荧光假单孢杆菌制品及其应用 技术领域：
本发明涉及一种荧光假单孢杆菌制品及其应用，具体涉及在消除土壤和水体五氯酚钠污染上的应用。
背景技术：
荧光假单孢杆菌(Pseudomanasfluorescens)是一种能发出荧光的细菌，天然存在于自然土壤中，通常情况下因为具有一定的促使作用和抗病作用，用于农作物的防病上。荧光假单孢杆菌在生长过程中能向环境中分泌一些胞外酶，分解复杂的有机物，获取养分供自身生长利用。
我国南方很多省份河流众多，50-70年代曾大面积发生由钉螺滋生造成的人和动物血吸虫病大爆发、大流行，造成大量的人畜死亡。为消灭血吸虫病，我国从50年代末大量生产使用五氯酚钠这一广谱高效灭螺药，起到很好的作用，农田土壤和河流中的钉螺被大大控制住，因而血吸虫病得到控制。但是，随着后来大量的医学研究发现，过量施用的五氯酚钠残留在土壤中造成对人体的潜在危害，造成严重的环境污染。研究表明，五氯酚钠对小鼠体液免疫、细胞免疫功能和巨噬细胞功能产生抑制作用；小鼠微核试验和斑马鱼胚胎发育试验表明五氯酚钠对哺乳动物有一定的致突变性，同时五氯酚钠对小鼠精子有强烈致畸作用；五氯酚钠能诱导中国仓鼠卵巢细胞和鲤鱼肾细胞DNA损伤和染色体畸变；五氯酚钠影响水稻幼苗和葡萄老蔓的生长；五氯酚钠能使柑桔幼叶干枯死亡；因此，消除我国南方农田土壤和水体中残留的大量的五氯酚钠，对保障环境生态安全和人体健康都具有重要意义。理论上讲，有很多物理化学方法能够降解消除五氯酚钠，但是对于广袤的农田土壤和农村河流而言，这些方法都无法实施。主要是因为成本太高，根本不能承受，同时，又引入新的污染物，造成二次污染，因此开发新的安全、低成本降解方法很有必要。
发明内容：
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种荧光假单孢杆菌制品，该制品制备工艺简便，生产成本低。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
本发明的荧光假单孢杆菌制品，制备步骤如下：首先将培养基置入培养容器内，灭菌后，控制培养温度为28-32℃，接种荧光假单孢杆菌(Pseudomanasfluorescens)按每毫升液体培养基接种活菌体1～2×107个，培养48-72小时后，用稀盐酸调节pH值6.5-7.5，沉淀池静置1-3天，去掉上层澄清液，向下层浑浊液中分别添加占浑浊液体总重0.5-1％的工业纤维素，2-5％的麦麸或米糠和1-6％的粘土或凹凸棒土，离心处理，收集沉淀物即得荧光假单孢杆菌产制品。
培养基的组成为：每1000mL水中加入五氯酚钠20-100mg，牛肉膏100-500mg，KH2PO4 200-600mg，K2HPO4 1200-2000mg，MgSO4 0.04-0.09mg，FeSO4 2.5-3.5mg，CuSO4 0.05-0.08mg，(NH4)2SO4 500-1500mg，pH 6.5-7.5；培养基灭菌温度为115～120℃，压力为0.1～0.15MPa，时间为20～40分钟。
3、根据权利要求1所述的荧光假单孢杆菌制品，其特征在于，在荧光假单孢杆菌的培养过程中，0-8小时保持培养压力为0.03-0.05Mpa，通气量为0.3-0.5VVM，8-26小时保持培养压力为0.08-0.12Mpa，通气量为0.6-1.2VVM，6小时到培养结束保持培养压力为0.04-0.06Mpa，通气量为0.3-0.5VVM。
进行离心时，可采用500-1000转工业离心机离心10-15分钟，收集沉淀荧光假单孢杆菌混合物，为粘稠液体产物，即为最终产品。
使用时，将上述产品加入20-50倍体积的水分，拌匀，均匀喷洒农田地表、河流、五氯酚钠化工厂废水中用于降解五氯酚钠。
本发明另一目的在于提供该荧光假单孢杆菌制品的应用，具体应用在使用该微生物制品处理农田土壤、河流、五氯酚钠化工厂的含五氯酚钠土壤、水体和化工废水，并将五氯酚钠降解，变成无毒物质，具有很高的经济价值和良好的应用前景。
本发明采用荧光假单孢杆菌制品来降解消除农田土壤、河流和化工废水中的五氯酚钠，保护环境，减少污染。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明的产品制备过程操作简便，容易控制，没有易燃易爆化学品，生产成本和使用成本低；
2.本发明的产品制备过程中没有有毒有害的气体、液体和固体产生排放到环境中，发酵基质全部利用转入产品中，生产过程达到污染零排放，且最终产品是一种环境友好的绿色生态产品，使用于农田土壤和河流后，不会污染环境，对人体和其他生物没有危害；
3.本发明生产的产品的作用机理不同于一般的化学或物理法，也不同于普通的植物吸收法，其作用机理是：该荧光假单孢杆菌制品施入农田土壤和河流后，在适宜的环境条件下，荧光假单孢杆菌活体和孢子能继续萌发、生长、繁殖，并保持足够的活性，利用土壤或水体中的五氯酚钠做碳源和能源，分泌胞外酶，将土壤和水体中的五氯酚钠降解，利用其中的能量和碳源合成自身需要的营养物质，供自身生长发育，从而达到降解土壤和水体中的五氯酚钠的目的，作用持续时间长；
4.本发明生产的产品特别适合于生产有机食品、无公害食品、绿色食品，用于消除农田土壤中的五氯酚钠；本发明采用荧光假单孢杆菌处理含五氯酚钠的农田土壤、河流和工业废水，不但净化环境，减少污染，成本很低，而且容易实现，因此有着广阔的应用前景。
5.本发明的原料易得，荧光假单孢杆菌属微生物可从国内很多家高校、科研机构购得，也可从也可从中国科学院微生物研究所、中国农科院菌种保藏中心、山东大学、武汉大学、复旦大学和有关农业大学及南京信息工程大学获得。
具体实施方式：
实施例一：荧光假单孢杆菌制品
1、1000L水中分别加入下列各物质配置培养基：五氯酚钠60g，牛肉膏500g，KH2PO4 400g，K2HPO4 900g，MgSO4 0.05g，FeSO4 0.25g，CuSO4 0.06mg，(NH4)28O4 1000g，调pH6.5-7.5。灭菌条件为120℃，0.13MPa，时间为30分钟；培养基中干物质总重为2861g，整个液体培养基总重为1002.9kg。
2、将上述整个培养基置于发酵罐中进行高温灭菌30分钟，装料量为60-75％发酵罐容积，保持发酵罐中温度为120-124℃，压力为0.08-0.12Mpa；冷却发酵罐，通入除菌空气保持发酵罐压力0.08Mpa左右，当发酵罐中培养基降温至28-32℃左右时，接种荧光假单孢杆菌(Pseudomanas fluorescens)，接种量大约为每毫升液体培养基接种活菌体1.5×107个(接种量为1～2×107个均可)，接种荧光假单孢杆菌后进行培养，培养初期(8小时内)罐压保持在0.04Mpa左右，通气量为0.3-0.5VVM，培养中期(8-26小时内)罐压保持在0.08-0.12Mpa，通气量为0.6-1.2VVM，培养后期(26小时后到放罐)保持罐压0.05Mpa左右，通气量为0.4VVM左右，培养温度为30±2℃；
3、经48～72小时培养后，显微镜检查发酵液单位体积活菌数，待发酵液中每毫升活菌数达到大约5-10×108个时放罐，用稀盐酸调节pH 7左右，沉淀池静置2天，去掉上层澄清液体，向下层浑浊液体600kg(大约600L)添加占浑浊液总重5kg的工业纤维素(0.5-1％均可)，20kg的麦麸或米糠(2-5％均可)，25kg的粘土或凹凸棒土(1-6％均可)，拌匀，用工业离心机以300-500转/分钟速度离心处理10分钟，收集沉淀荧光假单孢杆菌混合物，为粘稠液体产物，即为最终产品(大约150kg)。
实施例二：荧光假单孢杆菌发酵制品在降解五氯酚钠上的应用
1.荧光假单孢杆菌发酵制品降解水中五氯酚钠
试验设不加荧光假单孢杆菌发酵制品对照、加发酵制品10mL、20mL、40mL三个处理，三次重复，考察5天、10天、15天、20天、30天降解结果，试验在实验室内进行，环境温度24℃左右，在1000ml烧杯中加入500ml水，添加200mg五氯酚钠，使全部溶解，搅匀后加入上述荧光假单孢杆菌发酵制品，再次搅拌均匀，每个烧杯通入一根软管，用增氧泵供应空气，同时搅拌液体。不同时间段取样检测溶液中的五氯酚钠含量，其结果如表1所示，一个月后的最大降解效果达到91％。
表1.荧光假单孢杆菌发酵制品降解水中五氯酚钠效果(mg/L)
5天 10天 15天 20天 30天 0(对照) 399 396 396 395 392 10mL 390 306 261 235 213 20mL 354 273 183 154 124 40mL 325 202 115 57 36
*表中为实际测定水中残留五氯酚钠含量
2.荧光假单孢杆菌发酵制品降解灭菌土壤中五氯酚钠
试验设不加荧光假单孢杆菌发酵制品对照、加发酵制品10mL/100克土壤、加发酵制品30mL/100克土壤、加发酵制品60mL/100克土壤三个处理，三次重复，考察5天、10天、15天、20天、30天降解结果，试验在实验室内进行，环境温度24℃左右，在塑料盆钵中加入5千克灭菌土壤，添加2000mg五氯酚钠，彻底拌匀；加入上述荧光假单孢杆菌发酵制品，拌匀，浇入大约200ml无菌水，每3天浇一次无菌水，保持土壤湿润，但不积水。不同时间段取样检测土壤中残留地五氯酚钠含量，其结果如表2所示，一个月后的五氯酚钠的最大降解效果达到82％。
表2.荧光假单孢杆菌发酵制品降解灭菌土壤中五氯酚钠效果(mg/kg)
5天 10天 15天 20天 30天 0(对照) 392 394 391 390 388 10mL/100克土壤 371 328 294 269 245 30mL/100克土壤 367 298 215 183 139 60mL/100克土壤 355 256 174 133 72
*表中为实际测定灭菌土壤中残留五氯酚钠含量