新型土壤诊断方法 技术领域 本发明主要涉及一种以土壤细菌数和物质循环活性为指标的新型土壤诊断方法， 以及使用该诊断方法的土壤质量控制方法和土壤改良方法。
背景技术 在各种环境如在土壤中， 微生物在物质的转化和循环中发挥了重要作用。 例如， 在 农业用地中微生物为了转化氮肥以便农作物能吸收， 需要进行 “硝化作用” 。
由于化学合成技术的进步， 战后使用化肥的种植方法得到了广泛开展。 然而， 由于 消费者对安全和安全农产品的需求增加， 或为了可持续的农业生产， 各地区越来越多地转 向有机农业或自然农业。在这些种植方式中， 土壤生态系统的实际使用是很重要的。此外， 农产品利用和吸收土壤中的成分进行生长， 因而对土壤进行适当的评价、 控制和改良有助 于改善盈利能力和生产率。
然而， 迄今已知的土壤评价主要涉及化学种植方法的分析， 因而评价主要基于物 理化学特性如无机离子的浓度和 pH 值， 却没有考虑微生物的活动 ( 见非专利文献 1 和 2)。
因此， 一直无法清楚地确定土壤是否适合使用有机种植方法或自然种植方法栽培 农作物， 或者土壤是否需要改良。
文献列表
[ 非专利文献 ]
[ 非专利文献 1] 日本土壤肥料学会主编， 土壤标准分析和测定方法委员会编 “土 壤标准分析 / 测定方法” ， 博友社， 107 ～ 117， 1986 年。
[ 非专利文献 2] 岩田进午等主编， “土的环境圈” ， 富士 Techno 系统， 223 ～ 228， 1997。
发明概述
本发明的主要目的在于提供一种土壤诊断方法、 土壤质量控制方法和土壤改良方 法， 其考虑土壤微生物所引起的物质循环， 特别是提供用于诊断、 控制和改善适于植物的农 用土地质量的方法。
鉴于上述问题， 本申请的发明人认真研究了反映土壤微生物活性的土壤评价和诊 断方法。 因此， 通过将土壤细菌数和对氮、 磷、 钾的分析相结合， 发明人发现可实现适当的土 壤诊断， 并通过进一步研究最终完成了本发明。
具体地， 本发明涉及下述的土壤诊断方法、 土壤质量控制方法和土壤改良方法。
第1项 ： 用于诊断土壤的土壤诊断方法， 其使用下述 (I) ～ (III) 计算出的循环活 性指标和 (IV) 土壤中土壤细菌数 ：
(I) 目标土壤中氨减少率 ；
(II) 目标土壤中植酸形成磷酸的活性 ； 以及
(III) 目标土壤中堆肥形成钾的活性。
第2项： 根据第 1 项所述的诊断方法， 其中循环活性指标表示 ：
以氨减少率的预设参考值、 植酸形成磷酸的活性的预设参考值和堆肥形成钾的活 性的预设参考值为顶点组成等边三角形，
以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的氨减少率 (I)、 植酸形成磷酸的活性 (II) 和堆肥形成钾的活性 (III) 的测定值为顶点的三角形面积 与上述等边三角形面积之比。
第3项： 一种用于诊断土壤的土壤诊断方法， 其使用至少
A) 使用下述 (A-1) ～ (A-3) 计算出的氮循环活性指标 ：
(A-1) 目标土壤中土壤细菌数 ；
(A-2) 目标土壤中氨减少率 ； 以及
(A-3) 目标土壤中亚硝酸减少率，
B) 使用下述 (B-1) ～ (B-3) 计算出的磷循环活性指标 ：
(B-1) 目标土壤中土壤细菌数 ；
(B-2) 目标土壤中植酸形成磷酸的活性 ； 以及
(B-3) 目标土壤中堆肥形成磷酸的活性， 和
C) 使用下述 (C-1) ～ (C-3) 计算出的钾循环活性指标 ：
(C-1) 目标土壤中土壤细菌数 ；
(C-2) 目标土壤中钾释放率 ； 以及
(C-3) 目标土壤中堆肥形成钾的活性。
第4项： 根据第 3 项所述的诊断方法， 其中氮循环活性指标表示 ：
以土壤细菌数的预设参考值、 氨减少率的预设参考值和亚硝酸减少率的预设参考 值为顶点组成等边三角形，
以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (A-1)、 氨减少率 (A-2) 和亚硝酸减少率 (A-3) 的测定值为顶点的三角形面积与上述等边三 角形面积之比。
第5项： 根据第 3 项或第 4 项所述的诊断方法， 其中， 磷循环活性指标表示 ：
以土壤细菌数的预设参考值、 以植酸形成磷酸的活性的预设参考值和堆肥形成磷 酸的活性的预设参考值为顶点组成等边三角形，
以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (B-1)、 植酸形成磷酸的活性 (B-2) 和从堆肥形成磷酸的活性 (B-3) 的测定值为顶点的三角 形面积与上述等边三角形面积之比。
第6项： 根据第 3 ～ 5 项任一项所述的诊断方法， 其中钾循环活性指标表示 ：
以土壤细菌数的预设参考值、 钾释放率的预设参考值和堆肥形成钾的活性的预设 参考值为顶点组成等边三角形，
以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (C-1)、 钾释放率 (C-2) 和堆肥形成钾的活性 (C-3) 的测定值为顶点的三角形面积与上述等 边三角形面积之比。
第7项： 一种用于控制土壤质量的土壤质量控制方法， 该方法包括 ：
随时间实施第 1 ～ 6 项任一项所述的诊断方法 ； 以及
分析指标随时间的变化。第8项： 一种土壤改良方法， 其包括 ：
实施第 1 ～ 6 项任一项所述的诊断方法 ； 以及
根据诊断结果实施用于改善指标的处理。
接下来， 对本发明进行更详细的描述。
1. 土壤诊断方法
1.1. 土壤诊断方法 (1)
本发明的土壤诊断方法 (1) 的特征在于， 其使用通过下述 (I) ～ (III) 计算出的 循环活性指标和 (IV) 土壤中土壤细菌数对土壤进行诊断 ：
(I) 目标土壤中氨减少率 ；
(II) 目标土壤中植酸形成磷酸的活性 ； 以及
(III) 目标土壤中堆肥形成钾的活性。
(I) 氨减少率
本发明中， 目标土壤中氨减少率表示施用到目标土壤中氨化合物浓度的减少率。
具体地， 当氨化合物施用到目标土壤后， 可通过下式计算出氨减少率的值。 1 2 1
氨减少率 (％ ) ＝ [1-(N -N )/N ]×100 ( 公式中， N1 表示氨化合物施用日的氨态氮的量， N2 表示施用氨化合物一定时期后 的氨态氮的量。)
氨化合物施用日是指将氨化合物施用到目标土壤中那天。 氨化合物施用日的氨态 氮的量可用施用第 0 天的氨态氮的量表示。
此外， 施用氨化合物后一定时期是指将氨化合物施用到目标土壤后一定时期过去 以后那天。例如， 可用施用第 3 天的氨态氮的量表示将氨化合物施用到土壤过去 3 天后的 氨态氮的量。
一定时期的长度可视情况而定， 优选为 3 ～ 7 天， 更优选为施用后 3 天。如果时间 比这短或者比这长很多， 则很难识别出活性的差异。
B) 使用下述 (B-1) ～ (B-3) 计算出的磷循环活性指标 ：
(B-1) 目标土壤中土壤细菌数 ；
(B-2) 目标土壤中植酸形成磷酸的活性 ； 以及
(B-3) 目标土壤中堆肥形成磷酸的活性， 和
C) 使用下述 (C-1) ～ (C-3) 计算出的钾循环活性指标 ：
(C-1) 目标土壤中土壤细菌数 ；
(C-2) 目标土壤中钾释放率 ； 以及
(C-3) 目标土壤中堆肥形成钾的活性。
第4项： 根据第 3 项所述的诊断方法， 其中氮循环活性指标表示 ：
以土壤细菌数的预设参考值、 氨减少率的预设参考值和亚硝酸减少率的预设参考 值为顶点组成等边三角形，
以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (A-1)、 氨减少率 (A-2) 和亚硝酸减少率 (A-3) 的测定值为顶点的三角形面积与上述等边三 角形面积之比。
第5项： 根据第 3 项或第 4 项所述的诊断方法， 其中， 磷循环活性指标表示 ：
以土壤细菌数的预设参考值、 以植酸形成磷酸的活性的预设参考值和堆肥形成磷 酸的活性的预设参考值为顶点组成等边三角形，
以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (B-1)、 植酸形成磷酸的活性 (B-2) 和从堆肥形成磷酸的活性 (B-3) 的测定值为顶点的三角 形面积与上述等边三角形面积之比。
第6项： 根据第 3 ～ 5 项任一项所述的诊断方法， 其中钾循环活性指标表示 ：
以土壤细菌数的预设参考值、 钾释放率的预设参考值和堆肥形成钾的活性的预设 参考值为顶点组成等边三角形，
以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (C-1)、 钾释放率 (C-2) 和堆肥形成钾的活性 (C-3) 的测定值为顶点的三角形面积与上述等 边三角形面积之比。
第7项： 一种用于控制土壤质量的土壤质量控制方法， 该方法包括 ：
随时间实施第 1 ～ 6 项任一项所述的诊断方法 ； 以及
分析指标随时间的变化。第8项： 一种土壤改良方法， 其包括 ：
实施第 1 ～ 6 项任一项所述的诊断方法 ； 以及
根据诊断结果实施用于改善指标的处理。
接下来， 对本发明进行更详细的描述。
1. 土壤诊断方法
1.1. 土壤诊断方法 (1)
本发明的土壤诊断方法 (1) 的特征在于， 其使用通过下述 (I) ～ (III) 计算出的 循环活性指标和 (IV) 土壤中土壤细菌数对土壤进行诊断 ：
(I) 目标土壤中氨减少率 ；
(II) 目标土壤中植酸形成磷酸的活性 ； 以及
(III) 目标土壤中堆肥形成钾的活性。
(I) 氨减少率
本发明中， 目标土壤中氨减少率表示施用到目标土壤中氨化合物浓度的减少率。
具体地， 当氨化合物施用到目标土壤后， 可通过下式计算出氨减少率的值。 1 2 1
氨减少率 (％ ) ＝ [1-(N -N )/N ]×100 ( 公式中， N1 表示氨化合物施用日的氨态氮的量， N2 表示施用氨化合物一定时期后 的氨态氮的量。)
氨化合物施用日是指将氨化合物施用到目标土壤中那天。 氨化合物施用日的氨态 氮的量可用施用第 0 天的氨态氮的量表示。
此外， 施用氨化合物后一定时期是指将氨化合物施用到目标土壤后一定时期过去 以后那天。例如， 可用施用第 3 天的氨态氮的量表示将氨化合物施用到土壤过去 3 天后的 氨态氮的量。
一定时期的长度可视情况而定， 优选为 3 ～ 7 天， 更优选为施用后 3 天。如果时间 比这短或者比这长很多， 则很难识别出活性的差异。
换言之， 可优选使用下式来获得目标土壤中氨减少率的值 ：
[ 式 1]
氨态氮的量是指每单位干重目标土壤的氨态氮 (NH4+) 的量。
可用靛酚法、 氯化钾溶出法、 高效液相色谱等测定氨态氮的量。更具体地， 可应用 本申请实施例的确定氨态氮量的方法测定氨态氮的量。
对施用到目标土壤的氨化合物种类没有特别限定， 氨化合物的实例包括铵盐， 如 硫酸铵、 氯化铵、 硝酸铵、 碳酸铵。这些中， 优选使用普通农用肥料硫酸铵。
此外， 对施用到目标土壤的氨化合物的的量没有特别的限定。考虑到普通田地土 壤中含氮化合物的浓度， 每单位干重目标土壤的氨化合物的量约为 30 ～ 100μg-N/g- 干土 壤， 优选约为 60 ～ 70μg-N/g- 干土壤。
氨减少率反映出氨态氮转化为亚硝态氮的效率。据认为如果减少率较高， 那么目 标土壤中含有许多氨氧化细菌或者目标土壤中含有每单位生物量活性较高的氨氧化细菌。 还认为如果减少率越低， 氨氧化细菌的数量越少。
(II) 由植酸形成磷酸的活性
本发明中， 目标土壤中由植酸形成磷酸的活性表示施用到目标土壤中植酸的转化 活性值。
具体地， 当植酸施用到目标土壤后， 可通过下式计算出目标土壤中植酸形成磷酸 的活性值。
植酸形成磷酸的活性 (％ ) ＝ [(P3-P2)/P1]×100
( 公式中， P1 表示植酸中磷酸的量， P2 表示植酸施用日的水溶性磷酸的量， P3 表示 施用植酸一定时期后的水溶性磷酸的量。)
可通过基于 1mol 植酸含有 6 摩尔磷酸这个事实， 根据植酸的量计算植酸中磷酸的 量。
植酸施用日是指将植酸施用到土壤中那天。 植酸施用日的水溶性磷酸的量可用施 用第 0 天的水溶性磷酸的量表示。 此外， 施用植酸后一定时期是指将植酸施用到土壤后一定时期过去以后的那一 天。例如， 可用施用第 3 天的水溶性磷酸的量表示将植酸施用到土壤过去 3 天后的水溶性 磷酸的量。
一定时期的长度可视情况而定， 优选为 3 ～ 7 天， 更优选为施用后 3 天。如果时间 比这短或者比这长很多， 则很难识别出活性的差异。
换言之， 可优选使用下式来获得目标土壤中植酸形成磷酸的活性值 ：
[ 式 2]
水溶性磷酸的量是指每单位干重目标土壤的水溶性磷酸的量。
可使用钼蓝法、 高效液相色谱等测定水溶性磷酸的量。 更具体地， 可应用本申请实 施例的确定水溶性磷酸的量的方法测定水溶性磷酸的量。
对施用到目标土壤中植酸的量没有特别限定， 每单位干重目标土壤约为 0.5 ～ 5％ (w/w)， 优选为 1 ～ 2％ (w/w)。
植酸形成磷酸的活性反映出植酸转化成水溶性磷酸的效率。据认为如果活性越 高， 那么植物体中所含的磷越有可能被利用。 因而， 认为如果活性较高， 那么土壤质量优良， 因而， 可将外部施用的磷肥的量减少到最小化。
另一方面， 据认为如果活性越低， 那么植物体中所含的磷越不可能被利用。因而， 认为如果活性较低， 那么土壤质量不足， 因而， 需要外部施用堆肥、 磷肥等。
(III) 堆肥形成钾的活性
本发明中， 目标土壤中堆肥形成钾的活性表示施用到目标土壤中堆肥的钾转化为 游离钾的活性值。
堆肥与上述与磷循环指标有关的堆肥相同， 堆肥的实例包括 ： 植物堆肥， 如树皮堆 肥； 牲畜堆肥， 如家禽粪便堆肥， 牛粪堆肥和猪粪堆肥 ； 和海草堆肥。可单独使用这些种类 的堆肥或组合使用两种或多种堆肥。
这些种类的堆肥中， 树皮堆肥含有大量的钾， 因而能够进行更适合的评价。通常， 树皮堆肥中总钾 (K2O) 的含量为 0.1％或以上 ( 干物质 )。
此外， 对施用堆肥的方法没有特别限定。可使用混有栽培土的堆肥。这种情况下， 堆肥的混合率为总栽培土重量的 10 ～ 50％， 优选为约 25 ～ 35％。
当堆肥施用到目标土壤后， 可通过下式计算出目标堆肥土壤中堆肥形成钾的活性 值。
堆肥形成钾的活性 (％ ) ＝ [(K6-K5)/K4]×100
( 公式中， K4 表示堆肥中钾的量， K5 表示堆肥施用日的钾释放量， K6 表示施用堆肥 一定时期后的钾释放量。)
可根据公知的方法测定堆肥中钾的量。 例如， 将醋酸铵水溶液加到堆肥中， 然后过 滤， 将获得的滤液即钾提取液用原子吸收光谱仪进行测定， 从而可获得钾的量。 堆肥施用日是指将堆肥施用到土壤中那天。例如， 堆肥施用日的钾释放量可用施 用第 0 天的钾释放量表示。
此外， 施用堆肥后一定时期是指将堆肥施用到土壤后一定时期过去以后的那天。 例如， 可用施用第 3 天的钾释放量表示将堆肥施用到土壤过去 3 天后的钾释放的量。
一定时期的长度可视情况而定， 优选为 3 ～ 7 天， 更优选为施用后 3 天。如果时间 比这短或者比这长很多， 则很难识别出活性的差异。
换言之， 可优选使用下式来获得目标土壤中堆肥形成钾的活性值 ：
[ 式 3]
钾的释放量可用下述相同的方法进行测定。
堆肥形成钾的活性反映出堆肥中钾转化成游离钾的效率。据认为如果活性越高， 堆肥中的钾越有可能被利用。 因而， 认为如果活性越高， 那么土壤质量优良， 因而， 可将外部 施用的钾的量减少到最小化。
另一方面， 据认为如果活性越低， 那么堆肥中的钾越不可能被利用。因而， 认为如 果活性较低， 那么土壤质量不足， 因而， 需要外部施用钾。
(IV) 土壤细菌数
本发明中， 土壤细菌数表示基于每单位重量取自目标土壤的样品中存在的 DNA 量 所获得的土壤细菌数。
如果单位重量为 1g， 那么， 这个量可用每单位重量目标土壤 ( 或样品 ) 的数目的单
位进行表示 ( 细胞 /g- 土壤或细胞 /g- 样品 )。
本申请的 DNA 量是指每单位重量取自目标土壤的样品中存在的 DNA 量。 更具体地， 这个量是指每单位重量样品中存在的不管何种来源的 DNA 总量。
使用适当的方法， 转化每单位重量取自目标土壤的样品中存在的 DNA 量可获得土 壤细菌数。
例如， 通过使用测定方法如显微镜， 初步获得土壤中土壤细菌数和 DNA 量之间的 相关性， 用相关性匹配样品中的 DNA 量来获得土壤细菌数。
在一个优选实施方案的实施例中， 通过使用下式转化每单位重量取自目标土壤的 样品中存在的 DNA 量获得土壤细菌数。
Y ＝ 1.7×108X(R2 ＝ 0.96)
[Y ； 土壤细菌数 ( 细胞 /g- 土壤 )， X； eDNA 量 (μg/g- 土壤 )]
取自目标土壤的样品表示取自 ( 取样自 ) 上述目标土壤的土壤。对取样的方法没 有特别限定， 可视情况使用任何公知的方法。
取样条件也可视情况进行设定。 然而， 为了适当地判断目标土壤中微生物的状态， 优选地， 取样时避开那些由于下雨等使土壤处于不正常状态的时期。
可通过洗脱取自用于诊断的目标土壤的样品中存在的 DNA 来测定每单位重量取 自目标土壤的样品的 DNA 量。
优选地， 获得样品后立即测定取自目标土壤的样品中的 DNA 量。然而， 获得的样品 可在低温下 ( 如约 -4 ～ -80 度， 更优选为约 -20 ～ -80 度 ) 储存约 1 天～ 3 周。
对洗脱样品中所含所有微生物的 DNA 的方法没有特别限定， 除非该方法引起 DNA 的显著分解或剪切以及引起检测的副作用。
用于洗脱 DNA 的方法的典型实施方案是用 DNA 洗脱液处理样品。
本申请所使用的 DNA 洗脱液的实例是一种通常用于洗脱细菌 DNA 的溶液。
具体地， 作为 DNA 提取液， 优选使用一种含有脱氧核糖核酸抑制剂， 如 EDTA 或 EGTA、 阳离子表面活性剂、 阴离子表面活性剂和 / 或含有上述这些的缓冲液的溶液。可选 地， 缓冲液中可含有蛋白水解酶， 如蛋白酶 K、 嗜热菌蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶等。各个组分 的混合比例可设置在没有显着抑制 DNA 洗脱的适当范围内。
在使用上述 DNA 洗脱液进行 DNA 洗脱中， 对 DNA 的洗脱条件没有特别限定。例如， 通过将上述 DNA 洗脱液以 2 ～ 20ml， 优选以 5 ～ 15ml， 更优选以 8 ～ 12ml 的量加入到 1g 需要进行洗脱处理的土壤中进行 DNA 洗脱。
此外， 依据使用的 DNA 洗脱液或需要进行洗脱处理的土壤类型， 可视情况设定洗 脱温度。
洗脱时间依使用的洗脱液类型、 需要进行洗脱处理的土壤类型、 洗脱温度等的不 同而不同， 不能进行统一规定。然而， 洗脱时间的实例为 0.1 ～ 4 小时， 优选 0.2 ～ 2 小时， 更优选 0.3 ～ 1 小时。
只要按上述方法测定了 DNA 量， 那么就可以获得目标土壤中存在的 DNA 量。
对测定 DNA 量的方法没有特别限定。例如， 洗脱的 DNA 必要时可进行纯化和收集， 然后用公知或常规测定 DNA 量的方法测定 DNA 量。
具体地， 测定 DNA 量的方法的实例为 ： 将纯化后收集的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭进行染色， 再测定凝胶上 DNA 条带的荧光强度。
可选地， 可使用下述方法 ： 将纯化后收集的 DNA 溶于缓冲液中， 测定溶液 260nm 的 吸光度。
对纯化 DNA 的方法没有特别限定， 或者， 可根据普通程序进行 DNA 纯化。纯化 DNA 的方法的实例包括如下步骤 ： 将上述进行过 DNA 洗脱处理的溶液进行离心， 收集上清液 ； 将 能与上清液分层的去杂质溶液， 如氯仿或氯仿 - 异戊醇加入到上述获得的上清液， 再进行 混合 ； 将含有 DNA 的层从混合溶液中抽提出来， 去除杂质 ； 将 DNA 沉淀剂， 如异丙醇、 乙醇或 聚乙二醇加入到前一步骤获得的含有 DNA 的层中， 沉淀并收集 DNA。
DNA 的提取效率取决于目标土壤的类型。因此， 优选初步测定样品的 DNA 提取效 率， 基于提取效率校正每个目标土壤的样品， 从而获得样品中的 DNA 量。
本申请所述的 DNA 的提取效率是指实际从取自目标土壤的样品中洗脱并测定的 DNA 量和样品中所含的 DNA 量的比值。
基于上述测得的 DNA 量， 并根据上述方法， 就可以获得土壤细菌数。
更具体地， 可用本申请实施例中所述的方法获得土壤细菌数。
样品中所有细菌的 DNA 总量反映出目标土壤的总体特性和状态。因此， 基于每单 位重量取自目标土壤的样品中的 DNA 量而获得的土壤细菌数， 可成为知晓土壤特性和土壤 中细菌所表现状态的一个指标。 据认为如果土壤细菌数较多， 那么土壤中的物质如各种有机物、 含氮化合物和含 磷化合物的转化活性高。另一方面， 据认为如果土壤细菌数较少， 那么土壤中含有污染物， 土壤细菌的生长受到抑制， 从而导致物质的转化活性低。如果土壤细菌数低于 2×108 细胞 /g- 土壤， 那么循环活性减低。
(V) 循环活性评价
上述 (I)、 (II)、 (III) 和 (IV) 是土壤中氮、 磷酸和钾循环的重要因素， 综合分析这 些因素是进行适当诊断的关键。
如果土壤细菌数等于或大于 2×108 细胞 /g- 土壤， 并且下述与 (I)、 (II) 和 (III) 有关的条件得到满足， 就可以判断土壤适合植物， 然而， 如果任何一个下述条件不能得到满 足， 就可以判断土壤不适合植物。
(I) 氨减少率的参考值可按如下设置。即将 60μg-N/g- 干土壤的硫酸铵施用到 目标土壤中， 测定第 0 天和第 3 天的氨态氮的量。当使用上述公式得到的值是 100％， 那这 个值可被设置为参考值。如果测量值为 30％或以上， 优选为 60％或以上， 就可以评价得出 土壤具有优良的氨转化活性。通常， 田间土壤中含氮化合物的浓度大约是 60μg-N/g- 干土 壤， 因此， 如果这个量的减少率为 100％， 就可以评价得出土壤具有必要的和足够的氨转化 活性。
植酸形成磷酸的活性的参考值可按如下设置。 即向目标土壤施用每单位干重目标 土壤的 1％ (w/w) 的植酸， 并测定第 0 天和第 3 天的水溶性磷酸的量。当使用上述公式得到 的值是 100％， 那这个值可被设置为参考值。如果测量值为 10％或以上， 优选为 30％或以 上， 那么可以评价得出土壤具有优良的植酸形成磷酸的活性。
堆肥形成钾的活性的参考值可按如下设置。 即向目标土壤施用每单位干重目标土 壤的 1％ (w/w) 的堆肥， 并测定第 0 天和第 3 天的钾的释放量。当使用上述公式得到的值是
100％， 那这个值可被设置为参考值。如果测量值为 5％或以上， 优选为 20％或以上， 那么可 以评价得出土壤具有优良的堆肥形成钾的活性。
尽管对通过综合上述因素 (I)、 (II) 和 (III) 计算循环活性指标的方法没有特别 限定， 但优选按照下述方法计算循环活性指标。 即以预设的氨减少率的参考值、 预设的植酸 形成磷酸的活性的参考值和预设的堆肥形成钾的活性的参考值为顶点组成等边三角形， 以 位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的氨减少率 (I)、 植酸形成 磷酸的活性 (II) 和堆肥形成钾的活性 (III) 的测定值为顶点组成三角形。计算该三角形 面积和等边三角形面积之比作为循环活性指标。
这种情况下， 如果上述与因素 (I)、 (II)、 (III) 有关的条件均满足 ； 土壤细菌数等 8 于或大于 2×10 细胞 /g- 土壤 ； 并且以该测定值为顶点组成的三角形的面积和以参考值为 顶点组成的等边三角形的面积之比为 10 或以上， 优选为 30 或以上， 就可以判断为土壤适合 植物。另一方面， 如果条件或范围不满足， 就可以判断为土壤不适合植物。
因此， 基于因素 (I)、 (II) 和 (III) 就可易于作出综合评价或判断。进一步地， 由 于采用图示法， 看一眼即可知晓指标大小。仍然进一步地， 变量 (I) ～ (III) 中哪个需要改 良很容易理解。 如果循环活性指标越高， 就可以评价植物越有可能吸收氮组分、 磷酸组分和钾组 分， 且土壤中氮、 磷酸和钾的循环效率也越好。
1.2. 土壤诊断方法 (2)
本发明的土壤诊断方法的特征在于， 其至少使用 (A) 氮循环活性指标、 (B) 磷循环 活性指标和 (C) 钾循环活性指标对土壤进行评价或诊断。
(A) 氮循环活性指标
本发明中， 氮循环活性指标为一个用于分析含氮化合物的转化 ( 包括硝化作用 ) 和土壤细菌之间关系的指标。
本发明的氮循环活性指标用下述计算出的值表示 ：
(A-1) 目标土壤中土壤细菌数，
(A-2) 目标土壤中氨减少率， 以及
(A-3) 目标土壤中亚硝酸减少率。
加入到土壤的有机氮化合物被分解成肽、 氨基酸等， 然后变成氨态氮。进一步地， + 氨态氮 (NH4 ) 转化成亚硝态氮 (NO2 )， 再转化成硝态氮 (NO3 )。部分发生了反硝化反应， 从 而转化成了氮气 (N2)。
在上述有机氮化合物的循环 / 转化途径中， 氨态氮转化成亚硝态氮以及亚硝态氮 转化成硝态氮是从有机氮化合物中产生可被植物吸收和利用的硝酸途径的基本部分。 特别 是， 在转化途径中氨态氮转化成亚硝态氮的反应率非常低， 其在一系列含氮化合物转化反 应中是限速的。 因而， 在评价氮循环活性中， 氨态氮减少率和亚硝态氮减少率被认为是非常 重要的因素。
(A-1) 土壤细菌数
目标土壤中土壤细菌数， 如上述 (IV) 循环活性指标中所记载。
(A-2) 氨减少率
目标土壤中氨减少率， 如上述 (I) 循环活性指标中所记载。
(A-3) 亚硝酸减少率
本发明中， 目标土壤中亚硝酸减少率表示施用到目标土壤中亚硝态氮 (NO2-) 的浓 度减少率。
具体地， 当亚硝酸化合物施用到目标土壤时， 可通过下述公式计算出亚硝酸减少 率。
亚硝酸减少率 (％ ) ＝ [1-(N3-N4)/N3]×100
( 公式中， N3 表示亚硝酸化合物施用日的亚硝态氮的量， N4 表示施用亚硝酸化合物 一定时期后的亚硝态氮的量。)
亚硝酸化合物的施用日是指将亚硝酸化合物施用到土壤中那天。 亚硝酸化合物施 用日的亚硝态氮的量可用施用第 0 天的亚硝态氮的量表示。
此外， 施用亚硝酸化合物后一定时期是指将亚硝酸化合物施用到土壤后一定时期 过去以后的那天。例如， 可用施用第 3 天的亚硝态氮的量表示将亚硝酸化合物施用到土壤 过去 3 天后的亚硝态氮的量。
一定时期的长度可视情况而定， 优选为 3 ～ 7 天， 更优选为施用后 3 天。如果时间 比这短或者比这长很多， 则很难识别出活性的差异。
换言之， 可优选使用下式来获得目标土壤中亚硝酸减少率的值 ： [ 式 4]亚硝态氮的量是指每单位干重目标土壤的亚硝态氮 (NO2-) 的量。
可用萘基乙二胺法、 高效液相色谱等测定亚硝态氮的量。 更具体地， 可应用本申请 实施例中所述的测定亚硝态氮量的方法测定亚硝态氮量。
亚硝酸减少率反映出亚硝态氮转化成硝态氮的效率。据认为如果减少率越高， 就 表明土壤中含有许多的亚硝酸盐氧化细菌， 或表明土壤中含有每单位生物量的活性较高的 亚硝酸盐氧化菌。认为如果减少率较低， 就表明只有少量的亚硝酸盐氧化细菌。
(A-4) 氮循环活性评价
上述 (A-1)、 (A-2) 和 (A-3) 是土壤中氮循环的重要因素， 综合分析这些因素是进 行适当诊断的关键。
如果下述与 (A-1)、 (A-2) 和 (A-3) 有关的条件都满足， 就可以判断土壤具有优良 的氮循环活性， 然而， 如果下述任意条件都不能满足， 就可以判断土壤没有优良的氮循环活 性。
至于土壤细菌数的参考值， 将农用土壤中土壤细菌数的平均值 3.25×109 细胞 / g- 土壤作为参考值的 100％。当测定值为 10％或以上， 优选 40％或以上， 就可以评价得出 土壤具有足够的土壤细菌数。
氨减少率的参考值可按如下设置。即将 60μg-N/g- 干土壤的硫酸铵施用到目标 土壤中， 测定第 0 天和第 3 天的氨态氮的量。 当使用上述公式得到的值是 100％， 那这个值可
被设置为参考值。如果测量值为 30％或以上， 优选为 60％或以上， 就可以评价得出土壤具 有优良的氨减少率。通常， 田间土壤中含氮化合物的浓度大约是 60μg-N/g- 干土壤， 因此， 如果这个量的减少率为 100％， 那么可以评价得出土壤具有必要的和足够的氨转化活性。
亚硝酸减少率的参考值可按如下设置。即向目标土壤施用 60μg-N/g- 干土壤的 亚硝酸钾， 并测定第 0 天和第 3 天的亚硝态氮的量。 当使用上述公式得到的值是 100％， 那这 个值可被设置为参考值。如果测量值为 60％或以上， 优选为 90％或以上， 那么可以评价得 出土壤具有优良的亚硝酸减少率。通常， 大田土壤中含氮化合物的浓度为约 60μg-N/g- 干 土壤， 因而， 如果这个量减少率为 100％， 就可以评价得出土壤具有必要的和足够的亚硝酸 转化活性。
对通过综合上述因素 (A-1)、 (A-2) 和 (A-3)， 计算氮循环活性指标的方法没有特 别的限定， 但优选按照下述方法计算氮循环活性指标。即以预设的土壤细菌数的参考值、 预设的氨减少率的参考值和预设的亚硝酸减少率的参考值为顶点组成等边三角形， 以位于 从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (A-1)、 氨减少率 (A-2) 和亚硝酸减少率 (A-3) 的测定值为顶点组成三角形。计算该三角形面积和等边三角 形面积之比作为氮循环活性指标。
因此， 基于 (A-1)、 (A-2) 和 (A-3) 就可易于作出综合评价或判断。进一步地， 由于 采用图示法， 如图 2 所示， 看一眼即可知晓指标大小。仍然进一步地， 变量 (A-1) ～ (A-3) 中哪个需要改良很容易理解。
这种情况下， 如果上述与因素 (A-1)、 (A-2)、 (A-3) 有关的条件均满足 ； 并且测定 值为顶点组成的三角形的面积和参考值为顶点组成的等边三角形的面积之比为 10 或以 上， 优选为 40 或以上， 就可以判断为土壤具有优良的氮循环活性。另一方面， 如果上述值不 满足， 就可以判断为土壤不具有优良的氮循环活性。
更具体地， 可用本申请实施例中所述的计算方法计算氮循环活性指标。
如果氮循环活性指标越高， 就可以评价植物越有可能吸收氮组分， 且土壤中氮循 环效率也越好。
(B) 磷循环活性指标
本发明中， 磷循环活性指标为一个用于分析含磷有机化合物转化成磷酸的活性， 即不可被植物利用的含磷化合物转化成可被植物利用的磷酸的活性和土壤细菌之间的关 系的指标。
本发明的磷循环活性指标表示用下述计算出的值 ：
(B-1) 目标土壤中土壤细菌数，
(B-2) 目标土壤中植酸形成磷酸的活性， 以及
(B-3) 目标土壤中堆肥形成磷酸的活性。
磷是植物的三大营养元素之一， 与植物生长密切相关， 因此， 磷循环活性的评价被 认为对于土壤诊断来说是重要的。
此外， 植物吸收水溶性磷酸。因此， 认为如果土壤中含有大量的水溶性磷酸， 那么 植物越有可能吸收磷。
因此， 磷化合物转化成水溶性磷酸的活性被认为是磷循环活性重要的因素。
此外， 作为磷化合物的植酸和堆肥被认为尤其重要。植酸是植物所利用的用于储存磷的物质， 杂草和农作物采收后的残留物中含有大 量的植酸。如果目标土壤中的微生物具有较高的从植物体所含的植酸中释放磷酸的活性， 就可以判断土壤具有较高的质量。
此外， 堆肥用于作为一种外部施用磷到低磷土壤中的方法。 然而， 堆肥不含有水溶 性磷酸， 但含有例如作为树皮堆肥组分的磷酸。如果目标土壤中的微生物具有较高的从堆 肥生成磷酸的活性， 就可以判断土壤具有较高的质量。
(B-1) 土壤细菌数
目标土壤的土壤细菌数， 如上述 (IV) 循环活性指标中所记载。
(B-2) 植酸形成磷酸的活性
目标土壤的植酸形成磷酸的活性， 如上述 (II) 循环活性指标中所记载。
(B-3) 堆肥形成磷酸的活性
本发明中， 目标土壤的堆肥形成磷酸的活性表示施用到目标土壤的堆肥转化成磷 酸的活性， 换言之， 转化 / 分解堆肥以释放水溶性磷酸的活性。
堆肥的实例包括 ： 植物堆肥， 如树皮堆肥 ； 牲畜堆肥， 如家禽粪便堆肥、 牛粪堆肥 和猪粪堆肥 ； 和海草堆肥。可单独使用这些种类的堆肥或组合使用两种或多种堆肥。
这些种类的堆肥中， 树皮堆肥含有大量植酸等形式的磷酸， 因而能够进行更适合 的评价。通常， 树皮堆肥中总磷酸 (P2O5) 的含量为 0.5％或以上 ( 干物质含量 )。
此外， 对施用堆肥的方法没有特别限定。可使用混有栽培土的堆肥。这种情况下， 堆肥的混合率为总栽培土重量的 10 ～ 50％， 优选为约 25 ～ 35％。
具体地， 当堆肥施用到目标土壤后， 可通过下式计算出堆肥形成磷酸的活性值。 6
堆肥形成磷酸的活性 (％ ) ＝ [(P -P5)/P4]×100
( 公式中， P4 表示堆肥中磷酸的量， P5 表示堆肥施用日的水溶性磷酸的量， P6 表示 施用堆肥一定时期后水溶性磷酸的量。)
可根据公知的测定磷酸含量方法测定堆肥中磷酸的量。例如， 用高氯酸分解堆肥 中的有机物， 用 0.002N 硫酸抽提。产生的物质进行钼蓝法测定， 从而测得总磷酸的量。
堆肥施用日是指将堆肥施用到土壤中那天。 堆肥施用日的水溶性磷酸的量可用施 用第 0 天的水溶性磷酸的量表示。
此外， 施用堆肥后一定时期是指将堆肥施用到土壤后一定时期过去以后的那一 天。例如， 可用施用第 3 天的水溶性磷酸的量表示将堆肥施用到土壤过去 3 天后的水溶性 磷酸的量。
一定时期的长度可视情况而定， 优选为 3 ～ 7 天， 更优选为施用后 3 天。如果时间 比这短或者比这长很多， 则很难识别出活性的差异。
换言之， 可优选使用下式来获得目标土壤中的堆肥形成磷酸的活性值 ：
[ 式 5]
如上所述， 水溶性磷酸的量是指每单位干重目标土壤的水溶性磷酸的量， 可用上 述的相同方法进行测定。
堆肥形成磷酸的活性反映出从堆肥中转化成水溶性磷酸的效率。 据认为如果活性 越高， 堆肥中的磷越有可能被利用。因而， 认为如果活性越高， 那么土壤质量优良， 因而， 可 将外部施用的磷的量减少到最小化。 另一方面， 认为如果活性越低， 那么堆肥中的磷越不可 能被利用。 因而， 认为如果活性较低， 那么土壤质量不足， 因而， 有必要增加施用的堆肥的量 或使用磷肥。
(B-4) 磷循环活性评价
上述 (B-1)、 (B-2) 和 (B-3) 是土壤中磷循环的重要因素， 综合分析这些因素是进 行适当诊断的关键。
如果下述与 (B-1)、 (B-2) 和 (B-3) 有关的条件都满足， 就可以判断土壤具有优 良的磷循环活性， 然而， 如果任意下述条件都不满足， 就可以判断土壤没有优良的磷循环活 性。
至于土壤细菌数的参考值， 将农业农业土壤中土壤细菌数的平均值 3.25×109 细 胞 /g- 土壤作为参考值的 100％。 当测定值为 10％或以上， 优选 40％或以上， 就可以评价得 出土壤具有足够的土壤细菌数。
植酸形成磷酸的活性的参考值可按如下设置。 即向目标土壤施用每单位目标土壤 干重的 1％ (w/w) 的植酸， 测定第 0 天和第 3 天的水溶性磷酸的量。当使用上述公式得到的 值是 100％， 那这个值可被设置为参考值。如果测量值为 10％或以上， 优选为 30％或以上， 就可以评价得出土壤具有优良的植酸形成磷酸的活性。
堆肥形成磷酸的参考值可按如下设置。 即向目标土壤施用每单位干重目标土壤的 1％ (w/w) 的堆肥， 测定第 0 天和第 3 天的水溶性磷酸的量。当使用上述公式得到的值是 100％， 那这个值可被设置为参考值。如果测量值为 10％或以上， 优选为 30％或以上， 就可 以评价得出土壤具有优良的堆肥形成磷酸的活性。
对通过综合上述因素 (B-1)、 (B-2) 和 (B-3)， 计算磷循环活性指标的方法没有特 别限定， 但优选按照下述方法计算磷循环活性指标。即以预设的土壤细菌数的参考值、 预 设的植酸形成磷酸的活性的参考值和预设的堆肥形成磷酸活性的参考值为顶点组成等边 三角形， 以位于从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (B-1)、 植酸形成磷酸的活性 (B-2) 和堆肥形成磷酸活性 (B-3) 的测定值为顶点组成三角 形。计算该三角形面积和等边三角形面积之比作为循环活性指标。
因此， 基于 (B-1)、 (B-2) 和 (B-3) 就可易于作出综合评价或判断。进一步地， 如图 4 所示， 由于采用图示法， 看一眼即可知晓指标大小。 仍然进一步地， 变量 (B-1) ～ (B-3) 中 哪个需要改良很容易理解。
这种情况下， 如果上述与因素 (B-1)、 (B-2)、 (B-3) 有关的条件均满足 ； 并且测定值为顶点组成的三角形的面积和参考值为顶点组成的等边三角形的面积之比为 1 或以上， 优选为 10 或以上， 就可以判断为土壤具有优良的磷循环活性。另一方面， 如果上述值不满 足， 就可以判断为土壤不具有优良的磷循环活性。
更具体地， 可用本申请实施例中所述的计算方法计算磷循环活性指标。
如果磷循环活性指标越高， 就可以评价植物越有可能吸收磷组分， 且土壤中磷循 环效率也越好。
(C) 钾循环活性指标
本发明中， 钾循环活性指标为一个用于分析含钾化合物的转化和土壤细菌之间的 关系的指标。
本发明中的钾循环活性指标表示用下述计算出的值 ：
(C-1) 目标土壤中土壤细菌数，
(C-2) 目标土壤中钾释放率， 以及
(C-3) 目标土壤中堆肥形成钾的活性。
钾是植物的三大营养元素之一， 与植物生长密切相关， 因此， 钾循环活性的评价被 认为对于土壤诊断来说是重要的。 植物吸收释放到土壤中的钾， 因此， 认为土壤中的游离钾的含量被认为是钾循环 活性中的重要因素。
此外， 堆肥用于作为一种外部施用钾到低钾土壤中的方法。 在堆肥中， 钾大量存在 于动植物残骸中。然而， 植物可利用的钾是游离钾。因而， 认为微生物的将堆肥中所含的钾 转化成游离钾的活性是重要的因素。
(C-1) 土壤细菌数
目标土壤的土壤细菌数， 如上述 (IV) 循环活性指标中所记载。
(C-2) 钾释放率
本发明中， 目标土壤中的钾释放率表示每单位干重目标土壤的钾的量。
具体地， 目标土壤中的钾释放率为用下述公式计算出的值。
钾释放率 (％ ) ＝ [(K3-K2)/K1]×100
( 公式中， K1 表示测定开始日目标土壤中钾的量， K2 表示测定开始日钾释放量， K3 表示测定开始日一定时期过后的钾释放量。)
可根据公知的方法测定目标土壤中钾的量， 可按如下方式获得。 例如， 将醋酸铵水 溶液加到土壤中， 过滤获得滤液。将获得的滤液， 即钾提取液用原子吸收光谱仪进行测定， 获得钾的量。
钾释放量是指每单位干重目标土壤钾的量。
可用原子吸收光谱仪或 ICP-MS 测定钾的释放量。例如， 用双蒸水抽提释放到土壤 中的钾， 用原子吸收光谱仪测定抽提液， 从而获得钾的释放量。具体地， 本申请的实施例中 所述的应用原子吸收光谱仪测定钾的量的方法可测定土壤中的钾的量。
可优选使用下式获得钾释放率 ：
[ 式 6]
钾释放率反映出植物可利用的钾的量。据认为如果值越高， 土壤中的钾越有可能 被利用。因此， 认为如果值较高， 就表明土壤质量优良， 可将外部施用的钾的量减少到最小 化。
另一方面， 据认为如果值越低， 那么土壤中的钾越不可能被利用。因而， 如果值较 低， 那么土壤被诊断为质量不足， 因而， 有必要增加外部施用的钾的量。
(C-3) 堆肥形成钾的活性
目标土壤中堆肥形成钾的活性， 如上述 (III) 循环活性指标中所记载。
(C-4) 钾循环活性评价
上述 (C-1)、 (C-2) 和 (C-3) 是土壤中钾循环的重要因素， 综合分析这些因素是进 行适当土壤诊断的关键。
如果下述与 (C-1)、 (C-2) 和 (C-3) 有关的条件都满足， 就可以判断土壤具有优 良的钾循环活性， 然而， 如果任意下述条件都不满足， 就可以判断土壤没有优良的钾循环活 性。
至于土壤细菌数的参考值， 将农用土壤中土壤细菌数的平均值 3.25×109 细胞 / g- 土壤作为参考值的 100％。当测定值为 10％或以上， 优选 40％或以上， 就可以评价得出 土壤具有足够的土壤细菌数。
至于钾释放率的参考值， 3 天内， 将目标土壤中钾完全转化成游离钾的活性定义为 100％。当测定值为 5％或以上， 优选为 10％或以上， 就可以判断出土壤具有足够的钾释放 率。
堆肥形成钾的活性的参考值可按如下设置。即向目标土壤施用每单位干重目标 土壤的 1％ (w/w) 的堆肥， 测定第 0 天和第 3 天的钾释放量。当使用上述公式得到的值是 100％， 那这个值可被设置为参考值。如果测量值为 5％或以上， 优选为 20％或以上， 就可以 评价得出土壤具有优良的堆肥形成钾的活性。
对通过综合上述因素 (C-1)、 (C-2) 和 (C-3)， 计算钾循环活性指标的方法没有特 预设 别限定， 但优选按照下述方法计算钾循环活性指标。 即以预设的土壤细菌数的参考值、 的钾释放量的参考值和预设的堆肥形成钾的活性的参考值为顶点组成等边三角形， 以位于 从该等边三角形的重心到相应的等边三角形顶点的线段上的土壤细菌数 (C-1)、 钾释放量 (C-2) 和堆肥形成钾的活性 (C-3) 的测定值为顶点组成三角形。计算该三角形面积和等边 三角形面积之比作为钾循环活性指标。
因此， 基于 (C-1)、 (C-2) 和 (C-3) 就可易于作出综合评价或判断。进一步地， 如图 5 所示， 由于采用图示法， 看一眼即可知晓指标大小。 仍然进一步地， 变量 (C-1) ～ (C-3) 中 哪个需要改良很容易理解。
这种情况下， 如果上述与因素 (C-1)、 (C-2) 和 (C-3) 有关的条件均满足 ； 并且测定 值为顶点组成的三角形的面积和参考值为顶点组成的等边三角形的面积之比为 1 或以上，优选为 5 或以上， 就可以判断为土壤具有优良的钾循环活性。另一方面， 如果任意上述值都 不满足， 就可以判断为土壤不具有优良的钾循环活性。
更具体地， 可用本申请实施例中所述的计算方法计算钾循环活性指标。
如钾循环活性指标越高， 就可以评价植物越有可能吸收钾组分， 且土壤中钾循环 效率也越好。
1.3. 目标土壤
本发明中， 对目标土壤的类型没有特别限定。 目标土壤的实例包括农用土地、 经过 生物修复处理的土壤等。
例如， 本发明可用于作为农用土地诊断方法用于诊断农用土地的质量是否适合植 物或农用土地是否需要改良以适合植物。此外， 本发明可用于仅作为土壤诊断方法用于判 断在已经进行过生物修复处理的土壤中， 是否恢复了土壤微生物的物质循环活性， 土壤是 否可用于通常的用途。
1.4. 诊断
本发明中， 用上述的循环活性指标， 或 (A) 氮循环活性指标、 (B) 磷循环活性指标， 以及 (C) 钾循环活性指标进行土壤诊断。
除上述循环活性指标或 (A) ～ (C) 指标外， 还可以使用其它的指标用于土壤诊断。 其它指标的实例包括 pH 值、 电导率、 溶解氧浓度、 颗粒大小、 土壤孔隙度。可用公知的方法 测定这些指标。
此外， 还可增加其它组分的指标用于诊断， 如与碳有关的指标。总有机碳 (TOC) 指 标可作为与碳有关的指标。 为了使微生物具有各种活性活动 ( 氮循环活性等 )， 作为生物成 分和能量的来源的碳是维持活动所必须的。因此， 碳的量也被认为是一个重要因素。
进一步地， 还可使用公知的与土壤或堆肥有关的指标， 如总有机碳和总氮的比值 (C/N 比 )。
对使用上述指标 (A) ～ (C) 进行诊断的方法没有特别限定。例如， 通过获得指标 (A) ～ (C) 的总和或乘积、 或作为综合指标的指标 (A) ～ (C) 的运算值进行诊断。例如， 如 果与土壤有关的指标 (A) ～ (C) 的总和较大， 就可以诊断为土壤具有较高的质量并适合植 物
例如， 如上所述， 组成以参考值为顶点的等边三角形， 以及组成以测定值为顶点的 三角形。 计算三角形面积和各个等边三角形面积的比值作为 (A) ～ (C) 的各个指标， 并计算 比值的平均值。如果平均值为 10 或以上， 优选为 35 或以上， 就可以判断为土壤适合植物， 而如果不满足上述值， 就可以判断为土壤不适合植物。
进一步地， 如上所述， 组成以参考值为顶点的等边三角形， 并组成以测定值为顶点 的三角形。计算该三角形面积和各个等边三角形面积的比值作为 (A) ～ (C) 的各个指标。 对于各以 100 为顶点组成的等边三角形， 以表示上述比例且位于从该等边三角形的重心到 相应顶点的线段上的点为顶点组成三角形。 当如此形成的三角形面积和该等边三角形的面 积之比为 1 或以上， 优选为 5 或以上时， 则可以判断土壤适合植物， 而如果不满足上述值， 则 可以判断土壤不适合植物。
如果用上述方法进行判断， 那么所有的变量 (A-1) ～ (A-3)、 (B-1) ～ (B-3) 和 (C-1) ～ (C-3) 都应该满足上述条件。此外， 可单独诊断上述循环活性指标或指标 (A) ～ (C) 用以判断氮循环、 磷循环和 钾循环中哪个需要改良， 进一步用以判断施用额外的组分进行改良是否有效， 或用于确定 土壤微生物状态的改良是否有效。
进一步地， 可组合使用指标 (A) ～ (C) 和其它指标作为综合指标进行土壤诊断。 仍 然进一步地， 可通过探讨指标 (A) ～ (C) 的平衡或通过指标 (A) ～ (C) 和其它指标的比较 进行诊断。
2. 土壤质量控制方法
根据本发明， 提供应用上述本发明诊断方法的土壤质量控制方法。
在本发明的土壤质量控制方法中， 随时间实施上述本发明的诊断方法， 并分析循 环活性指标、 (A) 氮循环活性指标、 (B) 磷循环活性指标和 (C) 钾循环活性指标随时间的变 化， 从而控制土壤质量。
对分析随时间的变化的方法没有特别限定， 可视情况使用任何公知的方法。 例如， 可用指标的进一步转换或运算值进行分析。 可选地， 可用显示方法， 如合适的图形或图表进 行分析。
进一步地， 用除上述循环活性指标和指标 (A) ～ (C) 以外的其它指标随时间的变 化进行分析。
其它指标的实例包括 pH 值、 电导率、 溶解氧浓度、 颗粒大小、 土壤孔隙度。进一步 地， 包括其它营养元素的指标， 如总有机碳。
进一步地， 基于随时间变化的分析进行必要的处理可维持土壤质量。 特别地， 根据 本发明， 可判断需要用氮、 磷、 钾中的哪个成分进行处理。
进一步地， 根据本发明的质量控制方法， 不仅可知晓植物所必需的物质的状态， 还 可知晓土壤中微生物的状态。 因此， 利用本发明的质量控制方法， 可知晓通过植物生长是否 较好地维持了土壤中的生态系统， 以及知晓各种物质的循环活性是否恰当地发挥作用。
3. 土壤改良方法
本发明提供应用上述本发明诊断方法的土壤质量改良方法。
在本发明的土壤改良方法中， 基于上述本发明的诊断方法， 获得与循环活性指标、 (A) 氮循环活性指标、 (B) 磷循环活性指标和 (C) 钾循环活性指标有关的土壤诊断结果。根 据详细的诊断结果进行处理， 使土壤得到改良。
详细的处理包括 ： 追施含氮、 磷和 / 或钾的肥料， 施用活化土壤微生物的营养成 分， 施用具有氮、 磷和 / 或钾循环活性的土壤微生物等。例如， 如果氨减少率较低， 可施用氨 氧化细菌。
在本发明的土壤改良方法中， 可判断需要施用氮、 磷和钾的哪个成分， 进一步地， 考虑土壤微生物的表现， 可有利地确定详细的处理。
例如， 即使知道土壤含有大量的氮化合物， 除非转化氮化合物的微生物的活性是 足够的， 否则植物不能充分地利用氮。 根据本发明， 可判断用于增强微生物活性的处理或施 用具这种活性的微生物对这种环境是否有效。 此外， 即使判断为土壤中氮的量不足， 需要外 施氮， 只要知晓微生物的活性是足够的， 就可调整施用的氮的量并可避免氮的过量施用。
在这种方式下， 根据本发明的土壤改良方法， 有效地利用土壤生态系统的性能， 可 实现改良土壤。可以实现高效的土壤改良， 进一步提高粮食生产效率。发明的有益效果
本发明可提供一种反映土壤中循环活性的土壤诊断方法， 特别是提供一种可判断 土壤是否适合农作物栽培的土壤诊断方法。
本发明的土壤诊断方法反映出土壤中与物质循环密切相关的微生物的状态， 因而 可根据自然循环系统准确诊断农用土地的质量。 特别地， 本发明的诊断方法， 可准确诊断适 合用生物质 (biomass) 的种植方法， 例如不依赖于化学种植方法的土壤的质量。
进一步地， 根据本发明的诊断方法， 可判断对植物来说很重要的氮循环、 磷循环和 钾循环中的哪个需要改良。 仍然进一步地， 可判断详细的改良处理， 如判断追施的成分是否 有效， 或者判断土壤微生物状态的改良是否有效。
进一步地， 根据本发明的质量控制方法可知晓植物所必需的物质的状态以及土壤 微生物的状态。 因此， 可知晓通过植物生长是否顺利维持了土壤中的生态系统， 以及各种物 质的循环活性是否恰当地发挥作用。
进一步地， 根据本发明的土壤改良方法， 有效地利用土壤生态系统的性能可实现 改良土壤。可以实现高效的土壤改良， 进一步提高粮食生产的利润率。
如上所述， 本发明提供一种基于自然循环功能的土壤质量诊断方法和土壤质量改 良方法， 并有助于改善种植方法如减少化学物质使用的有机种植方法的利润率， 并建立一 个对环境无害的农业生产体系。 附图说明
图 1 为说明实施例中各个土壤样本的氨减少率和亚硝酸减少率结果的图。每根左 柱表示氨减少率的值， 每根右柱表示亚硝酸减少率的值。
图 2 为说明使用土壤细菌数、 氨减少率和亚硝酸减少率评价氮循环活性的实施例 的图。
图 3 为说明实施例中施用自养氨氧化细菌对土壤中氮循环活性的作用分析结果 图。图 A 表示 1 号土壤， 图 B 表示 2 号土壤。此外， ◇表示不接种菌株的情况 ； ○表示施用 菌株 A 的情况 ； △表示施用菌株 B 的情况。
图 4 为说明使用土壤细菌数、 植酸形成磷酸的活性和堆肥形成磷酸的活性评价磷 循环活性的实施例的图。
图 5 为说明使用土壤细菌数、 钾释放率和堆肥形成钾的活性评价钾循环活性的实 施例的图。
图 6 为说明施用硫酸铵的土壤中的氮循环的图。 图中， A 表示施用 4μg-N/g- 土壤 的硫酸铵的情况 ； B 表示施用 40μg-N/g- 土壤的硫酸铵的情况 ； C 表示施用 400μg-N/g- 土 壤的硫酸铵的情况。符号代表如下意义。◆ ： 氨态氮， ■： 亚硝态氮， ▲： 硝态氮。
图 7 为说明施用亚硝酸钾的土壤中氮循环的图。 图中， A 表示施用 6μg-N/g- 土壤 的亚硝酸钾的情况 ； B 表示施用 60μg-N/g- 土壤的亚硝酸钾的情况 ； C 表示施用 600μg-N/ g- 土壤的亚硝酸钾的情况。符号代表如下意义。◆ ： 氨态氮， ■： 亚硝态氮， ▲： 硝态氮。
图 8 为说明每天的硝化量和土壤细菌数的关系的图。符号代表如下意义。▲ ： 田， ◆： 水田， ■： 除农用土地以外的土地。误差线表示标准差。具体实施方式
为详细描述本发明， 接下来将描述实施例和试验例。 然而， 本发明不限于这些实施 例。
[ 实施例 ]
1. 氮循环活性分析方法的建立
(1-1) 实验方法
1a) 硝化能力的评价
称取 10g 土壤， 加入到玻璃培养皿。110℃干燥 2 个小时后， 通过重量减少量计算 土壤含水量。将过 2mm 目筛的土壤 15g( 干重 ) 加入到 50ml UM 的样品瓶中， 再以 60μg-N/ g- 干土壤的量加入硫酸铵溶液 (0.080mM) 或亚硝酸钾溶液 (0.16mM)。将土壤充分搅拌， 25℃维持恒定的水分含量静置 3 天。
1b) 从土壤中提取无机氮
将 2.0g 土壤样品和 20ml 1M 氯化钾溶液加入到 50ml 离心管中， 进行悬浮， 混合物 100rpm 振荡 1 小时。振荡后， 混合物 10,000rpm 离心 5 分钟， 将上清液作为无机氮提取液。
1c) 用靛酚法测定氨态氮的量
将 1.0ml 土壤中提取的无机氮提取液加入到 2.0ml 的小离心管中， 加入 500μl 表 1 中所述的次氯酸钠溶液， 进行搅拌。将混合物室温下静置 5 分钟。静置后， 将表 2 中所述 的酚 - 硝普钠溶液加入到混合物中， 进行搅拌， 将获得的混合物在 30℃下静置 60 分钟。静 置后， 测定 640nm 处的吸光度。为测定吸光度， 用氨态氮标准溶液制作校准曲线， 从而获得 + 关系表达式， 用关系表达式测定氨态氮 (NH4 -N) 的量。
表1： 次氯酸钠水溶液的组成
表2： 苯酚 - 硝普钠溶液的组成1d) 用萘基乙二胺法测定亚硝态氮的量
将 1.0ml 土壤中提取的无机氮提取液加入到 1.5ml 的小离心管中， 加入 100μl 表 3 中所述的重氮化试剂， 进行搅拌。 将混合物室温下静置 5 分钟， 往混合物中加入 100μl 表 4 中所述的偶联剂。将获得的混合物室温静置 20 分钟， 测定 540nm 处的吸光度。基于用亚 硝态氮标准溶液制作的校准曲线测定亚硝态氮 (NO2 -N) 的量。
表3： 重氮化试剂的组成
表4： 偶联剂的组成1e) 用马钱子碱磺胺酸法测定硝态氮的量
将 800μl 土壤中提取的无机氮提取液和表 5 中所述的 400μl 马钱子碱磺胺酸加 入到测试管中， 往里加入 4.0ml 硫酸溶液 ( 硫酸∶水＝ 20 ∶ 3)， 进行搅拌。将混合物于冷 暗处静置 40 分钟后， 测定 410nm 处的吸光度。为测定吸光度， 用硝态氮标准溶液制作校准 曲线， 从而获得关系表达式， 用关系表达式测定硝态氮 (NO3 -N) 的量。
表5： 马钱子碱磺胺酸溶液的组成
1f) 用环境 DNA(eDNA) 分析方法测定土壤细菌数
称取 1.0g 土壤， 加入到 50ml 的离心管中， 加入 8.0ml 表 6 中所述的 DNA 提取缓冲 液 (pH 8.0) 和 1.0ml 20％ (w/v) 十二烷基硫酸钠溶液。将混合物在室温下， 1,500rpm 搅 拌 20 分钟。搅拌后， 从 50ml 离心管中分离出 1.5ml 的混合物， 加入到 1.5ml 无菌小离心管 中， 16℃， 8,000rpm 离心 10 分钟。 分离出 700μl 混合物水层， 加入到另一个小离心管中， 往 里加入 700μl 的氯仿 - 异戊醇 (24 ∶ 1， v/v)， 进行混合。将混合物在 16℃下， 13,000rpm 离心 10 分钟。离心后， 分离出 500μl 水层， 加入到又一个小离心管中， 往里加入 300μl 2- 丙醇， 轻柔混合。将混合物在 16℃下， 13,000rpm 离心 15 分钟。离心后， 将混合物中的 上清去除， 往离心管中加入 500μl 70％ (v/v) 的乙醇， 在 16℃下， 13,000rpm 离心 5 分钟。 离心后， 去除上清液， 用吸气器减压干燥剩余的混合物 30 分钟。加入 50μl 表 7 中所述的 TE(10 ∶ 1) 缓冲液 (pH8.0)， 将混合物充分溶解， 将生成的溶液作为 eDNA 溶液。将表 8 中 所述的 4.0ml 50×TAE 缓冲液 (pH 8.0) 和 20μl 0.1mM 的溴化乙锭溶液加入到 2.0g 琼脂 糖中， 用双蒸水补足至 200ml， 制备 1.0％的琼脂糖凝胶。将 1.0μl 上样染料 (Toyobo， 大 阪 ) 和 5.0μl 的 eDNA 溶液混合成 6.0μl。将混合液和 1.5μl 含有已知量 DNA 的 Smart Ladder(Nippon Gene， 富山 ) 上样到琼脂糖凝胶中。100V 电泳 40 分钟后， 用 UV 照射琼脂糖 凝胶检测 DNA 条带。用柯达 1D 图像分析软件 ( 柯达， NY， USA)， 分析 Smart Ladder 的 DNA 条带， 绘制表示 DNA 的量和荧光强度对应关系的校准曲线。利用校准曲线， 通过各个 DNA 条
带的荧光强度获得各个样品 DNA 溶液中 DNA 的量， 计算每个样品每 1.0g 土壤的 eDNA 量。 基于利用 DAPI 染色表示将一定量的 eDNA 转换为土壤细菌数的校准曲线， 获得土壤细菌数。 使用下述关系表达式， 根据测定的 eDNA 的量， 计算土壤细菌数。 8 2
Y ＝ 1.7×10 X(R ＝ 0.96)
[Y ； 土壤细菌数 ( 细胞 /g- 土壤 )， X； eDNA 的量 (μg/g- 土壤 )]
表6： DNA 提取缓冲液 (pH 8.0) 的组成
表7： TE 10 ∶ 1 缓冲液 (pH 8.0) 的组成
表8： 50×TAE 缓冲液 (pH 8.0) 的组成(1-2) 硝化能力的测定
根据上述 1b) ～ 1d) 的方法测定 10 个用途和施肥状态彼此不同的土壤样品 (1 号～ 10 号 ) 的氨态氮和亚硝态氮的量作为无机氮的量， 从而分析土壤中的硝化能力。表 9 所示为每个样品静置后第 0 天和第 3 天的无机氮的量和无机氮的减少率。
表9： 静置后第 0 天和第 3 天的土壤样品中无机氮量的分析实例
* * *在实验 (1) 中， 以 60μg-N/g- 干土壤的量加入硫酸铵溶液。在实验 (2) 中， 以 60μg-N/g- 干土壤的量加入亚硝酸钾溶液。
通过实际测定值减去对照值获得无机氮的量。
为进一步分析各个样品中的硝化活性， 通过无机氮的减少量计算氨减少率和亚硝 酸减少率。根据上述 1b) 和 1c) 测定的氨态氮的量， 利用下式计算氨减少率。 [ 式 7]
根据上述 b) 和 d) 测定的亚硝态氮 (NO2--N) 量， 利用下式计算亚硝酸减少率。 [ 式 8]
图 1 所示为每个样品氨减少率和亚硝酸减少率的结果。
在所有样品中， 亚硝酸减少率测定基本为 100％。另一方面， 氨减少率根据样品的 不同而不同， 在最高 72.0％至最低 3.10％范围内。由于所有样品的氨减少率低于亚硝酸减 少率， 认为在硝化反应中， 从氨变成亚硝酸的反应是限速的。
因此， 表明上述的评价方法适用于分析含有大量肥料的土壤。
(1-3) 土壤细菌数分析
土壤细菌数被认为与物质循环密切相关。因此， 用上述的方法 1f 分析每个样品 中的土壤细菌数。此外， 将数据库中农用土地的土壤细菌数的平均值， 即 3.25×109 细胞 / g- 土壤设为 100， 将测定的土壤细菌数计算成相对值 ( 下文中也被称为细菌量 )。表 10 所 示为每个样品中的土壤细菌数和细菌量。
表 10 ： 样品中土壤细菌数和细菌量
*N.D. ： 低于检测限 (0.78×107 细胞 /g- 土壤 ) (1-4) 氮循环活性分析基于获得的三项， 即土壤细菌数、 氨减少率和亚硝酸减少率， 制作如图 2 所示的图 表来评价土壤中氮循环活性。
图 2 中， 土壤细菌数表明当农用土地中的土壤细菌数的平均值， 即 3.25×109 细胞 /g- 土壤设为 100 时， 每个样品中土壤细菌数的比例， 也即表明细菌量。
进一步地， 氨减少率表明当三天内减少 60μg-N/g- 干土壤的氨化合物的活性设 为 100 时， 每个样品中氨减少率的比例。
进一步地， 亚硝酸减少率表明当三天内减少 60μg-N/g- 干土壤的亚硝酸化合物 的活性设为 100 时， 每个样品中亚硝酸减少率的比例。
仍然进一步地， 在图中， 表示 100 的顶点的三角形面积设为 100， 计算内部三角形 面积的相对值作为每个样品的氮循环指标。表 11 所示为每个样品的氮循环指标。
表 11 ： 每个样品中的氮循环活性评价值
如表 11 和图 2 所示， 样品编号 2 土壤的氨减少率、 亚硝酸减少率和细菌量都相对较高， 因而认为如果将有机氮加入到土壤中， 氮会迅速转化成氨并氧化成硝酸。
(1-5) 往土壤中通过施用自养氨氧化细菌改良氮循环活性
向硝化能力较差的土壤中， 即氮循环活性较差的土壤中施用能氧化氨的微生物被 认为是有效的。因此， 对施用氨氧化细菌是否促进了硝化能力进行了分析。
将两种类型的自养氨氧化细菌 ( 菌株 A、 菌株 B) 施用到土壤中研究是否促进了硝 化能力。
通过离心浓缩菌株 A 或菌株 B 的培养基， 并以 1.0×107 细胞 /g- 干土壤的量施用 到无菌土壤中 ( 土壤 1 和土壤 2)。进一步地， 以 60μg-N/g 干土壤的量将氨态氮施用到土 壤中， 混合物静置 3 天。分析无机氮的量随时间的变化。结果如图 3 所示。图 3 所示为亚 硝态氮的量和硝态氮的量随时间的变化。
如图 3 所示， 施用自养氨氧化细菌与不施用自养氨氧化细菌相比， 亚硝态氮的积 累量和硝态氮的积累量都提高了。
因此， 表明向土壤施用自养氨氧化细菌促进了氮循环活性。
2. 磷循环活性分析
分析 10 个用途和施肥状态彼此不同的土壤样品 (11 号至 20 号 ) 的磷循环。 (2-1) 实验方法
2a) 土壤细菌数分析
用如上 1f) 中相同的 eDNA 分析方法测定土壤细菌数。
2b) 植酸形成磷酸的活性分析
将 100g 土壤样品加入到 250ml UM 样品瓶中， 充分搅拌。称取 2.0g 的土壤， 加入 到 50ml 离心管中， 往里加入 20ml 的双蒸水， 100rpm 振荡 60 分钟。将混合物 10,000rpm 离 心 5 分钟， 将作为水溶性磷酸提取液的上清液进行钼蓝法测定。将 1.0ml 水溶性磷酸提取 液加入到 1.5ml 小离心管中。将 100μl 由表 12 所述的钼蓝母液和 0.41ML(+)- 抗坏血酸 水溶液以 5 ∶ 1 的比例混合而成的混合液加入到小离心管中， 进行搅拌， 混合液在 30℃下静 置 30 分钟。静置后， 测定 720nm 处的吸光度。通过磷酸标准溶液制作的校准曲线， 测定土 壤中的水溶性磷酸的量， 设为第 0 天的水溶性磷酸的量。
将植酸以 1％ (w/w) 的量加入到土壤样品中， 充分搅拌。将混合物在室温下静置 3 天。称取 2.0g 该土壤， 加入到 50ml 离心管中， 用上述方法提取水溶性磷酸。提取液进行钼 蓝法测定， 测定水溶性磷酸的量， 设为第 3 天的水溶性磷酸的量。
进一步地， 基于 1mol 植酸含有 6 分子磷酸这个事实， 通过施用的植酸的量计算植 酸中磷酸的量。
基于获得的水溶性磷酸的量以及植酸中磷酸的量， 用下式计算植酸形成磷酸的活 性。
[ 式 9]
表 12 ： 钼蓝母液的组成
2c) 堆肥形成磷酸的活性分析将 100g 土壤样品加入到 250ml UM 样品瓶中， 充分搅拌。称取 2.0g 的土壤， 加入 到 50ml 离心管中， 往里加入 20ml 的双蒸水， 100rpm 振荡 60 分钟。将混合物 10,000rpm 离 心 5 分钟， 将提取的水溶性磷酸进行钼蓝法测定。测定磷酸的量， 设为第 0 天的水溶性磷酸 的量。
将含有栽培土壤的树皮堆肥 (“Hana-chan Baiyodo” (Hanagokoro， 名古屋 )) 以 1％ (w/w) 的量加入到土壤样品中， 充分混合。将混合物在室温下静置 3 天。称取 2.0g 该 土壤， 加入到 50ml 离心管中， 用上述方法提取水溶性磷酸。提取液进行钼蓝法测定， 测定水 溶性磷酸的量， 设为第 3 天的水溶性磷酸的量。
进一步地， 用高氯酸分解堆肥中的有机物， 并用 0.002N 硫酸提取有机物， 开展钼 蓝法测定。然后， 测定堆肥中磷酸的量。
基于获得的水溶性磷酸的量以及堆肥中磷酸的量， 用下式计算堆肥形成磷酸的活 性。
[ 式 10]
(2-2) 基于磷循环和土壤细菌数评价土壤
用上述三项， 即土壤细菌数、 植酸形成磷酸的活性和堆肥形成磷酸的活性， 制作如 图 4 所示的图表。
图 4 中， 土壤细菌数表明当农用土地中的土壤细菌数平均值， 即 3.25×109 细胞 / g- 土壤设为 100 时， 每个样品中的土壤细菌数的比例。
进一步地， 植酸形成磷酸的活性表明当把三天内将 1％ (w/w) 的植酸中磷酸完全 转化成水溶性磷酸的活性设为 100 时， 每个样品中的植酸形成磷酸的活性的比例。
进一步地， 堆肥形成磷酸的活性表明当把三天内将 1％ (w/w) 的堆肥中的磷酸完 全转化成水溶性磷酸的活性设为 100 时， 每个样品中的堆肥形成磷酸的活性的比例。
仍然进一步地， 在图中， 表示 100 的顶点的三角形面积设为 100， 计算内部三角形 面积的相对值作为每个样品的磷循环活性指标。表 13 所示为每个样品的磷循环指标。
表 13 ： 每个样品中的磷循环活性值的评价
样品编号 12 的土壤具有较高的磷循环活性指标， 可评价为植物更有可能吸收和 利用土壤中的磷酸。
3. 钾循环活性分析方法的结构
分析 10 个用途和施肥状态彼此不同的土壤样品 (11 号至 20 号 ) 的钾循环。
(3-1) 实验方法
3a) 土壤细菌数分析
用如上 1f) 中相同的 eDNA 分析方法测定土壤细菌数。
3b) 钾释放率的测定
称取 3.0g 土壤， 加入到 50ml 锥形烧瓶中， 再往里加入 40ml 0.5M 的硝酸， 用搅拌 器搅拌 60 分钟。 搅拌后， 将混合物过滤， 滤液就作为钾提取液。 用原子吸收光谱仪 (Z-2300， 日立高新技术， 东京 ) 测定提取液。 测定条件为 ： 乙炔和压缩空气分别作为燃料气体和负载 气体， 每个气体的压强均设为 0.5Mpa。 基于用钾标准溶液制作的校准曲线， 测定土壤中钾的 释放量， 作为起始日 ( 第 0 天 ) 的钾释放量。
用相同的方法测定 3 日后的钾释放量， 作为第 3 天的钾释放量。
进一步地， 称取 3.0g 取自与测定起始日同一天的土壤， 加入到 50ml 的锥形烧瓶 中， 加入 40ml 1M 乙酸铵水溶液 (pH 7.0)。用搅拌器搅拌混合物 60 分钟， 过滤。用原子吸 收光谱仪按上述相同的方法检测所得滤液， 测定目标土壤的钾的量。
基于所得的钾释放量以及目标土壤中钾的量， 用下式计算钾释放量。
[ 式 11]
3c) 堆肥形成钾的活性
将 100g 土壤样品加入到 250ml UM 样品瓶中， 充分搅拌。称取 3.0g 的该土壤， 加 入到 50ml 锥形烧瓶中， 再加入 40ml 的双蒸水。用搅拌器将混合物搅拌 60 分钟， 过滤， 所得 滤液作为钾提取液。用原子吸收光谱仪按上述 3b) 相同的方法检测该提取液， 测定钾的量 作为第 0 天的钾释放量。
进一步地， 将含有栽培土壤的树皮堆肥 ( “Hana-chan Baiyodo” (Hanagokoro， 名古 屋 )) 以 1％ (w/w) 的量加入到土壤样品中， 充分混合。将混合物室温静置 3 天。称取 3.0g 土壤， 加入到 50ml 锥形烧瓶中， 用上述方法提取钾。提取液进行原子吸收光谱仪检测， 计算 钾释放量， 设为第 3 天的钾释放量。
进一步地， 除使用堆肥而非土壤外， 用上述 3b) 相同的检测钾含量的方法检测堆 肥中的钾含量。
基于所得的第 0 天和第 3 天的钾释放量和堆肥中的钾含量， 用下式计算堆肥形成 钾的活性。
[ 式 12]
(3-2) 基于钾循环和土壤细菌数的土壤评价 用上述三项， 即土壤细菌数、 钾释放率和堆肥形成钾的活性， 制作如图 5 所示的图表。 图 5 中， 土壤细菌数表明当农用土地中土壤细菌数的平均值， 即 3.25×109 细胞 / g- 土壤设为 100 时， 每个样品中土壤细菌数的比例。
进一步地， 钾释放率表明当把三天内将土壤中的钾完全转化为游离钾的活性设为 100 时， 每个样品中的钾释放率。
进一步地， 堆肥形成钾的活性表明当把三天内将 1％ (w/w) 堆肥中的钾完全转化 成游离钾的活性设为 100 时， 每个样品中的堆肥形成钾的活性的比例。
仍然进一步地， 在图中， 表示 100 的顶点的三角形面积设为 100， 计算内部三角形 面积的相对值作为每个样品的钾循环活性指标。表 14 所示为每个样品的钾循环指标。
表 14 ： 每个样品中的钾循环活性的评价值
样品编号 11 的土壤具有较高的钾循环活性指标， 可评价为植物更有可能吸收和 利用土壤中的钾。
4. 分析综合诊断和植物之间的关系
用下述方法分析基于氮循环活性、 磷循环活性和钾循环活性的土壤综合诊断和植 物之间的关系。使用 10 个用途和施肥状态彼此不同的土壤样品 (11 号至 20 号 )。
(4-1) 实验方法
4a) 土壤细菌数分析
用如上 1f 中所述相同的 eDNA 分析方法测定土壤细菌数。
4b) 氮循环活性分析
以如第 1 项相同的方法分析氮循环活性。
4c) 磷循环活性分析
以如第 2 项相同的方法分析磷酸循环活性。
4d) 钾循环活性分析
以如第 3 项相同的方法分析钾循环活性。
4e) 植物分析
将土壤样品放到育苗钵中， 每个种植孔播种 10 颗小松菜的种子。小松菜种子在 6,000 勒克斯， 25℃下生长 1 个星期。将赤玉土 (Akadama- 土壤 ) 放入 1/5,000a 的花盆中， 每个花盆加入约 1kg 的土壤样品， 每个花盆移植三棵相同高度的实生苗。实生苗在 6,000 勒克斯， 25℃下生长 3 个星期， 检测小松菜地上部分的活体重。每个土壤样品测试 3 盆， 用 平均值进行评价。
(4-2) 分析综合诊断和植物之间的关系
基于所得的每个样品的指标总和， 进行土壤的综合诊断。 也即， 将指标总和除以 3， 所得值越高就诊断为土壤质量越优， 而所得值越低诊断为土壤质量越差。
进一步地， 研究诊断结果和小松菜活体重的关系。结果如表 15 所示。根据结果预 计， 土壤综合诊断结果越高， 土壤中植物生长越好。
进一步地， 表 16 所示为通过氨减少率、 植酸形成磷酸的活性和堆肥形成钾的活性 为顶点的三角形面积获得的诊断值。 根据结果也同样预计， 土壤综合诊断结果越高， 土壤中
植物生长越好。
进一步地， 预计用氮、 磷和钾的指标进行综合诊断而非单独诊断， 可以准确评价适 合植物生长的土壤质量。
根据上述结果， 预计本发明的诊断方法有助于判断土壤是否适合植物或有助于作 为土壤改良的指标。
表 15 ： 循环活性和综合评价的预测
表 16 ： 土壤的综合评价值和植物预测
5. 测定用于检测氨循环活性的基质施用量为了在各种土壤类型中检测氨态氮循环活性， 研究了施用的基质的量。以 4、 40、 400μg-N/g- 土壤的量施用基质硫酸铵。随时间测定氨态氮、 亚硝态氮和硝态氮的量 ( 图 6)。
根据图 6， 当以 4 和 40μg/g- 土壤的量施用硫酸铵时， 氨态氮在第 4 天几乎完全减 少了， 而硝态氮积累。当以 400μg/g- 土壤的量施用硫酸铵时， 氨态氮的量与起始测定值相 比， 差异较小。
测定各种农用土地类型中所含的氨态氮， 基本上所有类型的土壤的氨态氮的量在 0 ～ 100μg-N/g- 土壤的范围内。因而， 基于下述理由， 确定作为基质施用的氨态氮的量。
1) 考虑能够识别氨态氮显著变化且通常包含于土壤中作为标准的氨态氮的量， 并
且考虑施用基质的量可在 40 ～ 60μg/g- 土壤的范围内。考虑到易于计算， 最终确定的施 用量为 60μg/g- 土壤。
2) 为了快速检测， 确定在能最迅速且最确定地识别出氨态氮量的差别的第 3 天进 行评价。
6. 测定用于检测亚硝态氮循环活性的基质施用量
为了在各种土壤类型中检测亚硝态氮循环活性， 研究了施用的基质的量。 以 6、 60、 600μg-N/g- 土壤的量施用基质亚硝酸钾。 随时间测定氨态氮、 亚硝态氮和硝态氮的量 ( 图 7)。
根据图 7， 当以 60μg/g- 土壤的量施用亚硝酸钾时， 亚硝态氮在第 2 天至第 4 天几 乎完全减少了， 而硝态氮积累。当以 600μg/g- 土壤的量施用亚硝酸钾时， 确认亚硝态氮随 时间减少。然而， 当以 6μg/g- 土壤的量施用亚硝酸钾时， 确认亚硝态氮的量与起始测定值 相比， 差异较小， 因而难以进行评价。
在各种类型的农用土地土壤中几乎不含有亚硝态氮。然而， 硝态氮的量几乎与氨 态氮的量相同， 为 0 ～ 100μg-N/g- 土壤范围内。因而， 基于下述理由确定作为基质的亚硝 态氮的量。
1) 以一般的土壤中所含的亚硝态氮的量为标准， 其亚硝态氮的量被认为是能够确 认亚硝态氮显著变化的量。考虑到易于计算， 最终确定的施用量为 60ug/g- 土壤。
2) 与氨态氮的量相似， 确定在第 3 天对亚硝态氮的变化量进行评价。
7. 细菌数下限的根据
研究了各种土壤类型中硝化活性和细菌数的关系。图 8 所示为每天的硝化量。用 与上述 1f 中相同的 eDNA 分析方法测定土壤细菌数。硝化量表示氨态氮以 60μg-N/g 干土 壤的量施用到土壤并静置 1 天后， 测定的亚硝态氮和硝态氮的量之和。根据结果， 当微生物 数为 2 亿个 /g 以下时， 说明硝化反应停滞。
8. 综合诊断值的下限
如果氨减少率、 菲丁 (Phytin) 形成磷酸的活性和堆肥形成钾的活性的值分别等 于或小于 30、 10 和 5， 就不能判断土壤具有优良的质量。 以这些下限值为顶点形成的三角形 的面积和相应的以参考值为顶点的等边三角形的面积的比值为 1.7， 这些下限值位于从该 等边三角形的重心到相应顶点的线段上。 因而， 如果比值小于这个值， 就无法预期土壤中的 植物能生长良好。
表 17 ： 氮、 磷酸、 钾和综合诊断值的下限
9. 与现有技术的比较
在现有技术中， 对土壤中的营养素含量、 土壤 pH 值和 CEC( 碱基替换容量 (base substitution capacity)) 等进行测定并用于农作物生产。然而， 当施用时， 肥料如含有大 量有机物质的堆肥的作用不能通过这些值进行准确地确认。
测定灭菌的大田土壤和未灭菌的大田土壤 ( 二者源于相同的土地 ) 的氮循环活性 和小松菜活体重 ( 表 18)。以 2.5％的量向灭菌的土壤和未灭菌的土壤施用堆肥， 分析小松 菜的生长。两者都使用实验大田土壤。
两种土壤类型的化学性质 ( 化学分析值 ) 都相同。然而， 由于灭菌土壤不含有微 生物， 在灭菌土壤中氮循环活性较低 ( 刚灭菌后土壤是无菌的， 但由于实验是在开放的大 田中进行的， 外界微生物进入土壤， 微生物数量逐渐恢复 )。 因而， 小松菜的活体重较低。 因 此， 本发明可明显区分常规的化学分析不能区分的任何土壤类型， 因而有助于进行更准确
的土壤评价。
表 18 ： 具有不同循环活性的土壤中的植物
每个实验用 6 个样品。两种土壤类型的化学分析值是相同的。