复合活菌生物净水剂的制备方法 【技术领域】
本发明公开的是一种复合活菌生物净水剂的制备方法，属于生物净水剂加工技术领域。
背景技术
现有的活菌净水剂大多利用具有降解有机氮、或无机氮化合物功能的芽孢杆菌、硝化菌、反硝化菌等有益菌复配制备而成。例如：中国专利公开号CN1396123A公开了一种复合型活菌生物净水剂的制备和应用，它是采用四株枯草芽孢杆菌变异株进行复配制取。正是由于枯草芽孢杆菌的功用，本技术方案所获得的净水剂对分解水产养殖池池水中的氨氨和硝基氮以及对分解过剩饲料和水产排泄物的大分子有机物具有一定的效果。由上述方案所获得的以产品名分别为“科利尔”、“西菲利”之类的净水剂在市场被采用，但由于组成此类净水剂的菌株，不能分泌粘性高分子物质，因此，这类净水剂无法发挥絮凝剂作用，以改善水体的澄清度。而水体的澄清度和透光度对水中养殖动物的生长有重要影响。
又，中国发明专利申请公开号为CN1384187A介绍了枯草芽孢杆菌变异株的批量间歇式培养方法，该方法之贡献仅在于为制备由CN1396123A所涉及的复合型活菌生物净水剂提供枯草芽孢杆菌的菌源保障。而用CN1396123A所公开的技术方案生产的净水剂如前所述只具分解水体中的氨氮、硝基氮以及水产排泄物的大分子有机物，不具改善水体澄清度的作用。
及，中国发明专利申请公开号为CN1344687A公开了一种活菌净水剂的高密度活菌发酵工艺，该技术方案之要点在于采用美国菌种集藏中心(American TypeCulture Collection)提供的菌株#456，该菌株采用连续加料方式发酵培养，即连续补加碳源、氮源和铁离子，使发酵液始终保持良好的铁离子浓度在一定地范围。可见，它仅仅涉及活菌生物净水剂生产过程中的发酵工艺本身，而未及其余。
鉴于前述的诸生物净水剂在澄清水质方面的不可作为性，在调理污泥、澄清水质方面，人们仍广泛采用合成高分子絮凝剂，而且实践证明效果不错。但无机高分子絮凝剂，如铝盐絮凝剂在水中累积会对生物产生威胁：1)水中铝含量高于0.2～0.5mg·dm-3时可使鲑鱼致死；2)如果处理水中AL+3浓度过高，铝盐絮凝法产生的污泥广泛应用于农业，导致土壤中铝含量升高，会影响植物正常生长，甚至死亡；同时伴随这些农作物进入食物键亦影响到人体的健康，如临床上铝中毒主要表现为铝性脑病、铝性骨病和铝性贫血等，老年性痴呆症即是铝性脑病的一种。因此，美国国家标准协会将铝化合物列为剧毒类物质。但就我国研究表明而言，铝对人体的毒性问题尚未做出定论；3)当铝的浓度大于25mg·dm-3时会对活性污泥产生毒性影响，并使整体去除效果下降。另外，铝盐絮凝剂与微生物絮凝剂如果混合使用，则铝盐絮凝剂将对微生物絮凝剂的活性产生毒性效应，致使微生物絮凝剂的絮凝活性下降。铁系絮凝剂在使用过程中，对金属有腐蚀作用，可造成处理水中带有颜色，且高浓度的铁对人体健康和生态环境有不利影响。有机高分子絮凝剂中，目前使用较多的是聚丙烯酰胺，但因合成其聚合物的单体具有强烈的神经毒性，且有很强的“三致”(致畸、致癌、致突变)效应，因而其应用范围受到限制。为此，人们改而探索生物絮凝剂。
余荣升，徐龙君在2003年，《环境污染与防治》第2期发表文章对微生物絮凝剂的现状与前景分析表明，至今发现具有絮凝性的微生物已超过17种，包括霉菌、细菌、放线菌和酵母菌等。其中最具有代表性的有以下三种：酱油曲霉(Aspergillussojae)产生的絮凝剂AJ7002，拟青霉(Paecilomyces sp.1-1)产生的MBF PF101，由红平红球菌(Rhodociccus erythropolis)制成的絮凝剂NOC-1。霉菌虽能产高聚的多糖或多肽类胶状物质，但在发酵生产过程中极易产生黄曲霉类似毒素物质，对水体养殖物有致病作用；放线菌是最大的抗生素的产生菌属，抗生素比如拟青霉素的累积作用，对水体养殖动物亦有危害，因此在养殖水域中的应用已被限制；酵母菌虽无害，但其本身是富含营养的优良饲料添加剂，对于已经富营养化的水体，再添加酵母菌，势必会进一步加重水体的净化负荷。可见，上述三种微生物均不宜用作养殖水域的絮凝剂。为此，研究者希望开发具有多功能活菌生物净水剂：既能絮凝沉降水中微粒，提高水的澄清度，又能降解水中有害有机物、氨氮；还能表现出无毒、无害、无二次污染；此外能使制备过程中离心分离得到的混合滤液得到良好利用。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种复合活菌生物净水剂的制备方法，用该方法制备的复合活菌生物净水剂能分解水产品的排泄物及饲料残留物；絮凝沉降水中微粒、提高水体澄清度和降解有害有机物、CODcr(化学耗氧量)及氨氮。
本发明的另一目的在于提供一种能将制备中产生的混合滤液得以应用的复合活菌生物净水剂的制备方法。
本发明采用以下技术方案达到上述第一个发明目的，一种复合活菌生物净水剂的制备方法，其是将现有的芽孢杆菌诱变改良后，进行单一纯菌种或混合菌种的接种、发酵，经分离得到湿菌泥，再经复配、流化干燥，得到干粉态活菌剂，特点在于它包括以下步骤：
a.在第一个发酵罐中按比例添加培养基，进行蒸汽灭菌，冷却后接入蜡状芽孢杆菌变异株和枯草芽孢杆菌变异株的混合种子液，进行混合发酵，发酵结束后，发酵液离心分离得到湿菌泥；
b.在第二个发酵罐中按照比例添加培养基并加入诱导剂，进行蒸汽灭菌，冷却后接入地表芽孢杆菌变异株进行纯种发酵，发酵结束后，发酵液离心分离得到湿菌泥待作粉剂用，粘性离心滤液灭菌保存，特与粉剂配合使用；
c.在第三个发酵罐中按照比例添加培养基，进行蒸汽灭菌，冷却后接入硝基还原菌变异株种子液进行发酵，发酵结束后，发酵液离心分离得到湿菌泥；
d.将前面所获得的湿菌泥按比例混合，并加入填充剂混匀，经流化干燥得到干粉态活菌剂产品。
为达到本发明的另一目的，其是对在离心分离获取湿菌泥过程中所放出的混合滤液加水，得到用于直接浇灌植物或与禽畜粪便混合发酵的有机复合肥料。
本发明方法所述的发酵罐中加入的诱导剂为谷氨酸和氯化钙。
本发明方法所述的在对所获得的诸湿菌泥按比例混合时所加入的填充剂为麸皮和轻质碳酸钙。
由本发明方法获得的复合活菌生物净水剂除了具有降解水体中的有害有机物、CODcr(化学耗氧量)及氨氮外，因向地表芽孢杆菌变异株纯种发酵的培养基中添加了作为诱导剂的谷氨酸钠和氯化钙，能使菌体代谢生成粘性的得以絮凝沉降水中微粒、提高水体澄清度。
附图及图面说明
附图为本发明复合活菌生物净水剂的制备方法工艺路线图。
【具体实施方式】
请参照附图，将来自于中国微生物菌种保藏中心(CICC)的菌种编号为1611号芽孢杆菌诱变改良后，采用常规的微生物发酵技术进行单一纯菌种或混合菌种接种发酵，经分离得到湿菌泥，再以所得到的诸湿菌泥复配、流化干燥，获得干粉态活菌剂，具体步骤为：
a.将葡萄糖、玉米浆、酵母膏、磷酸氢二钾，按比例投到第一发酵罐中，进行蒸汽灭菌，冷却至35～37℃，按比例接入蜡状芽孢杆菌AS1.1626变异株和枯草芽孢杆菌AS1.398变异株的混合种子液，进行发酵，30小时后发酵结束，放出发酵液，离心分离，得到湿菌泥；
b.将葡萄糖、豆粕粉、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、谷氨酸、柠檬酸亚铁铵、氯化钙，按比例投到第二发酵罐中，进行蒸汽灭菌，冷却至35～37℃，接入能产高聚的蛋白质胶状物质的地衣芽孢杆菌ATCC9945a变异株种子液，进行发酵，48小时后发酵结束，放出发酵液，离心分离，得到湿菌泥，离心滤液粘稠留作与粉剂配合使用，发酵液粘稠的诱导剂主要是谷氨酸钠和氯化钙；
c.将葡萄糖、玉米浆、蛋白胨和硫酸镁，按比例投到第三发酵罐中，进行蒸汽灭菌，冷却至30～32℃，接入硝基还原菌的种子液，进行发酵，48小时后发酵结束，放出发酵液，离心分离，得到湿菌泥；
d.将以上四株菌的湿菌泥按比例混合，并在掺混过程中加入适量麸皮和轻质碳酸钙，经流化干燥得到干粉态活菌剂产品。
由以上在步骤a、b、c中离心分离湿菌泥过程中所放出混合滤液加水稀释直接用于浇灌植物或与禽畜粪便混合发酵构成有机复合肥料。
实施例1：
a.在6T第一个发酵罐中加入120Kg的葡萄糖、100Kg的玉米浆、12Kg的酵母膏、3Kg磷酸氢二钾，加3.5T自来水，进行蒸汽灭菌，冷却至35～37℃，接种450Kg蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus AS1.1626)变异株和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis AS1.398)变异株3/1的混合种子液，进行发酵， PH控制在6～7之间，通气量1∶1VVM，溶氧相对值控制在15～30％，30小时后取样，稀释25倍，在可见光660nm位置检测发酵液的吸光值为0.75，放料离心得到湿菌泥1.06T；
b.在1T的第二个发酵罐中加入30Kg的葡萄糖、20Kg的豆粕粉、2.5Kg酵母膏、0.3Kg硫酸镁、1.5Kg磷酸氢二钾、5Kg磷酸二氢钠、20～30Kg谷氨酸和5Kg的柠檬酸亚铁铵、0.2～0.5Kg的氯化钙，加0.6T自来水，灭菌冷却至35～37℃，接入75Kg地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ATCC9945a)变异株种子液进行发酵，通气量1∶1VVM，溶氧相对值控制在15～30％，PH控制在7～7.5之间，发酵48小时后取样，稀释25倍，在可见光660nm位置检测发酵液的吸光值为0.85，放料离心过滤可得湿菌体150Kg；
c.在150L的第三个发酵罐中加入2Kg的葡萄糖、1Kg的玉米浆、100g的蛋白胨、5g的硫酸镁，加80L自来水，进行蒸汽灭菌，冷却至30～32℃，接入8L硝基还原菌(Pseudomonas sp.AS1.1796)变异株种子液进行发酵，通气量1∶1VVM，溶氧相对值控制在10～20％，PH控制在6～7之间，发酵48小时后取样，稀释25倍，在可见光660nm位置检测发酵液的吸光值为0.62，放料离心过滤可得湿菌泥20Kg。
d.将以上得到的菌泥，混合在一起，并掺入1T的麸皮和0.5T轻质碳酸钙，混匀，经流化干燥，即可得到2.1T干粉态活菌剂产品。地衣芽孢杆菌的离心滤液灭菌保存，此悬浊液具有絮凝功能。
按照1.5mg/L的用量向鱼塘施加以上方法制备的干粉态复合活菌生物净水剂产品，同时施加10ml/L上述悬浊液。每亩塘666.7m2，按平均水深1.5m计算，可容1000m3水，因此每亩塘施加1.5Kg干粉菌剂和10Kg悬浊液。使用时选择晴好天气，上午9～10点左右，先用100倍的温水(30～40℃)浸泡复苏，活化2～4小时后搅拌，全池均匀泼洒。3天后养殖水氨氮从原来的1.5mg/L降到0.25mg/L，澄清度由稀释20倍下降到3倍，效果非常明显。
实施例2：
取以上离心分离的混合滤液掺入2倍河水浇青菜，隔10天浇一次，25天收获，所得青菜明显个大、叶嫩，产量增加。混合滤液是良好的绿色肥料。