一种低成本、高效分离获取单细胞的系统和方法.pdf

本发明基于液滴微流控芯片技术，设计构建了一种低成本、高效分离获取单细胞的系统和方法。本发明的系统包括微流控芯片、液滴信号检测器、信号分析与分选控制单元、电磁阀、导管、液滴收集微管。单细胞分离过程如下：包裹细胞的液滴在线连续生成与定向流动，流经信号采集区时，对液滴进行信号采集、分析和分选控制，当满足分选条件（如：液滴中包裹有且只有单个细胞）时，控制电磁阀工作使液滴受力状态和流向改变，从而分离和收集单个液滴，进而通过破乳化、提取等操作实现获取单个细胞的目的。本发明提出的技术方法提供了一套简单可行、适用于不同检测方法的液滴分选、细胞分离与获取单细胞的系统和方法，相比于传统获取单细胞的方法具有效率高、耗时短、成本低、无污染、适用范围广、可扩展性强等优点。

1.  一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，包括：微流控芯片（7）、液滴信号检测器（8）、信号分析与分选控制单元（9）、电磁阀（10）、导管（11）、液滴收集微管（13）；
所述微流控芯片（7）内部包括微通道网络，用于使流体在外力驱动下在其微流道内定向流动，液滴的生成和分选，以及废液、被分选液滴的导出；
所述液滴信号检测器（8）用于采集流经所述微流控芯片（7）的检测区（12）的液滴的光学信号，并将其传送至信号分析与分选控制单元（9）；
所述信号分析与分选控制单元（9）用于分析来自所述液滴信号检测器（8）的信号，并控制电磁阀（10）的工作；
所述电磁阀（10）用于接收所述信号分析与分选控制单元（9）发送的分选控制指令，并通过改变液滴在微流控芯片（7）的运动方向执行相应的液滴分选操作；
所述导管（11）连接所述微流控芯片（7）与电磁阀（10），用于导出分选的液滴；
所述液滴收集微管（13）连接所述导管（11）的一端，用于收集所述微流控芯片（7）分选出的滴液。

2.  根据权利要求1所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，所述微流控芯片（7）是由上层和下层基片键和而成的，材质均可为塑料、玻璃或石英。

3.  根据权利要求1或2所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，所述微流控芯片（7）的上层包括微通道网络，所述微通道网络的出入口包括连续油相入口（1）、细胞悬浮液入口（2）、侧流油相入口（3）、电磁阀连接口（4）、废液出口（5）和被分选液滴出口（6）；
所述连续油相入口（1）所连通的一支微通道和细胞悬浮液入口（2）所连通的一支微通道连通后，再与所述侧流油相入口（3）、电磁阀连接口（4）、废液出口（5）和被分选液滴出口（6）连通。

4.  根据权利要求3所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，所述微通道为25-100微米宽，40-60微米深，形成的液滴直径为30-80微米。

5.  根据权利要求3所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，所述被分选液滴出口（6）为200-250微米宽、200-250微米深的微通道。

6.  根据权利要求1所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，所述液滴信号检测器（8）是高速相机、荧光检测器和拉曼光谱检测器中的任意一种。

7.  根据权利要求1所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，所述信号分析与分选控制单元（9）是由与所述液滴信号检测器（8）相对应的信号分析软件和电磁阀控制软硬件耦合而构成。

8.  根据权利要求1所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，所述电磁阀（10）有吸、推两种分别可控的工作模式。

9.  一种低成本、高效分离获取单细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
液体注入和液滴的形成：利用压力驱动油相通过连续油相入口（1）进入微流控芯片（7）的一支微通道，驱动细胞悬浮液水相通过细胞悬浮液入口（2）进入微流控芯片（7）的另一支微通道，在上述两支微通道的连接处通过油相对水相的剪切作用形成油包水微液滴；
液滴流向的控制：从侧流油相入口（3）引入的油相，使油包水微液滴在微流道内定向流动，且默认流入废液出口（5）；
液滴信号采集和分析：当油包水微液滴流经液滴信号检测器（8）时，油包水微液滴的液滴信号将被采集并传送到信号分析与分选控制单元（9），通过将所接收的信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的液滴信号是否满足所述分选规则的条件；
液滴分选：当采集的液滴信号满足分选条件时，信号分析与分选控制单元（9）触发电磁阀（10）工作，使油包水微液滴受到电磁阀（10）施加的力，进而改变其运动方向，流向被分选液滴出口（6）；
液滴的收集和单细胞的获取：被分选液滴出口（6）处的导管流入液滴收集微管（13）中，实现单液滴收集并通过后续破乳化、提取操作获取单细胞。

10.  根据权利要求9所述的一种低成本、高效分离获取单细胞的方法，其特征在于，所述分选规则为一个液滴中包裹有且只有单个细胞。

一种低成本、高效分离获取单细胞的系统和方法
技术领域
本发明属于生物技术和仪器科学领域，具体的说是基于微流控芯片上液滴包裹和液滴分选的方法实现低成本、高效分离获取单细胞的系统和方法。
背景技术
活体单细胞是生命活动的基本单元和进化的基本单位，从单个细胞层面研究细胞生物学过程有着重要的意义，能够从本质上揭示癌症发病机制，理解细胞分化与组织发育原理，识别基因表达特性与细胞特征。
快速分离、获取单细胞已成为单细胞研究与分析的关键技术。流式细胞分选仪在单细胞分选和分析方面的重要仪器平台，是分离细胞的有效手段。然而由于绝大多数活体细胞本身荧光效应较弱或没有荧光，外加荧光标记不适用于活体细胞筛选。商业化集成的微流控芯片单细胞分析仪能实现对单细胞的某种或某些分析的目的，但是其集成度较高，可扩展性不强，价格昂贵，不易实现单细胞的物理分离获取，限制了对单细胞的下游自主化分析，阻碍了其在实验室研究中的应用。目前实验室研究中常用的单细胞分离方法还包括激光光镊、显微分离和无限稀释法。前两种技术平台价格昂贵，分离通量较低；无限稀释法简单方便，但无法可控分离获得单细胞。
微流控芯片有着尺寸小、试剂消耗量少、高通量、易集成等特点，适用于微体系的研究和分析工作；微液滴作为独立的研究与分析单元，使基于微流控芯片的微液滴技术应用到单细胞研究与分析有着巨大的优势和前景。
发明内容
针对现有技术中存在的上述不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种低成本、高效分离获取单细胞的系统和方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种低成本、高效分离获取单细胞的系统，其特征在于，包括：微流控芯片、液滴信号检测器、信号分析与分选控制单元、电磁阀、导管、液滴收集微管；
所述微流控芯片内部包括微通道网络，用于使流体在外力驱动下在其微流道内定向流动，液滴的生成和分选，以及废液、被分选液滴的导出；
所述液滴信号检测器用于采集流经所述微流控芯片的检测区的液滴的光学信号，并将其传送至信号分析与分选控制单元；
所述信号分析与分选控制单元用于分析来自所述液滴信号检测器的信号，并控制电磁阀的工作；
所述电磁阀用于接收所述信号分析与分选控制单元发送的分选控制指令，并通过改变液滴在微流控芯片的运动方向执行相应的液滴分选操作；
所述导管连接所述微流控芯片与电磁阀，用于导出分选的液滴；
所述液滴收集微管连接所述导管的一端，用于收集所述微流控芯片分选出的滴液。
所述微流控芯片是由上层和下层基片键和而成的，材质均可为塑料、玻璃或石英。
所述微流控芯片的上层包括微通道网络，所述微通道网络的出入口包括连续油相入口、细胞悬浮液入口、侧流油相入口、电磁阀连接口、废液出口和被分选液滴出口；
所述连续油相入口所连通的一支微通道和细胞悬浮液入口所连通的一支微通道连通后，再与所述侧流油相入口、电磁阀连接口、废液出口和被分选液滴出口连通。
所述微通道为25-100微米宽，40-60微米深，形成的液滴直径为30-80微米。
所述被分选液滴出口为200-250微米宽、200-250微米深的微通道。
所述液滴信号检测器是高速相机、荧光检测器和拉曼光谱检测器中的任意一种。
所述信号分析与分选控制单元是由与所述液滴信号检测器相对应的信号分析软件和电磁阀控制软硬件耦合而构成。
所述电磁阀有吸、推两种分别可控的工作模式。
一种低成本、高效分离获取单细胞的方法，包括以下步骤：
液体注入和液滴的形成：利用压力驱动油相通过连续油相入口进入微流控芯片的一支微通道，驱动细胞悬浮液水相通过细胞悬浮液入口进入微流控芯片的另一支微通道，在上述两支微通道的连接处通过油相对水相的剪切作用形成油包水微液滴；
液滴流向的控制：从侧流油相入口引入的油相，使油包水微液滴在微流道内定向流动，且默认流入废液出口；
液滴信号采集和分析：当油包水微液滴流经液滴信号检测器时，油包水微液滴的液滴信号将被采集并传送到信号分析与分选控制单元，通过将所接收的信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的液滴信号是否满足所述分选规则的条件；
液滴分选：当采集的液滴信号满足分选条件时，信号分析与分选控制单元触发电磁阀工作，使油包水微液滴受到电磁阀施加的力，进而改变其运动方向，流向被分选液滴出口；
液滴的收集和单细胞的获取：被分选液滴出口处的导管流入液滴收集微管中，实现单液滴收集并通过后续破乳化、提取操作获取单细胞。
所述分选规则为一个液滴中包裹有且只有单个细胞。
本发明具有以下优点及有益效果：
1.本发明有效地利用微流控芯片的微液滴包裹技术，通过液滴包裹细胞的方法，提高了对单细胞操控的程度和精确度，尤其是对尺寸较小的细胞，此方法的优势更为突出。
2.本发明有效地利用微流控芯片的微液滴分选技术，通过对包裹细胞的液滴分选，实现了对单细胞的分离和获取的目的。
3.本发明通过调节电磁阀工作的时间，有效地控制了液滴所受力的大小，扩大此方法对尺寸不同液滴的适用范围。
4.本发明优化了微流控芯片与外界连接的界面结构，解决了微观与宏观界 面上尺度差异等引起的问题，实现了液滴的无阻滞、高效导出。
5.本发明提出的技术方法提供了一套简单可行、适用于不同检测方法的液滴分选、细胞分离与获取单细胞的系统和方法，该方法相比于传统获取单细胞的方法具有效率高、耗时短、成本低、无污染、适用范围广、可扩展性强等优点。
附图说明
图1为分离获取单细胞的微流控芯片示意图：
其中，1、连续油相入口；2、细胞悬浮液入口；3、侧流油相入口；4、电磁阀连接口；5、废液出口；6、被分选液滴出口。
图2为分离获取单细胞的系统结构示意图：
其中，7、微流控芯片；8、液滴信号检测器；9、信号分析与分选控制单元；10、电磁阀；11、导管；12、检测区；13、液滴收集微管。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：基于实验室常规成像技术低成本、高效分离获取单细胞
如图1、2所示，本实例所构建的基于实验室常规成像技术低成本、高效分离获取单细胞的系统，微流控芯片7的结构见图1，其包括：1、连续油相入口；2、细胞悬浮液入口；3、侧流油相入口；4、电磁阀连接口；5、废液出口；6、被分选液滴出口。微流控芯片7由上层PDMS和下层玻璃基片键和而成，其中上层有25-150微米宽，40-60微米深的微通道网络采用湿法刻蚀而得，下层玻璃基片上附着一层约1毫米厚的PDMS，其作用是易于产生油包水液滴和上下两层的键合封接。液滴靠油对水的剪切形成，通过加入表面活性剂使其均匀和稳定；微流控芯片7的出口和入口通过固定接口和微管与外界相连，实现油相和水相的导入，被分选液滴和废液的导出。具体实施方案如下：酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）经PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)稀释为10⁶-10⁷个/毫升，用微量注射泵以0.2μl/min的流量从细胞悬浮液入口2处进样，油相从连续 油相入口1以1.5μl/min的流量进样，通过油相的剪切作用形成约50μm左右的油包水（W/O）液滴，同时侧流油相从侧流油相入口3以1.2μl/min的流量进样用于引导液滴向废液出口5流向；通过显微镜观察分选处的液滴包裹细胞的个数，当包裹单个细胞时，触动电磁阀工作，进而改变该液滴受力和运动状态，从而使目标液滴从被分选液滴出口6流向单液滴收集微管，至此，实现单液滴收集的目的，通过后续破乳化、提取等操作可获取单个细胞。
实施例2：基于高速相机和图像处理技术高效分离获取单细胞
如图1、2所示，本实例所构建的基于高速相机和图像处理方法高效分离获取单细胞的系统，微流控芯片7的结构见图1，其包括：1、连续油相入口；2、细胞悬浮液入口；3、侧流油相入口；4、电磁阀连接口；5、废液出口；6、被分选液滴出口。微流控芯片7由上层PDMS和下层玻璃基片键和而成，其中上层有25-150微米宽，40-60微米深的微通道网络采用湿法刻蚀而得，下层玻璃基片上附着一层约1毫米厚的PDMS，其作用是易于产生油包水液滴和上下两层的键合封接。液滴靠油对水的剪切形成，通过加入表面活性剂使其均匀和稳定；芯片出口和入口通过固定接口和微管与外界相连，实现油相和水相的导入，被分选液滴和废液的导出。具体实施方案如下：酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）经PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)稀释为10⁶-10⁷个/毫升，用微量注射泵以0.5μl/min的流量从细胞悬浮液入口2处进样，油相从连续油相入口1以3.5μl/min的流量进样，通过油相的剪切作用形成约50μm左右的油包水（W/O）液滴，同时侧流油相从测流油相入口3以2.9μl/min的流量进样用于引导液滴向废液出口5流向；通过高速相机对液滴进行成像，图像处理软件运用细胞检测算法对成像进行分析与判定，若判定该液滴包裹单个细胞，触动电磁阀工作，进而改变该液滴受力和运动状态，从而使目标液滴从被分选液滴出口6流向单液滴收集微管，至此，实现单液滴收集的目的，通过后续破乳化、提取等操作可获取单个细胞。
实施例3：基于荧光检测技术低成本、高效分离获取单细胞
如图1、2所示，本实例所构建的基于荧光检测技术低成本、高效分离获取单细胞的系统，微流控芯片7的结构见图1，其包括：1、连续油相入口；2、细胞悬浮液入口；3、侧流油相入口；4、电磁阀连接口；5、废液出口；6、被分选液滴出口。微流控芯片7由上层PDMS和下层玻璃基片键和而成，其中上层有25-150微米宽，40-60微米深的微通道网络采用湿法刻蚀而得，下层玻璃基片上附着一层约1毫米厚的PDMS，其作用是易于产生油包水液滴和上下两层的键合封接。液滴靠油对水的剪切形成，通过加入表面活性剂使其均匀和稳定；芯片出口和入口通过固定接口和微管与外界相连，实现油相和水相的导入，被分选液滴和废液的导出。具体实施方案如下：细胞（表达有荧光蛋白或被荧光染色）经PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)稀释为10⁶-10⁷个/毫升，用微量注射泵以0.2μl/min的流量从细胞悬浮液入口2处进样，油相从连续油相入口1以1.5μl/min的流量进样，通过油相的剪切作用形成约50μm左右的油包水（W/O）液滴，同时侧流油相从侧流油相入口3以1.2μl/min的流量进样用于引导液滴向废液出口5流向；液滴流至分选区，其信号被荧光检测器捕获，并与判别规则比对，若判定该液滴包裹单个细胞，触动电磁阀工作，进而改变该液滴受力和运动状态，从而使目标液滴从被分选液滴出口6流向单液滴收集微管，至此，实现单液滴收集的目的，通过后续破乳化、提取等操作可获取单个细胞。
本发明基于液滴微流控芯片技术，设计构建了一种低成本、高效分离获取单细胞的系统和方法。本发明的系统包括微流控芯片、液滴信号采集器、信号分析与分选控制单元、电磁阀、导管、液滴收集微管。单细胞分离过程如下：包裹细胞的液滴在线连续生成与定向流动，流经信号采集区时，对液滴进行信号采集、分析和分选控制，当满足分选条件（如：液滴中包裹有且只有单个细胞）时，控制电磁阀工作使液滴受力状态和流向改变，从而分离和收集单个液滴，进而通过破乳化、提取等操作实现获取单个细胞的目的。本发明提出的技术方法提供了一套简单可行、适用于不同检测方法的液滴分选、细胞分离与获取单细胞的系统和方法，相比于传统获取单细胞的方法具有效率高、耗时短、 成本低、无污染、适用范围广、可扩展性强等优点。