∶1)，搅拌混匀，置30℃反应18小时，得到溶液II；称取牛血清白蛋白50mg溶解于3mL碳酸溶液中，在磁力搅拌下，逐滴加入到溶液II中(牛血清白蛋白与步骤一得到的化合物的投料物质的量比为10∶1)，30℃继续搅拌6h；待反应完毕，将反应液装入透析袋，在4℃用生理盐水溶液透析72h，换水6次，即得到目的产物(三聚氰胺抗原)；分装于安培瓶中，-20℃保存。实验设3次重复，目的产物三聚氰胺抗原的产率为40.8％。

    2、三聚氰胺抗原的鉴定

    按合成三聚氰胺抗原反应所用的半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm-400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算其结合比。实验设3次重复。结果产物的紫外光谱图与牛血清蛋白(BSA)相比发生了明显变化，说明半抗原已经与BSA成功偶联制得三聚氰胺抗原。经计算，三聚氰胺半抗原与BSA的结合摩尔比为22∶1。

    实施例4、通过三聚氰胺抗体检测本发明抗原的效果

    一、三聚氰胺抗血清的制备

    实验选用5只7周龄，体重2公斤左右，健康的新西兰大白兔，分别编号1-5。实验免疫剂量基础免疫为0.5～1.0mg/kg，加强免疫剂量为1.5mg/kg，用稀释液稀释适量三聚氰胺抗原，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，在兔背部皮内多点注射进行首免。2周后，取同样量抗原加弗氏不完全佐剂乳化后进行背部皮下多点注射，每2周加强免疫一次。从第三次加强免疫开始，每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，测定效价。

    每次采血后应将血液先置室温一段时间待其凝固，再放4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，离心，分离出血清。

    二、三聚氰胺抗体效价的测定

    免疫复合物按常规方法免疫了5只兔子。从第三次加强免疫开始，每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血。血清经适当稀释后用间接竞争性ELISA测定效价。

    五免后，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价为1∶2×10⁵。

    三、抗血清最低检测限(LOD值)和半数抑制量(IC₅₀)的检测

    三聚氰胺标准品购自Sigma Aldrich公司；CAS号：108-78-1。

    用方阵滴定法确定抗原(载体蛋白为卵清蛋白，制备方法同实施例1所示)和三聚氰胺抗体的工作浓度，抗原的工作浓度为1μg/mL，三聚氰胺抗体的工作浓度为1/20000(ug/ml)。

    用不同浓度的三聚氰胺标准品溶液做实验溶液，其浓度如下：0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1μg/mL。采用8组平行试验(n＝8)。

    间接竞争性ELISA方法：用上述工作浓度的抗原包被酶标板，将实验溶液与抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置空白孔(将添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(将添加的实验溶液用PBS溶液代替，其它一致)，37℃温育0.5h，倒出孔内液体，用洗涤液(10×PBST)洗涤3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打；加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中，37℃温育0.5h，用洗涤液重复洗3-5次，吸干；加入底物显色溶液到酶标板小孔中，室温下反应10-15min，用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值A。以吸光度值A为纵坐标，以三聚氰胺实验溶液浓度的log₁₀值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。结果表明标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数8次，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在15％以内。

    根据标准曲线得出得出10％抑制量和半数抑制量(IC₅₀)，比较检测灵敏度。

    抑制率以下式计算：

    

    式中：OD_max为不加标准品时的吸光值(即阴性对照)，OD_x为标准品x时的吸光值，OD_min为空白对照孔的吸光值。

    由上述公式计算得三聚氰胺抗体在缓冲液中的LOD值为12ng/mL，半数抑制量(IC₅₀)为75ng/mL。

    四、三聚氰胺抗体特异性测定

    抗体特异性是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越好。

    本实验选择的三聚氰胺同系物为三聚氰酸、4，6-二氨基-2-羟基-1，3，5-三嗪、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、四环素、庆大霉素、氨苄青霉素。

    用样品稀释液将各同系物分别稀释成如下浓度：0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL。

    按照实验三中所述方法，各自建立标准曲线，测定抑制中浓度IC₅₀。

    交叉反应率(％)＝(引起50％抑制三聚氰胺的浓度/引起50％抑制类似物浓度)×100％。

    实验设3次重复，结果取平均数。结果，各类似物的交叉反应率(％)：三聚氰胺100.0，三聚氰酸＜10.0，其4，6-二氨基-2-羟基-1，3，5-三嗪＜0.5，三聚氰酸一酰胺＜0.01，三聚氰酸二酰胺＜0.01，四环素＜0.01，庆大霉素＜0.01，氨苄青霉素＜0.01。本发明抗体与三聚氰胺类似物的交叉反应率很小，说明抗体的特异性好。