农杆菌介导外源基因转化灵芝的方法 本发明涉及一种采用农杆菌介导外源基因转化灵芝的方法。
灵芝是一种珍贵的药用和食用真菌，由于其对多种疾病尤其是当今医学上的一些顽症如肝炎、心血管疾病、癌症等具有显著的疗效，因而已引起国际医学界的重视，并已广泛开展了对其生化药理及临床应用等方面的研究。但目前关于灵芝的分子生物学方面的研究报道还很少，迄今尚未有外源基因成功地在灵芝中表达的报道。灵芝是一种大型药用和食用真菌，以它作为基因工程的受体菌，有着与细菌、酵母菌不同的独特优点。它是一种应用前景很广的异源基因表达系统，因此，通过基因工程技术建立稳定的灵芝转化系统，对充分利用和开发灵芝这一珍贵的资源有着重要的意义。
本发明的目的在于提供一种利用外源基因转化灵芝的方法，以便建立稳定有效的灵芝外源基因转化体系，从而能够直接有效地获得具有优良遗传性状或重要经济价值的表达产物地转基因灵芝新菌种。
本发明的目的是通过以下技术措施来实现的：灵芝菌丝经溶壁酶液酶解后，再纯化灵芝原生质体，然后以含有外源基因的Ti质粒为载体，利用农杆菌侵染灵芝的特性，对该纯化的灵芝原生质体进行转化处理，将处理后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。
本发明方法包括以下具体步骤：
(1)构建的Ti质粒pCAW，含有能在原核生物中表达的卡那霉素抗性基因，而且在T-DNA区含有能在真菌中表达的潮霉素筛选标记基因(潮霉素磷酸转移酶基因，即hph基因)；农杆菌采用LBA4404，其中的辅助质粒带利副平抗性；
(2)按以下步骤将pCAW质粒导入LBA4404：
(a)按1％的量接种LBA4404于50ml含浓度为30～50mg/L利副平的YEB液体培养中，25～28℃过夜培养；
(b)取步骤(a)中的培养液1ml接种于50ml的新鲜YEB培养基中，25～28℃培养至OD660达到0.13～0.17，转入50ml离心管中，冰上放置30分钟，4000rpm离心10分钟，用PH7.5的TE洗一次，重悬于10mlYEB；
(c)取步骤(b)中100ul，加入适量质粒，混匀，依次置冰上、液氮、37℃水浴各5分钟，涂布于含浓度为30～50mg/L卡那霉素的固体YEB培养基平板，25～28℃培养，筛选转化子；
(3)含pCAW质粒的LBA4404按1％的接种量接种于含浓度为30～50mg/L利副平和浓度为40～50mg/L卡那霉素的基本培养基中，25～28℃培养过夜，用液体诱导培养基稀释至OD660达到0.15，28℃下200转/分钟培养3小时；
(4)取PDA斜面上生长旺盛的灵芝菌丝，接种于液体PDA培养基中，25～28℃培养2～4天，然后以3000～5000转/分钟离心5～10min，去上清液，用0.5～0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液洗涤1～3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝；
(5)取新鲜灵芝湿菌丝，按每克湿菌丝2～10ml酶液的比例加入溶壁酶液，30～35℃酶解1.5～3.0小时；
(6)将上述酶解液用G3砂芯漏斗过滤，滤液经离心去上清液，再用0.5～0.8mol/L的渗透压稳定剂洗涤1～3次，得到纯化的灵芝原生质体；
(7)取经液体诱导培养基诱导培养的含pCAW质粒的LBA4404和纯化的灵芝原生质体(107个/mL)各100ul，混匀涂布于固体诱导培养基上；28～35℃培养2～3天，转移至含选择因子浓度为50～100mg/L潮霉素和浓度为500～1000mg/L先锋霉素的再生培养基中继续培养6～8天，得灵芝转化株。
本发明步骤(1)所述的pCAW质粒所带的大肠杆菌hph基因上游和下游分别与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子和色氨酸合成酶C基因(trpC)转录终止序列连接而能在真菌中表达。
本发明步骤(2)所述的YEB液体培养基为：950mL去离子水中加5g Tryptone，5g Yeast extract，5g蔗糖，2mM MgSO4，定容至1L，调PH值为7.2；YEB固体培养基为：在上述YEB液体培养基中加入15g琼脂。
本发明步骤(3)所述基本培养基为：950mL去离子水中加0.3～0.6g MgSO4，3～4g K2HPO4，1～2g KH2PO4，0.5～1g(NH4)2SO4，1～2g葡萄糖，0.3～0.5g柠檬酸钠，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本发明步骤(3)所述液体诱导培养基为：950mL去离子水中加0.3～0.6g MgSO4，3～4g K2HPO4，1～2g KH2PO4，0.5～1g(NH4)2SO4，2～3g葡萄糖，0.3～0.5g柠檬酸钠，1.0～2.0μmolρ-羟基苯甲酸，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本发明步骤(5)所述的溶壁酶液的成份及其配比为：溶壁酶1-2.5％(w/v)，崩溃酶0.5-1.0％(w/v)，溶于100mL浓度为0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液中；其中渗透压稳定剂通常为硫酸镁或甘露醇。
本发明步骤(7)所述的固体诱导培养基：950mL去离子水中加0.3～0.6g MgSO4，3～4g K2HPO4，1～2g KH2PO4，0.5～1g(NH4)2SO4，2～3g葡萄糖，0.3～0.5g柠檬酸钠，1.0～2.0μmolρ-羟基苯甲酸，定容至1L，调PH值为7.2，15g琼脂，定容至1L。
本发明步骤(7)所述的选择因子为浓度为50～100mg/L的潮霉素和浓度为500～1000mg/L的先锋霉素。
本发明步骤(7)所述再生培养基为纤维二糖再生培养基或MYG再生培养基；其中纤维二糖液体再生培养基为：纤维二糖15克，蛋白胨2克，酵母粉4克，溶于0.5～0.8mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；在该液体再生培养基中加入15g的琼脂，即成纤维二糖固体再生培养基；其中MYG液体再生培养基为：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，pH自然，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L；在该液体再生培养基中加入15g的琼脂，即成MYG固体再生培养基。
本发明方法适用于现有的各种灵芝菌种，例如泰山赤灵芝，日本灵芝，韩国灵芝等。经本发明方法用农杆菌转化系统处理的灵芝原生质体在含有HmB(潮霉素)的MYG平板上生长出众多菌株，而且这些菌株在无选择压力的情况下经过4代传代后，仍能保持良好的HmB抗性(如图2所示)；而未经本发明方法处理的灵芝原生质体则全部不能在含HmB的MYG平板上生长(如图3所示)；说明本发明方法已有效地将hph基因整合到灵芝基因组中，并且使hph基因在灵芝中得到稳定表达，因此灵芝转化株表现出外源基因所具有的HmB抗性，并且转化株在无选择压力的情况下经多代传代后仍具有较强的HmB抗性，说明转化株中外源基因的表达具有较强的稳定性。
上述结果说明本发明方法能有效地介导外源基因整合入灵芝基因组中，并使之得到稳定的复制和表达，从而建立了灵芝的转化系统。
本发明方法所建立的灵芝转化系统，为灵芝开辟了广阔的应用领域，将使灵芝这一宝贵资源得到更充分的利用。具体说来，主要包括：
1.灵芝有着很高的蛋白质分泌能力，能正确进行表达产物的翻译后加工，包括肽链剪切和糖基化等，且糖基化的方式与高等真核生物的类似，而且灵芝还是已经确认的安全菌株，对人体有益无害，并有成熟的发酵和后处理工艺，因而可以利用灵芝转化技术将一些具有重要经济价值的、来自高等生物的外源基因导入灵芝中表达。这样，利用灵芝发酵方法即可快速、大规模、廉价地生产具有活性的外源蛋白质。
2.通过灵芝转化技术将一些与优良性状有关的基因导入灵芝中，可在短时间内快速定向改良灵芝菌株，培育出优质高产的灵芝新品种。
3.在基础研究方面，灵芝的转化作为真菌的基因克隆和表达系统，可用于基因分离、基因组结构、基因表达及其调控等方面的研究，并且可为建立其它大型真菌的转化系统提供理论和实验依据。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
图1为pCAW的质粒图谱；
图2为灵芝转化子在HmB(潮霉素)抗性平板的生长情况；
图3为野生型灵芝在HmB(潮霉素)抗性平板的生长情况。
如图1所示，RB为T-DNA区的右边界；LB为T-DNA区的左边界；EcoRI、SaeI、KpnI、SmaI、HindIII为限制性内切酶位点；Pgpd为3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子；Ttrp为色氨酸合成酶C基因的终止子；Kanamycin为卡那霉素；hph为潮霉素磷酸转移酶基因。
实施例1：
取PDA斜面上生长旺盛的灵芝菌丝，接种于液体PDA培养基中，28℃培养2天，然后以5000转/分钟离心10min，去上清液，用0.5mol/L的甘露醇溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
称取1克灵芝湿菌丝，加3ml溶壁酶液，35℃酶解2小时。将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，3000转/分钟离心10分钟，去上清液，用0.5mol/L甘露醇洗涤2次，得纯化的灵芝原生质体。
构建Ti质粒pCAW，pCAW质粒所带的大肠杆菌hph基因上游和下游分别与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子和色氨酸合成酶C基因(trpC)转录终止序列连接而能在真菌中表达。农杆菌采用LBA4404，是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它含有Ti质粒，该质粒带利副平抗性；能诱导被侵染的植物或真菌细胞；Ti质粒上有一段转移DNA，在农杆菌侵染宿主时，这段DNA可以插入到宿主基因组中，使其携带的基因在宿主中得以表达。按以下步骤将pCAW质粒导入LBA4404：
(a)按1％的量接种LBA4404于50ml的含浓度为50mg/L利副平的YEB液体培养中，25℃过夜培养；
(b)取步骤(a)中的培养液1ml接种于50ml的新鲜YEB培养基中，25℃培养至OD660达到0.14，转入50ml离心管中，冰上放置30分钟，4000rpm离心10分钟，用PH7.5的TE洗一次，重悬于10mlYEB；
(c)取步骤(b)中100ul，加入适量质粒，混匀，依次置冰上、液氮、37℃水浴各5分钟，涂布于含浓度为50mg/L卡那霉素的固体YEB培养基平板，25℃培养，筛选转化子；
将上述已导入pCAW质粒的农杆菌LBA4404按1％的接种量接种于含浓度为50mg/L的利副平和50mg/L的卡那霉素的基本培养基中，28℃培养过夜，用液体诱导培养基稀释至OD660达到0.15，28℃下200转/分钟培养3小时。
取精制纯化后的200μl灵芝原生质体(1×108个/mL)与200μl上述制备的LBA4404混匀。涂布于固体诱导培养基上，35℃下培养2天。转移至含有浓度为50mg/L的HmB和500mg/L的先锋霉素的纤维二糖固体再生培养基平板，在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株，转化频率约为100个转化子/107个原生质体。
本实施例1中的YEB液体培养基为：950mL去离子水中加5gTryptone，5g Yeast extract，5g蔗糖，2mM MgSO4，定容至1L，调PH值为7.2；YEB固体培养基为：在上述YEB液体培养基中加入15g琼脂。
本实施例1中的基本培养基为：950mL去离子水中加0.5g MgSO4，3.5g K2HPO4，1g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，2g葡萄糖，0.5g柠檬酸钠，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本实施例1中的液体诱导培养基为：950mL去离子水中加0.5gMgSO4，3.5g K2HPO4，1g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，2g葡萄糖，0.5g柠檬酸钠，1.0μmoLρ-羟基苯甲酸，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本实施例1中的溶壁酶液的成份及其配比为：溶壁酶1g，崩溃酶0.5g，溶于100mL浓度为0.6mol/L的硫酸镁(渗透压稳定剂)溶液中。
本实施例1中的固体诱导培养基：950mL去离子水中加0.5gMgSO4，3.5g K2HPO4，1g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，1.5g葡萄糖，0.5g柠檬酸钠，1.0μmolρ-羟基苯甲酸，调PH值为7.2，15g琼脂，定容至1L。
本实施例1中的纤维二糖固体再生培养基为：纤维二糖15克，蛋白胨2克，酵母粉4克，溶于0.8mol/L甘露醇(渗透压稳定剂)中，在该液体再生培养基中再加入15g的琼脂，，至总体积为1L，即成纤维二糖固体再生培养基。
本实施例1中的PDA培养基为：马铃薯200g，煮30分钟后，四层纱布过滤，加葡萄糖20g，加水至1L，pH自然。
实施例2：
取PDA斜面上生长旺盛的灵芝菌丝，接种于液体PDA培养基中，27℃培养3天，然后以4000转/分钟离心10min，去上清液，用0.5mol/L的硫酸镁溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
称取2克灵芝湿菌丝，加8ml溶壁酶液，30℃酶解2.5小时。将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，4000转/分钟离心10分钟，去上清液，用0.5mol/L硫酸镁洗涤两次，得纯化的原生质体。
按实施例1中的相同的步骤将pCAW质粒导入LBA4404；把已导入pCAW质粒的农杆菌LBA4404按1％的接种量接种子含45mg/Lrif、45mg/L卡那霉素的基本培养基中，培养过夜，用液体诱导培养基稀释至OD660达到0.14，27℃下200转/分钟培养3小时。
取精制(纯化)后的100μl灵芝原生质体(1×108个/mL)与200μl上述制备的LBA4404混匀。涂布于固体诱导培养基上，30℃下培养2天。转移至含有浓度为100mg/L HmB和1000mg/L先锋霉素的MYG固体再生培养基平板，在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株。转化频率约为150个转化子/107个原生质体。
本实施例2中的YEB液体培养基和YEB固体培养基与实施例1中的相同。本实施例2中的基本培养基为：950mL去离子水中加0.4gMgSO4，3g K2HPO4，2g KH2PO4，0.5g(NH4)2SO4，2g葡萄糖，0.3g柠檬酸钠，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本实施例2中的液体诱导培养基为：950mL去离子水中加0.4gMgSO4，3g K2HPO4，2g KH2PO4，0.5g(NH4)2SO4，2g葡萄糖，0.3g柠檬酸钠，2.0μmolρ-羟基苯甲酸，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本实施例2中的溶壁酶液的成份及其配比为：2.5g溶壁酶，1g崩溃酶，溶于100mL浓度为0.8mol/L的硫酸镁(渗透压稳定剂)中。
本实施例2中的固体诱导培养基：950mL去离子水中加0.4gMgSO4，3g K2HPO4，2g KH2PO4，0.5g(NH4)2SO4，3g葡萄糖，0.3g柠檬酸钠，2.0μmolρ-羟基苯甲酸，定容至1L，调PH值为7.2，15g琼脂，定容至1L。
本实施例2中的MYG固体再生培养基为：麦芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，pH自然，溶于0.6mol/L硫酸镁(渗透压稳定剂)中，在该液体再生培养基中再加入15g的琼脂，至总体积为1L，即成MYG固体再生培养基。
本实施例2中的PDA培养基与实施例1相同。
实施例3：
取PDA斜面上生长旺盛的灵芝菌丝，接种于液体PDA培养基中，25℃培养2天，然后以3000转/分钟离心10min，去上清液，用0.8mol/L的甘露醇溶液洗涤3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。
称取4克灵芝湿菌丝，加10ml溶壁酶液，32℃酶解2.5小时。将酶解液用灭过菌的G3砂芯漏斗过滤，3500转/分钟离心10分钟，去上清液，用0.8mol/L甘露醇洗涤两次，得纯化的原生质体。
按实施例1中的相同的步骤将pCAW质粒导入LBA4404；把已导入pCAW质粒的农杆菌LBA4404按1％的接种量接种于含30mg/Lrif、50mg/L卡那霉素的基本培养基中，培养过夜，用液体诱导培养基稀释至OD660达到0.15，28℃下200转/分钟培养3小时。
取精制(纯化)后的200μl灵芝原生质体(1×108个/mL)与150μl上述制备的LBA4404混匀。涂布于固体诱导培养基上，28℃下培养2天。转移至含有浓度为70mg/LHmB和800mg/L先锋霉素的纤维二糖再生培养基平板，在同样温度下倒置培养5天后得到HmB抗性转化株。转化频率约为170个转化子/107个原生质体。
本实施例3中的的YEB液体培养基为：950mL去离子水中加5gTryptone，5g Yeast extract，5g蔗糖，2mM MgSO4，定容至1L，调PH值为7.2；YEB固体培养基为：在上述YEB液体培养基中加入15g琼脂。
本实施例3中的基本培养基为：950mL去离子水中加0.3g MgSO4，4g K2HPO4，2g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，1.5g葡萄糖，0.3g柠檬酸钠，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本实施例3中的液体诱导培养基为：950mL去离子水中加0.3gMgSO4，4g K2HPO4，2g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，1.5g葡萄糖，0.3g柠檬酸钠，1.5μmolρ-羟基苯甲酸，定容至1L，调PH值为7.2，定容至1L。
本实施例3中的溶壁酶液的成份及其配比为：溶壁酶2g，崩溃酶0.8g，溶于100mL浓度为0.5mol/L甘露醇(渗透压稳定剂)中。
本实施例3中的固体诱导培养基：950mL去离子水中加0.3gMgSO4，4g K2HPO4，2g KH2PO4，1g(NH4)2SO4，3g葡萄糖，0.3g柠檬酸钠，1.5μmolρ-羟基苯甲酸，定容至1L，调PH值为7.2，15g琼脂，定容至1L。
本实施例3中的纤维二糖固体再生培养基为：纤维二糖15g，蛋白胨2g，酵母粉4g，溶于0.5mol/L甘露醇(渗透压稳定剂)中，在该液体再生培养基中再加入15g的琼脂，至总体积为1L，即成纤维二糖固体再生培养基。
本实施例3中的PDA培养基与实施例1相同。