一种检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法.pdf

一种检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法，属于检测动物胃微生物的方法。方法步骤：提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通过测序确定其微生物种类及相对数量；(1)基因组DNA抽提、(2)PCR扩增、(3)荧光定量、(4)高通量测序平台文库构建、(5)高通量测序平台测序、(6)生物信息分析和(7)测序结果；结果能够快速，全面，高效的检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的种类及数量，以便人们对其瘤胃微生物种类及数量的分析，研究瘤胃微生物对其摄取营养的吸收消化机制。优点：该方法能够减少检测时间，检测结果精确全面，能够准确测出荷斯坦奶牛瘤胃中所有微生物的种类及相对数量。

1.  一种检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法，其特征是：提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通过测序确定其微生物种类及相对数量；按如下操作步骤制备：
（1）基因组DNA 抽提：提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后进行微生物DNA组的提取纯化，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA；
（2）聚合酶链式反应扩增：按指定测序区域，合成带有条形码的特异引物；将同一样品的PCR 产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用基因组DNA小量试剂盒凝胶回收试剂盒切胶回收PCR 产物，三氨基甲烷洗脱，2%琼脂糖电泳检测；全部样品按照正式实验条件进行，每个样品3个重复；
（3）荧光定量：参照电泳初步定量结果，将PCR 产物用荧光计蓝色荧光定量系统进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合；
（4）高通量测序平台文库构建，按以下步骤进行：
①连接“Y”字形接头；
②使用磁珠筛选去除接头自连片段；
③利用聚合酶链式反应扩增进行文库模板的富集；
④氢氧化钠变性，产生单链DNA片段；
（5）高通量测序平台测序，按以下步骤进行：
① DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
②另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；
③聚合酶链式反应扩增，产生DNA簇；
④ DNA扩增子线性化成为单链；
⑤加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸，每次循环只合成一个碱基；生成“荧光基团”和“终止基团”；
⑥用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
⑦将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性即非平末端，继续聚合第二个核苷酸；
⑧统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列；
（6）生物信息分析：高通量测序平台测序得到的首尾读长首先根据重叠部分关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样品后进行波长转换器聚类分析和物种分类学分析，基于波长转换器可以进行多样性指数即物种多样性分析，基于波长转换器聚类分析结果，可以对波长转换器进行物种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析；
（7）测序结果：确定荷斯坦奶牛瘤胃所有微生物的种类相对数量。

一种检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法
技术领域
本发明涉及一种检测动物胃微生物的方法，特别是一种检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法。
背景技术
高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing,MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。第一、第二代测序技术测序时间长，测量结果不够精确，测序通量较低，操作较为复杂。
发明内容
本发明的目的是要提供一种快速、全面的检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的方法，帮助人们了解荷斯坦奶牛瘤胃中的微生物种类和数量，尤其是对不可培养的瘤胃微生物有了较全面的认识。
本发明是按如下技术方案实现的：提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通过测序确定其微生物种类及相对数量；按如下操作步骤制备：
(1)基因组DNA抽提：提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后进行微生物DNA组的提取纯化，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA；
(2)聚合酶链式反应扩增：按指定测序区域，合成带有条形码的特异引物；将同一样品的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用基因组DNA小量试剂盒凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，三氨基甲烷洗脱，2％琼脂糖电泳检测；全部样品按照正式实验条件进行，每个样品3个重复；
(3)荧光定量：参照电泳初步定量结果，将PCR产物用荧光计蓝色荧光定量系统进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合；
(4)高通量测序平台文库构建，按以下步骤进行：
①连接“Y”字形接头；
②使用磁珠筛选去除接头自连片段；
③利用聚合酶链式反应扩增进行文库模板的富集；
④氢氧化钠变性，产生单链DNA片段；
(5)高通量测序平台测序，按以下步骤进行：
①DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
②另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；
③聚合酶链式反应扩增，产生DNA簇；
④DNA扩增子线性化成为单链；
⑤加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸，每次循环只合成一个碱基；生成“荧光基团”和“终止基团”；
⑥用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
⑦将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性即非平末端，继续聚合第二个核苷酸；
⑧统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列；
(6)生物信息分析高通量测序平台测序得到的首尾读长首先根据重叠部分关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样品后进行波长转换器聚类分析和物种分类学分析，基于波长转换器可以进行物种多样性指数分析，基于波长转换器聚类分析结果，可以对波长转换器进行物种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析；
(7)测序结果：确定荷斯坦奶牛瘤胃所有微生物的种类相对数量。
有益效果，由于采用了上述方案，结果能够快速，全面，高效的检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物的种类及数量，以便人们对其瘤胃微生物种类及数量的分析，研究瘤胃微生物对其摄取营养的吸收消化机制。解决了测序时间长，效率低，结果精确度低，测序结果不全面等问题达到了本发明的目的。
优点：该方法能够减少检测时间，检测结果精确全面，能够准确测出荷斯坦奶牛瘤胃中所有微生物的种类及相对数量。
附图说明：
图1是本发明的制备方法流程图。
图2是本发明的六头荷斯坦奶牛瘤胃属水平下的微生物的种类及相对数量图。
图3是六头荷斯坦奶牛瘤胃目水平下的微生物的种类及相对数量图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步描述
实施例1：本发明的方法为：提取荷斯坦奶牛瘤胃液，抽提其中的微生物DNA通过测序确定其微生物种类及相对数量；按如下操作步骤制备：
(1)基因组DNA抽提：提取荷斯坦奶牛瘤胃液然后进行微生物DNA组的提取纯化，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA；
(2)聚合酶链式反应：按指定测序区域，合成带有条形码的特异引物；将同一样品 的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用基因组DNA小量试剂盒凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，三氨基甲烷洗脱，2％琼脂糖电泳检测；全部样品按照正式实验条件进行，每个样品3个重复；所述的条形码英文表达barcode；所述的基因组DNA小量试剂盒英文表达AxyPrepDNA；所述的三氨基甲烷英文表达Tris_HCl；所述的聚合酶链式反应英文表达PCR；
(3)荧光定量：参照电泳初步定量结果，将聚合酶链式反应产物用荧光计蓝色荧光定量系统进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合；所述的荧光计的型号为TBS-380，英文表达QuantiFluor^TM-ST；
(4)高通量测序平台文库构建，按以下步骤进行：
①连接“Y”字形接头；
②使用磁珠筛选去除接头自连片段；
③利用聚合酶链式反应扩增进行文库模板的富集；
④氢氧化钠变性，产生单链DNA片段；所述的高通量测序平台英文表达Miseq；
(5)高通量测序平台测序，按以下步骤进行：
①DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；
②另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；
③聚合酶链式反应扩增，产生DNA簇；
④DNA扩增子线性化成为单链；
⑤加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸，每次循环只合成一个碱基；生成“荧光基团”和“终止基团”；所述的脱氧核糖核苷三磷酸英文表达dNTP；所述的荧光基团为荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸中的荧光素与DNA结合后产生的荧光基团，所述的终止基团是不含3’羟基的脱氧核糖核苷三磷酸。
⑥用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；
⑦将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端粘性即非平末端，继续聚合第二个核苷酸；
⑧统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列；
(6)生物信息分析：高通量测序平台测序得到的首尾读长首先根据重叠部分关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样品后进行波长转换器聚类分析和物种分类学分析，基于波长转换器可以进行物种多样性指数分析，基于波长转换器聚类分析结果，可以对波长转换器进行物种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析；所述的首尾读长英文表达PE reads；所述的重叠部分英文表达overlap；所述的波长转换器英文表达OUT；
(7)测序结果：确定荷斯坦奶牛瘤胃所有微生物的种类相对数量。
具体制备方法如图1所示
应用效果试验：选取6头体况、泌乳年龄，胎次等相似荷斯坦奶牛，抽提其瘤胃液然后提取纯化DNA并进行测序。试验相关情况如下。
1材料与方法
1.1材料
供试动物：荷斯坦奶牛
供试仪器：PCR仪、电泳槽、IIIumina Genome Analyze、磁珠、基因芯片
供试试剂：琼脂糖凝胶、氢氧化钠、DNA聚合酶、4种荧光标记的dNTP
1.2试验设计
6头荷斯坦奶牛进行抽提瘤胃液，提取纯化瘤胃液中的微生物DNA,设计引物进行PCR扩增最后进行测序分析得到微生物的种类及相对数量。
2试验结果与分析
2.1检测荷斯坦奶牛瘤胃微生物种类及数量方法结果见图2和图3，即六头荷斯坦奶牛瘤胃属水平下的微生物的种类及相对数量图
2.2分析
由图2和图3可知：利用MiSeq高通量测序技术可以全面精确的的测出在属的水平下和目的水平下荷斯坦奶牛瘤胃微生物的种类和相对数量，图2和图3中相对丰度百分比小于1％的归为Others。