用于治疗过敏性眼 / 鼻疾病的姜黄色素及其代谢物 技术领域 本发明涉及一种眼 / 鼻治疗液组合物， 其含有天然的姜黄色素或其代谢物， 如姜 黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧基姜黄素及合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其它去甲基 姜黄色素， 它们单独存在或选择性地与合适的表面活性剂和 / 或作为透皮促进剂的共溶剂 以及其它眼 / 鼻赋形剂混合， 用于防止或治疗过敏性疾病， 如过敏性结膜炎、 过敏性鼻炎以 及人和动物的其它相关疾病。
背景技术
眼睛是身体中一个复杂而敏感的器官， 它会产生多种疾病。眼睛会形成各种屏障 来保护其组织不受破坏。即眼睛的前部对疾病很敏感。首要及最重要的屏障是结膜， 它是 眼球周围的黏液薄膜。
这些症状的特征通常是眼睛发红、 发痒且红肿， 半伴有眼泪。 这在很大程度上归因 于肥大细胞脱颗粒， 由于交联后的 IgE 过敏原致敏， 导致组胺结膜突出。肥大细胞中的结膜 很多， 实验发现组胺过量引起的过敏原致敏会导致眼睛瘙痒及发红。目前的治疗方法包括 抗组胺滴液 ( 富马酸依美斯汀和左卡巴斯汀 )， 外用肥大细胞稳定剂 ( 奥洛他定， 酮替芬 )， 减充血剂和外用消炎药物 ( 类固醇消炎药的和皮质类固醇激素 )。
过敏性鼻炎是一种鼻腔炎症， 通常与水样鼻涕和鼻眼发痒有关。症状发生在鼻子 和眼睛中， 通常是在接触到灰尘、 毛屑或某些季节性花粉后产生。 患者的日常活动会受到严 格的限制， 从而使他们长时间的远离学校或工作。每年在治疗这种慢性疾病的过程中需要 花费百万美元来支付医生的服务和治疗费用。 大量常年和季节性过敏原引起的过敏性鼻炎 会加重形成常年性变应性鼻炎 (PAR)， 并且后续会形成季节性过敏性结膜炎 (SAR)。
尘螨、 蟑螂、 霉菌及动物皮屑是每年过敏原的范例。
典型症状包括反复打喷嚏、 流鼻涕 ( 流涕 )、 鼻后滴流、 鼻塞、 眼耳鼻喉搔痒 ( 痒 ) ； 以及普遍的疲劳。症状也包括气喘、 眼睛流泪， 咽痛及嗅觉受损。鼻后滴流之后会引起一种 慢性咳嗽， 但不应误认为是哮喘。窦性头痛和耳朵堵塞也是常见的。
用于过敏性结膜炎的抗组胺剂和减充血剂
抗组胺剂可以用于治疗过敏性结膜炎， 市售的有片剂、 胶囊和液体， 并混有或未混 有减充血剂。常见的抗组胺剂包括溴苯那敏或扑尔敏及氯马斯汀。非镇静作用 ( 不太可能 引起嗜睡 ) 长效抗组胺剂包括氯雷他定和非索非那定。单独口服减充血剂可能会有所帮 助， 包括伪麻黄碱。
鼻腔喷雾剂
一种色甘酸钠 (Nasalcrom) 的鼻腔喷雾剂或是一种类固醇鼻腔喷雾剂， 如氟尼 缩 松 (Nasalide)， 丙 酸 倍 氯 米 松 (Beconase， Vancenase)， 曲 安 奈 德 (Nasacort) 和 氟 替 卡松 (Flonase) 可以很好地用于控制流鼻涕， 因此不需要额外的抗组胺剂或减充血剂。 重要的是要记住使用类固醇鼻腔喷雾剂治疗后一至两周内症状无法获得改善。短期内 使用口服皮质类固醇通常会发现在严重鼻部症状时阻碍外用制剂的充分扩散。HealthEncyclopedia-Diseases and Conditions.
但是由于它们会产生不尽如人意的副作用， 因此已经急剧地增加了对非甾体类、 植物为主的消炎和抗过敏剂的需求， 它们会在各种治疗的应用中被潜在地使用。姜黄色素 是一种已经被证实具有消炎和抗过敏特性的化合物。
姜黄色素是天然的多酚类化合物， 它们以三种不同的形式存在于姜黄中 a) 姜黄 素、 b) 双去甲氧基姜黄素和 c) 去甲氧基姜黄素。姜黄素是最主要的姜黄色素， 是异常强效 的抗氧化剂和消炎剂， 它可以防止自由基 ( 氧化应激 ) 和炎症引起的细胞损伤。目前姜黄 素及其类似物 / 衍生物的利用水平可从下述文献中获知。
从隆加姜黄属植物中提炼生产双 -O- 去甲基姜黄素和四氢四羟基 - 姜黄素的工艺 在我们早期的 PCT 申请 WO/2007/043058 中公开。根据该申请公开的内容所述， 与其他姜黄 色素化合物和天然姜黄素混合物比较， 双 -O- 去甲基姜黄素呈现出最强效的抗癌， 抗氧化 和消炎活性。
然而， 现有技术中并没有公开在眼科制剂中单独或组合使用天然姜黄色素， 如姜 黄素， 双去甲基姜黄素， 去甲基姜黄素和合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其他去甲基姜黄 色素。天然姜黄色素， 如姜黄素， 双去甲基姜黄素， 去甲基姜黄素和合成的双 -O- 去甲基姜 黄素和 / 或其他去甲基姜黄素单剂或组合使用时是一种亲脂性药物， 具有低水溶解性， 因 而在相同条件下限制了治疗效果。 所有的姜黄色素， 包括天然的和合成的均具有与酮基共轭的双键亲脂结构， 从而 表现出具有一个介电常数， 从而与充满负电性的膜作用时使得其不能透过该生物膜。 因此， 要使这些姜黄素穿过细胞膜， 就必须使这些亲脂性分子胶囊化。 此外， 必须使这些分子晶格 作为单一实体， 以便这些胶囊化的分子可跨膜输送。
抗过敏及消炎药物分为止痛药、 抗组胺剂、 抗微生物剂、 皮质类固醇和非甾体消炎 药 (NSAID)。 这些药物分类可以用来治疗各种眼疾。 长期使用皮质类固醇、 非甾体消炎药和 上述其它种类药物会引起青光眼、 视神经损伤、 视力问题、 白内障或继发性眼部感染。
因此， 本发明的目的是提供一种新的植物药剂混合物， 它将在眼科领域成为治疗 眼鼻疾病 / 障碍的潜在继任者。令人震惊的是， 在初步实验中已经证实了使用表面活性剂 和共溶剂后溶解的姜黄色素能达到 200mg w/v， 从而有效地地增加了液体介质中的溶解性。 现有的方法包括在姜黄色素上使用表面活性剂和共溶剂涂层， 以增强的姜黄色素的水溶 性， 使其能渗透并穿过细胞膜。
因此， 本发明提供了至今尚未利用的眼科混合物， 其包括单独或组合的天然姜黄 色素， 如姜黄素， 双去甲基姜黄素， 去甲基姜黄素和合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其他 去甲基姜黄素， 它们与表面活性剂和 / 或共溶剂混合， 形成用于治疗眼部疾病或障碍且剂 型为凝胶 / 悬浮液 / 软膏型的液体眼科混合物。
发明概述
本发明的一个重要方面是提供了一种滴眼液成分 ( 外用 )， 其含有天然的姜黄色 素和 / 或及代谢物， 如姜黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧基姜黄素及合成的双 -O- 去甲基 姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄色素， 它们单独存在或选择性地与表面活性剂、 共溶剂以及 合适的眼赋形剂混合， 用于消除眼科炎症， 如过敏性结膜炎。
另一方面， 本发明提供了一种鼻腔喷雾剂， 其含有天然的姜黄色素和 / 或及代谢
物， 如姜黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧基姜黄素及合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其 它去甲基姜黄色素， 它们单独存在或选择性地与非离子型表面活性剂、 共溶剂以及合适的 赋形剂混合， 用于消除鼻科炎症， 如过敏性鼻炎。
另一方面， 本发明提供了用于眼睛的合适制剂， 如本文作述， 是一种滴液液或眼凝 胶的制剂， 其含有天然的姜黄色素和 / 或及代谢物， 如姜黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧 基姜黄素及合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄色素， 它们单独存在或选择 性地与表面活性剂和 / 或共溶剂的药用赋形剂以及合适的眼科赋形剂混合。
另一方面， 本发明提供了治疗鼻子的制剂， 如本文所述， 它是一种喷雾剂， 其含有 姜黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧基姜黄素和 / 或合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其它 去甲基姜黄色素， 它们单独存在或与药用赋形剂或合适的鼻科赋形剂混合。
另一方面， 本发明提供了混合物， 其含有一种或多种姜黄衍生混合物， 它们是天然 的或是合成的或是半合成的， 并用于制备本发明所述的混合物。
另一方面还提供了天然的姜黄色素和 / 或及代谢物的给药方法， 所述的天然的姜 黄色素和 / 或及代谢物， 如姜黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧基姜黄素及合成的双 -O- 去 甲基姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄色素， 它们单独存在或选择性地与药用赋形剂或载体或 稀释液混合， 然后使用一个治疗有效量来防止， 延缓病情的发展或减少各种炎症， 如眼睛 / 眼结膜和 / 或鼻道的过敏性疾病的症状。 另一方面本发明公开了使用本发明所述的混合物来预防并治疗动物及人类的眼、 鼻类过敏性疾病。
本发明还有一个方面是公开了治疗或预防动物及人类的眼、 鼻科过敏性疾病的方 法， 所述的方法包括使用本发明所述混合物的有效治疗量来给药。
附图说明 图I： 图 I 比较了纳米乳化的姜黄素与普通姜黄素的胞内运动， 图中显示了纳米乳 化的姜黄色素和未纳米乳化的姜黄色素分别在 5 分钟、 10 分钟和 25 分钟时的共焦照片。
图 II ： 图 II 比较了纳米乳化的姜黄素与普通姜黄素的肠道吸收， 图中显示了纳米 乳化的姜黄色素和未纳米乳化的姜黄色素分别在两组不同动物内间隔 1 小时的共焦照片。
图 III ： 图 III 显示了使用马尔文粒度分析仪进行的颗粒大小的研究。
图 IV ： 图 IV 显示了 TEM 显微照片 ： TEM 下的纳米乳化的显微照片。
图V： 图 V 显示了 SEM 显微照片 ： SEM 下的纳米乳化的显微照片。
图 VI ： 图 VI 显示了 FRAP 分析 - 姜黄素的总抗氧活性。
图 VII ： 图 VII 所示的线性图显示了 PMA- 诱导的 U937 人类单核细胞经所示的不 同浓度的姜黄素 ( 制剂或非制剂 ) 处理后所产生的 β- 氨基己糖苷酶抑制。未经处理的对 照细胞所产生的 β- 氨基己糖苷酶是 100％。结果显示了四种培养方式的平均值。
图 VIII ： 图 VIII 所示的线性图显示了 PMA- 诱导的 U937 人类单核细胞经所示的 不同浓度的制剂或非制剂化的姜黄素处理后所产生的组胺抑制。
发明详述
下面将结合特定的优选实施例来详细说明本发明， 因此可以更加充分地了解和认 识本发明的各个方面。
本文中， 术语 “姜黄色素” 或 “姜黄色素类” 指一种或多种姜黄科学衍生成分， 包括 天然的姜黄色素， 如姜黄素， 二去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素和 / 或合成的双 -O- 去甲 基姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄素， 它们单独存在或选择性地与一种或多种药用赋形剂混 合， 并根据需要用于人类和动物的各种炎症及过敏性疾病。
本文中， 术语 “表面活性剂” 或 “表面活性剂类” 指作用时能降低水的表面张力， 使 亲脂化合物溶解的表面活性试剂。
所述的天然表面活性剂是双亲性的， 即它们含有一个疏水尾和一个亲水头。因此 可以在疏水介质和水中均能溶解。所述的表面活性剂有两种 ： a) 离子的 ( 阴离子和阳离 子 )， b) 非离子的。本发明涉及的阴离子、 阳离子和非离子表面活性剂是在药物方面的使 用。本发明中使用的这些表面活性剂非限制性地选自吐温 80 和 20， 聚羟亚烃， 聚乙二醇酯 和其它任意适用于制备本发明所述混合物的药用表面活性剂。
因此， 在一个实施例中， 本发明提供了一种滴眼液 ( 外用 ) 或眼凝胶制剂， 其含有 一种或多种姜黄衍生制剂及其代谢物， 优选天然姜黄色素， 如姜黄素， 二去甲氧基姜黄素和 去甲氧基姜黄素和 / 或合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄素， 它们单独存 在或选择性地与药用活性剂、 共溶剂或合适的眼科赋形剂混合。 在另一个实施例中， 本发明提供了一种鼻腔喷雾剂， 其含有一种或多种姜黄衍生 制剂及其代谢物， 优选天然姜黄色素， 如姜黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧基姜黄素及合 成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄色素， 它们单独存在或与合适的赋形剂混 合。
在另一个实施例中， 本发明提供了一种滴眼液 ( 外用 ) 或眼凝胶制剂， 其含有一种 有效量的天然 / 合成姜黄色素以及一种一定量的药用表面活性剂， 一种共溶剂或合适的眼 科赋形剂， 当向眼睛给药时它们能有效地增加亲脂性姜黄色素的生物利用率， 或是使用一 种含有天然 / 合成姜黄色素有效量的软膏向眼睛进行外用给药时能有效地治疗各种炎症 以及眼睛、 鼻子的过敏性疾病。
本发明还提供了一种滴眼液， 其含有一种眼药 ( 外用 ) 混合物， 该混合物含有一种 有效量的天然 / 合成姜黄色素和一种药用表面活性剂， 及一种能有效地提高天然活性剂溶 解性的治疗有效量的共溶剂， 或是用于制备所述混合物的合成成分。本发明所述的混合物 不会产生任何副作用， 并且向眼睛给药时能有效地延长活性试剂的治疗有效性。
本发明还提供了一种盛有鼻腔喷雾剂混合物的鼻腔喷雾剂容器， 鼻腔喷雾剂混合 物由一种或多种有效量的天然 / 合成姜黄色素和一定量的药用试剂， 如非离子型表面活性 剂和一种能有效地提高那些用于制备所述混合物的天然活性或合成成分溶液性的共溶剂 或合适的鼻科赋形剂组成。
本发明提供的药用药物是由一种或多种天然或合成或半合成的姜黄成分衍生而 来的。 姜黄或姜黄根是一种在印度被广泛使用的香料和着色剂， 其来源丰富， 具有潜在的消 炎， 抗氧化和抗过敏活性， 同时不会产生副作用。
据报道， 姜黄素具有抗过敏特性， 能有效抑制肥大细胞释放组胺。 姜黄素在过敏及 哮喘方面的有效性已经使用过小鼠的过敏模型进行了研究。 结果显示在用姜黄素处理过的 动物上， 其过敏应答的标记抑制证实姜黄素在降低过敏应答中具有重要作用。在将姜黄素 用于控制人体过敏和哮喘前， 这些发现还需要进行进一步的评估， 推算和证实。Kurup et
al.， ” Immunomodulatory effects of curcumin in allergy” Mol Nutr Food Res.2008 Sep ； 52(9) ： 1031-9
姜黄素这种良好的预防或推定的治疗特性也被认为是与其抗氧化和消炎特性有 关。因为自由基介导的细胞膜脂质过氧化及 DNA、 蛋白质的氧化损伤被认为是与各种慢 性病理并发症， 如癌症， 动脉粥样硬化和神经退行性疾病相关的。姜黄素被认为在控制这 些病理症状里具有重要作用。姜黄素的这种消炎效果很有可能是通过其够抑制环氧合 酶 -2(COX-2)， 脂氧合酶 (LOX) 和可诱导的一氧化氮合酶来调节的。 COX-2、 LOX 和 iNOS 在调 节炎症过程中是非常重要的酶。 COX-2 和 / 或 iNOS 的不当上调与人体癌症和炎症紊乱的某 些类型的病理生理学学。由于炎症与肿瘤促进密切相关， 姜黄素潜在的消炎特性被预计能 对癌变具有预防作用。因此， 过去几十年已经进行了对姜黄素抗氧化和消炎特性的多项研 究。 在结论中， 姜黄素的抗氧化和消炎特性， 作用方式及其治疗不同病理学疾病时的用法都 已经清楚地说明了。 Menon VP et al.， Antioxidant and anti-inflammatory properties of curcumin Adv Exp Med Biol.2007 ； 595 ： 105-25
姜黄素 ( 姜黄素 )， 这种来自姜黄根茎的天然产物， 其平喘特性已经在一个呼吸道 高反应的豚鼠模型中进行测试了。所述的豚鼠对卵清蛋白 (OVA) 敏感， 并形成一些哮喘的 特征 ： 过敏原诱导的呼吸道收缩， 呼吸道对组胺的高反应。豚鼠在敏感态 ( 检查其预防效 果 ) 或发展到具有呼吸道损伤特性之后 ( 检查其治疗效果 ) 使用姜黄素进行处理。呼吸 道收缩及呼吸道高反应状态是通过使用一种非侵入性技术， 恒容的身体体积描记法来测量 具体的呼吸道电导 (SGaw) 来确定的。姜黄素 (20mg/kg 体重 ) 疗法显著地抑制了 OVA 诱 导的呼吸道收缩 (p ＜ 0.0399) 和呼吸道高反应 (p ＜ 0.0043)。这些结果证实姜黄素能 在 OVA 敏感的豚鼠体内有效地改善受损的呼吸道的性能。Arjun Ram et al.， Curcumin Attenuates Allergen-Induced Airway Hyperresponsiveness in Sensitized Guinea Pigs， Biological & Pharmaceutical Bulletin Vol.26(2003)， No.71021
因此本发明引用上述参考文献以及许多其它文献是为了下述试验中的研究并检 测姜黄素在治疗或预防各种眼睛和鼻子炎症， 如过敏性结膜炎 / 过敏性鼻炎的效果， 其中 由于组胺的释放， 因此过敏性结膜炎的主要症状是眼睛瘙痒、 发红并浮肿。
因此， 本发明提供了以合适剂型存在的眼药混合物 / 制剂， 优选为滴眼液或眼凝 胶， 其中所述的制剂可以包括一种或多种姜黄衍生成分， 如天然获得或合成或半合成的姜 黄色素。
在一个优选的实施例中， 所使用的活性剂非限制性地含有单独或组合形式存在 的天然姜黄素混合物， 如姜黄素， 二去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素， 和 / 或合成的 双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄素成分， 它们单独或混合存在， 并具有抗氧化或 消炎活性。本发明的混合物中， 所有姜黄色素的浓度为 0.01％ -5.0％ ( 重量 / 体积 )， 优选 0.05％ -2.5％， 而一个有效浓度为 0.06％。所述的姜黄素成分均是由一种或多种姜黄属， 包括姜黄、 郁金、 莪术衍生而来。
如本发明所述的药物和表面活性剂均能和可接受的载体混合来形成一种稳定的 眼药配制剂， 它能提高生物利用度和稳定性。 这些载体包括药用赋形剂和添加剂， 它们非限 制性地选自水溶性聚合物、 螯合剂、 稳定剂、 等渗剂、 缓冲物质、 防腐剂、 增稠剂、 络合剂、 电 解质和其他赋形剂。所述的水溶性聚合物非限制性地选自甲基纤维素、 羟乙基纤维素、 羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 羟丙基乙基纤维素、 羧甲基纤维素钠、 聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙 二醇、 聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 )、 聚卡波非、 明胶、 藻朊酸纤维、 聚 ( 丙烯酸 )、 聚环氧乙烷和壳 聚糖或它们的一种衍生物。
所述的表面活性剂可以是阴离子、 阳离子或非离子型的， 其非限制性地选自聚山 梨酯 80 和 20， 聚乙二醇酯， 聚乙二醇， 甘油醚或它们的混合物。
所述的共溶剂非限制性地选自一羟醇或多羟醇， 如聚乙烯乙二醇， 聚丙二醇等。
所述的混合物还含有一种螯合剂， 如 EDTA 的钠盐。
所述的混合物可以含有适宜的溶解了聚合物的水溶液， 本发明使用的聚合物非限 制性地包括甲基纤维素， 羟乙基纤维素， 羟丙基纤维素， 羟丙基甲基纤维素， 羟丙基乙基纤 维素， 羧甲基纤维素钠， 聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮， 聚乙二醇， 聚 ( 甲基丙烯酸甲酯 )， 聚卡 波非， 明胶， 藻朊酸纤维， 聚 ( 丙烯酸 )， 聚环氧乙烷和壳聚糖或它们的一种衍生物。
本发明混合物中的稳定剂非限制性地包括亚硫酸氢钠， 甘油， 柠檬酸钠， 对羟基丁 酯， 苯扎氯铵， 依地酸或其药学上可接受的盐， 维生素 E 或其衍生物， 依地酸二钠。
本发明混合物中的等渗剂非限制性地包括氯化钠， 氯化钾， D- 甘露醇， 葡萄糖， 甘 油， 木糖醇和丙烯中的任意一种。 所述的增稠剂非限制性地包括甲基纤维素， 乙基纤维素， 羟丙基甲基纤维素， 聚乙 烯吡咯烷酮， 聚乙烯醇， 硫酸软骨素钠， 透明质酸钠和壳聚糖。
所述的防腐剂非限制性地包括亚硫酸氢钠， 硫酸氢钠， 硫代硫酸钠， 苯扎氯铵， 氯 代丁醇， 硫柳汞， 苯基醋酸， 苯基硝酸盐， 对羟基苯甲酸甲酯， 聚乙烯醇和苯乙醇。
所述的缓冲剂非限制性地包括碳酸钠， 四硼酸钠， 磷酸钠， 醋酸钠， 碳酸氢钠。
如氯化钠和氯化钾等电解质也可以含在所述的制剂中。
本发明的眼科 / 鼻腔内的水合药物制剂可以置于适当的容器中使药物更好地释 放。
本发明所述的眼科水合药物制剂的剂型非限制性地包括一种滴眼液， 或者制备为 眼凝胶。例如， 本发明所述的眼科水合药物悬浮制剂可以广泛地用于治疗所有前后相关的 症状或眼睛疾病。
本发明所述的鼻内水合药物制剂的剂型非限制性地包括鼻腔喷雾剂， 也可以制为 鼻滴液。
此外， 本发明所述的眼科 / 鼻科水合溶液制剂包括一种非甾类药物。因此即使持 续长时间的给药它也不会产生任何副作用， 仅有很低的可能性会损坏角膜 / 鼻黏膜上皮细 胞或结膜细胞。 。
有效的姜黄色素， 如姜黄素、 二去甲氧基姜黄素能够抑制水肿、 纤维蛋白沉积、 毛 细血管渗漏和吞噬细胞迁移等炎症响应的所有关键特征， 从而抑制炎症。这些姜黄色素能 防止前列腺素的释放， 其中一些已被确定为会调解黄斑囊样水肿。 此外， 包括二去甲氧基姜 黄素在内的姜黄色素已经显示出能够抑制血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达， 其为一种细 胞活素， 能够潜在地促进血管通透性。
为了进一步地证实对姜黄色素抗过敏活性的假设， 进行了一些体外和体内的研 究。 豚鼠回肠研究将是一个理想的体外实验， 用所述的制剂治疗过敏性敏感的豚鼠回肠， 然
后评估其效果。使用同样的方法， 先使动物对组胺敏感， 然后用所述的制剂治疗， 最后评估 其效果， 从而完成对所述制剂在动物体内的测试。
用传统的给药方式来使用姜黄色素会限制其在治疗包括黄斑水肿在内的眼部疾 病的效果， 这主要是由于无法为后部提供并维持足够的药物量而不产生毒性。 例如， 在使用 滴眼液进行普通的典型给药后， 仅有 1％会达到前部， 而仅有一点的量会达到后部。虽然可 以对玻璃体注射药物， 但是暴露出药物的风险是非常短的药物半衰期， 约为 3 小时。
在我们可行的印度专利申请 PCT/IN2009/000651 中， 公开了可以在声纳能的辅助 下， 利用表面活性剂和共溶剂来溶解天然或合成的姜黄素及其它姜黄色素。
还发现与普通的姜黄素相比， 纳米乳化的姜黄素能有效地进入细胞。纳米乳化的 姜黄素会增加药代动力学和药效学特性， 因此具有更好的治疗效果。这种处理能提高姜黄 素的摄入量， 因此具有一个潜在的疗效。 纳米乳化处理会提高姜黄素的抗过敏活性， 因此与 其它公知的治疗试剂相比， 可以提高所述制剂的有效性。
本 发 明 中， 姜 黄 素 的 纳 米 颗 粒 的 大 小 为 10-20nm。 但 是， 纳米液滴的大小为 5-500nm， 优选 5-100nm， 更优选 5-30nm。在纳米乳化中使用透射电子显微镜 (TEM) 和扫描 电子显微镜 (SEM) 进行研究， 以证实纳米颗粒的形状和大小。 本发明中一种典型的滴眼液 / 鼻腔喷雾剂制剂包括一种或多种姜黄衍生组成， 其 选自一种天然固体姜黄色素的药物悬浮液， 所述的天然固体姜黄色素如姜黄素、 二去甲氧 基姜黄素、 去甲氧基姜黄素及合成的双 -O- 去甲基姜黄素和 / 或其它去甲基姜黄色素等具 有抗氧化或消炎活性的物质选择性地与药用赋形剂混合， 所述的药用赋形剂非限制性地选 自非离子表面活性剂， 优选环糊精包合物、 如羟丙基甲基纤维素和其他纤维素衍生物的水 溶性聚合物、 螯合剂、 金属离子 ( 如镁离子 ) 和 / 或如醋酸钠和柠檬酸钠的有机盐类， 这些 添加剂可以在其中用于稳定系统， 提高粘膜粘着性能。
在另一个优选的实施例中， 按本发明所述的使用本发明所述的混合物来预防并治 疗动物及人体内的眼科和鼻科过敏性症状
使用如本发明所述的混合物可以用于预防并治疗眼部相关的症状， 如过敏性结膜 炎、 过敏性角结膜炎、 春季结膜炎、 巨乳头状结膜炎等症状。
使用如本发明所述的混合物可以用于预防并治疗鼻部相关的症状， 如过敏性鼻 炎。本发明还公开了使用如本发明所述的混合物可以用于预防并治疗哮喘。
在另一个实施例中公开了天然姜黄色素及 / 或其代谢物的给药方法， 所述的天 然姜黄色素及 / 或其代谢物如姜黄素、 二去甲氧基姜黄素、 去甲氧基姜黄素和 / 或合成的 双 -O- 去甲基姜黄素及其它去甲基姜黄色素， 它们单独存在或选择性地与一种药用赋形剂 或载体或稀释液混合， 然后使用一个治疗有效量来防止， 延缓病情的发展或减少各种炎症， 如眼睛 / 眼结膜和 / 或鼻道的过敏性疾病的症状。
在另一个实施例中， 本发明公开了减少或预防或延缓如过敏性结膜炎， 过敏性角 结膜炎， 春季结膜炎， 巨乳头状结膜炎等眼部相关症状的方法， 其包括用本发明所述的混合 物的一个有效量向一个患有所述症状的目标给药。
在另一个实施例中， 本发明公开了一种治疗并预防哮喘的方法， 其包括用本发明 所述的混合物的一个有效量向一个患有哮喘的目标给药。
在另一个实施例中， 本发明公开了一种治疗并预防如过敏性鼻炎等鼻科症状的方
法， 其包括用本发明所述的混合物的一个有效量向一个患有所述症状的目标给药。
上述方法中所述的目标是指动物或人体。
对本发明所涉及的一些优选实施例进行描述， 其他实施例参照本文献的说明书中 的技术改变是显而易见的。 本发明通过接下来的例子在细节上的描述更进一步明确本发明 的制备和使用方法。应理解为本文献中的这些技术包括原料和方法有很多的变化， 也没有 超出本发明的范围。 具体实施方式 ：
实施例 1 ：
制剂 -1 的制备
表 -1
序号 1 2 4 6 7 8 9 10 11 12
序号 1 组分 天然 / 合成的姜黄色素 浓度 20-2500mg 组分 天然 / 合成的姜黄色素 聚乙二醇 吐温 80 羟丙基甲基纤维素 苯扎氯铵 乙二胺四乙酸 ( 钠盐 ) 四硼酸钠 (0.1M) 硼酸 (1M) NaCl 灭菌的注射用水 浓度 20-2500mg 0.7g-1g 0.7g-1g 0.1g 20mg 100mg 3.81g 6.8g 0.795g 100ml实施例 2 ： 制剂 -2 的制备 表 -212102361552 A CN 102361569 2 4 6 7 8 9 10 11 12
序号 1 2 4 6 7 8 9 10 11 12
组分说聚乙二醇 吐温 20明书0.7g-1g 0.7g-1g 0.1g 20mg 100mg 3.81g 6.8g 0.795g 100ml9/13 页羟丙基甲基纤维素 苯扎氯铵 乙二胺四乙酸 ( 钠盐 ) 四硼酸钠 (0.1M) 硼酸 (1M) NaCl 灭菌的注射用水实施例 3 ： 制剂 -3 的制备 表 -3浓度 20-2500mg 0.7g-1g 0.7g-1g 0.1g 20mg 100mg 3.81g 6.8g 0.795g 100ml天然 / 合成的姜黄色素 聚乙二醇 辛苯昔醇 羟丙基甲基纤维素 苯扎氯铵 乙二胺四乙酸 ( 钠盐 ) 四硼酸钠 (0.1M) 硼酸 (1M) NaCl 灭菌的注射用水实施例 4 ： 制剂 -4 的制备表 -4
实施例 5 ： 一种 0.06％的典型眼部制剂 表 -5序号 1 2 4 6 7 8 9 10 11 12 组分 姜黄色素 聚乙二醇 吐温 80 羟丙基甲基纤维素 苯扎氯铵 乙二胺四乙酸 ( 钠盐 ) 四硼酸钠 (0.1M) 硼酸 (1M) NaCl 灭菌的注射用水 浓度 60mg 1g 1g 0.1g 20mg 100mg 3.81g 6.8g 0.795g 100ml实施例 6 ： 纳米乳化的姜黄色素与普通姜黄素在细胞内运动的比较
对象 ： 将分别用浓度为 60μg/ml 纳米乳化和普通的姜黄素孵化后的 Caco-2 细胞 进行研究。
实验方法 ： 所述的研究用于评估纳米乳化的姜黄素在细胞内的吸收。细胞在插入
到 100％汇流的侵袭上生长。细胞用 60μg/ml 纳米乳化和普通的姜黄素孵化 5 分钟、 10 分 钟和 20 分钟。最后将插入物用 HBSS 缓冲液冲洗， 并用 3％的多聚甲醛固定。然后将插入物 切割并放到一个载玻片上， 盖上盖玻片。这些载玻片置于 63x 的共聚焦显微镜下观察。该 测试法具体见表 -6， 结果见图 I。
表 -6
实施例 7 ： 使用单独的回肠模型来比较纳米乳化的姜黄素与普通姜黄素在小鼠肠 道细胞中吸收
在冷冻切片小鼠小肠组织样本中进行共聚焦显微镜研究， 利用单独的回肠模型以 确定姜黄素的细胞内摄取。简而言之， 用甲苯噻嗪 / 氯胺酮麻醉小鼠， 然后解剖。接着露出 肠道， 找出回肠， 冲洗掉回肠内容物后用手术缝合线将回肠的顶部和底部用一个环系住。 每 组中， 使用一个注射器和一个与针状物相连的聚乙烯管将浓度为 300ug/ml 的药物溶液注 入到管腔内， 孵化 60 分钟。60 分钟后， 切除组织， 并立即在液氮中冷冻。然后将组织进行冷 冻切片， 放在一块载玻片上， 盖上盖玻片， 置于 63x 的共聚焦显微镜下观察。结果如图 II 所 示。
组号 ： -2( 纳米乳化的 (NE) ； 普通姜黄素 (NNE))
动物 / 组号 ： -2
实施例 8 ： 使用马尔文粒度分析仪进行的颗粒大小的研究
使用马尔文粒度分析仪分析颗粒大小。 利用激光束的衍射和扩散来测量颗粒大小 ( 粉末， 悬浮液和乳液 )。在进行激光衍射测量时用一束激光束照射颗粒。颗粒散射光的角 度与颗粒大小成反比。使用光敏探测器来测量角强度。角度与散射强度的比值图即得颗粒 大小值。 使用马尔文粒度分析仪测量纳米乳液的液滴大小， 结果为 10.55nm。 粒子马尔文粒 度分析仪获得的颗粒大小分析结果如图 III 所示。
峰值 峰值 -1
颗粒大小 10.55 PDI 0.2387表7实施例 9 ： TEM 表征的纳米乳化液
使用透射电子显微镜 (TEM) 来研究纳米乳化液的形态学和结果。将增加了放大倍 率和衍射模型的明场成像用来揭示纳米乳化液的形态和大小。在进行 TEM 观察前， 纳米乳 化液制剂需要用水稀释 (1/100)。稀释后的纳米乳化液的一个液滴直接沉积在多孔膜电网 上， 待其干燥后进行观察。 纳米乳化液的成像结果清晰地显现出纳米颗粒的形状为球形， 大小为 10-20nm。纳米乳化液的 TEM 成像如 IV 所示。
实施例 10 ： SEM 表征的纳米乳化液
对纳米乳化液进行的 SEM 研究显示这些颗粒是球形的， 其大小为纳米级 ( 图 V)。 颗粒大小为 10-20nm。
实施例 11 ： 对姜黄素进行的 FRAP 分析 ( 总抗氧化活性 )
使用由 Benzie 和 Strain[R] 改进的 FRAP 分析 (TPTZ 分析 ) 来比较维生素 C 和没 食子酸， 从而测量出姜黄素的总抗氧化活性。所分析的混合物含有 2.5mL 300mM 醋酸盐缓 冲液， 溶于 40mM HCl 中的 pH 3.6、 0.25mL 10mM TPTZ 溶液， 0.25mL 20mM FeCl3 和溶于 0.1mL 水或甲醇中的姜黄素。 孵化 30 分钟后， 使用 Cary-50， 紫外可见分光光度计在 593nm 处测定 吸光度。用已知浓度的亚铁盐水 / 甲醇溶液代替 FeCl3 做出标准曲线。所有的测试做三次 平行， 并使用所测量到的值计算 EC1 值。 EC1 被定义为抗氧化剂浓度所具有的亚铁盐减少量 与 1mM 亚铁盐的比值。
结果 ： 天然姜黄素中， 单位为 mcg/ml 的 IC50 值为 6.92( 图 VI)。
实施例 12 ： 抗过敏研究
用于眼部过敏研究的临床前模型是基于让卵清蛋白处理结膜， 形成眼部过敏， 使 动物对过敏原卵清蛋白敏感而进行的。用于这项研究的二十四只动物 (SD 大鼠 ) 分成 10 至 14 周的年龄组， 每组 6 只动物， 共 4 组。组 1 是空白对照 ( 既不诱导也不治疗 )， 组2是 卵清蛋白诱导组， 组 3 是姜黄素滴眼液治疗组， 组 4 是仅用眼科溶液制剂中使用的载体进行 治疗的组。组 2、 组 3 和组 4 中所有的动物都用含有 100μg 卵清蛋白和 20mg 明矾的 1ml 腹 腔悬浮注射液激活 14 天。第 15 天时， 在眼球结膜上使用 1M DL- 二硫苏糖醇 (DTT) 的磷酸 盐缓冲液 (pH-7.4)， 10 分钟后用在磷酸盐缓冲液中制得的 10μl 卵清蛋白 (100mg/ml) 典 型地激发结膜， 形成眼部过敏。在 DTT 和过敏激发前， 轻轻地打开组 3 中小鼠的眼睛， 使之 10 分钟内不眨动， 向其中滴入姜黄素制成的眼溶液， 检测药效。使用相似的方法用所述的 载体治疗组 4 的动物。 ， 然后分别在 0 分、 20 分钟、 45 分钟、 90 分钟和第 4 个小时结束时用 0-4 点结膜计分系统测量结膜充血和水肿状况， 所示的药效与基线相比， 减少了结膜发红和 结膜水肿的状况。
实施例 13 ： 纳米乳化的姜黄素对 β- 氨基己糖苷酶的抑制。
本研究检测出在 U937 人体单核细胞的佛波酯 (PMA) 诱导模型中， 未制剂型和制 剂型姜黄素 ( 纳米乳化的 ) 混合物对 β- 氨基己糖苷酶抑制效果的比较。简而言之， 等量 (50,000 细胞 ) 的 U937 人体单核细胞接种于 96 孔细胞培养板的每个孔中。分别用不同浓 度的非制剂型姜黄素和制剂型姜黄素混合物在 20nM PMA 中或在没有 PMA 时处理这些细胞。 在未做处理的对照或处理后的培养物中收集细胞培养物悬浮液， 并在 10,000g、 4℃下澄清 5 分钟 ； 检测所释放的 β- 氨基己糖苷酶 (6)。
检测 β- 氨基己糖苷酶 ： 37℃下， 用 20μl 1mM p- 硝基苯基 -N- 醋酸基 -β-D- 氨 基葡萄糖苷的 0.1M 柠檬酸钠缓冲液 (pH 4.5) 诱导 20 微升等分的细胞培养悬浮液 1 小时。 诱导结束时， 加入 250μl 0.1M Na2CO3 和 0.1M NaHCO3 缓冲液 (pH 10.0)。405nm 下测量吸 光度。每个处理做四孔平行。对照培养所获得的 OD 值定义为 100％的氨基己糖苷酶释放。
在 PMA 诱导的人体单核细胞中， 姜黄素及其单独进行纳米乳化的制剂对 β- 氨基 己糖苷酶的释放抑制的效果对比如图 VII 所示。实施例 15 ： 纳米乳化的姜黄素对组胺释放的抑制
同量 (50,000 细胞 ) 的 U937 人体单核细胞接种于 96 孔细胞培养板的每个孔中。 用不同浓度的非制剂型姜黄素和制剂型姜黄素 ( 纳米乳腺化的 ) 混合物在 20nMPMA 中处 理这些细胞 1 小时。在未做处理的对照或处理后的培养物中收集细胞培养物悬浮液， 并在 10,000g、 4℃下澄清 5 分钟。用商用 EIA 试剂盒 (SPI-Bio， 法国 ) 检测所释放的组胺。用姜 黄素及其纳米乳化的制剂处理后的 PMA 诱导人体单核细胞产生的培养悬浮液中， 所释放的 组胺浓度如 VIII 所示。
制备所述制剂的方法 ：
制备硼酸盐缓冲液 ：
1) 称取 3.81g 四硼酸钠到一个烧杯中， 加入 100ml 水来溶解。
2) 称取 6.8g 硼酸到一个烧杯中， 加入 100ml 水来溶解。
3) 检查四硼酸钠溶液的 pH 值， 发现其为 9。
另外用硼酸将 pH 值调节为 7.2。
4) 所制得的缓冲液用于调节所述制剂的 pH 值。
姜黄素的溶解 ：
1) 称取 60 毫克姜黄素到 10 毫升的烧杯。
2) 向其中加入 1 克 (765 微升 ) 吐温 80 和 1 克 PEG， 并用玻璃棒搅拌均匀。
3) 然后用超声波振荡 30 分钟或直到姜黄素完全溶解。
形成一种深红色溶液。
眼药制剂的制备 ：
1) 在磁力搅拌器上向烧杯中放入 100 毫升水。
2) 加入 HPMC 并搅拌至 HPMC 完全溶解。
3)15 分钟内将姜黄素 + 吐温 80 溶液滴加到上述溶液中， 边滴加边搅拌。
4) 加入 BAC， EDTA 和氯化钠， 并搅拌至所有物质完全溶解， 并获得澄清的黄色溶 液。
5) 检测溶液的 pH 值， 并发现是在 5.3-5.4 范围内。因此， 用硼酸缓冲液将 pH 值调 节到 6.5。
本领域的普通技术人员可知， 本发明不仅限于如图所示的实施例的内容， 本发明 也可以在权利要求的范围内以各种方式实施， 因此本发明的实施例仅用于举例说明， 而不 是限制本发明的范围， 其上文的内容仅用于说明权利要求， 因此， 在权利要求保护的范围内 进行的所有变化都属于本发明的范围。