微孔膜渗透乳化制备固定醇脱氢酶的明胶微球的方法.pdf

本发明涉及一种微孔膜渗透乳化制备固定醇脱氢酶的明胶微球的方法。该方法步骤包括：将固体明胶和醇脱氢酶溶解于去离子水中，配制成称为水相的明胶/醇脱氢酶溶液；将油溶性乳化剂司班-80加入到液体石蜡中，配制成称为油相的液体石蜡油；将微孔膜浸润于液体石蜡油中，按明胶/醇脱氢酶溶液与液体石蜡油的体积比，以压力使明胶/醇脱氢酶溶液透过微孔膜进入液体石蜡油，乳化形成W/O型乳液；向W/O型乳液加入戊二醛经交联、固化、洗涤和干燥得到固定醇脱氢酶的明胶微球。本发明的优点在于：制备条件温和，制备工艺简单易行，制备微球粒度均一，大小可控，储存稳定性好，使用过程醇脱氢酶的泄漏率低，耐酸碱环境能力强。

1.  一种微孔膜渗透乳化制备固定醇脱氢酶的明胶微球的方法，该方法采用包括微孔膜组件的装置加以实现的，其特征在于包括以下步骤：
1）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将固体明胶溶解于去离子水中，配制成浓度为0.05-0.5克/毫升的明胶溶液，按明胶溶液中的明胶与醇脱氢酶的质量比为100：（0.2~2）再向明胶溶液中加入醇脱氢酶溶解，得到明胶/醇脱氢酶溶液，称为水相；
2）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将油溶性乳化剂司班-80加入到液体石蜡中，司班-80质量为液体石蜡质量的0.25-4.0%，混合均匀的液体石蜡油，称为油相；
3）将膜孔径为3.5-10.2微米的管状微孔膜浸润于油相中，按步骤1）制的水相与步骤2）制的油相的体积比为1:（2~15），在温度40℃-70℃及以5kPa-50kPa压力下，将水相加入膜乳化装置中的管状微孔膜腔内，由管状微孔膜的膜孔渗透的水相液滴进入油相，乳化形成W/O型乳液；
4）将步骤3）制得的W/O型乳液磁力搅拌5-30分钟后，移置于0℃-8℃冰水浴中，按照每克明胶加入1mL戊二醛的标准，加入交联剂戊二醛0.5mL-5mL，交联固化0.5-4小时后，分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至无油相组分为止，然后在空气中自然干燥得到固定醇脱氢酶的明胶微球。

微孔膜渗透乳化制备固定醇脱氢酶的明胶微球的方法
技术领域
本发明涉及一种微孔膜渗透乳化制备明胶微球的方法，属于固定化酶的明胶微球技术领域。
背景技术
明胶微球是一种常用的固定化酶载体。明胶是动物胶原蛋白部分水解的产物，是由18种氨基酸与多肽交联形成的直链聚合物。明胶无毒、几乎无抗原性，生物降解性和生物相容性好，价格便宜，是一种非常适宜制备微球的天然高分子材料。明胶微球也广泛应用于制备栓塞剂、药物载体、组织修复等，同时也可作模板剂制备各种具有高级结构的材料。
现有的制备固定醇脱氢酶的明胶微球的技术方法包括：
名为《明胶载体固定化乙醇脱氢酶技术研究》的论文（《中国酿造》2010年11期第50-51页，作者毛跟年、李鑫、郭倩、瞿建波、李丽维等）公开了一种制备颗粒明胶载体固定化乙醇脱氢酶的方法，具体过程包括：配制15%的明胶溶液，70℃水浴至明胶完全溶解，倒入平板，冷却后放置冰箱过夜，切块粉碎成明胶颗粒，与4%戊二醛溶液交联2h，称取1g明胶颗粒，按1∶1（m/v）的比例与酶液混合，25℃振荡反应2.5h，取出用蒸馏水洗涤数次，即得明胶固定化醇脱氢酶载体。此方法虽然使固定化醇脱氢酶的活力在使用10个循环后维持在52.89%，但是依靠机械粉碎获得的明胶颗粒粒径过大、球形度不好，同时载体过大会造成醇脱氢酶与底物接触困难，催化反应速率较低。
公开号为CN103468669A的发明专利公开了一种包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶剂制备方法。其制备过程包括：配制明胶及含有醇脱氢酶混合溶液；配制硅酸钠及戊二醛溶液前驱体混合溶液；将明胶及醇脱氢酶的混合溶液逐滴加入到0-4℃的去离子水中，生成包埋醇脱氢酶明胶凝胶颗粒，再经搅拌孵化得到包埋醇脱氢酶的明胶-氧化硅杂化凝胶。虽然此发明具有制备条件温和、工艺简单可行，固定化醇脱氢酶泄漏率低等优点，但是此法获得的明胶球粒径仍然较大，在3-4毫米范围内，同时表面覆盖致密氧化硅层，均不利于底物扩散进入。造成醇脱氢酶与底物接触困难，催化反应速率较低。
名为《Biomimetic polymer-inorganic hybrid microcapsules for yeast alcohol dehydrogenase encapsulation》的论文（《Reactive and Functional Polymers》2008年11期第1507-1515页，作者Lei Zhang、Yanjun Jiang、Jiafu Shi、Xiaohui Sun、Jian Li、Zhongyi Jiang等）公开了一种制备海藻酸钙-明胶复合凝胶载体固定化醇脱氢酶的方法，具体过程包括：将海藻酸钠固体和醇脱氢酶固定一同溶解于去离子水，得到海藻酸钠/醇脱氢酶溶液，其中海藻酸钠质量体积浓度2%w/v、醇脱氢酶质量浓度为0.24毫克/毫升。另外将明胶固体与氯化钙固定共溶解于去离子水，配制成明胶/氯化钙溶液，其中明胶质量体积浓度为1%w/v，氯化钙摩尔浓度为0.1摩尔/升。将海藻酸钠/醇脱氢酶溶液用注射器滴加入明胶/氯化钙溶液中，海藻酸钠/醇脱氢酶溶液液滴经固化10分钟后，得到固定化醇脱氢酶的海藻酸钙/明胶复合凝胶球。此方法将固定化醇脱氢酶的微球粒径减小至1-2毫米，循环使用和储存稳定性都有所提高，但是颗粒粒径依然较大、催化反应速率较低。同时醇脱氢酶主要存在于海藻酸钙凝胶中，明胶处于外层，未对醇脱氢酶产生有效的保护。
作为固定化酶材料或药物载体的明胶微球大多采用搅拌乳化法制备。此类方法虽然可获得球形度良好的微球，但是搅拌法常存在着微球粒径不均一、难以控制、需要大量后续筛分处理的问题。中国专利号CN103393606A的发明专利提供了一种包封仙人掌多糖的明胶微球制备工艺。其制备方法为：首先取少许明胶溶于适量水中，再加入野生仙人掌多糖溶液，充分混匀经初乳化制成水相溶液；油相连续相为液体石蜡，添加少量吐温-80为乳化剂；在保持原有稳定的条件下，将明胶多糖水相缓缓加入液体石蜡并充分搅拌，充分乳化后迅速冷却5℃下并保持搅拌，加入戊二醛固化2小时；最后离心，取沉淀用异丙醇或乙醇洗去残留油质和戊二醛，冻干得到微球。此法所得微球粒度分布较宽，且未用于固定化醇脱氢酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微孔膜渗透乳化制备固定醇脱氢酶的明胶微球的方法。以该方法所制得的固定醇脱氢酶的明胶微球的粒度均一、大小可控，储存稳定性好，使用过程醇脱氢酶的泄漏率低，耐酸碱环境能力强。
本发明是通过以下技术方案加以实现的，一种微孔膜渗透乳化制备固定醇脱氢酶的明胶微球的方法，该方法采用包括微孔膜组件的装置加以实现的，其特征在于包括以下步骤：
1）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将固体明胶溶解于去离子水中，配制成浓度为0.05-0.5克/毫升的明胶溶液，按明胶溶液中的明胶与醇脱氢酶的质量比为100：（0.2~2）再向明胶溶液中加入醇脱氢酶溶解，得到明胶/醇脱氢酶溶液，称为水相；
2）在容器中，于温度为40℃-70℃及搅拌下将油溶性乳化剂司班-80加入到液体石蜡中，司班-80质量为液体石蜡质量的0.25-4.0%，混合均匀的液体石蜡油，称为油相；
3）将膜孔径为3.5-10.2微米的管状微孔膜浸润于油相中，按步骤1）制的水相与步骤2）制的油相的体积比为1:（2~15），在温度40℃-70℃及以5kPa-50kPa压力下，将水相加入膜乳化装置中的管状微孔膜腔内，由管状微孔膜的膜孔渗透的水相液滴进入油相，乳化形成W/O型乳液；
4）将步骤3）制得的W/O型乳液磁力搅拌5-30分钟后，移置于0℃-8℃冰水浴中，按照每克明胶加入1mL戊二醛的标准，加入交联剂戊二醛0.5mL-5mL，交联固化0.5-4小时后，分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至无油相组分为止，然后在空气中自然干燥得到固定醇脱氢酶的明胶微球。
本发明提出的制备方法的优点在于：制备条件温和，制备工艺简单易行，固定醇脱氢酶的明胶微球粒度均一，且可通过采用不同膜孔径的微孔膜达到控制固定醇脱氢酶的明胶微球粒径的目的，粒径可控在20-90μm范围内，醇脱氢酶固定的能力强，对酸碱耐受性能优良，储存稳定性好。
附图说明
图1为实现本方法的装置示意图
图中：（1）为管状微孔膜，（2）为压力气体通入管路，（3）为盛放明胶/醇脱氢酶的储罐，（4）为盛放液体石蜡油的烧杯，（5）为磁力搅拌器，（6）为明胶/醇脱氢酶溶液，（7）为液体石蜡油。
图2为实施例1制得的固定醇脱氢酶的明胶微球的扫描电镜（SEM）照片。
图3为对比例1制得的固定醇脱氢酶的明胶微球的扫描电镜（SEM）照片。
对照图2和图3能明显看出本发明方法制得的固定醇脱氢酶的明胶微球的粒度非常均一。
图4为根据采用不同尺寸膜孔径的微孔膜制得粒径不同尺寸的固定醇脱氢酶的明胶微球数据，绘制的膜孔径与微球粒径尺寸的对应关系线图。
数据来自实施例1-3。
图5为实施例1和对比例1中制备的明胶微球固定化的醇脱氢酶在不同pH值下相对酶活力变化图。
图6为实施例1和对比例1中制备的明胶微球固定醇脱氢酶在储存不同天数后相对酶活力变化图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是为了帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
膜乳化法制备固定醇脱氢酶的明胶微球：
在以200转/分钟磁力搅拌和温度55℃条件下，向10毫升水中加入1克明胶干粉，维持此速度下磁力搅拌0.5小时，至明胶干粉完全溶解于水中，溶解后明胶浓度为0.1克/毫升，向该明胶溶液中加入醇脱氢酶1毫克，溶解后醇脱氢酶浓度为0.1毫克/毫升。以上述明胶/醇脱氢酶水溶液作为水相。
将油溶性乳化剂司班-80加入到60毫升的液体石蜡中，司班-80质量为液体石蜡质量的1.5%。以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟，至司班-80完全溶解，并将上述溶液加热至60℃作为油相。
膜乳化过程：采用管状Shirasu Porous Glass微孔膜（SPG微孔膜）。膜管直径为1厘米，长度为2厘米，膜孔径为3.5微米。使用前需要预先将微孔膜浸润于在预热至60℃的液体石蜡中30分钟，然后将微孔膜装入膜乳化装置中，膜乳化装置结构见附图1。快速将上述制备好的水相明胶/醇脱氢酶溶液加入膜乳化装置，通入氮气，在5kPa压力下使水相溶液通过微孔膜进入磁力搅拌的60℃油相中，得到液滴均匀的W/O型乳液，搅拌速度为400转/分钟。将所得乳液继续在400转/分钟下磁力搅拌15分钟后，迅速置于4℃冰水浴中，加入交联剂戊二醛1mL，交联固化2小时。结束后，分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至油相组分完全去除，然后在空气中自然干燥得到固定醇脱氢酶的明胶微球。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Mastersizer2000进行测量，固定醇脱氢酶的明胶微球的粒径及分布见表1。
对上述过程制得的固定醇脱氢酶的明胶微球在不同pH下的相对酶活力进行测定：
    将甲醛和还原型辅酶Ⅰ二钠加到0.05mol/L、不同pH值的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，配成甲醛浓度为10mmol/L，还原型辅酶Ⅰ二钠浓度为133μmol/L，加入制备的固定化醇脱氢酶的明胶微球，在25℃、搅拌的条件下进行甲醛转化反应，用紫外-可见分光光度计测定还原型辅酶Ⅰ二钠的转化量，得到固定醇脱氢酶的活力，并以最高酶活力对应的pH值为最适pH值，将最适pH值下相对酶活力定义为100％。
将其他pH值下的醇脱氢酶活力与最适pH值下的醇脱氢酶活力对比，得到最适pH值为7.0，pH7.0时固定醇脱氢酶明胶微球的相对酶活力为100%。与最适pH值条件下相比， pH4.0时固定醇脱氢酶明胶微球的相对酶活力为68.3%；pH5.0时固定醇脱氢酶明胶微球的相对酶活力为92.0%；pH6.0时固定醇脱氢酶明胶微球的相对酶活力为96.8%； pH8.0时固定醇脱氢酶明胶微球的相对酶活力为76.2%；pH9.0时固定醇脱氢酶明胶微球的相对酶活力为52.7%；pH10.0时固定醇脱氢酶明胶微球的相对酶活力为44.4%。
对上述过程制得的固定化醇脱氢酶的明胶微球中醇脱氢酶的储存稳定性进行测定：
    将甲醛和还原型辅酶Ⅰ二钠加到0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，配成甲醛浓度为10mmol/L，还原型辅酶Ⅰ二钠浓度为133μmol/L，加入实施例14中制备的固定化醇脱氢酶的明胶微球，在25℃、搅拌的条件下进行甲醛转化反应，用紫外-可见分光光度计测定还原型辅酶Ⅰ二钠的转化量，得到固定化醇脱氢酶的活力，并以此醇脱氢酶活力为初始酶活力，定义为100%。
将实施例1制备的新鲜的固定化醇脱氢酶的明胶微球存放一天后，重复上述反应过程，得到固定化过醇脱氢酶的酶活力，与初始活力相比，此时的相对酶活力为96.5％。将实施例14制备的新鲜固定化醇脱氢酶的明胶微球存放存放三天，六天，十天，十五天，二十一天，二十八天后重复上述反应过程，得到储存三天的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为90.5％；储存六天的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为81.2％；储存十天的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为75.0％；储存十五天的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为47.6％；储存二十一天的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为42.9％；储存二十八天的固定化醇脱氢酶的相对酶活力为41.7％。
实施例2
    本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将采用的膜孔径为3.5微米的微孔膜改用膜孔径为5.0微米的微孔膜，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例3
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将采用的膜孔径为3.5微米的微孔膜改用膜孔径为7.2微米的微孔膜，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例4
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在膜乳化过程中将采用的搅拌速度400转/分钟改变为200转/分钟，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例5
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在膜乳化过程中将采用的搅拌速度400转/分钟改变为800转/分钟，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例6
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在膜乳化过程中将采用的5kPa的操作压力改变为10kPa的操作压力，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例7
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在膜乳化过程中将采用的5kPa的操作压力改变为50kPa的操作压力，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例8
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将水相中的明胶溶液的浓度由0.1克/毫升改变为0.05克/毫升，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例9
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将水相中的明胶溶液的浓度由0.1克/毫升改变为0.5克/毫升，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例10
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将膜乳化过程中采用的表面活性剂司班-80质量为液体石蜡质量的0.25%。制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例11
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：将膜乳化过程中采用的表面活性剂司班-80质量为液体石蜡质量的4.0%。制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例12
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在膜乳化过程中将水相与油相的体积比由1:6改变为1:2，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
实施例13
本实施例制备过程与实施例1相同，不同之处在于：在膜乳化过程中将水相与油相的体积比由1:6改变为1:15，制得固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
对比例1
搅拌法制备明胶微球：
向200转/分钟磁力搅拌、55℃的10毫升水中加入1克明胶干粉，维持此速度下磁力搅拌0.5小时，至明胶干粉完全溶解于水中，溶解后明胶浓度为0.1克/毫升。向0.1克/毫升的明胶溶液中加入醇脱氢酶1毫克，溶解后醇脱氢酶浓度为0.1毫克/毫升。以上述明胶/醇脱氢酶水溶液作为水相。
将油溶性乳化剂司班-80加入到60毫升的液体石蜡中，司班-80质量为液体石蜡质量的1.5%。以200转/分钟速度磁力搅拌30分钟，至司班-80完全溶解，并将上述溶液加热至60℃作为油相。
搅拌乳化过程：将上述制备好的水相明胶/醇脱氢酶溶液加入磁力搅拌的60℃油相中，得到液滴均匀的W/O型乳液，搅拌速度为400转/分钟。将所得乳液继续在400转/分钟下磁力搅拌15分钟后，迅速置于4℃冰水浴中，加入交联剂戊二醛1mL，交联固化2小时。结束后，分别用异丙醇和丙酮进行洗涤至油相组分完全去除，然后在空气中自然干燥得到固定醇脱氢酶的明胶微球。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒度仪Mastersizer2000进行测量，固定醇脱氢酶的明胶微球粒径及分布见表1。
对上述过程制得固定醇脱氢酶的明胶微球在不同pH下的相对酶活力进行测定：
将甲醛和还原型辅酶Ⅰ二钠加到0.05mol/L、不同pH值的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，配成甲醛浓度为10mmol/L，还原型辅酶Ⅰ二钠浓度为133μmol/L，加入游离醇脱氢酶溶液，在25℃、搅拌的条件下进行甲醛转化反应，用紫外-可见分光光度计测定还原型辅酶Ⅰ二钠的转化量，得到固定化醇脱氢酶的活力，并以最高酶活力对应的pH值为最适pH值，将最适pH值下相对酶活力定义为100％。
将其他pH值下的酶活力与最适pH值下的酶活力对比，得到最适pH值为7.0，pH7.0时固定醇脱氢酶的明胶微球的相对酶活力为100%。与最适pH值条件下相比， pH4.0时固定醇脱氢酶的明胶微球的相对酶活力为12.3%；pH5.0时固定醇脱氢酶的明胶微球的相对酶活力为67.7%；pH6.0时固定醇脱氢酶的明胶微球的相对酶活力为95.8%； pH8.0时固定醇脱氢酶的明胶微球的相对酶活力为90.8%；pH9.0时固定醇脱氢酶的明胶微球的相对酶活力为26.1%；pH10.0时固定醇脱氢酶的明胶微球的相对酶活力为0。
对上述过程制得固定醇脱氢酶的明胶微球中醇脱氢酶的储存稳定性进行测定：
将甲醛和还原型辅酶Ⅰ二钠加到0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，配成甲醛浓度为10mmol/L，还原型辅酶Ⅰ二钠浓度为133μmol/L，加入新鲜的游离醇脱氢酶溶液，在25℃、搅拌的条件下进行甲醛转化反应，用紫外-可见分光光度计测定还原型辅酶Ⅰ二钠的转化量，得到游离醇脱氢酶的活力，并以此酶活力为初始酶活力，定义为100%。
将新鲜的游离醇脱氢酶溶液存放一天后，重复上述反应过程，得到固定化过醇脱氢酶的酶活力，与初始活力相比，此时的相对酶活力为85.3％。将新鲜的游离醇脱氢酶溶液存放三天，六天，十天，十五天，二十一天，二十八天后重复上述反应过程，得到储存三天的游离醇脱氢酶的相对酶活力为69.0％；储存六天的游离醇脱氢酶的相对酶活力为40.5％；储存十天的游离醇脱氢酶的相对酶活力为24.3％；储存十五天的游离醇脱氢酶的相对酶活力为3.5％；储存二十一天及二十八天的游离醇脱氢酶的相对酶活力完全丧失，为0%。
表1所示为实施例1-13和对比例1测定的固定醇脱氢酶的明胶微球粒径大小及分布的对比结果。
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