氯化钾KCl在制药中的应用 技术领域：
本发明涉及医药技术领域，确切地说涉及KCl的医药新用途，涉及KCl作为促进神经细胞生长剂、促进PC12细胞生长剂、抗氧化应激损伤剂、PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤剂的应用，以及KCl在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
背景技术：
KCl可以使细胞膜去极化，兴奋细胞，改变离子通道通透性，调节质膜和钙库膜上的钙离子通道，从而引起细胞内游离钙离子升高，所以通常被用来建立组织缺血所导致细胞内钙离子浓度升高模型(William J.Moody and Martha M.Bosma.IonChannel Development，Spontaneous Activity，and Activity-DependentDevelopment in Nerve and Muscle Cells.Physiol Rev，Jul 2005；85：883-941)。并且，KCl常用于治疗低钾血症的防治，亦可用于强心甙中毒的阵发性心动过速或者频发室性期外收缩(Paul H.Ratz，Krystina M.Berg，Nicole H.Urban，and AmyS.Miner Regulation of smooth muscle calcium sensitivity：KCl as acalcium-sensitizing stimulus.Am J Physiol Cell Physiol，Apr 2005；288：C769-C783)。
MPP+是1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)经过单胺氧化酶B(MAO-B)催化后生成的具有细胞毒性的活性代谢产物，它与线粒体复合物-I结合抑制其活性，使细胞线粒体ATP的下降和膜电位的破坏，最终导致线粒体功能障碍和氧自由基生成增加，细胞凋亡。MPP+通常用来做帕金森病的细胞模型，MPP+抑制PC12细胞的生长增殖，诱导细胞凋亡(JieBai，Hajime Nakamura，Shugo Ueda，Yong-Won Kwon，Toru Tanaka，Sadayuki Ban，and Junji YodoiProteasome-dependent Degra-dation of Cyclin D1 in1-Methyl-4-phenylpyridinium Ion(MPP+)-induced Cell Cycle Arrest.J.Biol.Chem.，Sep 2004；279：38710-38714.)。
硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一种普遍存在于原核生物和真核生物中的小分子蛋白质，它与NAPDH和硫氧还蛋白还原酶组成细胞内主要的氧化还原系统。Trx-1是生物体所必须的基因，如果选择性地敲除小鼠的Trx-1基因，小鼠则早期胚胎致死(Matsui M.，Oshima M.，Oshima H.，Takaku K.，Maruyama T.，Yodoi J.，and Taketo M.M.Early embryonic lethality caused by targeted disruptionof the mouse thioredoxin gene.Dev.Biol.1996，178：179-185)。作为细胞内的抗氧化剂，Trx-1能保护细胞、减轻氧化应激所致的损伤，并且能抑制p38 MAPK和凋亡信号调节激酶1活性，增强细胞的抗凋亡能力(Saito M.，Nishitoh，H.，Fujii，M.，Takeda，K.，Tobiume，K.，Sawada，Y.，Kawabata，M.，Miyazono，K.，and Ichijyo，H.Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosissignal-regulating kinase(ASK)1.EMBO，1998，17：2596-2606；Hashimoto S.，Matsumoto K.，Gon Y.，Furuichi S.，Maruoka S.，Takeshita I.，Hirota K.，YodoiJ.，and Horie T.Thioredoxin negatively regulates p38 MAP kinase activationand IL-6 production by tumor necrosis factor-alpha.Biochem.Biophys.Res.Commun.1999，258：443-447.)。到目前为止，Trx与人类疾病有关的研究很多，Trx具有保护神经元抑制帕金森病作用(Thioredoxin suppresses1-methyl-4-phenylpyridinium-induced neurotoxicity in rat PC12 cells.BaiJ，Nakamura H，Hattori I，Tanito M，Yodoi J.Neurosci Lett.2002 Mar15；321(1-2)：81-4.Does thioredoxin-1 prevent mitochondria-and endoplasmicreticulum-mediated neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine？Bai J，Nakamura H，Kwon YW，Tanito M，Ueda S，Tanaka T，Hattori I，Ban S，Momoi T，Kitao Y，Ogawa S，Yodoi J Antioxid RedoxSignal.2007 May；9(5)：603-8)。
迄今，现有技术中未见KCl保护神经元免受MPP+损伤的作用的报道。
发明内容：
本发明旨在提供KCl的医药新用途，涉及KCl作为促进神经细胞生长剂、促进PC12细胞生长剂、抗氧化应激损伤剂、PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤剂的应用，以及KCl在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
本发明的上述目的是用下面的技术方案得以实现的：
KCl作为促进神经细胞生长剂的应用。
KCl作为促进PC12细胞生长剂的应用。
KCl作为抗氧化应激损伤剂的应用。
KCl作为PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤剂的应用。
KCl在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
附图说明：
图1：四噻唑蓝(MTT)法测定KCl对PC12细胞的存活率影响；
图2：Western Blot检测KCl对PC12细胞中Trx蛋白表达的影响；
图3：四噻唑蓝(MTT)法测定KCl对MPP+刺激的PC12细胞的保护作用；
图4：Western Blot检测KCl对MPP+刺激的PC12细胞Trx蛋白表达的影响。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：把KCl(KCl购自天津市化学试剂三厂)250mg，溶于1000ml水中制成0.25％浓度的水溶液加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品。
实施例2：把KCl(KCl购自天津市化学试剂三厂)125mg，溶于1000ml水中制成0.125％浓度的水溶液加热溶解，混合均匀后，装入药瓶中密封，消毒制成产品。
实施例3：把KCl(KCl购自天津市化学试剂三厂)2500mg，溶于1000ml水中制成水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成5mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制成产品。
实施例4：把KCl(KCl购自天津市化学试剂三厂)1500mg，溶于1000ml水中制成水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成3mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制成产品。
实施例5：把KCl(KCl购自天津市化学试剂三厂)5000mg，溶于1000ml水中制成水溶液，加热溶解，混合均匀后，分装成10mg/2ml/支浓度的注射液于药瓶密封，消毒制成产品。
实施例6：取100克KCl(KCl购自天津市化学试剂三厂)、560克微晶纤维素、380克无水乳糖、200克硬脂酸镁、30克氧化硅，按公知的制片技术和装备制成片剂，即取上述配方中除硬脂酸镁外所有成分混合25-30分钟，再筛入硬脂酸镁，继续混匀，尔后用12/32英寸(约1.03cm)标准凹冲压成片。
下面用本发明的试验例来证明本发明的药理效果。
下列试验所采用的材料和条件如下：
1、细胞
PC12细胞：大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，购自中国科学院昆明动物所。
2、药品及主要试剂
KCl购自天津市化学试剂三厂；MPP+购自美国sigma公司；一抗Anti-mouse Trx，由日本京都大学淀井溶司教授提供；一抗Anti-mouse β-actin购自santa；Protein Marker购自Fermentas公司；RPMI Medium 1640购自Invitrogen corporation；蛋白质定量试剂盒(BCA法)购自Bio-Rad公司；Chemiluminesent substrate购自生物晶美公司；PVDF膜购自Millipore公司；TRISBase购自NOVON公司；Acrylamide购自Solarbio公司；十二烷基硫酸钠购自xiamensanland chemicals company limited；琼脂糖、考马斯亮蓝R-250、Aprotimin、PMSF和NP-40，均购自Sanland-chem International InC；TEMED购自HUALVYUANBIOTECHNOLOGY；X射线胶片购自中国乐凯胶片集团公司；二抗affinity purifiedantibody peroxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L)HSA liquid conjugate和affinity purified antibody peroxidase labled goat anti-rabbit lgG(H+L)HSA liquid conjugate，购自美国Kirkegaard & laboratories；四噻唑蓝(MTT)购自美国Promega公司。
3、主要实验仪器
BHC-1300II A/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司生产；TS100生物倒置相差显微镜，日本NIKON公司生产；CO2培养箱，美国NBS公司生产；TS-1脱色摇床，金纭市杰瑞尔电器有限公司生产；电子分析天枰，北京塞多利斯仪器系统有限公司生产；旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；BYY-6C双稳定时电泳仪，北京六一仪器有限公司生产；酶标仪，美国MD公司生产；J-25离心机，美国贝克曼公司生产；XJX-IIX射线摄影暗匣，上海跃进医用光学器械厂生产；血球计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公司；96孔板细胞培养板，Biousing Biotechnology有限公司生产。
试验例1：
四噻唑蓝(MTT)法测定PC12细胞的存活率：
(一)PC12细胞株的培养
PC12细胞用含10％马血清，5％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度下进行贴壁培养。每2-3天更换培养液一次，细胞达约70％～80％融合时，传代或用于实验。
(二)PC12细胞的排板
用0.25％的胰酶将贴壁的PC12细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为1×104cell/孔，在含有10％马血清，5％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中培养。
(三)梯度浓度KCl刺激
细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养液，对照组不加KCl，实验组分别用20、40、80mM的浓度KCl刺激。各组设5个平行实验。
(四)四噻唑蓝(MTT)实验
取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl，继续孵育4小时后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，小心混匀，用酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。
(五)细胞的存活率计算
存活率％＝加药组A值/对照组A值×100％
试验例2：
KCl诱导PC12细胞中Trx蛋白表达升高：
(一)细胞株培养和KCl刺激处理
PC12细胞用含10％马血清，5％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度下进行贴壁培养。每2-3天更换培养液一次，细胞达约70％～80％融合时，传代或用于实验。
将细胞接种于平板中，培养过夜后，KCl处理细胞。分组处理如下：对照组不加药，实验组分别加20、40、80mM地KCl。上述处理后，置于37℃和5％CO2培养箱中培养24小时，然后收集细胞，以提取蛋白：1500rpm离心5min收获细胞，分别加入100μl细胞裂解液(150mM NaCl，0.5％NP-40，10mM Tris-HCl，pH 7.2，0.1mM PMSF，2μg/ml aprotinin，200μg/ml NaN3)，充分混悬后于冰浴下放置裂解50min(中间振荡5～6次)，4℃下15000rpm离心15min，转上清至新离心管中，-80℃保存。
(二)免疫印迹
1.蛋白含量的测定
用BCA试剂盒测定：将10μl标准品或待测样本与200μlWR工作溶液混合，37℃孵育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓度。
2.蛋白免疫印迹(Western Blot)
总蛋白加样量为6μg，与2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，95℃热变性5min，用15％的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜；取出PVDF膜，用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗后，加入1000倍稀释的一抗室温孵育75min；用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗，加入5000倍稀释的二抗室温孵育75min；用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发光底物溶液中反应1min，X射线胶片曝光。
试验例3：
四噻唑蓝(MTT)法测定KCl对MPP+刺激的PC12细胞的保护作用：
(一)PC12细胞株的培养
PC12细胞用含10％马血清，5％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度下进行贴壁培养。每2-3天更换培养基一次，细胞达约70％～80％融合时，传代或用于实验。
(二)PC12细胞的排板
用0.25％的胰酶将贴壁的PC12细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为1×104cell/孔，在含有10％马血清，5％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度下进行贴壁培养。
(三)梯度浓度KCl刺激
细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养基，对照组不加KCl，实验组分别用40mM的浓度KCl，0.3mM浓度MPP+，30mM的浓度KCl加上0.3mM浓度MPP+分别刺激刺激。各组设5个平行实验。
(四)四噻唑蓝(MTT)试验
取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl，继续孵育4小时后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，小心混匀，用酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。
(五)细胞的存活率计算
存活率％＝加药组A值/对照组A值×100％
试验例4：
Western Blot检测KCl对MPP+刺激的PC12细胞Trx蛋白表达的影响：
(一)PC12细胞株的培养
PC12细胞用含10％马血清，5％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度下进行贴壁培养。每2-3天更换培养基一次，细胞达约70％～80％融合时，传代或用于实验。
(二)PC12细胞的排板
用0.25％的胰酶将贴壁的Hela细胞消化起来，1500rpm离心5min，除去胰酶。将细胞均匀的排在96孔板中，排板密度为1×104cell/孔，在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，于37℃、5％CO2和95％湿度下进行贴壁培养。
(三)梯度浓度KCl刺激
细胞培养过夜，换新鲜RPMI1640培养基，对照组不加KCl，实验组分别用实验组分别用40mM的浓度KCl，0.3mM浓度MPP+，40mM浓度KCl加上0.3mM浓度MPP+刺激。各组设三个以上平行实验。
(四)四噻唑蓝(MTT)试验
取出待测的96孔细胞培养板，每孔加MTT溶液(5mg/ml)10μl，继续孵育4小时后，3000rpm室温下离心15min，小心去掉上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，小心混匀，用酶标仪在波长570nm处测定吸光度值。
(五)细胞的存活率计算
存活率％＝加药组A值/对照组A值×100％
(二)免疫印迹
1.蛋白含量的测定
用BCA试剂盒测定：将10μl标准品或待测样本与200μlWR工作溶液混合，37℃孵育30min，将反应管温度冷却至室温。测定562nm光密度值，绘制标准曲线，并计算蛋白浓度。
2.蛋白免疫印迹(Western Blot)
总蛋白加样量为6μg，与2×SDS凝胶加样缓冲液混合后，95℃热变性5min，用15％的SDS-PAGE胶电泳分离后，将蛋白条带用电转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶4℃封闭过夜；取出PVDF膜，用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗后，加入1000倍稀释的一抗室温孵育75min；用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗，加入5000倍稀释的二抗室温孵育75min；用含0.1％Tween-20的TPBS冲洗，将PVDF膜浸入发光底物溶液中反应1min，X射线胶片曝光。
与对照组相比，在最适剂量时KCl能增加PC12细胞生长繁殖并且诱导了Trx蛋白表达水平，KCl还可以保护PC12细胞免于帕金森毒性物MPP+损伤。由于Trx具有抗凋亡，保护细胞的作用，因此，KCl通过诱导Trx的表达来促进神经细胞的生长和保护神经细胞。本发明通过上述试验证明了KCl能促进PC12细胞的生长和保护PC12细胞免于帕金森病毒性物损伤。
本发明的试验例旨在证实KCl保护神经细胞免于MPP+的损伤。
很多研究中，把细胞外高钾(高浓度KCl，20-200mM)刺激作为组织缺血导致细胞内游离钙离子升高的模型。KCl具有促使细胞膜去极化而导致细胞内游离Ga2+离子升高的作用，而钙离子作为第二信使，参与调控很多与促进细胞增殖，细胞分化相关的信号通路。不同程度细胞内游离钙离子的浓度，本身对细胞内各种生理反应起到不同程度的信号调节作用，甚至起到相反的作用，这些都提示我们KCl的浓度不同所产生的作用亦不同。本发明中也探讨了不同浓度的KCl的不同作用。MPP+具有抑制PC12细胞的生长增殖并诱导PC12细胞的凋亡的作用。PC12细胞中加入KCl，结果表明：20-40mM的KCl能促进PC12细胞的生长(图1)，诱导PC12细胞中Trx的蛋白表达(图2)，而且，用20-40mM的KCl预刺激PC12细胞时，明显保护细胞免受由MPP+所致细胞损伤作用(图3)，并且加入KCl的能使MPP+所致的Trx的蛋白表达有所回升(图4)。这些结果都说明适当浓度的KCl可用于促进神经细胞生长或者增殖，保护神经细胞免于帕金森病毒性物的损伤。
由于KCl能促进PC12细胞的生长，保护神经细胞免于帕金森病毒性物的损伤是本发明首次发现的。因此，以适当浓度的KCl作为促进神经细胞生长和保护神经细胞免于帕金森病毒性物损伤就成为必然。