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一种磷酸钙骨水泥及其制备方法
    【技术领域】
     本发明涉及一种医用填充材料及其制备方法。具体而言， 本发明公开了一种含有 丝素蛋白的高性能磷酸钙骨水泥。本发明还涉及丝素蛋白添加到磷酸钙骨水泥中， 合成高 性能骨水泥的方法。制备方法包括首先制备了磷酸四钙粉体、 磷酸氢钙粉体以及 HA 晶种， 其次用家蚕生丝中制备了丝素蛋白粉末， 最后将上述步骤的物质按照比例混合， 形成了高 性能的骨水泥。背景技术
     骨质疏松性骨折十分常见 [Riggs BL， Melton LJ 3RD.The worldwideproblem of osteoporosis ： insights afforded by epidemiology.Bone， 1995 ； 17 ： 505S-511S]。 Cooper 等统计报道骨质疏松性椎体压缩骨折的发生率为 1.23％， 其中女性发病率高达 1.53％， 约 为男性的两倍 [Cooper C， Atkinson EJ， O′ FallonWM， et al.Incidence of clinically diagnosed vertebral fractures ： a population-basedstudy in Pochester， Minnesota， 1985 ～ 1989.J Bone Miner Res， 1999， 7： 221-227.]。 在 美 国， 每 年 约 有 150 万 例 骨 质 疏松性骨折， 其中发生于脊柱为 70 万例， 为髋部骨折的两倍 [Melton LJ 3rd， Thamer M， Ray NF， et al.Fractures attributableto osteoporosis ： report from the National Osteoporosis Foundation.J Bone Miner Res， 1997 ； 12 ： 16-23]。仅骨质疏松性骨折的医 疗护理费用 ： 1995 年即超过 138 亿美元， 预计 2030 年将大于 600 亿美元 [Ray NF， Chan JK， Thamer M， et al.Medical expenditures for the treatment of osteoporotic fractures in the United Statesin 1995 ： report from the National Osteoporosis Foundation.J Bone Miner Res， 1997 ； 12 ： 24-35..]。而椎体压缩骨折的医疗费用为 15 亿美元， 以平均住 院 8 天计算， 每年约需 15 万个住院日 [Iqbal MM.Osteoporosis ： epidemiology， diagnosis， andtreatment.South Med J， 2000 ； 93 ： 2-18.]。椎体压缩骨折不仅发生率高， 而且后果严 重， Cooper 和 Kado 等报告 5 年内死亡率达 23％ -34％ [Kado M， BrownerWS， Palermo L， et al.Vertebral fractures and mortality in older women.Arch InternMed， 1999 ； 159 ： 487-492]。骨质疏松性椎体压缩骨折 (Osteoporotic VertebralCompression Fractures， OVCF) 导致的脊柱畸形， 在胸椎可以明显减少肺容积， 在腰椎也可导致限制性呼气功能障碍 也可造成肺容积减少， 同时腹腔容积的减少引起食欲下降， 进而继发全身性营养不良。另 外， OVCF 引起的慢性背痛、 失眠、 活动减少、 精神抑郁等， 给患者及其家庭带来沉重的经济和 精神负担。
     创伤性脊柱骨折是常见病也是骨科领域中的一个难题。 随着我国工业化进程的加 快、 汽车消费的增长和建筑业的迅速发展以及安全设施及教育的相对滞后。尽管没有更新 尤其是车祸以及高处坠落导致的脊柱骨折 的统计数据， 但有理由相信其发病率仍在升高， 的发病率越来越高。据报道 [Van derRoer N， de Lange ES， Bakker FC， et al.Management of traumatic thoracolumbarfractures ： a systematic review of the literature.Eur Spine J， 2005 ； 14 ： 527-534]， 在美国， 其发病率高达 35-60 人 / 百万人 / 年 (2001)， 日本约为 40-72 人 / 百万人 / 年 (2001)， 我国 1987 年的统计数据显示其发生率 6.7 人 / 百万人 / 年 [ 唐天驷 . 胸腰段脊柱脊髓损伤的外科治疗进展 . 中华创伤杂志， 1995 ； 11 ： 327-330]。 由 于外伤性脊柱骨折多数为中青年， 终身残疾率高， 给患者个人、 家庭以及社会均带来了沉重 的负担。目前， 创伤性椎体压缩骨折， 如压缩程度不足 1/3 时， 常常采用卧床休息加背伸肌 锻炼的方法行保守治疗 [Weidenbaum M， FarcyJPC.Surgical management of thoracic and lumbar burst fractures[M].In ： BridwellKH， DeWald RL， eds.The textbook of spinal surgery.2nd ed.Philadelphia(NY) ： Lippincott-Raven Publishers， 1997， 1839-1880.]。 但这些患者往往年龄较轻， 工作相当繁忙， 长期卧床必将严重影响其工作和生活， 也将影响 其多方面的生理内环境。 后凸畸形的存在， 改变了脊柱正常的生理曲度和生物力学环境， 这 也必将加速其脊柱今后的退变。这确实是现代医学亟待解决的重要问题。
     虽然， 骨质疏松性椎体压缩骨折卧床休息 3 月左右骨折可愈合， 但由于椎体仍处 于压缩状态而遗留高度丢失和后凸畸形。同时卧床休息会进一步导致骨量丢失， 加重骨 质疏松。据报道卧床一周将导致骨量丢失 1％ [KarlssonMK， Hasserius R， Gerdhem P， et al.Vertebroplasty and kyphoplasty ： New treatmentstrategies for fractures in the osteoporotic spine.Acta Orthop， 2005 ； 76 ： 620-627] ； 而后凸畸形将使脊椎负重重心前 移， 生物力学环境改变， 造成再骨折的机会将增加 5-12 倍 [Harrop JS， Prpa B， Reinhardt MK， et al.Primary and secondaryosteoporosis′ incidence of subsequent vertebral compression fractures afterkyphoplasty.Spine， 2004 ； 29 ： 2120-2125]。 椎 体 再 骨 折 后又将卧床休息， 骨量进一步丢失， 并且后凸畸形也更加增大， 陷入恶性循环。此外患者常 常伴有顽固性背痛， 严重影响日常活动。当一个胸椎发生压缩骨折时， 肺活量将降低 9％ [Leech JA， Dulberg C， Kellie S， et al.Relationship of lung function to severity ofosteoporosis in women.Am Rev Respir Dis， 1990 ； 141 ： 68-71] ； 当多个椎体压缩骨折 时， 将显著影响脊柱的正常功能以及肺、 胃肠功能， 导致生活质量急剧下降， 最后生活完全 不能自理， 使其在 5 年内的死亡率达 34％， 与以往髋部骨折保守治疗的死亡率相当 [Cooper C， Atkinson EJ， O′ Fallon WM， et al.Incidence of clinically diagnosed vertebral fractures ： a populaion-based study inPochester， Minnesota， 1985 ～ 1989.J Bone Miner Res， 1999， 7： 221-227]。 目前， 髋部骨折和股骨粗隆间骨折采用手术复位内固定方法 治疗， 使死亡率明显降低。因此， 积极有效地治疗椎体压缩骨折的关键在于迅速缓解疼痛， 打断恶性循环， 尽可能恢复椎体高度和矫正后凸畸形， 提高患者的生存质量， 降低死亡率。
     20 世纪 80 年代， 法国医生 Deramand 和 Galibert 首先运用椎体成形术治疗血 管瘤所致的椎体骨质破坏， 即刻缓解了患者的长期疼痛， 此后这一技术广泛运用于治疗 骨质疏松症以及肿瘤所致的椎体压缩骨折和骨质破坏， 开创了椎体压缩骨折微创治疗的 新纪元 [Deramond H， Depriester C， Galibert P， etal.Percutaneous vertebroplasty with polymethylmethacrylate ： techniques， indications， and results.Radiol Clin North Am， 1998， 36 ： 533-546]。但是， 这一技术骨水泥渗漏率高， 手术风险大， 且对椎体高 度、 后凸畸形无纠正作用 [Groen RJ， du ToitDF， Phillips FM， et al.Anatomical and pathological considerations in percutaneousvertebroplasty and kyphoplasty ： a reappraisal of the vertebral venous system.Spine， 2004 ； 29 ： 1465-1471。 1994 年出现 了可扩张球囊为核心的手术器械， 通过球囊扩张来恢复椎体高度、 纠正后凸畸形， 即球囊扩张后凸成形术 [Mathis JM， Barr JD， Belkoff SM， et al.Percutaneous vertebroplasty ： a developing standard ofcare for vertebral compression fractures.Am J Neuroradiol， 2001 ； 22 ： 373-381]。经临床应用， 该技术不仅能迅速缓解患者疼痛， 增加椎 体刚度和强度 ； 同时又能使骨折椎体复位， 恢复椎体高度， 矫正后凸畸形， 增加肺活量， 改善 肺功能 ； 并且通过球囊扩张， 可使椎体内产生一空腔， 骨水泥渗漏率明显减少， 取得了更为 满意的治疗效果 [ 杨惠林， Yuan HA， 陈亮， 等 . 椎体后凸成形术治疗老年骨质疏松脊柱压缩 骨折 . 中华骨科杂志， 2003 ； 23 ： 262-265]。 这一新型微创脊柱外科技术， 在椎体压缩性骨折 的治疗中一改传统难尽人意的过去， 显示出极大的优越性。
     后凸成形术中椎体内扩张后， 在恢复椎体的正常高度的同时， 在椎体内形成空腔， 须在空腔内填入合适的充填材料， 才能在术后维持恢复后的高度。椎体内的空腔如何得以 修复？这是国内外学者尚未解决的问题， 椎体内的空腔的修复与四肢等其他部位内固定后 骨缺损的修复不同， 有其明显的特殊性 ： 因其缺损位置在椎体内， 位置较深， 不能直视， 必须 在 X 线监视下注入， 且入路空间有限， 就要求注入的材料具有可注射性、 适宜的粘滞性， 阻 滞 X 线性 ( 即可在 X 线透视下注射 ) ； 后凸成形术后需要获得椎体的即刻稳定， 充填材料在 没有任何辅助固定的情况下必须即刻能承受较高的应力达到支撑作用， 要求充填材料具有 合适的机械性能和凝固时间 ； 填充材料必须具备良好的生物活性、 骨传导性， 椎体内松质骨 对充填材料进行爬行替代的过程同时也要保持其良好的机械强度， 这就要求充填材料降解 速度要小于或者等于椎体内松质骨的成骨速度 ； 充填材料的凝固过程是在体内进行， 这要 求充填材料在体内凝固的过程中不能释放大量的热， 以较低的温度下进行聚合， 以免损伤 周围组织， 尤其是脊髓和神经根。
     目 前，后 凸 成 形 术 最 常 采 用 的 充 填 材 料 是 聚 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯 (Polymethylmethacrylate， PMMA)， 然 而 PMMA 存 在 很 多 的 缺 点 [Belkoff SM， Molloy S.Temperature measurement during polymerization ofpolymethylmethacrylate cement used for vertebroplasty.Spine， 2003 ； 28 ： 1555-1559] ： 生物相容性差， 无生物 活性， 聚合时释放大量的热， 未聚合单体的毒性等。这些缺点导致了 PMMA 在临床应用时常 常会发生一些严重的并发症。国外研究者认为 PMMA 不适于充填创伤性脊柱压缩骨折的椎 体的扩张后空腔 [Verlaan JJ， Dhert WJ， Verbout AJ， et al.Balloon vertebroplasty incombination with pedicle screw mstrumentation ： a novel technique to treat thoracicand lumbar burst fractures.Spine， 2005 ； 30 ： E73-E79]。与骨质疏松性椎体压 缩骨折有所不同， 对于年轻创伤性椎体压缩骨折行椎体后凸成形术后， 充填材料 PMMA 在体 内须永久存留， 然而临床缺乏大规模较长时间追踪研究， 缺乏对其长期安全性和有效性的 评估证据 ； 且 PMMA 无生物活性， 不宜直接用于该类患者体内。要将后凸成形术应用创伤性 椎体压缩骨折的治疗上， 就需要研制出合适的生物活性充填材料。
     二 十 世 纪 八 十 年 代， Brown 和 Chow 发 明 了 磷 酸 钙 骨 水 泥 (CalciumPhosphate Cement， CPC)[Brown WE， Chow LC.A new calcium phosphatewater-setting cement. American Ceramic Society， OH ： Westerville， 1987 ： 352]， 因其具有良好的生物相容性和 骨传导性， 并能在体内降解等优点而倍受关注。国内外学者对其进行了在椎体内充填的 体外实验发现 CPC 具有较好的机械性能， 有望成为理想的椎体内充填材料， 甚至已被少数 学者在后凸成形术中试用 [Takemasa R， Yamamoto H， Tani T， et al.Kyphoplasty usingbioactive calciumphosphate cement for osteoporotic vertebral fractures.In 71th Annual Meeting ofAmerican Academy of Orthopedic Surgeons.San Francisco， California ： 2004， p538]。但是 CPC 力学强度低， 脆性大， 在生理环境中的抗疲劳与破 坏强度不高， 尤其是在湿环境下断裂韧性很低， 为一种典型的脆性材料 [Xu HH， Simon CGJr.Fast setting calcium phosphate-chitosan scaffold ： mechanical properties andbiocompatibility.Biomaterials， 2005 ； 26 ： 1337-1348]， 同时存在固化时间长， 粘结 性差的缺点。这些使 CPC 的应用受到较大的限制， 一定程度上影响了它用于椎体强化的效 果。
     国内外学者纷纷致力于上述问题的解决， 将 CPC 与各种材料进行复合， 如壳聚糖、 可吸收纤维、 聚合物等， 但均未能取得突破性的进展 [Liu H， Li H， Cheng W， et al.Novel injectable calcium phosphate/chitosan composites for bonesubstitute materials. Acta Biomater， 2006 ； 2： 557-565]。CPC 本身强度和脆性问题解决的关键是研制一种有机 无机复合人工骨， 以可降解有机高分子材料来增强、 增韧磷酸钙骨水泥， 在保持良好的骨传 导性的同时使其机械性能得到大幅度提高。如果采用合成的可降解高分子增韧， 则由于无 机材料与有机聚合物界面性质相差较大， 它们之间的亲和性差， 难以混合均匀， 所以必须选 择与磷酸钙有良好亲和力的可降解高分子， 而丝素蛋白就是其中比较好的一种。 丝素蛋白是一种由家蚕分泌的天然高分子纤维蛋白， 含量约占蚕丝的 70 ～ 80 ％， 主要由甘氨酸 - 丙氨酸 - 甘氨酸 - 丙氨酸 - 丝氨酸的重复多肽链所组成 [Li MZ， Wu ZY， Zhang CS， et al.Study on porous silk fibroin materials.II.Preparation and characteristics of spongy porous silk fibroin materials.J Appl PolymSci， 2001 ； 79 ： 2192-2199]。大量的研究表明丝素蛋白是一种非常出色的医用生物材料， 一 方面具有良好的生物相容性和生物活性， 对机体没有细胞毒性， 不引起炎症反应， 也没 有遗传毒性， 细胞能在丝素材料上很好地黏附、 扩散和增殖 [Min BM， Lee G， Kim SH， et al.Electrospinning of silk fibroin nanofibersand its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes andfibroblasts in vitro.Biomaterials， 2004 ； 25 ： 1289-1297]， 体内试验能修复骨缺损 [Fini M， Motta A， Torricelli P， et al.The healing of confined critical size cancellousdefects in the presence of silk fibroin hydrogel.Biomaterials， 2005 ； 26 ： 3527-3536] 和 愈 合 皮 肤 创 伤 [Sugihara A， Sugiura K， Morita H， et al.Promotive effects of a silkfilm on epidermal recovery from full-thickness skin wounds.Proc Soc Exp Biol Med， 2000 ； 225 ： 58-64] ； 另一 方面表现出了卓越的力学性能， 有研究将丝素蛋白纤维经特定的理化处理， 形成接近于 正常的前交叉韧带性能的丝素蛋白基质材料 [Altman GH， Horan RL， Lu HH， et al.Silk matrix for tissue engineered anteriorcruciate ligaments.Biomaterials， 2002 ； 23 ： 4131-4141] ； 同时， 丝素蛋白在体内易降解， 由于其由氨基酸构成， 降解产物无任何毒 性和刺激性， 易被人体吸收而不产生炎症反应 [Minoura N.Biomaterial application of polymeric materials.CRC Press Boca Raton， 1993 ； 21 ： 128]。 和其他生物材料相比， 丝素 蛋白还具有来源广、 纯度高、 提取方法简便， 成本低廉等优点。
     为了解决磷酸钙骨水泥力学强度低与脆性大的缺点， 根据丝素蛋白的上述优点， 本发明尝试改进了磷酸钙骨水泥， 为骨质疏松性骨折提供了更高性能的活性充填材料。
     发明内容
     本发明制备了一种新型的高性能磷酸钙骨水泥 本发明所述的磷酸钙骨水泥， 是添加了一定量丝素蛋白的磷酸钙骨水泥。 本发明确定了丝素蛋白的添加合适比例， 为按照重量比的 1.0 ％ -2.5 ％丝素蛋白。 所述丝素蛋白为从家蚕生丝中制备的丝素蛋白， 丝素蛋白在添加之前用离心喷雾 干燥机处理为丝素蛋白粉末。
     本发明还公开了一种磷酸钙骨水泥的制备方法， 包括以下步骤 ：
     1) 制备磷酸四钙粉体、 磷酸氢钙粉体以及 HA 晶种 ；
     2) 从家蚕生丝中提取丝素蛋白， 并制备丝素蛋白粉末 ；
     3) 将上述步骤的物质按比例混合形成高性能的骨水泥
     本发明为家蚕丝素蛋白提供了一种新用途。
     附图说明 图 1 实验组及对照组抗压强度的比较分析。如图所示， 不同材料抗压强度趋势如 下： CPC ＜ SF0.5/CPC ＜ SF1.0/CPC ＜ SF1.5/CPC ＜ SF2.0/CPC ＜ SF2.5/CPC ＜ SF3.0/CPC。
     图 2 实验组及对照组凝固时间的比较分析。如图所示， 不同材料的凝固时间趋势 如下 ： CPC ＞ SF0.5/CPC ＞ SF1.0/CPC ＞ SF1.5/CPC ＞ SF2.0/CPC ＞ SF2.5/CPC ＞ SF3.0/CPC
     图 3 实验组及对照组注射性能的比较分析。如图所示， 不同材料注射系数趋势如 下： CPC ＞ SF0.5/CPC ＞ SF1.0/CPC ＞ SF1.5/CPC ＞ SF2.0/CPC ＞ SF2.5/CPC ＞ SF3.0/CPC。
     图 4SF2.5/CPC 扫描电镜图。照片的放大倍数为 3000 倍。
     图 5SF2.5/CPC 扫描电镜图。照片的放大倍数为 10000 倍。
     图 6 单纯 CPC 原料的 X 线衍射图。
     图 7CPC 水化 24h 产物的 X 线衍射图。无水磷酸氢钙的峰显示该物质还有残留。
     图 8SF2.5/CPC 原料的 X 线衍射图。图中没有出现丝素蛋白的峰。
     图 9SF2.5/CPC 水化 24h 产物的 X 线衍射图。无水磷酸氢钙的峰已完全消失。
     实施例 1TTCP/DCPA 体系磷酸钙盐与丝素蛋白的制备
     1.TTCP/DCPA 体系磷酸钙盐的制备
     1) 磷酸四钙的制备
     通过液相沉淀法制备 ： 将 Ca(NO3)2 和 (NH4)2HPO4 分 别 溶 于 蒸 馏 水 中 配 制 成 1.00mol/L 的溶液。按 Ca/P ＝ 1.67 的比例， 将 Ca(NO3)2 溶液缓慢滴加到 (NH4)2HPO4 溶 液中， 同时用氨水调节溶液的 pH 值为 10.00。不断搅拌， 在常温下反应 22h 后， 按整个体系 Ca/P ＝ 2.0 的比例， 向上述悬浮液中同时滴加 1.00mol/L 的 Ca(NO3)2 溶液和 0.5mol/L 的 (NH4)2CO3 溶液， 滴加完后， 继续搅拌反应 2h， 最后形成均一的悬浮液。将其真空抽滤后所 得滤饼于 80℃下干燥， 即得 HA-CC 包覆粉末。将此粉末于高温炉中以 5℃ /min 的速率升温 至 1500℃， 保温 5h 后， 取出在空气中急冷， 破碎后过 200 目筛， 即得 TTCP 粉体。
     2) 磷酸氢钙的制备
     分析纯原料 DCPD 粉末在 120℃下干燥处理 12h， 冷却， 过筛， 即得 DCPA 粉体。
     3)HA 晶种的制备
     参考液相沉淀法制备 TTCP 的步骤， 将 Ca(NO3)2 溶液和 (NH4)2HPO4 溶液按 Ca/P 摩 尔比为 1.67 的比例在碱性条件通过液相沉淀反应生成低结晶度 HA 沉淀， 洗涤， 过滤， 80℃ 烘干， 在 800℃下锻烧 3h， 得高结晶度的 HA。
     2. 丝素蛋白的制备
     1) 家蚕丝纤维脱胶
     家蚕生丝置于 0.5‰的无水碳酸钠溶液中， 于 90 ～ 100℃处理 30min， 重复操作三 次， 前两次用自来水， 最后一次用去离子水， 以脱去蚕丝中的丝胶。 脱胶后洗净， 烘箱 60℃烘 干后得到精炼蚕丝——丝素纤维。
     2) 丝素纤维溶解
     配制 CaCl2· CH3CH2OH· H2O( 摩尔比 1 ∶ 2 ∶ 8) 三元溶液。于 72±2℃在三元溶 液中磁力搅拌溶解丝素纤维， 浴比 1 ∶ 10， 时间 1h， 得到混合溶液。
     3) 透析
     将丝素溶液装入透析袋， 在流动自来水中透析 48h 之后换用去离子水， 每小时换 一次水， 持续 48h。经透析、 过滤得到纯家蚕丝素蛋白溶液。 4) 喷雾干燥
     在 130℃的温度下， 用 OPD-8 型高速离心喷雾干燥机将丝素溶液干燥后制得可溶 性丝素蛋白粉末， 喷雾条件为塔顶 120℃， 塔底 60 ～ 70℃。
     实施例 2 丝素蛋白增强磷酸钙骨水泥的合成及性能测定
     1.CPC 浆体制备
     将制得的粉体以无水乙醇为介质在球磨机中湿磨 24h， 然后 80℃烘干， 玛瑙研钵 中研磨， 过筛。将合成和处理过的 TTCP 和 DCPA 粉体按等摩尔比混合， 添加 4％质量比例的 HA 晶种及不同量的丝素蛋白粉末， 充分混合后放置在干燥器中备用。称取 13.6g 磷酸二氢 钾和 42.6g 磷酸氢钠溶解于 1000ml 去离子水中， 获得 pH 约为 7.0 的磷酸盐缓冲溶液作为 CPC 固化液。
     分别将丝素蛋白粉末按 0.5wt％、 1.0wt％、 1.5wt％、 2.0wt％、 2.5wt％、 3.0wt％的 比例分为 6 组， 分别作为 SF0.5/CPC、 SF1.0/CPC、 SF1.5/CPC、 SF2.0/CPC、 SF2.5/CPC、 SF3.0/ CPC， 单纯 CPC 组作为空白对照。根据预实验的结果， 按 0.4 的液固比 (ml/g)， 在温度为 22±1℃， 湿度为 40％～ 60％的条件下混合。
     2.CPC 性能参数测定
     SF 在 CPC 固 相 粉 末 中 的 质 量 配 比 不 同， 制 备 的 6 种 SF/CPC 复 合 材 料 的 抗 压
     强度、 凝固时间及注射性能也不同。数据采用均数 ± 标准差表示， 运用随机区组设计资料的方差分析进行比较， 以 P ＜ 0.05 代表差异有统计学意义。应用 SAS 8.01(Statistical Analysis System) 统计分析软件进行统计学处理。
     1) 抗压强度
     将 CPC 调和物填注于自制不锈钢模具内 ( 高 12mm， 直径 6mm 的圆柱体 )， 30min 后 脱模。放入温度 37℃、 湿度为 100％的恒温培养箱中， 24h 后取出， 打磨试件使上下面光滑、 水平。 在生物力学测试仪上进行测试， 加载头直径为 6mm， 以 1mm/min 的加载速度轴向加压， 自动记录仪记录压力和位移的变化。抗压强度为单位面积试件的最大承受力。每种复合材料如此重复 5 次。不同 SF 含量的 SF/CPC 抗压强度如下 ： SF0.5/CPC 同对照组相比差别无统 计学意义， 从 SF1.0/CPC 开始抗压强度差别有统计学意义 ； 不同材料抗压强度趋势如下 ： CPC ＜ SF0.5/CPC ＜ SF1.0/CPC ＜ SF1.5/CPC ＜ SF2.0/CPC ＜ SF2.5/CPC ＜ SF3.0/CPC( 图 1)。其中当 丝素蛋白的重量比大于 1.0％时， 抗压强度较不添加丝素蛋白时增加 44％， 具有实际应用 的意义。
     2) 凝固时间
     将 CPC 调和物置入直径 10mm， 高 40mm 的玻璃管中， 从维卡针初凝试针接触试样表 面开始， 让滑杆自由落下至试针插入试样距底板 4±1mm， 此时为水泥的初凝状态。换用终 凝试针， 试针从接触试样表面后让滑杆自由落下， 当试针沉入试样不超过 0.5mm 时骨水泥 达终凝状态。每种复合材料如此重复 5 次。不同 SF 含量的 SF/CPC 凝固时间如下 ： 初凝时 间 SF0.5/CPC 同对照组相比差别无统计学意义， 从 SF1.0/CPC 开始材料的初凝时间同对照组 相比差别有统计学意义 ； 终凝时间所有实验组同对照组相比差别有统计学意义。不同材料 的凝固时间趋势如下 ： CPC ＞ SF0.5/CPC ＞ SF1.0/CPC ＞ SF1.5/CPC ＞ SF2.0/CPC ＞ SF2.5/CPC ＞ SF3.0/CPC( 图 2)。如图所示， 当丝素蛋白的重量比为 3.0％时 (SF3.0/CPC)， 初凝时间明显比 SF2.5/CPC 缩短， 缩短了 51％。初凝时间的减小， 降低了骨水泥在手术中的方便应用。所以 本发明选取了小于等于 2.5％比例丝素蛋白的骨水泥。
     3) 注射性能
     使用一次性 20ml 注射器， 内径为 20mm， 前端开口内径为 2mm， 将 7.5g 骨水泥粉末 和固化液混合后填入注射器内， 将其置于测试机上， 垂直加载压力为 50N， 混合 3min 后开始 加压。 计算注射前后的骨水泥质量， 注射系数＝ ( 注射出的质量 / 注射前总质量 )×100％。 每种复合材料如此重复 5 次。不同 SF 含量的 SF/CPC 注射性能如下 ： SF0.5/CPC 及 SF1.0/CPC 同对照组相比差别无统计学意义， 从 SF1.5/CPC 开始注射系数差别有统计学意义 ； 不同材料 注射系数趋势如下 ： CPC ＞ SF0.5/CPC ＞ SF1.0/CPC ＞ SF1.5/CPC ＞ SF2.0/CPC ＞ SF2.5/CPC ＞ SF3.0/CPC( 图 3)。如图所示， 当丝素蛋白的重量比为 3.0％时 (SF3.0/CPC)， 注射系数较明显 比 SF2.5/CPC 减小。
     3.CPC 表面形貌观察
     将 SF2.5/CPC 的断裂样本干燥， 断裂面经真空镀膜仪表面喷金， 扫描电镜 (XL-30， Philips， Netherlands) 不同放大倍数下观察复合材料的结构特征。SF2.5/CPC 复合材料的 固化产物由规则的片状和粒状晶体构成， 互相附着， 晶体间充满均匀而又不规则的孔隙， 微 孔大小 5 ～ 10μm， SF 贯穿于 CPC 晶体间， 将 CPC 晶体紧密连接。高倍镜下见固化产物几乎 由都由针状晶体组成， 晶粒非常细小， 并且互相缠绕， 呈放射状 ( 图 4 与图 5)。
     4.CPC 成分分析
     将混合 24h 后的 CPC 和 SF2.5/CPC 浸入丙酮终止反应， 真空干燥后用玛瑙研钵对 试样进行研磨 15 ～ 20min。在 X- 射线衍射仪上对研磨后的样品进行测试， 并和固化前的 粉体进行对比。测试条件 ： 采用超能探测器， Ni 滤波片， CuKα 辐射， 管电压 40kV， 管电流 30mA， 连续扫描， 步长 0.0330°。
     CPC 和 SF2.5/CPC 固相粉末的 X 线衍射 (XRD) 图上均可以看到磷酸四钙和无水磷酸 氢钙的特征峰， 以及极弱的羟基磷灰石的峰， 由于量很少， SF2.5/CPC 图上并没有出现 SF 的 峰。 固化 24h 后的 XRD 图显示 ： SF2.5/CPC 固化产物主要成分为羟基磷灰石， 同时有少许未反应完全的磷酸四钙， 无水磷酸氢钙的峰已完全消失 ； 而单纯 CPC 的固化产物中除了羟基磷 灰石， 仍可见到明显的磷酸四钙的峰 ( 图 6-9)。这说明 SF2.5/CPC 的水化反应速度要比单纯 CPC 快， 而最终产物仍为羟基磷灰石。