与植物种子大小相关的蛋白及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及一种与植物种子大小相关的蛋白及其编码基因与应用。背景技术 水稻的粒型和粒重是水稻品质和产量的主要决定因素。最初发现的矮秆突变体 d1(dwarf 1) 的种子相对野生型显著变小， 其千粒重约是野生型的 40％。利用图位克隆方 法 (map-based cloning strategy) 和序列测定， 发现 D1 编码 G 蛋白 α 亚基， 其突变体表 型是因该基因有 833 碱基缺失而造成的隐性突变。表明 G 蛋白 α 亚基调控了种子的外形， 特别是种子长短的变化。近年来又成功克隆到一个位于水稻第 3 号染色体着丝粒附近、 控 制米粒长度 / 粒重的主效 QTL， 来源于明恢 63 中该基因的等位基因在川 7 的背景下会导致 粒长增加 1.80mm-3.87mm， 千粒重增加 1.50g-15.6g。利用川 7 和明恢 63 构建的近等基因 系， 将该 QTL/ 基因 (GS3) 精细定在 7.9kb 的物理区间内。对 GW2 的研究表明， GW2 作为一 个新的 E3 泛素连接酶可能参与降解促进细胞分裂的蛋白， 从而调控水稻颖壳大小、 控制粒 重以及产量， 在突变体 gw2 中谷壳的宽度、 粒重以及产量都得到了增加。 2008 年又克隆了一 个编码细胞壁蔗糖酶的水稻种子灌浆相关基因 GIF1， 突变体在形态和结实率上表现正常， 但灌浆程度比野生型低、 籽粒淀粉粒排列松散、 垩白度高， 最终的粒重比野生型低 24％、 直 链淀粉和支链淀粉含量也明显比野生型低。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植株种子粒型和 / 或粒重相关的蛋白及其编码基因。 本 发 明 提 供 的 蛋 白 质， 名 称 为 OsFBK12， 来 源 于 水 稻 (Oryza sativa L.cv Zhonghua10)， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ：
1) 由序列表中的序列 2 的氨基酸残基序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中的序列 2 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关由 1) 衍生的蛋白质。
上述序列表中的序列 2 由 431 个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的 取代和 / 或缺失和 / 或添加是指不超过 10 个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加。
所述蛋白 (OsFBK12) 的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白 (OsFBK12) 的编码基因为如下 1)-5) 中任一所述的 DNA 分子 ：
1) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 197-1492 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 148-1589 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
3) 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ；
4) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列杂交且与植物种子粒型或种子 长或种子宽或种子重相关的 DNA 分子 ；
5) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列至少具有 70％、 至少具有 75％、 至少具有 80％、
至少具有 85 ％、 至少具有 90 ％、 至少具有 95 ％、 至少具有 96 ％、 至少具有 97 ％、 至少具有 98％或至少具有 99％同源性且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关的 DNA 分 子。
上述序列表中的序列 1 由 1899 个核苷酸组成， 其 CDS 区为自 5’ 末端第 197-1492 位核苷酸。
所述严格条件可为在 0.1×SSPE( 或 0.1×SSC)， 0.1％ SDS 的溶液中， 在 65℃下杂 交并洗膜。
含有所述编码基因的重组载体、 重组菌、 转基因细胞系或表达盒也是本发明保护 的范围。
所述重组载体的启动子为玉米泛素启动子 UbiPro。
所述重组载体通过如下步骤获得 ：
1) 将 用 PstI 和 BamHI 酶 切 质 粒 KSP9 得 到 的 大 小 约 为 2.0kb 的 小 片 段 插 入 pUC19 的 PstI 和 BamH I 识 别 位 点 间 获 得 中 间 载 体 pUC19+UbiPro ； 再 用 SacI 和 EcoRI 酶切 pBI221 得到的小片段插入中间载体 pUC19+UbiPro 的 SacI 和 EcoRI 识别位点间， 获得中间载体 pUC19+UbiPro+Noster ； 再用 EcoRI 部分酶切和 HindIII 完全酶切中间载 体 pUC19+UbiPro+Noster 得到的大小约为 2.3kb 的片段插入 pCAMBIA1301 的 EcoR I 和 HindIII 识别位点间， 构成中间载体 pUN1301 ； 2) 将 OsFBK12 蛋白的编码基因插入中间载体 pUN1301 的 KpnI 和 BamHI 识别位点 间， 获得重组载体。
扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对 ； 所述引物对如下所示 ： 一条引物序 列如序列表中序列 3 所示， 另一条引物序列如序列表中序列 4 所示。
本发明的另一个目的是提供一种培育种子粒型改良的转基因植物的方法， 是将所 述的编码基因导入目的植物得到种子粒型改良的转基因植物。
所述粒型改良为如下 1)-3) 中的至少一种 ：
1) 所述转基因植物的种子粒长大于所述目的植物 ；
2) 所述转基因植物的种子粒宽大于所述目的植物 ；
3) 所述转基因植物的种子的粒重大于所述目的植物。
所述粒重为百粒重。
所述编码基因是通过所述重组载体导入所述目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物， 所述单子叶植物优选为水稻， 所述水 稻的品种尤其优选为中花 10 号。
本发明的实验证明， 将粳稻中花 10 号中克隆到的基因 OsFBK12 导入水稻中花十号 获得过过量表达 OsFBK12 基因的水稻， 同样将基因 OsFBK12 的正义、 反义片段导入水稻中 花十号获得转正义、 反义 OsFBK12 水稻， 发现过量表达 OsFBK12 基因的水稻和转正义、 反义 OsFBK12 水稻在种子粒型和粒重上发生明显的改变 ； 过表达水稻的种子粒长、 种子粒宽、 种 子的百粒重均大于所述目的植物。证实 OsFBK12 基因可以控制水稻粒型和粒重的变化， 为 将来育种提供基础。
附图说明图 1RT-PCR 方法扩增 OsFBK12 的全长 cDNA 图 2RT-PCR 方法扩增 OsFBK12 的用于 RNAi 构建的部分 cDNA 图 3 超表达载体的物理图谱 图 4RNAi 载体构建部分示意图 图 5 转基因水稻的荧光实时定量 PCR 鉴定 图 6 转基因水稻的表型观察具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 转 OsFBK12 水稻的获得
1、 OsFBK12 的克隆
根据数据库分析的结果设计引物， 5′端引物 ； 5′ -CGG GAT CCT CAG AAG AGC AGG AGGAA-3′ ( 下划线序列为 BamHI 位点 ； 序列 3)， 3′端引物 ： 5′ -GGG GTA CCG CTA CGG AGCATC AGG A-3′ ( 下划线序列为 KpnI 位点 ； 序列 4)， 提取水稻中花十号三叶期幼苗总 RNA 为模板， 采用 RT-PCR 方法扩增到 1296bp 片段。具体操作过程如下 ：
1) 植 物 总 RNA 的 提 取 ： 选 取 三 叶 期 水 稻 中 花 十 号 (Oryza sativa L.cv Zhonghua10)( 李梅芳， 水稻花培品种 - 中花 10 号， 农业科技通讯， 1998 年第 1 期第 26 页。 公 众可从中国科学院植物研究所获得。) 的幼苗 100mg 为材料， 在液氮中研磨， 将液氮中研碎 的冻干粉转入到含 1mlTrizol 试剂 (Invitrogen) 的 1.5ml 离心管中， 充分混匀 ； 25℃放置 5 分钟 ； 每管中加入 0.2ml 新鲜氯仿， 剧烈振摇 15 秒， 25℃温育 2-3 分钟 ； 12,000rpm， 4℃， 离心 15 分钟 ； 把上清的水相 0.5ml 转移到一个新的 1.5ml 离心管中， 加 0.5ml 异丙醇， 室温 放置 10 分钟使 RNA 沉淀 ； 12,000rpm， 4℃， 离心 10 分钟 ； 去上清， 将 RNA 沉淀用 1ml 75％乙 醇清洗 2 次， 超净台吹至半干 ； 用 50μlDEPC-ddH2O 重悬沉淀， 60℃水浴 10 分钟， 以溶解 RNA 沉淀。将此 RNA 溶液分装后 -70℃保存， 备做反转录的模板。
2)RT-PCR ： 取 1μl 上述 RNA 溶液， 用 DEPC-ddH2O 稀释 100 倍， 利用 600nm 光吸收在 分光光度计测定 RNA 浓度。参照 RT-PCR 试剂盒 (Promega) 说明书， 根据 RNA 的定量结果， 取 2μg 上述 RNA 溶液， 加 1.0μg Oligo dT 引物， 用 DEPC-ddH2O 补充至 15μl， 混匀后 70℃ 变性 5 分钟， 冰浴 5 分钟。短暂离心后， 加入 25μl 反转录混合物 (5μl M-MLV5×Reaction Buffer， 6μl dNTP Mixture(2.5mM)， 1μl M-MLV Reverse Transcriptase， 0.5μl RNase Inhibitor， 12.5μl DEPC-ddH2O)。混匀后， 42℃水浴 1 小时完成反转录过程 ； 75℃水浴 10 分钟使反转录酶失活， 得到含有第一链 cDNA 的混合物。
取 1μl 上 述 第 一 链 cDNA 作 为 PCR 的 模 板， 按 以 下 体 系 进 行 进 行 PCR 反 应 ： 0.2μlLA Taq(5U/μl)、 10μl 2×GC buffer， 1.8μl dNTPs， 0.5μl 5′端引物 (10μM， 序列 3)， 0.5μl 3′端引物 (10μM， 序列 4)， 加 ddH2O 终体积 20μl。引物序列如前， PCR 程序为 ： 94℃预变性 3 分钟后进入 PCR 循环， 循环参数为 94℃ 30 秒变性→ 58℃ 30 秒复性 → 72℃ 1 分钟延伸， 30 个循环后在 72℃继续合成 10 分钟。
扩增的 PCR 产物经过 0.8 ％的琼脂糖凝胶电泳分离， 结果如图 1 所示， 从图中 可 以 看 出， 得 到 分 子 量 大 约 1.3kb 的 条 带， 用 AxyPrep DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 (AxygenBiosciences) 回收该片断得到 20μl 回收产物。进行测序分析， 结果为该 PCR 产物具有序 列表中序列 1 的自 5’ 末端第 148-1589 位核苷酸序列， 序列 1 的 CDS 区为序列 1 自 5’ 末端 的第 197-1492 位核苷酸。该 PCR 产物的基因命名为 OsFBK12， OsFBK12 编码的蛋白命名为 OsFBK12， 该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。
2、 表达载体 pUN-FBK12 的获得
1) ： 含有 OsFBK12 的 cDNA 序列的载体 pTE-FBK12
取 3.5μl 上述 PCR 产物的回收产物， 加入 1μl(3U/μl)T4-DNA 连接酶、 5μl 2× 连接酶缓冲液、 0.5μl(50mg/ml)pGEM-T Easy 载体 (Promega)4℃连接过夜， 得到连接产物， 用连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞， 经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到含有重 组质粒大肠杆菌菌株。采用碱裂解法从该菌株中分离提取重组质粒， 选用 pGEM-T Easy 载 体上的 T7 和 SP6 启动子序列为引物测序， 测序结果为该重组质粒为将序列 1 的自 5‘末端 的第 148-1589 位核苷酸插入 pGEM-T Easy 载体得到， 将该重组质粒命名为 pTE-OsFBK12。
2)、 OsFBK12 超表达载体的构建
第一步 ： 剪取约 0.2g 玉米幼苗， 置于液氮中研磨 ； 然后加入 800μL 新配制的提取 缓冲液 ( 含 0.1M Tris-HCl pH8.0， 50mM EDTA， 0.5M NaCl， 1％ SDS 和 1％ β- 巯基乙醇 )， 剧烈振荡使其全部悬浮 ； 65℃水浴 30 分钟， 每 5 分钟颠倒混匀一次 ； 然后加入 250μL 预冷 的 5M 乙酸钾， 立即颠倒混匀， 冰浴 5 分钟 ； 加入等量酚 / 氯仿， 抽提一次， 12000rpm 离心 5 分 钟； 收集上清， 加入 0.6 倍体积的异丙醇沉淀 DNA， 室温放置 40 分钟 ； 4℃ 12000rpm 离心 15 分钟， 弃上清 ； 沉淀用 70％、 100％乙醇各洗一次 ； 干燥后， 溶于 20μL 含 100μg/mL RNaseA 的 ddH2O 中， 得到玉米基因组 DNA。
第二步 ： 取 上 述 玉 米 基 因 组 DNA 溶 液 2μL 作 为 模 板， 在 带 有 HindIII 识 别 位 点 的 5 ′ 引 物 (GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG) 和 带 有 BamHI 识 别 位 点 的 3 ′ 引 物 (CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG) 为引物， 进行 PCR 扩增， PCR 反应条件为 ： 先 94℃ 3 分 钟； 再 94℃ 45 秒， 62℃ 45 秒， 72℃ 2 分钟， 共 35 个循环， 最后 72℃ 10 分钟。反应结束后， 对 PCR 产物进行 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测， 表明得到长度为 1.98kb 的扩增片段， 与预期结 果相符， 回收该 PCR 产物， 再用限制性内切酶 Hind III 和 BamHI 双酶切后回收， 得到片段经 测序， 该 PCR 产物具有序列表中序列 5 自 5’ 末端的第 1-1986 位核苷酸， 为带有粘性末端的 玉米泛素启动子 (UbiPro)。( 玉米泛素启动子 (UbiPro) 也可以人工合成获得。)
第三步 ： 用限制性内切酶 Sac I 和 EcoR I 将 Noster poly A 终止序列从质粒载体 pBI 121( 北京拜尔迪生物技术有限公司产品货号 ： MP-091) 上切下， 插入到载体 pUC19( 北 京百泰克生物技术有限公司目录号 ： DP7801) 的 Sac I 和 EcoR I 识别位点间， 得到重组载 体， 命名为 pUC19-Noster。再用限制性内切酶 HindIII 和 BamHI 双酶切 pUC19-Noster， 琼 脂糖凝胶电泳检测后， 回收线性化的载体大片段， 并将该回收片段与第二步中获得的带有 粘性末端的玉米泛素启动子 (UbiPro) 相连， 得到重组载体， 命名为 pUN19。
第四步 ： 用限制性内切酶 EcoRI 部分酶切和 HindIII 完全酶切从第三步购建的重 组载体 pUN19 切下包含 UbiPro 和 Noster 的长度约为 2.3kb 的片段， 将该片段克隆入质粒载 体 pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture， www.cambia.org) 的 EcoRI 和 HindIII 位 点 处， 得 到 重 组 载 体， 命名为 pUN1301。3) ： 表达载体 pUN-FBK12 的获得
用限制性内切酶 KpnI 和 BamHI 对 B 步骤获得的质粒 pUN1301 进行双酶切， 酶切体 系为 ： 质粒 10μl、 10x 酶切缓冲液 5μl、 KpnI 1μl(10U/μl)、 BamHI 0.8μl(10U/μl)， 加 ddH2O 补充反应体系至 50μl， 37℃酶切 4 小时。 用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离， 用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 (Axygen Biosciences) 回收线性化的 pUN1301 大片段， 溶于 20μl ddH2O 中。
先用 KpnI 酶对上述获得 pTE-OsFBK12 进行部分酶切， 酶切体系为 ： 质粒 10μl， 酶切缓冲液 5μl、 KpnI 1μl(10U/μl)、 加 ddH2O 补充反应体系至 50μl， 37℃酶切 4 个小 时； 再加入 BamHI 0.2μl(10U/μl)， 37℃酶切 20 分钟。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进 行分离， 用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收 1300bp 的 OsFBK12 cDNA 片段。
将 10μl 上述回收的 1300bp 的 OsFBK12cDNA 溶液、 6μl 回收的载体 pUN1301 大片 段溶液， 与 2μl(3U/μl)T4DNA 连接酶和 2μl 10x 连接酶缓冲液混和， 16℃连接 16 小时， 得到的连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞， 经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性 克隆。提取阳性克隆中的质粒进行测序鉴定， 结果为该质粒为将序列表序列 1 的自 5’ 末端 第 148-1589 位核苷酸插入到载体 pUN1301 的 KpnI 和 BamHI 的识别位点间得到的， 且启动 子玉米泛素启动子 (UbiPro)、 基因和终止子的结构正确， 将该质粒命名为 pUN-FBK12， 构建 成功植物表达载体， 该表达载体的物理图谱示意图如图 3 所示。 3、 含有 OsFBK12 正、 反义片段的 RNAi 载体 pTCK-FBK12 的获得
正反义片段的获得 ： 设计分别含有酶切点的上游引物 FBK12F(5 ′ -GG GGT ACC ACTAGT AGT ATG ACA AGC AAA ACA-3， 下划线序列为 KpnI-SpeI 位点 ) 以及含有酶切点的 下游引物 FBK12R(5′ -CG GGA TCC GAG CTC TCA GGA CTG AAG CAA TT-3， 下划线序列为 BamHI-SacI 位点 )， 提取水稻中花十号 (Oryza sativa L.cv Zhonghua 10) 的幼苗的 RNA 反转录获得的第一链 cDNA 作为 PCR 的模板， 按以下体系进行 PCR 反应 ： 0.2μl LA Taq， 10μl 2×GC buffer， 1.8μl dNTP， 0.5μl 上 游 引 物 FBK12F(10μM)， 0.5μl 下 游 引 物 FBK12R(10μM)， 加 ddH2O 终体积 20μl。PCR 程序为 ： 94℃预变性 3 分钟， 进入 PCR 循环， 循 环参数为 94℃ 30 秒变性→ 58℃ 30 秒复性→ 72℃ 1 分钟延伸， 30 个循环后在 72℃继续合 成 10 分钟。用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行分离， 得到 376bpPCR 产物 ( 图 2)， 经过测 序， 该 PCR 产物具有序列表中序列 1 自 5’ 末端的第 1242-1578 位核苷酸。取 10μl 上述 PCR 产物通过 SpeI/SacI 双酶切， 获得长度为 354bp 的正义 OsFBK12 片段 ； 另取 10μl 上述 PCR 产物通过 BamH1/KpnI 双酶切， 获得长度为 366bp 的反义的 OsFBK12 片段， 将获得的正、 反义片段与 RNAi 载体的连接。
具体方法如下 ：
以下关于质粒的提取、 连接、 对大肠杆菌的转化以及阳性克隆的筛选均参照实验 2 中相应的方法。
RNAi 载 体 的 获 得 ： 用 SpeI/SacI 酶 切 载 体 质 粒 pTCK303(A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice.Wang et al.， 2004， Plant Mol Biol Rep 22 ： 409-417， 公众可从中国科学院植物研究所获得。)， 用 AxyPrep DNA 凝 胶回收试剂盒回收 pTCK303 载体片段。将上述获得的正义的 OsFBK12 片段与上述回收 的 pTCK303 载体片段连接， 将连接产物转化大肠杆菌得到转化子， 将转化子提取的质粒经
SpeI/SacI 双酶切， 获得长度为 354bp 片段的质粒为含有 OsFBK12 正义片段的阳性质粒， 命 名为 pTCK303- 正义 FBK12。将 pTCK303- 正义 FBK12， 再经 BamHI/KpnI 双酶切， 将回收片 段与上述获得的反义的 OsFBK12 片段连接， 将连接产物转化大肠杆菌得到转化子。提取转 化子的质粒为模板， 用上游引物 FBK12F1(5′ -ATG ACA AGC AAA ACA-3′ ) 以及下游引物 FBK12R1(5′ -TCA GGA CTG AAG CAA TT-3′ ) 为模板， 按以下体系进行 PCR 反应 ： 0.2μl LA Taq， 10μl 2×GC buffer， 1.8μl dNTP， 0.5μl 上游引物 FBK12F1(10μM)， 0.5μl 下 游引物 FBK12R1(10μM)， 加 ddH2O 终体积 20μl。PCR 程序为 ： 94℃预变性 3 分钟， 进入 PCR 循环， 循环参数为 94℃ 30 秒变性→ 58℃ 30 秒复性→ 72℃ 1 分钟延伸， 30 个循环后在 72℃ 继续合成 10 分钟。用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行分离， 得到 348bp 的片段。
提取转化子的质粒， 用限制性内切酶 SacI 和 BamHI 进行双酶切， 酶切体系为 ： 质粒 6μl、 10x 酶切缓冲液 5μl、 SacI 1μl(10U/μl)、 BamHI 0.8μl(10U/μl)， 加 ddH2O 补充 反应体系至 50μl， 37℃酶切 4 小时。 用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离。 得到 1200bp 的片段。
将上述 PCR 鉴定得到 348bp 的片段且酶切鉴定得到 1200bp 的片段的质粒为阳性 质粒， 命名为 pTCK-FBK12。进一步测序验证 pTCK-FBK12， 证实 pTCK-FBK12 的结构是 ： 在 pTCK303 载体的 SpeI/SacI 间插入序列表中的序列 1 自 5’ 末端的第 1242-1578 位核苷酸和 在 pTCK303 载体的 BamHI/KpnI 间插入序列表中的序列 1 自 5’ 末端的第 1242-1578 位核苷 酸的反向互补序列。从该载体的部分结构示意图 ( 见图 4) 可以看出， 在该载体中 OsFBK12 正、 反义片段中间由 500bp 左右的水稻的内含子序列隔开。
上述验证结果表明， pTCK-FBK12 为含有 OsFBK12 正、 反义片段的 RNAi 载体。
4、 转 OsFBK12 水稻的获得
遗传转化 ： 参 照 电 激 仪 (EasyJecT Plus 电 激 仪， 英 国 EquiBio 公 司 ) 操 作 指 南， 分 别 将 上 述 获 得 的 载 体 pUN-FBK12 和 pTCK-FBK12 分 别 用 电 击 法 转 化 农 杆 菌 EHA105(Biovector Co.， LTD 产品货号 Biovec-11) 菌株， 经含卡那霉素的抗性平板筛选 分别得到的超表达工程菌和 RNAi 工程菌， 将超表达工程菌提取质粒， 经 KpnI 和 BamHI 酶切得到 1300bp 片段的质粒， 其对应的工程菌为阳性的超表达工程菌， 命名为 EHA105/ pUN-FBK12 ； 将 RNAi 工程菌提取质粒， 经 SacI 和 BamHI 酶切得到 1200bp 片段的质粒， 其对 应的工程菌为阳性 RNAi 工程菌， 命名为 EHA105/pTCK-FBK12。
水稻阳性苗的筛选分化 ： 将上述获得的 EHA105/pUN-FBK12 和 EHA105/pTCK-FBK12 分别导入中花 10 号水稻 (Oryza sativa L.cv Zhonghua 10) 的愈伤组织， 再分别将导入 EHA105/pUN-FBK12 和 EHA105/pTCK-FBK12 的愈伤组织用含 300mg/L 头孢霉素的无菌水洗涤 4-5 遍， 无菌滤纸吸干后转至 N6D2S1 培养基上， 筛选一代。两周后， 转移至 N6D2S2 培养基上筛 选二代 (2 周 / 代 )。取出经过 3 代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织， 转移至预分化培养基上， 在分化培养箱 (12 小时光周期， 白天 28℃， 夜晚 25℃ ) 中培养 7 天 ； 然后转移至分化培养基 上， 在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的苗在生根壮苗培养基上生根壮苗。待小苗 长至 10 厘米左右时， 打开容器封口膜， 炼苗 2-3 天， 然后将小苗移入人工气候室栽培， 分别 获得 15 株 T0 代转 pUN-FBK12 水稻 ( 即转 OsFBK12 水稻 ) 和 65 株 T0 代转 pTCK-FBK12 水 稻 ( 即转正、 反义 OsFBK12 水稻 )。
表 1 水稻组织培养和转化过程中使用的培养基及其成分实施例 2、 转 OsFBK12 水稻的表型观察
1、 转 OsFBK12 水稻的验证
转基因苗的 GUS 鉴定 ：
分 别 从 T0 代 转 OsFBK12 水 稻 和 T0 代 转 正、 反 义 OsFBK12 水 稻 上 收 获 T1 代 转 OsFBK12 水稻和 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻的种子， 播种获 85 株 T1 代转 OsFBK12 水稻 幼苗和 120 株 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻幼苗。剪取 2-3mm 的幼苗叶片材料放到 GUS 染色液中， 抽气几分钟， 然后置于 37℃温育过夜， 染色后的组织用 70％乙醇脱色。叶片呈 蓝色的即为阳性植株， 获得 63 株阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻和 106 株阳性 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻。GUS 染色液 (pH 7.0) 组分为 ： 100mM Na3PO4(pH 7.0)， 0.1％ Triton X-100， 10mM EDTA， 0.5mM 亚铁氰化钾， 0.5mM 铁氰化钾， 1mg/ml X-Gluc。
转基因植株的定量 PCR 鉴定 ： 分别提取上述鉴定获得的 10 株阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻和 15 株阳性 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻的 RNA， 并反转录获得第一链 cDNA。利用 荧光实时定量 PCR 法， 以基因特异序列为引物对转基因植株中 OsFBK12 的表达丰度进行检
测。用于定量分析的试剂为 SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)。所用仪器 为美国 Stratagene 公司实时荧光定量 PCR 仪 Mx3000P。吸取 1μl 第一链 cDNA 溶液， 稀释 50 倍作为模板， 按以下体系进行 PCR 反应 ： 10μl SYBR Green Realtime PCRMaster Mix， 4μl 模版， 1μl 5′端引物 (10μM)(5′ -CTG TAC AGA TCA CGG CA-3′ )， 1μl 3′端引 物 (10μM)(5′ -TCT TTC CTC CTG CTC TTC-3′ )， 加 ddH2O 终体积 20μl。用 Actin 作为 内参， 其 5′端引物 ： 5′ -ACC ACA GGT ATT GTG TTG GAC TC-3′， 3′端引物为 ： 5′ -AGA GCA TAT CCT TCA TAG ATG GG-3′。PCR 程序为 ： 预变性 2 分钟， 进入 PCR 循环， 循环参数 为 94℃ 15 秒→ 58℃ 15 秒→ 72℃ 15 秒， 共 40 个循环。
以野生型水稻 ( 中花 10 号， WT) 为对照， 结果如图 5 所示， 从图中可以看出， 在 Actin 基因作为内参的情况下， 阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻 ( 株系编号为 OX9) 和阳性 T1 代 转正、 反义 OsFBK12 水稻 ( 株系编号为 R4、 R10、 R12) 的表达丰度有了不同程度的上调和下 调， 说明目的基因 OsFBK12 已经成功导入水稻， 并且发挥了功能。
采用同样的方法分别将空载体 pUN1301 和 pTCK303 转入水稻中花十号 (Oryza sativa L.cv Zhonghua 10) 中分别获得 T0 代转 pUN1301 水稻和 T0 代转 pTCK303 水稻， 从 T0 代转 pUN1301 水稻和 T0 代转 pTCK303 水稻收获得到 T1 代转 pUN1301 水稻和 T1 代转 pTCK303 水稻， 从 T1 代转 pUN1301 水稻和 T1 代转 pTCK303 水稻收获得到 T2 代转 pUN1301 水稻和 T2 代转 pTCK303 水稻
2、 转 OsFBK12 水稻的表型分析
将上述 GUS 检测后的 53 株阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻和 90 株阳性 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻幼苗移栽到网室中种植。 自然光周期下生长约五个月后 (5 月 10 日一 10 月 20 日 )， 从 T1 代转 OsFBK12 水稻和 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻上分别收获 T2 代转 OsFBK12 水稻种子和 T2 代转正、 反义 OsFBK12 水稻种子。以 T2 代转 pUN1301 水稻、 T2 代转 pTCK303 水稻和野生型水稻 ( 中花 10 号 ) 的种子为对照。
种子表型如图 6A 所示， 从图中显示与野生型水稻相比， T2 代转 OsFBK12 水稻 (OX9) 种子变大 ； T2 代转正、 反义 OsFBK12 水稻种子 (R4、 R10、 R12) 变小。
图 6B、 6C 和 6D 分别是对种子的粒长、 粒宽及百粒重统计图， 实验重复三次， 结果 取平均值。结果表明 ： 野生型水稻 ( 中花 10 号 ； WT) 粒长、 粒宽和百粒重分别是 0.503cm、 0.269cm 和 2.249g， T2 代转 OsFBK12 水稻株系 OX9 种子的粒长是野生型的 104％ (0.526cm)、 粒宽是野生型的 102 ％ (0.276cm)、 百粒重是野生型的 130 ％ (2.93g) ； T2 代转正、 反义 OsFBK12 水稻株系 4 号 (R4)、 10 号 (R10) 和 12(R12) 号株系种子的粒长分别为野生型 84％ (0.421cm)、 85％ (0.427cm)、 85％ (0.429cm)， 它们的粒宽分别为野生型的 85％ (0.229cm)、 86 ％ (0.232cm)、 90 ％ (0.242cm)， 它 们 的 百 粒 重 分 别 为 野 生 型 的 75 ％ (1.686g)、 75 ％ (1.68g)、 77％ (1.736g)。这些变化与其表达量的变化基本吻合。
本发明涉及一种与植物种子大小相关的蛋白及其编码基因与应用。背景技术 水稻的粒型和粒重是水稻品质和产量的主要决定因素。最初发现的矮秆突变体 d1(dwarf 1) 的种子相对野生型显著变小， 其千粒重约是野生型的 40％。利用图位克隆方 法 (map-based cloning strategy) 和序列测定， 发现 D1 编码 G 蛋白 α 亚基， 其突变体表 型是因该基因有 833 碱基缺失而造成的隐性突变。表明 G 蛋白 α 亚基调控了种子的外形， 特别是种子长短的变化。近年来又成功克隆到一个位于水稻第 3 号染色体着丝粒附近、 控 制米粒长度 / 粒重的主效 QTL， 来源于明恢 63 中该基因的等位基因在川 7 的背景下会导致 粒长增加 1.80mm-3.87mm， 千粒重增加 1.50g-15.6g。利用川 7 和明恢 63 构建的近等基因 系， 将该 QTL/ 基因 (GS3) 精细定在 7.9kb 的物理区间内。对 GW2 的研究表明， GW2 作为一 个新的 E3 泛素连接酶可能参与降解促进细胞分裂的蛋白， 从而调控水稻颖壳大小、 控制粒 重以及产量， 在突变体 gw2 中谷壳的宽度、 粒重以及产量都得到了增加。 2008 年又克隆了一 个编码细胞壁蔗糖酶的水稻种子灌浆相关基因 GIF1， 突变体在形态和结实率上表现正常， 但灌浆程度比野生型低、 籽粒淀粉粒排列松散、 垩白度高， 最终的粒重比野生型低 24％、 直 链淀粉和支链淀粉含量也明显比野生型低。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植株种子粒型和 / 或粒重相关的蛋白及其编码基因。 本 发 明 提 供 的 蛋 白 质， 名 称 为 OsFBK12， 来 源 于 水 稻 (Oryza sativa L.cv Zhonghua10)， 是如下 1) 或 2) 的蛋白质 ：
1) 由序列表中的序列 2 的氨基酸残基序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中的序列 2 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关由 1) 衍生的蛋白质。
上述序列表中的序列 2 由 431 个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的 取代和 / 或缺失和 / 或添加是指不超过 10 个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加。
所述蛋白 (OsFBK12) 的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白 (OsFBK12) 的编码基因为如下 1)-5) 中任一所述的 DNA 分子 ：
1) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 197-1492 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 148-1589 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
3) 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ；
4) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列杂交且与植物种子粒型或种子 长或种子宽或种子重相关的 DNA 分子 ；
5) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列至少具有 70％、 至少具有 75％、 至少具有 80％、
1) 由序列表中的序列 2 的氨基酸残基序列组成的蛋白质 ；
2) 将序列表中的序列 2 氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 缺失和 / 或添加且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关由 1) 衍生的蛋白质。
上述序列表中的序列 2 由 431 个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的 取代和 / 或缺失和 / 或添加是指不超过 10 个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加。
所述蛋白 (OsFBK12) 的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白 (OsFBK12) 的编码基因为如下 1)-5) 中任一所述的 DNA 分子 ：
1) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 197-1492 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 148-1589 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
3) 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ；
4) 在严格条件下与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列杂交且与植物种子粒型或种子 长或种子宽或种子重相关的 DNA 分子 ；
5) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列至少具有 70％、 至少具有 75％、 至少具有 80％、
至少具有 85 ％、 至少具有 90 ％、 至少具有 95 ％、 至少具有 96 ％、 至少具有 97 ％、 至少具有 98％或至少具有 99％同源性且与植物种子粒型或种子长或种子宽或种子重相关的 DNA 分 子。
上述序列表中的序列 1 由 1899 个核苷酸组成， 其 CDS 区为自 5’ 末端第 197-1492 位核苷酸。
所述严格条件可为在 0.1×SSPE( 或 0.1×SSC)， 0.1％ SDS 的溶液中， 在 65℃下杂 交并洗膜。
含有所述编码基因的重组载体、 重组菌、 转基因细胞系或表达盒也是本发明保护 的范围。
所述重组载体的启动子为玉米泛素启动子 UbiPro。
所述重组载体通过如下步骤获得 ：
1) 将 用 PstI 和 BamHI 酶 切 质 粒 KSP9 得 到 的 大 小 约 为 2.0kb 的 小 片 段 插 入 pUC19 的 PstI 和 BamH I 识 别 位 点 间 获 得 中 间 载 体 pUC19+UbiPro ； 再 用 SacI 和 EcoRI 酶切 pBI221 得到的小片段插入中间载体 pUC19+UbiPro 的 SacI 和 EcoRI 识别位点间， 获得中间载体 pUC19+UbiPro+Noster ； 再用 EcoRI 部分酶切和 HindIII 完全酶切中间载 体 pUC19+UbiPro+Noster 得到的大小约为 2.3kb 的片段插入 pCAMBIA1301 的 EcoR I 和 HindIII 识别位点间， 构成中间载体 pUN1301 ； 2) 将 OsFBK12 蛋白的编码基因插入中间载体 pUN1301 的 KpnI 和 BamHI 识别位点 间， 获得重组载体。
扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对 ； 所述引物对如下所示 ： 一条引物序 列如序列表中序列 3 所示， 另一条引物序列如序列表中序列 4 所示。
本发明的另一个目的是提供一种培育种子粒型改良的转基因植物的方法， 是将所 述的编码基因导入目的植物得到种子粒型改良的转基因植物。
所述粒型改良为如下 1)-3) 中的至少一种 ：
1) 所述转基因植物的种子粒长大于所述目的植物 ；
2) 所述转基因植物的种子粒宽大于所述目的植物 ；
3) 所述转基因植物的种子的粒重大于所述目的植物。
所述粒重为百粒重。
所述编码基因是通过所述重组载体导入所述目的植物中。
所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物， 所述单子叶植物优选为水稻， 所述水 稻的品种尤其优选为中花 10 号。
本发明的实验证明， 将粳稻中花 10 号中克隆到的基因 OsFBK12 导入水稻中花十号 获得过过量表达 OsFBK12 基因的水稻， 同样将基因 OsFBK12 的正义、 反义片段导入水稻中 花十号获得转正义、 反义 OsFBK12 水稻， 发现过量表达 OsFBK12 基因的水稻和转正义、 反义 OsFBK12 水稻在种子粒型和粒重上发生明显的改变 ； 过表达水稻的种子粒长、 种子粒宽、 种 子的百粒重均大于所述目的植物。证实 OsFBK12 基因可以控制水稻粒型和粒重的变化， 为 将来育种提供基础。
附图说明图 1RT-PCR 方法扩增 OsFBK12 的全长 cDNA 图 2RT-PCR 方法扩增 OsFBK12 的用于 RNAi 构建的部分 cDNA 图 3 超表达载体的物理图谱 图 4RNAi 载体构建部分示意图 图 5 转基因水稻的荧光实时定量 PCR 鉴定 图 6 转基因水稻的表型观察具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 转 OsFBK12 水稻的获得
1、 OsFBK12 的克隆
根据数据库分析的结果设计引物， 5′端引物 ； 5′ -CGG GAT CCT CAG AAG AGC AGG AGGAA-3′ ( 下划线序列为 BamHI 位点 ； 序列 3)， 3′端引物 ： 5′ -GGG GTA CCG CTA CGG AGCATC AGG A-3′ ( 下划线序列为 KpnI 位点 ； 序列 4)， 提取水稻中花十号三叶期幼苗总 RNA 为模板， 采用 RT-PCR 方法扩增到 1296bp 片段。具体操作过程如下 ：
1) 植 物 总 RNA 的 提 取 ： 选 取 三 叶 期 水 稻 中 花 十 号 (Oryza sativa L.cv Zhonghua10)( 李梅芳， 水稻花培品种 - 中花 10 号， 农业科技通讯， 1998 年第 1 期第 26 页。 公 众可从中国科学院植物研究所获得。) 的幼苗 100mg 为材料， 在液氮中研磨， 将液氮中研碎 的冻干粉转入到含 1mlTrizol 试剂 (Invitrogen) 的 1.5ml 离心管中， 充分混匀 ； 25℃放置 5 分钟 ； 每管中加入 0.2ml 新鲜氯仿， 剧烈振摇 15 秒， 25℃温育 2-3 分钟 ； 12,000rpm， 4℃， 离心 15 分钟 ； 把上清的水相 0.5ml 转移到一个新的 1.5ml 离心管中， 加 0.5ml 异丙醇， 室温 放置 10 分钟使 RNA 沉淀 ； 12,000rpm， 4℃， 离心 10 分钟 ； 去上清， 将 RNA 沉淀用 1ml 75％乙 醇清洗 2 次， 超净台吹至半干 ； 用 50μlDEPC-ddH2O 重悬沉淀， 60℃水浴 10 分钟， 以溶解 RNA 沉淀。将此 RNA 溶液分装后 -70℃保存， 备做反转录的模板。
2)RT-PCR ： 取 1μl 上述 RNA 溶液， 用 DEPC-ddH2O 稀释 100 倍， 利用 600nm 光吸收在 分光光度计测定 RNA 浓度。参照 RT-PCR 试剂盒 (Promega) 说明书， 根据 RNA 的定量结果， 取 2μg 上述 RNA 溶液， 加 1.0μg Oligo dT 引物， 用 DEPC-ddH2O 补充至 15μl， 混匀后 70℃ 变性 5 分钟， 冰浴 5 分钟。短暂离心后， 加入 25μl 反转录混合物 (5μl M-MLV5×Reaction Buffer， 6μl dNTP Mixture(2.5mM)， 1μl M-MLV Reverse Transcriptase， 0.5μl RNase Inhibitor， 12.5μl DEPC-ddH2O)。混匀后， 42℃水浴 1 小时完成反转录过程 ； 75℃水浴 10 分钟使反转录酶失活， 得到含有第一链 cDNA 的混合物。
取 1μl 上 述 第 一 链 cDNA 作 为 PCR 的 模 板， 按 以 下 体 系 进 行 进 行 PCR 反 应 ： 0.2μlLA Taq(5U/μl)、 10μl 2×GC buffer， 1.8μl dNTPs， 0.5μl 5′端引物 (10μM， 序列 3)， 0.5μl 3′端引物 (10μM， 序列 4)， 加 ddH2O 终体积 20μl。引物序列如前， PCR 程序为 ： 94℃预变性 3 分钟后进入 PCR 循环， 循环参数为 94℃ 30 秒变性→ 58℃ 30 秒复性 → 72℃ 1 分钟延伸， 30 个循环后在 72℃继续合成 10 分钟。
扩增的 PCR 产物经过 0.8 ％的琼脂糖凝胶电泳分离， 结果如图 1 所示， 从图中 可 以 看 出， 得 到 分 子 量 大 约 1.3kb 的 条 带， 用 AxyPrep DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 (AxygenBiosciences) 回收该片断得到 20μl 回收产物。进行测序分析， 结果为该 PCR 产物具有序 列表中序列 1 的自 5’ 末端第 148-1589 位核苷酸序列， 序列 1 的 CDS 区为序列 1 自 5’ 末端 的第 197-1492 位核苷酸。该 PCR 产物的基因命名为 OsFBK12， OsFBK12 编码的蛋白命名为 OsFBK12， 该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。
2、 表达载体 pUN-FBK12 的获得
1) ： 含有 OsFBK12 的 cDNA 序列的载体 pTE-FBK12
取 3.5μl 上述 PCR 产物的回收产物， 加入 1μl(3U/μl)T4-DNA 连接酶、 5μl 2× 连接酶缓冲液、 0.5μl(50mg/ml)pGEM-T Easy 载体 (Promega)4℃连接过夜， 得到连接产物， 用连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞， 经含羧苄青霉素的抗性平板筛选得到含有重 组质粒大肠杆菌菌株。采用碱裂解法从该菌株中分离提取重组质粒， 选用 pGEM-T Easy 载 体上的 T7 和 SP6 启动子序列为引物测序， 测序结果为该重组质粒为将序列 1 的自 5‘末端 的第 148-1589 位核苷酸插入 pGEM-T Easy 载体得到， 将该重组质粒命名为 pTE-OsFBK12。
2)、 OsFBK12 超表达载体的构建
第一步 ： 剪取约 0.2g 玉米幼苗， 置于液氮中研磨 ； 然后加入 800μL 新配制的提取 缓冲液 ( 含 0.1M Tris-HCl pH8.0， 50mM EDTA， 0.5M NaCl， 1％ SDS 和 1％ β- 巯基乙醇 )， 剧烈振荡使其全部悬浮 ； 65℃水浴 30 分钟， 每 5 分钟颠倒混匀一次 ； 然后加入 250μL 预冷 的 5M 乙酸钾， 立即颠倒混匀， 冰浴 5 分钟 ； 加入等量酚 / 氯仿， 抽提一次， 12000rpm 离心 5 分 钟； 收集上清， 加入 0.6 倍体积的异丙醇沉淀 DNA， 室温放置 40 分钟 ； 4℃ 12000rpm 离心 15 分钟， 弃上清 ； 沉淀用 70％、 100％乙醇各洗一次 ； 干燥后， 溶于 20μL 含 100μg/mL RNaseA 的 ddH2O 中， 得到玉米基因组 DNA。
第二步 ： 取 上 述 玉 米 基 因 组 DNA 溶 液 2μL 作 为 模 板， 在 带 有 HindIII 识 别 位 点 的 5 ′ 引 物 (GGAAGCTTCTGCAGTGCAGCGTGACCCGG) 和 带 有 BamHI 识 别 位 点 的 3 ′ 引 物 (CGGGATCCAAGTAACACCAAACAACAGGG) 为引物， 进行 PCR 扩增， PCR 反应条件为 ： 先 94℃ 3 分 钟； 再 94℃ 45 秒， 62℃ 45 秒， 72℃ 2 分钟， 共 35 个循环， 最后 72℃ 10 分钟。反应结束后， 对 PCR 产物进行 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测， 表明得到长度为 1.98kb 的扩增片段， 与预期结 果相符， 回收该 PCR 产物， 再用限制性内切酶 Hind III 和 BamHI 双酶切后回收， 得到片段经 测序， 该 PCR 产物具有序列表中序列 5 自 5’ 末端的第 1-1986 位核苷酸， 为带有粘性末端的 玉米泛素启动子 (UbiPro)。( 玉米泛素启动子 (UbiPro) 也可以人工合成获得。)
第三步 ： 用限制性内切酶 Sac I 和 EcoR I 将 Noster poly A 终止序列从质粒载体 pBI 121( 北京拜尔迪生物技术有限公司产品货号 ： MP-091) 上切下， 插入到载体 pUC19( 北 京百泰克生物技术有限公司目录号 ： DP7801) 的 Sac I 和 EcoR I 识别位点间， 得到重组载 体， 命名为 pUC19-Noster。再用限制性内切酶 HindIII 和 BamHI 双酶切 pUC19-Noster， 琼 脂糖凝胶电泳检测后， 回收线性化的载体大片段， 并将该回收片段与第二步中获得的带有 粘性末端的玉米泛素启动子 (UbiPro) 相连， 得到重组载体， 命名为 pUN19。
第四步 ： 用限制性内切酶 EcoRI 部分酶切和 HindIII 完全酶切从第三步购建的重 组载体 pUN19 切下包含 UbiPro 和 Noster 的长度约为 2.3kb 的片段， 将该片段克隆入质粒载 体 pCAMBIA1301(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture， www.cambia.org) 的 EcoRI 和 HindIII 位 点 处， 得 到 重 组 载 体， 命名为 pUN1301。3) ： 表达载体 pUN-FBK12 的获得
用限制性内切酶 KpnI 和 BamHI 对 B 步骤获得的质粒 pUN1301 进行双酶切， 酶切体 系为 ： 质粒 10μl、 10x 酶切缓冲液 5μl、 KpnI 1μl(10U/μl)、 BamHI 0.8μl(10U/μl)， 加 ddH2O 补充反应体系至 50μl， 37℃酶切 4 小时。 用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离， 用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 (Axygen Biosciences) 回收线性化的 pUN1301 大片段， 溶于 20μl ddH2O 中。
先用 KpnI 酶对上述获得 pTE-OsFBK12 进行部分酶切， 酶切体系为 ： 质粒 10μl， 酶切缓冲液 5μl、 KpnI 1μl(10U/μl)、 加 ddH2O 补充反应体系至 50μl， 37℃酶切 4 个小 时； 再加入 BamHI 0.2μl(10U/μl)， 37℃酶切 20 分钟。用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进 行分离， 用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收 1300bp 的 OsFBK12 cDNA 片段。
将 10μl 上述回收的 1300bp 的 OsFBK12cDNA 溶液、 6μl 回收的载体 pUN1301 大片 段溶液， 与 2μl(3U/μl)T4DNA 连接酶和 2μl 10x 连接酶缓冲液混和， 16℃连接 16 小时， 得到的连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞， 经含卡那霉素的抗性平板筛选得到阳性 克隆。提取阳性克隆中的质粒进行测序鉴定， 结果为该质粒为将序列表序列 1 的自 5’ 末端 第 148-1589 位核苷酸插入到载体 pUN1301 的 KpnI 和 BamHI 的识别位点间得到的， 且启动 子玉米泛素启动子 (UbiPro)、 基因和终止子的结构正确， 将该质粒命名为 pUN-FBK12， 构建 成功植物表达载体， 该表达载体的物理图谱示意图如图 3 所示。 3、 含有 OsFBK12 正、 反义片段的 RNAi 载体 pTCK-FBK12 的获得
正反义片段的获得 ： 设计分别含有酶切点的上游引物 FBK12F(5 ′ -GG GGT ACC ACTAGT AGT ATG ACA AGC AAA ACA-3， 下划线序列为 KpnI-SpeI 位点 ) 以及含有酶切点的 下游引物 FBK12R(5′ -CG GGA TCC GAG CTC TCA GGA CTG AAG CAA TT-3， 下划线序列为 BamHI-SacI 位点 )， 提取水稻中花十号 (Oryza sativa L.cv Zhonghua 10) 的幼苗的 RNA 反转录获得的第一链 cDNA 作为 PCR 的模板， 按以下体系进行 PCR 反应 ： 0.2μl LA Taq， 10μl 2×GC buffer， 1.8μl dNTP， 0.5μl 上 游 引 物 FBK12F(10μM)， 0.5μl 下 游 引 物 FBK12R(10μM)， 加 ddH2O 终体积 20μl。PCR 程序为 ： 94℃预变性 3 分钟， 进入 PCR 循环， 循 环参数为 94℃ 30 秒变性→ 58℃ 30 秒复性→ 72℃ 1 分钟延伸， 30 个循环后在 72℃继续合 成 10 分钟。用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行分离， 得到 376bpPCR 产物 ( 图 2)， 经过测 序， 该 PCR 产物具有序列表中序列 1 自 5’ 末端的第 1242-1578 位核苷酸。取 10μl 上述 PCR 产物通过 SpeI/SacI 双酶切， 获得长度为 354bp 的正义 OsFBK12 片段 ； 另取 10μl 上述 PCR 产物通过 BamH1/KpnI 双酶切， 获得长度为 366bp 的反义的 OsFBK12 片段， 将获得的正、 反义片段与 RNAi 载体的连接。
具体方法如下 ：
以下关于质粒的提取、 连接、 对大肠杆菌的转化以及阳性克隆的筛选均参照实验 2 中相应的方法。
RNAi 载 体 的 获 得 ： 用 SpeI/SacI 酶 切 载 体 质 粒 pTCK303(A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice.Wang et al.， 2004， Plant Mol Biol Rep 22 ： 409-417， 公众可从中国科学院植物研究所获得。)， 用 AxyPrep DNA 凝 胶回收试剂盒回收 pTCK303 载体片段。将上述获得的正义的 OsFBK12 片段与上述回收 的 pTCK303 载体片段连接， 将连接产物转化大肠杆菌得到转化子， 将转化子提取的质粒经
SpeI/SacI 双酶切， 获得长度为 354bp 片段的质粒为含有 OsFBK12 正义片段的阳性质粒， 命 名为 pTCK303- 正义 FBK12。将 pTCK303- 正义 FBK12， 再经 BamHI/KpnI 双酶切， 将回收片 段与上述获得的反义的 OsFBK12 片段连接， 将连接产物转化大肠杆菌得到转化子。提取转 化子的质粒为模板， 用上游引物 FBK12F1(5′ -ATG ACA AGC AAA ACA-3′ ) 以及下游引物 FBK12R1(5′ -TCA GGA CTG AAG CAA TT-3′ ) 为模板， 按以下体系进行 PCR 反应 ： 0.2μl LA Taq， 10μl 2×GC buffer， 1.8μl dNTP， 0.5μl 上游引物 FBK12F1(10μM)， 0.5μl 下 游引物 FBK12R1(10μM)， 加 ddH2O 终体积 20μl。PCR 程序为 ： 94℃预变性 3 分钟， 进入 PCR 循环， 循环参数为 94℃ 30 秒变性→ 58℃ 30 秒复性→ 72℃ 1 分钟延伸， 30 个循环后在 72℃ 继续合成 10 分钟。用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行分离， 得到 348bp 的片段。
提取转化子的质粒， 用限制性内切酶 SacI 和 BamHI 进行双酶切， 酶切体系为 ： 质粒 6μl、 10x 酶切缓冲液 5μl、 SacI 1μl(10U/μl)、 BamHI 0.8μl(10U/μl)， 加 ddH2O 补充 反应体系至 50μl， 37℃酶切 4 小时。 用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离。 得到 1200bp 的片段。
将上述 PCR 鉴定得到 348bp 的片段且酶切鉴定得到 1200bp 的片段的质粒为阳性 质粒， 命名为 pTCK-FBK12。进一步测序验证 pTCK-FBK12， 证实 pTCK-FBK12 的结构是 ： 在 pTCK303 载体的 SpeI/SacI 间插入序列表中的序列 1 自 5’ 末端的第 1242-1578 位核苷酸和 在 pTCK303 载体的 BamHI/KpnI 间插入序列表中的序列 1 自 5’ 末端的第 1242-1578 位核苷 酸的反向互补序列。从该载体的部分结构示意图 ( 见图 4) 可以看出， 在该载体中 OsFBK12 正、 反义片段中间由 500bp 左右的水稻的内含子序列隔开。
上述验证结果表明， pTCK-FBK12 为含有 OsFBK12 正、 反义片段的 RNAi 载体。
4、 转 OsFBK12 水稻的获得
遗传转化 ： 参 照 电 激 仪 (EasyJecT Plus 电 激 仪， 英 国 EquiBio 公 司 ) 操 作 指 南， 分 别 将 上 述 获 得 的 载 体 pUN-FBK12 和 pTCK-FBK12 分 别 用 电 击 法 转 化 农 杆 菌 EHA105(Biovector Co.， LTD 产品货号 Biovec-11) 菌株， 经含卡那霉素的抗性平板筛选 分别得到的超表达工程菌和 RNAi 工程菌， 将超表达工程菌提取质粒， 经 KpnI 和 BamHI 酶切得到 1300bp 片段的质粒， 其对应的工程菌为阳性的超表达工程菌， 命名为 EHA105/ pUN-FBK12 ； 将 RNAi 工程菌提取质粒， 经 SacI 和 BamHI 酶切得到 1200bp 片段的质粒， 其对 应的工程菌为阳性 RNAi 工程菌， 命名为 EHA105/pTCK-FBK12。
水稻阳性苗的筛选分化 ： 将上述获得的 EHA105/pUN-FBK12 和 EHA105/pTCK-FBK12 分别导入中花 10 号水稻 (Oryza sativa L.cv Zhonghua 10) 的愈伤组织， 再分别将导入 EHA105/pUN-FBK12 和 EHA105/pTCK-FBK12 的愈伤组织用含 300mg/L 头孢霉素的无菌水洗涤 4-5 遍， 无菌滤纸吸干后转至 N6D2S1 培养基上， 筛选一代。两周后， 转移至 N6D2S2 培养基上筛 选二代 (2 周 / 代 )。取出经过 3 代筛选生长旺盛的抗性愈伤组织， 转移至预分化培养基上， 在分化培养箱 (12 小时光周期， 白天 28℃， 夜晚 25℃ ) 中培养 7 天 ； 然后转移至分化培养基 上， 在分化培养箱中培养至产生再生苗。再生的苗在生根壮苗培养基上生根壮苗。待小苗 长至 10 厘米左右时， 打开容器封口膜， 炼苗 2-3 天， 然后将小苗移入人工气候室栽培， 分别 获得 15 株 T0 代转 pUN-FBK12 水稻 ( 即转 OsFBK12 水稻 ) 和 65 株 T0 代转 pTCK-FBK12 水 稻 ( 即转正、 反义 OsFBK12 水稻 )。
表 1 水稻组织培养和转化过程中使用的培养基及其成分实施例 2、 转 OsFBK12 水稻的表型观察
1、 转 OsFBK12 水稻的验证
转基因苗的 GUS 鉴定 ：
分 别 从 T0 代 转 OsFBK12 水 稻 和 T0 代 转 正、 反 义 OsFBK12 水 稻 上 收 获 T1 代 转 OsFBK12 水稻和 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻的种子， 播种获 85 株 T1 代转 OsFBK12 水稻 幼苗和 120 株 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻幼苗。剪取 2-3mm 的幼苗叶片材料放到 GUS 染色液中， 抽气几分钟， 然后置于 37℃温育过夜， 染色后的组织用 70％乙醇脱色。叶片呈 蓝色的即为阳性植株， 获得 63 株阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻和 106 株阳性 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻。GUS 染色液 (pH 7.0) 组分为 ： 100mM Na3PO4(pH 7.0)， 0.1％ Triton X-100， 10mM EDTA， 0.5mM 亚铁氰化钾， 0.5mM 铁氰化钾， 1mg/ml X-Gluc。
转基因植株的定量 PCR 鉴定 ： 分别提取上述鉴定获得的 10 株阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻和 15 株阳性 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻的 RNA， 并反转录获得第一链 cDNA。利用 荧光实时定量 PCR 法， 以基因特异序列为引物对转基因植株中 OsFBK12 的表达丰度进行检
测。用于定量分析的试剂为 SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)。所用仪器 为美国 Stratagene 公司实时荧光定量 PCR 仪 Mx3000P。吸取 1μl 第一链 cDNA 溶液， 稀释 50 倍作为模板， 按以下体系进行 PCR 反应 ： 10μl SYBR Green Realtime PCRMaster Mix， 4μl 模版， 1μl 5′端引物 (10μM)(5′ -CTG TAC AGA TCA CGG CA-3′ )， 1μl 3′端引 物 (10μM)(5′ -TCT TTC CTC CTG CTC TTC-3′ )， 加 ddH2O 终体积 20μl。用 Actin 作为 内参， 其 5′端引物 ： 5′ -ACC ACA GGT ATT GTG TTG GAC TC-3′， 3′端引物为 ： 5′ -AGA GCA TAT CCT TCA TAG ATG GG-3′。PCR 程序为 ： 预变性 2 分钟， 进入 PCR 循环， 循环参数 为 94℃ 15 秒→ 58℃ 15 秒→ 72℃ 15 秒， 共 40 个循环。
以野生型水稻 ( 中花 10 号， WT) 为对照， 结果如图 5 所示， 从图中可以看出， 在 Actin 基因作为内参的情况下， 阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻 ( 株系编号为 OX9) 和阳性 T1 代 转正、 反义 OsFBK12 水稻 ( 株系编号为 R4、 R10、 R12) 的表达丰度有了不同程度的上调和下 调， 说明目的基因 OsFBK12 已经成功导入水稻， 并且发挥了功能。
采用同样的方法分别将空载体 pUN1301 和 pTCK303 转入水稻中花十号 (Oryza sativa L.cv Zhonghua 10) 中分别获得 T0 代转 pUN1301 水稻和 T0 代转 pTCK303 水稻， 从 T0 代转 pUN1301 水稻和 T0 代转 pTCK303 水稻收获得到 T1 代转 pUN1301 水稻和 T1 代转 pTCK303 水稻， 从 T1 代转 pUN1301 水稻和 T1 代转 pTCK303 水稻收获得到 T2 代转 pUN1301 水稻和 T2 代转 pTCK303 水稻
2、 转 OsFBK12 水稻的表型分析
将上述 GUS 检测后的 53 株阳性 T1 代转 OsFBK12 水稻和 90 株阳性 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻幼苗移栽到网室中种植。 自然光周期下生长约五个月后 (5 月 10 日一 10 月 20 日 )， 从 T1 代转 OsFBK12 水稻和 T1 代转正、 反义 OsFBK12 水稻上分别收获 T2 代转 OsFBK12 水稻种子和 T2 代转正、 反义 OsFBK12 水稻种子。以 T2 代转 pUN1301 水稻、 T2 代转 pTCK303 水稻和野生型水稻 ( 中花 10 号 ) 的种子为对照。
种子表型如图 6A 所示， 从图中显示与野生型水稻相比， T2 代转 OsFBK12 水稻 (OX9) 种子变大 ； T2 代转正、 反义 OsFBK12 水稻种子 (R4、 R10、 R12) 变小。
图 6B、 6C 和 6D 分别是对种子的粒长、 粒宽及百粒重统计图， 实验重复三次， 结果 取平均值。结果表明 ： 野生型水稻 ( 中花 10 号 ； WT) 粒长、 粒宽和百粒重分别是 0.503cm、 0.269cm 和 2.249g， T2 代转 OsFBK12 水稻株系 OX9 种子的粒长是野生型的 104％ (0.526cm)、 粒宽是野生型的 102 ％ (0.276cm)、 百粒重是野生型的 130 ％ (2.93g) ； T2 代转正、 反义 OsFBK12 水稻株系 4 号 (R4)、 10 号 (R10) 和 12(R12) 号株系种子的粒长分别为野生型 84％ (0.421cm)、 85％ (0.427cm)、 85％ (0.429cm)， 它们的粒宽分别为野生型的 85％ (0.229cm)、 86 ％ (0.232cm)、 90 ％ (0.242cm)， 它 们 的 百 粒 重 分 别 为 野 生 型 的 75 ％ (1.686g)、 75 ％ (1.68g)、 77％ (1.736g)。这些变化与其表达量的变化基本吻合。
T2 代转 pUN1301 水稻、 T2 代转 pTCK303 水稻和野生型水稻的种子的结果无显著差 异。10102336824 A CN 102336834
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