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用于免疫治疗的基于酵母的疫苗
     本申请是中国申请 200380109787.5 的分案申请， 该母案的国际申请日为 2003 年 12 月 6 日， 本分案采用了与该母案一致的发明名称。技术领域
     本发明涉及含有异源抗原的基于酵母的疫苗在诱发体液免疫和细胞免疫， 和一方 面预防和治疗多种动物癌症中的用途。 背景技术 导致新的、 异常生长的瘤形成或快速细胞增殖过程是许多疾病的特征， 这些疾病 可能是严重的， 并且有时是威胁生命的。 通常， 细胞和组织的瘤性生长以高于细胞的正常增 殖为特征， 其中即使诱发 (instigating) 因子 ( 例如， 肿瘤启动子， 致癌原， 病毒 ) 不再存在 之后， 细胞仍然继续生长。细胞生长往往显示出结构上缺乏组织和 / 或缺乏与正常组织的 协调， 并且通常产生一团可能是良性或恶性的组织 ( 例如， 肿瘤 )。恶性细胞生长， 或恶性 肿瘤是世界范围内死亡的最主要的原因， 研发肿瘤性疾病的有效治疗方法是大体研究的课
     题。 虽然已经提出了多种治疗和预防癌症的创新方法， 很多癌症仍然具有高死亡率， 并且可 能难以治疗或者对于常规疗法相对无反应。
     例如， 肺癌是美国第二种最普遍的癌症形式， 占全部癌症的 15％和全部癌症死亡 数的 28％。 2002 年， 估计将诊断出 177,000 例肺癌新增病例， 166,000 人将死亡， 死亡率高于 结肠直肠癌、 前列腺癌和乳腺癌的总和。80％的原发性肺部肿瘤是非小细胞肺癌 (NSCLC)。 由于多种药物治疗产生最小存活优势和严重毒性， 标准化疗联合仍然是相对无效的。
     另有一例， 多形性成胶质细胞瘤 ( 神经胶质瘤 ) 是成年人中最普遍的原发恶性脑 肿瘤。尽管应用了外科手术， 放疗和化疗， 治愈率和平均患者存活数仍没有改善。其它肿瘤 也向脑部转移， 这种情况下， 由于血脑屏障对药物传递的限制使它们对外周化疗的反应不 太好。明确地说， 需要更多的针对脑肿瘤的治疗方法。这种方法的其中之一包括免疫疗法。 一段时间以来已知在外周致敏了的淋巴细胞能通过血脑屏障并靶向脑组织。 脑肿瘤免疫疗 法的主要靶点是诱发针对在脑肿瘤细胞中特异性表达的新的或突变的抗原的免疫反应的 疫苗。 这个目标将提供一种疫苗方法， 以提供广泛的、 有力的和长效的免疫保护作用对抗颅 内肿瘤。
     疫苗广泛地用于预防疾病和治疗确定的疾病 ( 免疫治疗疫苗 )。 蛋白抗原 ( 例如， 由于重组 DNA 技术使其研制成为可能的亚单位疫苗 )， 当不与佐剂一起给予时， 诱发弱体液 ( 抗体 ) 免疫， 并因此到目前为止是令人失望的， 因为它们仅产生有限的免疫原性。亚单位 疫苗与灭活病毒和重组活病毒疫苗的另一个缺点是当与佐剂一起给予时， 虽然刺激强体液 免疫反应， 但不能诱发保护性细胞免疫。 佐剂实验性地用来刺激小鼠的有效免疫反应， 并且 希望用于人疫苗， 但只有少数佐剂被批准用于人类应用。 实际上， 在美国批准使用的唯一佐 剂是铝盐， 氢氧化铝和磷酸铝， 它们中没有一个刺激细胞介导的免疫。 铝盐制剂不能冷冻或 冻干， 并且这种佐剂不是与所有抗原都有效。另外， 多数佐剂不会导致细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL) 的诱导。CTL 是杀死合成异常蛋白， 包括病毒蛋白和突变 “自身” 蛋白的细胞所需的。 正在大力研究刺激 CTL 的疫苗以用于对抗多种疾病， 包括所有癌症 ( 例如黑色素瘤， 前列腺 癌， 卵巢癌等 )。因此总之需要总体刺激 CTL 和细胞介导免疫的佐剂。
     酵母已用于亚单位蛋白疫苗的产生 ； 然而， 在这种情况中， 酵母用于产生蛋白， 但 是酵母细胞或其亚细胞级分实际上不能传递给患者。也有在免疫之前用酵母喂饲动物， 试 图以非特异性方式启动免疫反应 ( 例如， 刺激吞噬作用以及补体和干扰素的产生 )。结论 是不明确的， 并且这种方法不能产生保护性细胞免疫 ； 参见例如 Fattal-German 等， 1992， Dev.Biol.Stand.77， 115-120 ； Bizzini 等， 1990， FEMSMicrobiol.Immunol.2， 155-167。
     1998 年 11 月 3 日公布的 Duke 等人的美国专利 US 5,830,463， 描述了使用带有至 少一个能调节免疫反应的化合物的非致病性酵母， 并证明了这种复合物对刺激细胞介导的 免疫和刺激体液免疫都有效。具体的， US 5,830,463 证明了当给予动物后， 经遗传改造表 达异源抗原的酵母能诱发细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。
     尽管癌症治疗和疫苗技术目前有进展， 仍然急迫需要研制安全和有效的疫苗和佐 剂， 它们是针对适用于免疫疗法的疾病， 包括瘤性转化 ( 癌 ) 导致的疾病， 特别是针对那些 对使用常规癌症疗法和普通疫苗策略的治疗特别耐受的癌症。
     发明概述
     本发明的一个实施例涉及一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或可 能发展为癌症的动物给予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状。所述疫苗包含 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工。 融合 蛋白要满足下述额外要求 ： (1) 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ； (2) 融合蛋白位 置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ； (3) 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫 氨酸 ； 和 (4) 融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。一方面， 所述肽由至 少 2-6 个与癌抗原异源的氨基酸残基组成。 另一方面， 所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基 酸序列， 其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X3 是除甲硫 氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任 意一种氨基酸 ； X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和 X6 是除甲硫氨 酸之外的任意一种氨基酸。一方面， X6 是脯氨酸。另一方面， 所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     本发明的另一个实施例涉及一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或 可能发展为癌症的动物给予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状。 所述疫苗包含 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融 合蛋白的翻译后加工。一方面， 所述酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     上述任意一个本发明的实施例， 还要考虑下述额外方面。 一方面， 融合蛋白包含至 少两种或多种癌抗原。另一方面， 融合蛋白包含一种或多种癌抗原的至少一个或多个免疫 原性功能域。 另一方面， 癌抗原是与选自以下组癌症相关的抗原 ： 黑色素瘤， 鳞状细胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢癌， 膀胱癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤 (angiosarcoma)， 血管肉瘤 (hemangiosarcoma)， 肥大细胞肿瘤， 原发性肝 癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠癌， 肾细胞癌， 造血细胞瘤形成及它们的转移性癌症。
     另一方面， 癌抗原是 ras 基因编码的野生型或突变蛋白。例如， 癌抗原可包括选自 以下组的 ras 基因编码的野生型或突变蛋白 ： K-ras， N-ras 和 H-ras 基因。一方面， ras 基 因编码带有单突变或多突变的 Ras 蛋白。另一方面， 癌抗原包含片段， 所述片段含有对应于 野生型 Ras 蛋白位置 12， 13， 59 或 61 的氨基酸的野生型 Ras 蛋白的至少 5-9 个连续氨基酸 残基， 其中位置 12， 13， 59， 或 61 的氨基酸残基相对于野生型 Ras 蛋白发生了突变。
     另一方面， 癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 其中每个功能域由 来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至少 4 个氨基 酸残基组成， 其中突变与致肿瘤性相关。 这方面， 融合蛋白构建体由至少一个与另一个突变 肿瘤抗原在阅读框内融合的肽组成， 其中所述肽选自以下组 ： (a) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 8-16 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基发生了突变 ； (b) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 9-17 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 13 的氨基酸残基发生了 突变 ； (c) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 55-63 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 59 的 氨基酸残基发生了突变 ； 和 (d) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 57-65 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 61 的氨基酸残基发生了突变。一方面， 突变的肿瘤抗原是相对于野生型 Ras 蛋白序列含有至少一个突变的 Ras 蛋白。 上述任一方法的一个实施例中， 疫苗施用到呼吸道。 另一实施例中， 以胃肠道外给 予途径给予疫苗。 另一实施例中， 疫苗进一步包含树突细胞或巨噬细胞， 其中表达融合蛋白 的酵母载体传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且将包含表达癌抗原的酵母载体的 树突细胞或巨噬细胞给予动物。这个实施例的一方面， 树突细胞或酵母载体额外装载了游 离抗原。 一方面， 疫苗作为治疗性疫苗给予。 另一方面， 疫苗作为预防性疫苗给予。 一方面， 动物已经患有或者可能发展为选自以下组的癌症 ： 脑癌， 肺癌， 乳腺癌， 黑色素瘤和肾癌。 另 一方面， 动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤之后再给予疫苗。另一方面， 动物 患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 并且进行不引起骨髓重度抑制的同种异体干 细胞移植之后再给予疫苗。另一方面， 动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 进 行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植， 以及输注同种异体的供体淋巴细胞之后再 给予疫苗。
     本发明的另一个实施例涉及一种保护动物对抗脑癌或肺癌的方法， 包括将包含酵 母载体和至少一种癌抗原的疫苗施用到已患有或可能发展为脑癌或肺癌的动物的呼吸道， 以减少或预防至少一种动物脑癌或肺癌的症状。这个实施例中， 疫苗可包括上述任意一种 融合蛋白和其它抗原。一方面， 疫苗包含至少两种或多种癌抗原。另一方面， 癌抗原是含有 至少一种或多种癌抗原的融合蛋白。另一方面， 癌抗原是含有一种或多种癌抗原的至少一 个或多个免疫原性功能域的融合蛋白。
     这个实施例的一方面， 疫苗以鼻内给予方式给予。 另一方面， 疫苗以气管内给予方 式给予。 另一实施例中， 酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且包 含酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物的呼吸道。
     一方面， 所述方法保护动物对抗脑癌， 包括但不限于原发性脑癌， 如多形性成胶质
     细胞瘤或来自另一器官的转移癌。 另一个实施例中， 所述方法保护动物对抗肺癌， 包括但不 限于原发性肺癌 ( 例如， 非小细胞癌， 小细胞癌和腺癌 ) 或来自另一器官的转移癌。 一方面， 疫苗作为治疗性疫苗给予。另一方面， 疫苗作为预防性疫苗给予。
     本发明还有一个实施例涉及一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应以及抗原 特异性细胞介导的免疫反应的方法。 所述方法包括给予动物包含下述的治疗性组合物 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种抗原 ； 和 (ii) 与抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳 定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工。 所述融合蛋白要满 足下述额外要求 ： 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ； 融合蛋白位置 2 的氨基酸残 基不是甘氨酸或脯氨酸 ； 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和融合蛋白位 置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。一方面， 所述肽由至少 6 个与抗原异源的氨 基酸残基组成。 另一方面， 所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列， 其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的 任意一种氨基酸 ； X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X5 是除甲硫氨 酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和 X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。 一 方面， X6 是脯氨酸。另一方面， 所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。一 方面， 抗原选自以下组 ： 病毒抗原， 过表达的哺乳动物细胞表面分子， 细菌抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫 (helminth) 抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一个和多个突变氨基酸 的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过插入流行病 学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以及通过调节 序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     另一实施例涉及用于如上所述方法的疫苗。
     本发明还有一个实施例涉及一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应和抗原特 异性细胞介导的免疫反应的方法， 所述方法包括给予动物包含下述的治疗性组合物 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种抗原 ； 和 (ii) 与该抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基 酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻 译后加工。一方面， 所述酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     本发明另一实施例涉及用于如上所述方法的疫苗。
     本发明还有一个实施例涉及一种治疗癌症病人的方法， 包括 ： (a) 用能有效建立 稳定混合的骨髓嵌合状态的不引起骨髓重度抑制的干细胞转移来治疗癌症病人， 其中干细 胞由同种异体的供体提供 ； (b) 将从同种异体的供体处获得的淋巴细胞给予病人 ； 和 (c) 在 步骤 (b) 之后， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予病人。一方面， 所述方法还包 括在步骤 (a) 之前， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予同种异体的供体。另一 实施例中， 所述方法包括在进行步骤 (a) 之前， 切除病人的肿瘤。
     该方法一方面， 疫苗包含至少两种或多种癌抗原。 另一方面， 癌抗原是含有一种或 多种癌抗原的融合蛋白。另一方面， 癌抗原是包含一种或多种癌抗原的一个或多个免疫原 性功能域的融合蛋白。另一方面， 癌抗原由包含多个功能域的融合蛋白构建体组成， 其中 每个功能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至少 4 个氨基酸残基组成， 其中突变与致肿瘤性相关。另一方面， 酵母载体表达癌抗原， 其 中癌抗原是融合蛋白， 包含 ： (a) 至少一个癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的肽， 所 述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的 表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ： 其中融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨 酸； 融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ； 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基 都不是甲硫氨酸 ； 和融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。另一方面， 酵母载体表达癌抗原， 其中癌抗原是融合蛋白， 包含 ： (a) 至少一个癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌 抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组 成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后 加工。
     这个实施例的一方面， 疫苗以鼻内给予方式给予。 另一方面， 疫苗以胃肠道外给予 方式给予。 另一方面， 酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且包含 酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物的呼吸道。
     上述任意一种本发明的方法和组合物中， 涉及酵母载体的下述方面也包括在本 发明中。一个实施例中， 酵母载体选自以下组 ： 完整的酵母， 酵母原生质球， 酵母胞质体， 酵母空胞， 以及亚细胞性酵母膜提取物或级分。一方面， 用编码抗原的重组核酸分子转化 用来制备酵母载体的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球中重组表达 抗原。在这方面中， 重组表达抗原的酵母细胞或酵母原生质球用来制备包含酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或级分的酵母载体。一方面， 酵母载体来自非致病性 酵母。另一方面， 酵母载体来自选自以下组的酵母 ： 糖酵母 (Saccharomyces)， 裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)， 克鲁维酵母 (Kluveromyces)， 汉逊酵母 (Hansenula)， 假丝酵母 (Candida) 和毕赤酵母 (Pichia)。一方面， 酵母是酿酒酵母 (S.cerevisiae)。
     总之， 酵母和抗原可通过本文所述的任意技术结合， 一方面， 酵母载体在细胞内装 载了 (load) 癌抗原。另一方面， 癌抗原与酵母载体共价或非共价结合。另一方面， 通过混 合使酵母载体和抗原结合。另一方面， 由酵母载体或衍生出酵母载体的酵母细胞或酵母原 生质球来重组表达抗原。
     更具体地， 本发明涉及 ：
     1. 一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或可能发展为癌症的动物给 予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状， 其中所述疫苗包含 ：
     (a) 酵母载体 ； 和
     (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种癌抗原 ； 和
     ii) 与癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     2. 项 1 的方法， 其中所述肽由至少 2-6 个与癌抗原异源的氨基酸残基组成。3. 项 1 的方法， 其中所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列 ；
     其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和
     X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。
     4. 项 3 的方法， 其中 X6 是脯氨酸。
     5. 项 1 的方法， 其中所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     6. 一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或可能发展为癌症的动物给 予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状， 其中所述疫苗包含 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种癌抗原 ； 和
     ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个 至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达 的融合蛋白的翻译后加工。
     7. 项 6 的方法， 其中酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     8. 项 1 或 6 的方法， 其中融合蛋白包含至少两种或多种癌抗原。
     9. 项 1 或 6 的方法， 其中融合蛋白包含一种或多种癌抗原的至少一个或多个免疫 原性功能域。
     10. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原是与选自以下组癌症相关的抗原 ： 黑色素瘤， 鳞 状细胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢癌， 膀胱 癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤， 血管肉瘤， 肥大细胞肿瘤， 原发性肝癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠癌， 肾细胞癌， 造血细胞瘤形成及它们的转移性癌症。
     11. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原是 ras 基因编码的野生型或突变型蛋白。
     12. 项 11 的方法， 其中癌抗原是由选自 K-ras， N-ras 或 H-ras 基因的 ras 基因编 码的野生型或突变型蛋白。
     13. 项 11 的方法， 其中 ras 基因编码带有单突变或多突变的 Ras 蛋白。
     14. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原包含片段， 所述片段含有对应于野生型 Ras 蛋白 第 12， 13， 59 或 61 位的氨基酸的野生型 Ras 蛋白至少 5-9 个连续氨基酸残基， 其中第 12， 13， 59， 或 61 位的氨基酸残基相对于野生型 Ras 蛋白发生了突变。
     15. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 其中 每个功能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由所述蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一 侧的至少 4 个氨基酸残基组成， 所述突变与致肿瘤性相关。
     16. 项 15 的方法， 其中融合蛋白构建体由至少一种肽组成， 其中所述肽与另一突 变肿瘤抗原在阅读框内融合， 该肽选自以下组 ：
     a) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 8-16， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 12 的 氨基酸残基发生了突变 ；
     b) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 9-17， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 13 的氨基酸残基发生了突变 ；
     c) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 55-63， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 59 的氨基酸残基发生了突变 ； 和
     d) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 57-65， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 61 的氨基酸残基发生了突变。
     17. 项 16 的方法， 其中突变的肿瘤抗原是相对于野生型 Ras 蛋白序列包含至少一 个突变的 Ras 蛋白。
     18. 项 1 或 6 的方法， 其中酵母载体选自以下组 ： 完整酵母， 酵母原生质球， 酵母胞 质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     19. 项 1 或 6 的方法， 其中用编码所述癌抗原的重组核酸分子转化用于制备酵母载 体的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球重组表达该癌抗原。
     20. 项 19 的方法， 其中重组表达所述癌抗原的酵母细胞或酵母原生质球用于制备 包含酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分的酵母载体。
     21. 项 1 或 6 的方法， 其中酵母载体来自非致病性酵母。
     22. 项 1 或 6 的 方 法， 其中酵母载体来自选自以下组的酵母： 糖酵母 (Saccharomyces)， 裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)， 克鲁维酵母 (Kluveromyces)， 汉逊 酵母 (Hansenula)， 假丝酵母 (Candida) 或毕赤酵母 (Pichia)。 23. 项 1 或 6 的方法， 其中糖酵母是酿酒酵母 (S.Cerevisiae)。
     24. 项 1 或 6 的方法， 其中将疫苗施用到呼吸道。
     25. 项 1 或 6 的方法， 其中以胃肠道外给予方式给予疫苗。
     26. 项 1 或 6 的方法， 其中疫苗进一步包含树突细胞或巨噬细胞， 其中将表达融合 蛋白的酵母载体传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且将包含表达癌抗原的酵母载 体的树突细胞或巨噬细胞给予动物。
     27. 项 26 的方法， 其中树突细胞或酵母载体额外装载了游离抗原。
     28. 项 1 或 6 的方法， 其中疫苗作为治疗性疫苗给予。
     29. 项 1 或 6 的方法， 其中疫苗作为预防性疫苗给予。
     30. 项 1 或 6 的方法， 其中动物已经患有或者可能发展为选自以下组的癌症 ： 脑 癌， 肺癌， 乳腺癌， 黑色素瘤或肾癌。
     31. 项 1 或 6 的方法， 其中动物患有癌症， 并且在通过外科手术切除动物的肿瘤之 后再给予疫苗。
     32. 项 1 或 6 的方法， 其中动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 并且进 行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植之后再给予疫苗。
     33. 项 1 或 6 的方法， 其中动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 进行不 引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植， 以及输注同种异体的供体淋巴细胞之后再给予 疫苗。
     34. 一种保护动物对抗脑癌或肺癌的方法， 包括将包含酵母载体和至少一种癌抗 原的疫苗施用到已患有或可能发展为脑癌或肺癌的动物的呼吸道， 以减少或预防动物脑癌 或肺癌的至少一种症状。
     35. 项 34 的方法， 其中疫苗包含至少两种或多种癌抗原。
     36. 项 34 的方法， 其中癌抗原是含有至少一种或多种癌抗原的融合蛋白。
     37. 项 34 的方法， 其中癌抗原是含有一种或多种癌抗原的至少一个或多个免疫原 性功能域的融合蛋白。
     38. 项 34 的方法， 其中癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 每个功 能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由所述蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至 少 4 个氨基酸残基组成， 所述突变与致肿瘤性相关。
     39. 项 34 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合 蛋白 ：
     a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     40. 项 34 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合蛋白 ： a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个 至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达 的融合蛋白的翻译后加工。
     41. 项 34 的方法， 其中酵母载体选自以下组 ： 完整酵母， 酵母原生质球， 酵母胞质 体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     42. 项 34 的方法， 其中用编码所述癌抗原的重组核酸分子转化用于制备酵母载体 的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球重组表达所述癌抗原。
     43. 项 42 的方法， 其中重组表达癌抗原的酵母细胞或酵母原生质球用于制备包含 酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分的酵母载体。
     44. 项 34 的方法， 其中酵母载体在细胞内装载癌抗原。
     45. 项 34 的方法， 其中癌抗原与酵母载体共价或非共价结合。
     46. 项 34 的方法， 其中通过混合使酵母载体与癌抗原结合。
     47. 项 34 的方法， 其中以鼻内给予方式给予疫苗。
     48. 项 34 的方法， 其中以气管内给予方式给予疫苗。
     49. 项 34 的方法， 其中将酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细 胞， 并且将包含酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物呼吸道。
     50. 项 34 的方法， 其中所述方法保护动物对抗脑癌。
     51. 项 50 的方法， 其中脑癌是原发性脑癌。
     52. 项 50 的方法， 其中脑癌是多形性成胶质细胞瘤。
     53. 项 50 的方法， 其中脑癌是来自另一器官的转移癌。
     54. 项 34 的方法， 其中所述方法保护动物对抗肺癌。
     55. 项 54 的方法， 其中肺癌是原发性肺癌。
     56. 项 54 的方法， 其中肺癌选自非小细胞癌， 小细胞癌和腺癌。
     57. 项 54 的方法， 其中肺癌是来自另一器官的转移癌。
     58. 项 34 的方法， 其中疫苗作为治疗性疫苗给予。
     59. 项 34 的方法， 其中疫苗作为预防性疫苗给予。
     60. 项 34 的方法， 其中酵母载体来自非致病性酵母。
     61. 项 34 的方法， 其中酵母载体来自选自以下组的酵母 ： 糖酵母， 裂殖酵母， 克鲁 维酵母， 汉逊酵母， 假丝酵母或毕赤酵母。
     62. 项 34 的方法， 其中糖酵母是酿酒酵母。
     63. 一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应和抗原特异性细胞介导的免疫反应 的方法， 所述方法包括给予动物包含下述物质的治疗性组合物 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与该抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ； 其中融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     64. 项 63 的方法， 其中所述肽由至少 6 个与所述抗原异源的氨基酸残基组成。
     65. 项 63 的方法， 其中所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列 ；
     其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和
     X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。
     66. 项 65 的方法， 其中 X6 是脯氨酸。
     67. 项 63 的方法， 其中所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     68. 项 63 的方法， 其中抗原选自以下组 ： 病毒抗原， 过表达的哺乳动物细胞表面分 子， 细菌抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一个或多个 突变氨基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过 插入流行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以 及通过调节序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     69. 一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应和抗原特异性细胞介导的免疫反应 的方法， 所述方法包括给予动物包含下述物质的治疗性组合物 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2- 约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达 的融合蛋白的翻译后加工。
     70. 项 69 的方法， 其中酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     71. 一种疫苗， 含有 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与该抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     72. 项 71 的疫苗， 其中所述肽由至少 6 个与该抗原异源的氨基酸残基组成。
     73. 项 71 的疫苗， 其中所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列 ；
     其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和
     X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。
     74. 项 73 的疫苗， 其中 X6 是脯氨酸。
     75. 项 73 的疫苗， 其中所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     76. 项 73 的疫苗， 其中抗原选自以下组 ： 病毒抗原， 哺乳动物细胞表面分子， 细菌 抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一个或多个突变氨 基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过插入流 行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以及通过 调节序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     77. 项 73 的疫苗， 其中抗原是癌抗原。
     78. 一种疫苗， 包含 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表 达的融合蛋白的翻译后加工。
     79. 项 78 的疫苗， 其中酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     80. 一种治疗癌症病人的方法， 包括 ：
     a) 用能有效建立稳定混合的骨髓嵌合状态且不引起骨髓重度抑制的干细胞转移来治疗癌症病人， 其中干细胞由同种异体的供体提供 ；
     b) 将从同种异体的供体获得的淋巴细胞给予病人 ； 和
     c) 在步骤 (b) 之后， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予病人。
     81. 项 80 的方法， 进一步包括在步骤 (a) 之前， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原 的疫苗给予同种异体的供体。
     82. 项 80 的方法， 进一步包括在步骤 (a) 之前， 切除病人的肿瘤。
     83. 项 80 的方法， 其中疫苗包含至少两种或多种癌抗原。
     84. 项 80 的方法， 其中癌抗原是包含一种或多种癌抗原的融合蛋白。
     85. 项 80 的方法， 其中癌抗原是含有一种或多种癌抗原的一个或多个免疫原性功 能域的融合蛋白。
     86. 项 80 的方法， 其中癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 每个功 能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由所述蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至 少 4 个氨基酸残基组成， 所述突变与致肿瘤性相关。
     87. 项 80 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合 蛋白 ：
     a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与该癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与该癌抗原异源的氨基酸残 基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加 工；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     88. 项 80 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合 蛋白 ：
     a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与该癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表 达的融合蛋白的翻译后加工。
     89. 项 80 的方法， 其中酵母载体选自以下组 ： 完整酵母， 酵母原生质球， 酵母胞质 体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     90. 项 80 的方法， 其中用编码所述癌抗原的重组核酸分子转化用于制备酵母载体 的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球重组表达所述癌抗原。
     91. 项 90 的方法， 其中重组表达癌抗原的酵母细胞或酵母原生质球用于制备包含 酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分的酵母载体。
     92. 项 80 的方法， 其中酵母载体在细胞内装载癌抗原。
     93. 项 80 的方法， 其中癌抗原与酵母载体共价或非共价结合。
     94. 项 80 的方法， 其中通过混合使酵母载体与癌抗原结合。
     95. 项 80 的方法， 其中以鼻内给予方式给予疫苗。96. 项 80 的方法， 其中以胃肠道外给予方式给予疫苗。
     97. 项 80 的方法， 其中将酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细 胞， 并且将包含酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物呼吸道。
     98. 项 80 的方法， 其中酵母载体来自非致病性酵母。
     99. 项 80 的方法， 其中酵母载体来自选自以下组的酵母 ： 糖酵母， 裂殖酵母， 克鲁 维酵母， 汉逊酵母， 假丝酵母或毕赤酵母。
     100. 项 80 的方法， 其中糖酵母是酿酒酵母。
     附图简述
     图 1 是柱形图， 显示基于酵母的 Ras61-VAX 疫苗在体外控制预先存在的乌拉坦 (urethane) 诱导的肺部肿瘤。
     图 2 是柱形图， 显示当经皮下和鼻内途径给予时， 基于酵母的 RasV-VAX 疫苗提供 对抗肺部肿瘤生长的特异性保护。
     图 3 是柱形图， 显示当以鼻内给予方式而不是皮下给予方式给予时， 表达 Gag 的基 于酵母的疫苗能防护颅内肿瘤。
     图 4 是存活曲线图， 显示当经皮下和鼻内给予时， 表达 EGFR 的基于酵母的疫苗 (EGFR-tm VAX) 能防护表达 EGFR 的颅内肿瘤的攻击。 图 5 是柱形图， 显示接种表达乳腺肿瘤抗原的基于酵母的疫苗联合不引起骨髓重 度抑制的同种异体干细胞移植能防护肿瘤攻击。
     图 6 是柱形图， 显示接种表达黑色素瘤抗原的基于酵母的疫苗能防护表达该抗原 的黑色素瘤的肿瘤攻击。
     图 7 是用于本发明基于酵母的疫苗的各种突变 Ras 融合蛋白的构建示意图。
     发明内容 本发明涉及治疗和 / 或预防多种适用于免疫疗法的疾病和状态的组合物和方法， 一个具体实施例涉及治疗和 / 或预防动物癌症的组合物和方法。本发明包括使用包含酵母 载体和选择用来诱发动物抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应的抗原的基于酵母的 疫苗， 用于预防性和 / 或治疗性接种以及预防和 / 或治疗多种疾病和状态。特别是， 发明人 在此描述了使用基于酵母的疫苗以在体内减小 (reduce) 多种不同形式癌症中的肿瘤， 包 括肺癌， 脑癌， 乳腺癌和肾癌。 本文还描述了对用于癌症治疗和各种免疫治疗方法和组合物 的基于酵母的疫苗的改进。
     发明人以前描述过能诱导有效的细胞介导免疫， 包括细胞毒性 T 细胞 (CTL) 反应 的疫苗技术。所述疫苗技术包括使用酵母及其衍生物作为疫苗载体， 其中酵母被改造成表 达相关抗原或者装载了相关抗原， 来诱发抗该抗原的免疫反应。US 5,830,463 概括描述了 这种技术并且全部引入本文作为参考。本发明采用了 US 5,830,463 中描述的现有酵母疫 苗技术， 并提供了对以下内容的具体改进 ： 一种使用酵母载体和挑选的癌抗原减轻癌症方 法， 包含具有提高的稳定性的新蛋白的新酵母疫苗， 和使用新酵母疫苗治疗任意疾病或状 态的方法， 对于这些疾病或状态诱发免疫反应可能具有治疗益处。对可用于本发明各个实 施例中的酵母疫苗的概括描述在未审结的系列申请 US09/991,363 中也有描述， 全部引入 本文作为参考。
     特别是， 本发明人发现虽然多种免疫途径对于在外周破坏肿瘤可能效果相当， 而 本发明所使用的基于酵母的疫苗能够致敏肺部独特的效应细胞。因此， 虽然其它给予途径 仍然有效， 将酵母疫苗经过呼吸道 ( 如鼻内， 吸入， 气管内 ) 给予能产生惊人的强免疫反应 和抗肿瘤效果， 这是迄今所研究的其它给予途径不能实现的。 特别是， 本发明人发现将酵母 疫苗施用到呼吸道对减小肺癌肿瘤的效果明显好于将该疫苗施用到外周的效果。 可能在脑 肿瘤中获得的结果甚至更惊人， 当将酵母疫苗施用到呼吸道时， 能在迄今所研究的全部试 验模型中诱导有效的抗肿瘤反应， 外周 ( 皮下 ) 给予疫苗对于诱导脑部抗肿瘤反应不太有 效， 并且在至少一个脑癌的试验模型中， 外周给予没能在脑部产生明显的抗肿瘤效果。因 此， 本发明的基于酵母的疫苗能致敏肺部独特的免疫效应细胞前体， 这种免疫细胞能特别 有效地通过血脑屏障， 影响颅内肿瘤的生长进程。 不被理论束缚， 本发明人相信免疫途径可 能是设计针对至少是脑部肿瘤和肺部肿瘤的有效疫苗的一个重要因素。 因为本发明的基于 酵母的疫苗能非常容易的应用于多种免疫途径， 所以该疫苗必将以迄今未被认识到的治疗 某些癌症的潜力， 唯一地激发高度特异性的免疫反应。
     本发明人还发现， 在 Luznik 等， (Blood 101(4) ： 1645-1652， 2003 ； 全部引入本文 作为参考 ) 先前描述的混合同种异体骨髓嵌合的一种新修改方案中使用本发明的酵母疫 苗， 能在体内极好地诱导治疗性免疫和抗肿瘤反应。 重要的是， 不需使用来自受者的全部肿 瘤制备物， 不需用生物学反应改良剂， 如粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 加强疫 苗， 不需使用常规的佐剂， 也能获得该结果。另外， 使用本发明的酵母载体在选择抗原和抗 原组合方面有极大的灵活性， 并能显著增强针对抗原的细胞免疫。 此外， 通过用本发明的酵 母疫苗以可控的、 选择性的方式免疫供体， 产生了额外的增强作用。 另外， 本发明人利用能稳定异源蛋白在酵母载体中的表达和 / 或防止所表达的异 源蛋白的翻译后加工的新的融合蛋白改进了基于酵母的疫苗技术。具体的， 本发明人在 此描述了一种在酵母中表达异源抗原的新构建体， 其中所需抗原性蛋白或肽的氨基末端 与下述物质融合 ： (a) 合成肽 ； 或 (b) 内源性酵母蛋白的至少一部分， 其中任一融合伙伴 (partner) 能显著增加蛋白在酵母中表达的稳定性和 / 或防止酵母细胞对蛋白的翻译后加 工。 融合肽还提供了设计用来为选择性物质， 如抗体识别的表位， 并且不会消极影响针对构 建体中的接种抗原的免疫反应。这种物质适用于鉴定、 筛选和纯化用于本发明的蛋白。
     另外， 本发明预计使用与抗原构建体 C 末端融合的肽， 特别用于筛选和鉴别蛋白。 这种肽包括， 但不限于任何合成的或天然的肽， 如肽标记 ( 如 6×His)， 或任何其它短表位 标记。根据本发明的附加在抗原 C 末端的肽， 可在添加或不添加如上所述 N 末端肽的情况 下使用。
     最后， 本发明人在此描述了用于提供来自相同构建体中一个或多个抗原的多个免 疫原性功能域的基于酵母的疫苗中的新融合蛋白抗原。 当希望在单一疫苗构建体中包含在 抗原的一个或几个位置天然发生的几个不同的突变和 / 或突变组合时， 这种融合蛋白特别 有用。例如， 已知 ras 基因家族的癌基因中有几个与天然肿瘤细胞表现型相关的不同突变。 发现在 78％的胰腺癌， 34％的结肠直肠癌， 27％的非小细胞肺癌和 24％的卵巢癌中， 编码 Ras 蛋白 12 位氨基酸的密码子发生突变。还发现多种癌症中在 13 位， 59 位和 61 位有不同 的突变。本发明人在此描述了采用基于酵母的疫苗的方法制备融合蛋白， 包括但不限于基 于 ras 突变的融合蛋白， 使得在相同的抗原疫苗内， 在相同的位置有几个突变和 / 或在一个
     以上的位置有不同的突变组合。
     作为本发明所使用的方法和组合物的概括描述， 此处所述的疫苗和方法将使 T 细胞高效活化的有效抗原传递整合在一个不需要附加的佐剂成分或生物调节剂的强效疫 苗制剂中。本文所述的疫苗具有许多使其成为理想疫苗候选物的其它属性， 包括但不限 于容易构建， 大批制备时费用低， 生物学稳定和安全。对小鼠， 大鼠， 兔， 豚尾猴 (Macaca nemestrina)， 猕猴或免疫缺陷 CB.17scid 小鼠， 以完整酵母进行初次免疫或重复给予时， 没有出现严重的不良反应 ( 观察结果未公布 )。此外， 如系列申请 US 09/991,363( 出处同 上 ) 所述， 酵母抗原复合物使树突细胞成熟为有效的抗原递呈细胞 (APCs)， 同时将抗原有 效传递到 MHC I 类和 MHC Ⅱ类加工途径的能力表明， 基于酵母的疫苗载体将提供一种有效 的诱导对抗多种传染性疾病和癌症靶的细胞介导免疫的有效策略。实际上， 本文所述的数 据以及基于酵母的疫苗技术的进步也证明了这个一般原则， 同时提供了对以前未被重视的 技术的重要改进。
     根据本发明， 酵母载体是可与本发明的疫苗或治疗性组合物中的抗原联合使用的 或作为佐剂使用的任意酵母细胞 ( 如全部的或完整的细胞 ) 或其衍生物 ( 见下文 )。因此 酵母载体包括， 但不限于， 活的完整的酵母微生物 ( 即， 具有其全部成分包括细胞壁的酵母 细胞 )， 灭活的 ( 死的 ) 完整的酵母微生物， 或其衍生物， 包括 ： 酵母原生质球 ( 即缺少细胞 壁的酵母细胞 )， 酵母胞质体 ( 即缺少细胞壁和细胞核的酵母细胞 )， 酵母空胞 ( 即缺少细 胞壁、 细胞核和细胞质的酵母细胞 )， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分 ( 以前也称作亚细 胞酵母颗粒 )。
     通常， 通过酶消化酵母细胞壁制备酵母原生质球。例如 Franzusoff 等， 1991， Meth.Enzymol.194， 662-674 描述了这种方法， 并全部引入本文作为参考。 通常， 通过从酵母 细胞摘除细胞核制备酵母胞质体。 例如 Coon， 1978， Natl.Cancer Inst.Monogr.48， 45-55 描 述了这种方法， 并全部引入本文作为参考。 通常如下制备酵母空胞， 重新密封经透化处理的 或溶解了的细胞， 并可以包含但不是必需包含该细胞的至少一些细胞器。例如 Franzusoff 等， 1983， J.Biol.Chem.258， 3608-3614 和 Bussey 等， 1979， Bioclaim.Biophys.Acta 553， 185-196 描述了这种方法， 每一个都全部引入本文作为参考。 亚细胞性酵母膜提取物或其级 分指缺少天然细胞核或细胞浆的酵母膜。该颗粒可以是任意大小， 包括从天然酵母膜的大 小到微颗粒的大小， 所述微颗粒是用超声处理或本领域技术人员已知的其它膜破裂方法， 随后重新密封制备的。制备亚细胞性酵母膜提取物的方法如 Franzusoff 等， 1991， Meth. Enzymol.194， 662-674 所述。还可使用酵母膜提取物级分， 它含有部分酵母膜， 并且在酵母 重组表达抗原时在制备酵母膜提取物之前含有目标抗原。
     可用任意酵母菌株制备本发明的酵母载体。酵母是单细胞微生物， 属于下述 三纲之一： 子 囊 菌 纲 (Ascomycetes)， 担 子 菌 纲 (Basidiomycetes) 和 半 知 菌 (Fungi Imperfecti)。虽然致病酵母菌株或其非致病突变体都可用于本发明， 但优选非致病 酵母菌株。优选酵母菌株的属包括糖酵母属， 假丝酵母属 ( 可能是致病的 )， 隐球菌属 (Cryptococcus)， 汉逊酵母属， 克鲁维酵母属， 毕赤酵母属， 红酵母属 (Rhodotorula)， 裂 殖酵母属和西洋蓍霉 (Yarrowia)， 更优选糖酵母属， 假丝酵母属， 汉逊酵母属， 毕赤酵母 属和裂殖酵母属， 特别优选糖酵母属。优选酵母菌株的种包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 卡 氏 酵 母 (Saccharomyces carlsbergensis)， 白 色 假 丝 酵 母 (Candidaalbicans)， 乳酒假丝酵母 (Candida kefyr)， 热带假丝酵母 (Candida tropicalis)， 罗伦 隐球菌 (Cryptococcus laurentii)， 新生隐球菌 (Cryptococcus neoformans)， 异常汉逊 酵母 (Hansenula anomala)， 多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)， 脆壁克鲁维酵母 (Kluyveromycesfragilis)， 乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)， 马克斯克鲁维酵母 乳酸变体 (Kluyveromyces marxianus var.lactis)， 巴氏毕赤酵母 (Pichia pastoris)， 深 红类酵母 (Rhodotorula rubra)， 栗酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) 和 Yarrowia lipolytica。应该知道许多这些菌种包括属于上述种的多种亚种， 型， 亚型等。更优选的 酵母种包括酿酒酵母， 白色假丝酵母 (C.albicans)， 多形汉逊酵母 (H.polymorpha)， 巴氏 毕赤酵母 (P.pastors) 和栗酒裂殖酵母 (S.pombe)。特别优选酿酒酵母， 因为它相对来说 容易操作并且用作食品添加剂 “通常被认为是安全的” (“GRAS” )(GRAS， FDA 提出的规则 62FR18938， 4 月 17， 1997)。本发明的一个实施例是能使质粒复制到相当高的拷贝数的酵母 株， 如酿酒酵母 cir° (S.cerevisiae cir) 株。
     一个实施例中， 本发明优选的酵母载体能与该酵母载体和抗原被传递到的细胞 ( 如树突细胞或巨噬细胞 ) 融合， 从而显著影响酵母载体的有效传递， 在很多实施例中是显 著影响酵母载体将抗原有效传递到细胞。本文中， 酵母载体与靶细胞的融合是指酵母细胞 膜， 或其颗粒与靶细胞 ( 如树突细胞或巨噬细胞 ) 膜融合， 形成合胞体的能力。本文中， 合 胞体是细胞合并产生的原生质多核团 (mass)。各种病毒表面蛋白 ( 包括免疫缺陷病毒， 如 HIV， 流感病毒， 脊髓灰质炎病毒和腺病毒的表面蛋白 ) 和其它促融剂 ( 如卵子和精子融合 时涉及的促融剂 ) 能影响两个膜之间的融合 ( 即病毒和哺乳动物细胞膜之间的融合或哺乳 动物细胞膜之间的融合 )。例如， 在其表面上产生 HIVgp120/gp41 异种抗原的酵母载体能 与 CD4+T- 淋巴细胞融合。然而要注意， 虽然在某些情况下需要将寻靶部分掺入到酵母载体 中， 但这不是必需的。本发明人以前证明了本发明的酵母载体很容易被树突细胞 ( 以及其 它细胞， 如巨噬细胞 ) 摄入。
     利用本领域技术人员已知的许多技术， 可以将酵母载体配制到本发明的组合物 中， 包括直接给予病人的制品或首先装入 (load) 载体中 ( 如树突细胞 ) 的制品。例如， 将 酵母载体暴露于液氮或干冰， 通过冻干或冷冻干燥酵母载体。 将酵母包装成块状或片状， 正 如将酵母用于烘焙或酿造操作时所做的， 也可制备含有酵母载体的配制剂。 另外， 在装入树 突细胞之前， 或与抗原以其它类型给予方式给予之前， 酵母载体可与药物可接受赋形剂， 如 宿主细胞耐受的等渗缓冲液混合。 这种赋形剂包括， 例如水， 盐水， 林格 (Ringer′ s) 溶液， 葡萄糖 (dextrose) 溶液， Hank′ s 液， 以及其它的含水生理平衡盐溶液。也可使用非水介 质， 如不挥发油， 芝麻油， 油酸乙酯， 或甘油三酯。其它的有用制剂包括含有增稠剂， 如羧甲 基纤维素钠， 山梨醇， 甘油或葡聚糖的悬液。赋形剂还可包含少量添加剂， 如增加等渗性和 化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液， 碳酸盐缓冲液和 Tris 缓冲液， 防腐 剂的例子包括硫柳汞， 间 (m-) 甲苯酚或邻 (o-) 甲苯酚， 福尔马林和苯甲醇。标准的配制剂 是可注射的液体或是能用合适的液体溶解为注射用悬液或溶液的固体。因此， 在非液体配 制剂中， 赋形剂包括， 例如葡萄糖， 人血清白蛋白， 和 / 或防腐剂， 在给予之前加入无菌水或 无菌盐水。
     本发明的治疗性组合物或疫苗的一个成分包括至少一种免疫接种动物的抗原。 所 述组合物或疫苗可根据需要包括， 一， 二， 几个， 一些或大量抗原， 所述抗原包括一个或多个抗原的一个或多个免疫原性功能域。根据本发明， 本文通常使用的术语 “抗原” 指天然存在 的或合成衍生的蛋白的任意部分 ( 肽， 部分蛋白， 全长蛋白 )， 细胞成分 ( 完整的细胞， 细胞 溶解物或破裂的细胞 )， 生物体 ( 完整生物体， 溶解的或破裂的细胞 ) 或碳水化合物或其它 分子， 或其部分， 其中抗原诱发抗原特异性免疫反应 ( 体液和 / 或细胞免疫反应 )， 或作为耐 受原， 针对在给予所述抗原的动物的细胞和组织内碰到的相同或相似抗原。
     本发明的一个实施例中， 当需要刺激免疫反应时， 术语 “抗原” 可与术语 “免疫原” 交换使用， 并用来描述诱发体液和 / 或细胞免疫反应的 ( 即， 是抗原性的 ) 蛋白， 肽， 细胞成 分， 生物体或其它分子， 因此给予动物免疫原 ( 例如， 通过本发明的疫苗 ) 可产生针对动物 组织中碰到的相同或相似抗原的抗原特异性免疫反应。 因此， 一个实施例中， 接种动物以对 抗特定抗原意味着给予该抗原的结果是诱发抗所述抗原的免疫反应。 优选免疫接种产生保 护效果或治疗效果， 其中随后暴露于抗原 ( 或抗原来源 ) 将诱发抗所述抗原的 ( 或来源的 ) 减轻或防止动物的疾病或状态的免疫反应。免疫接种的概念是本领域已知的。通过给予本 发明的治疗性组合物诱发的免疫反应可以是， 与不给予疫苗时比较， 免疫反应的任意方面 的任意可检测的变化 ( 例如， 细胞反应， 体液反应， 细胞因子的产生 )。
     另一实施例中， 当需要抑制抗指定抗原的免疫反应时， 抗原可包括耐受原。 根据本 发明， 耐受原用来描述以减轻或改变针对抗原的免疫反应的给予形式， 给予量或给予途径 提供的蛋白， 肽， 细胞成分， 生物体或其它分子， 优选与耐受原或表达或递呈这种耐受原的 细胞接触时， 基本无应答， 无反应性， 其它失活作用或清除免疫系统细胞。
     “接种抗原” 可以是免疫原或耐受原， 它是疫苗中所用的抗原， 诱发抗接种抗原的 生物学反应 ( 免疫反应的诱发， 耐受 )。
     指定抗原的免疫原性功能域可以是当给予动物时作为免疫原的包含至少一个表 位的抗原的任意部分 ( 即， 肽片段或亚单位 )。例如， 单个蛋白可包含多个不同的免疫原性 功能域。
     本文中表位定义为指定抗原中足够诱发免疫反应的单个免疫原性位置， 或指定抗 原中足够抑制， 消除或灭活免疫反应的单个耐受性位置。本领域技术人员知道 T 细胞表位 在大小和组成上与 B 细胞表位不同， 通过 MHC I 类途径递呈的表位不同于通过 MHC II 类途 径递呈的表位。抗原可以如单个表位一样小， 或稍大， 可包含多个表位。因此， 抗原的大小 可以是约 5-12 个氨基酸 ( 如， 肽 ) 一样小， 或像全长蛋白， 包括多体和融合蛋白， 嵌合蛋白， 完整细胞， 完整微生物或其部分 ( 如完整细胞的溶解物或微生物提取物 ) 一样大。另外， 抗 原包括可装入酵母载体或本发明的组合物的碳水化合物， 如癌细胞表达的碳水化合物。一 些实施例中 ( 即， 当酵母载体从重组核酸分子表达抗原时 )， 抗原是蛋白， 融合蛋白， 嵌合 蛋白， 或其片段， 而不是全细胞或微生物。一个优选实施例中， 抗原选自肿瘤抗原或传染性 疾病病原体抗原 ( 即病原体抗原 )。一个实施例中， 抗原选自病毒抗原， 过表达哺乳动物细 胞表面分子， 细菌抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一 个或多个突变氨基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋 白， 通过插入流行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的 蛋白， 以及通过调节序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     根据本发明， 适合用在本发明组合物或疫苗的抗原可包括来自相同抗原的两个或 多个免疫原性功能域或表位， 来自相同细胞， 组织或生物体的两个或多个抗原免疫原性功能域或表位， 或来自不同细胞， 组织或生物体的两个或多个不同抗原， 免疫原性功能域或表 位。优选抗原是与酵母菌株异源的 ( 即， 并非是在不进行遗传或生物学操作时， 酵母菌株天 然产生的蛋白 )。
     本发明的一个实施例涉及用作本发明疫苗的抗原的几个改良的蛋白。具体的， 本 发明提供了能稳定异源蛋白在酵母载体中的表达和 / 或防止所表达的异源蛋白的翻译后 加工的新的融合蛋白构建体。通常， 这些融合蛋白多数由酵母载体以重组蛋白的形式表达 ( 例如， 通过完整的酵母或酵母原生质球， 它任选的进一步处理成酵母胞质体， 酵母空胞或 酵母膜提取物或其片段 )， 一个或多个这种融合蛋白可以装入酵母载体或与上述构成本发 明疫苗的酵母载体复合或混合， 这只是本发明的一个实施例。
     用于本发明的一个这种融合构建体是融合蛋白， 包含 ： (a) 至少一种抗原 ( 包括全 长抗原的免疫原性功能域和抗原表位， 以及本文其它部分所描述的各种融合蛋白和多抗原 构建体 ) ； 和 (b) 合成肽。所述合成肽优选与癌抗原的 N 末端连接。该肽由至少两个与癌 抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的 融合蛋白的翻译后加工。合成肽和抗原的 N 末端部分一起形成满足下列要求的融合蛋白 ： (1) 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ( 即合成肽的第一个氨基酸是甲硫氨酸 ) ； (2) 融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ( 即合成肽的第二个氨基酸不是甘 氨酸或脯氨酸 ) ； (3) 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ( 即所述蛋白或合成 肽的一部分的位置 2-6 的氨基酸， 条件是合成肽少于 6 个氨基酸， 都不包括甲硫氨酸 ) ； (4) 融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸 ( 即所述蛋白或合成肽的一部分的 位置 2-5 的氨基酸， 条件是所述合成肽少于 5 个氨基酸， 都不包括赖氨酸或精氨酸 )。合成 肽可以只有两个氨基酸， 但更优选至少有 2-6 个氨基酸 ( 包括 3， 4， 5 个氨基酸 )， 可以比 6 个氨基酸长， 总长直至约 200 个氨基酸。
     一个实施例中， 所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列， 其中 M 是甲硫氨酸 ； X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和 精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和 X6 是除甲硫氨酸之外的任意 一种氨基酸。一个实施例中， X6 残基是脯氨酸。增强抗原在酵母细胞中表达的稳定性和 / 或防止蛋白在酵母中的翻译后加工的示例性合成序列包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的 序列。除了增强表达产物的稳定性， 本发明人相信这个融合伙伴不会消极影响抗构建体中 接种抗原的免疫反应。 此外， 合成的融合蛋白可被设计成提供为选择性物质， 如抗体识别的 表位。
     根据本发明， “异源氨基酸” 指不是天然发现的 ( 即不是在自然界和体内发现的 ) 特定氨基酸序列侧翼的氨基酸序列， 或与特定氨基酸序列的功能不相关的氨基酸序列， 或 当基因中出现位于编码特定氨基酸序列的天然存在核酸序列的侧翼的核苷酸时， 不应由该 核苷酸编码的氨基酸序列， 条件是在天然存在的序列中的此核苷酸是采用衍生指定氨基酸 序列的生物体所使用的标准密码子翻译的。因此， 与癌抗原异源的至少两个氨基酸残基是 任意两个不天然存在于癌抗原侧翼的氨基酸残基。
     本发明的另一个实施例涉及一种融合蛋白， 包含 (a) 至少一种抗原 ( 包括全长抗 原的免疫原性功能域和表位， 以及本文其它部分所描述的各种融合蛋白和多抗原构建体 )，并与 (b) 内源酵母蛋白的至少一部分融合。内源酵母蛋白优选与癌抗原的 N 末端融合， 并 显著增强蛋白在酵母中表达的稳定性和 / 或防止酵母细胞对蛋白的翻译后加工。另外， 内 源酵母抗原与合成肽的这种融合伙伴不会消极影响抗构建体中接种抗原的免疫反应。 已能 获得或很容易制备选择性结合内源抗原的抗体。最后， 如果需要将蛋白定位到具体的细胞 位置 ( 例如， 进入分泌途径， 进入线粒体， 进入细胞核 )， 那么构建体可使用酵母蛋白的内源 信号， 以确保细胞结构最适于传递系统。
     内源酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成 ( 或最多 22kDa)， 所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加 工。任何适合的内源酵母蛋白都可用于这个实施例， 特别优选包括但不限于下述的蛋白， SUC2( 酵母转化酶 ； 这是一个良好的候选物， 因为它能在胞质 (cytosolically) 表达蛋白或 将蛋白引入来自相同启动子的分泌途径， 但依赖于培养基的碳源 ) ； α 因子信号前导序列 ； SEC7 ； CPY ； 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 PCK1 ； 磷酸甘油激酶 PGK 和磷酸丙糖异构酶 TPI 基因产 物， 因为在葡萄糖中的抑制性表达和胞质定位 ； Cwp2p， 因为它在细胞壁中分布和贮留 ； 热 休克蛋白 SSA1， SSA3， SSA4， SSC1 和 KAR2， 对细胞进行热处理能诱导这些蛋白的表达并使这 些蛋白更加耐热 ； 线粒体蛋白 CYC1， 因为它能进入线粒体 ； BUD 基因， 因为在子细胞形成的 初始期， 它位于酵母细胞芽 ； ACT1， 因为它锚定在肌动蛋白束上。
     一个实施例中， 内源酵母蛋白 / 肽或合成肽包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体 表位。优选， 获得或制备可选择性结合融合伙伴的抗体。根据本发明， 术语 “选择性结合” 指 本发明的抗体， 抗体结合片段或结合伙伴优先结合特定蛋白的能力。更具体的， 术语 “选择 性结合” 指一个蛋白与另一个蛋白 ( 例如针对抗原的抗体， 其片段， 或结合伙伴 ) 的特异性 结合， 当通过任何标准试验 ( 例如， 免疫测定法 ) 测量时， 其结合水平统计学上显著高于试 验的背景对照。例如， 当进行免疫测定时， 对照通常包括含有抗体或仅仅抗原结合片段 ( 即 缺少抗原 ) 的反应孔 / 反应试管， 其中缺少抗原时抗体或其抗原结合片段的反应量 ( 例如， 与孔的非特异性结合 ) 作为背景。测量结合可采用各种现有技术中的标准化方法， 包括酶 免疫测定 ( 例如， ELISA)， 免疫印迹测定， 等。
     抗体的特征是含有免疫球蛋白功能域， 并因此是蛋白的免疫球蛋白超家族的成 员。本发明的分离的抗体可包括含有这种抗体的血清， 或已纯化到不同程度的抗体。本发 明的完整抗体可以是多克隆的或单克隆的。 或者， 本发明还可使用完整抗体的功能等价体， 如其中一个或多个抗体功能域被截短或缺失的抗原结合片段， ( 例如， Fv， Fab， Fab′， 或 F(ab)2 片段 )， 以及遗传改造的抗体或其抗原结合片段， 包括单链抗体或与超过一个表位结 合的抗体 ( 例如双特异性抗体 )， 或与一个或多个不同抗原结合的抗体 ( 例如， 双特异性或 多特异性抗体 )。
     通常， 制备抗体时， 将合适的试验动物， 例如但不限于， 兔， 绵羊， 仓鼠， 荷兰猪， 小 鼠， 大鼠， 或鸡暴露于所需抗体针对的抗原。通常， 用有效量的注射到动物内的抗原免疫动 物。抗原的有效量指诱导动物产生抗体所需的量。动物的免疫系统随后经过一段预设时间 后发生反应。可以重复进行免疫过程直到发现免疫系统制备针对抗原的抗体。为了获得抗 原特异性多克隆抗体， 从动物收集含有所需抗体的血清 ( 或如果动物是鸡的情况时， 可从 蛋中收集抗体 )。 这种血清可用作试剂。 通过， 例如用硫酸铵处理血清， 可以从血清 ( 或蛋 ) 进一步纯化多克隆抗体。单克隆抗体可根据 Kohler 和 Milstein(Nature 256 ： 495-497， 1975) 的方法制备。 例如， 从免疫动物脾脏 ( 或任何合适组织 ) 收集 B 淋巴细胞， 然后与骨髓瘤细胞融合， 获得 在适合培养基中能连续生长的杂交瘤细胞群。 通过检测杂交瘤所产生的抗体与所需抗原结 合的能力， 来筛选产生所需抗体的杂交瘤。
     本发明还扩展到有时称作结合伙伴的非抗体多肽， 它被设计成特异性结合本发明 的蛋白， 并且根据需要激活或抑制本发明的蛋白。具有规定的配体特异性的这种多肽的设 计实例见 Beste 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.96 ： 1898-1903， 1999)， 全部引入本文作为参考。
     本发明另一个实施例中， 疫苗的抗原部分制备成含有两个或多个抗原的融合蛋 白。一方面， 融合蛋白可包含一个或多个抗原的两个或多个免疫原性功能域或两个或多个 表位。 在一个特别优选的实施例中， 融合蛋白包含抗原的两个或多个免疫原性功能域， 优选 多个功能域， 其中多个功能域共同拥有在抗原的一个或几个位置天然发生的几个不同突变 和 / 或突变组合。这对提供一种针对非常特异性抗原的疫苗特别有利， 已知所述抗原在多 种病人中发生不定的突变。这种疫苗可对广泛范围的病人提供抗原特异性免疫。例如， 用 于本发明的多个功能域融合蛋白可具有多个功能域， 其中每个功能域由来自特定蛋白的肽 组成， 所述肽由蛋白任意一侧的至少 4 个氨基酸残基组成， 并包括所述蛋白中发现的突变 氨基酸组成， 所述突变与特定疾病 ( 例如， 癌症 ) 相关联。 Ras 是癌基因的一个实例， 已知其中的一些突变发生在特定位置并且与一种或多 种类型癌症的发展相关联。因此， 可以购建由含有已知在某种癌症中发生突变的特定残基 的肽组成的融合蛋白， 其中每个功能域包含在那个位置的不同突变以便涵盖那个位置已知 的几个或全部突变。 例如， 关于 Ras， 可以提供含有任意一侧至少 4 个氨基酸， 包括 12 位的氨 基酸的免疫原性功能域， 其中每个功能域具有非突变 Ras 蛋白中正常发生的对甘氨酸的不 同取代。 一个实施例中， 癌抗原包含片段， 所述片段含有对应于野生型 Ras 蛋白位置 12， 13， 59， 或 61 的氨基酸的野生型 Ras 蛋白的至少 5-9 个连续氨基酸残基， 其中位置 12， 13， 59， 或 61 的氨基酸残基相对于野生型 Ras 蛋白发生了突变。一方面， 融合蛋白构建体由至少一个 与其它突变肿瘤抗原在阅读框内融合的肽组成 ( 例如， 含有至少一个相对于野生型 Ras 蛋 白序列的突变的 Ras 蛋白 )， 其中所述肽选自以下组 ： (a) 一种肽， 其至少含有 SEQ IDNO ： 3 位置 8-16 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基发生了突变 ； (b) 一种肽， 其至少含 有 SEQ ID NO ： 3 位置 9-17 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 13 的氨基酸残基发生了突变 ； (c) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 55-63 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 59 的氨基酸残 基发生了突变 ； 和 (d) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 57-65 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 61 的氨基酸残基发生了突变。注意， 这些位置也对应于 SEQ ID Nos ： 5， 7， 9， 11 或 13 的任一， 因为人和小鼠的序列在蛋白的这个区域是同一的， 并且 K-Ras， H-Ras 和 N-Ras 在这 个区域也是同一的。
     特别适用于本发明这种策略的其它抗原对本领域技术人员是显而易见的， 包括但 不限于 ： 任意癌基因， TP53( 也称作 p53)， p73， BRAF， APC， Rb-1， Rb-2， VHL， BRCA1， BRCA2， AR( 雄激素受体 )， Smad4， MDR1， 和 / 或 Flt-3。
     本发明的一个实施例中， 本文所描述的任一氨基酸序列可从至少一个至约 20 个 附加的、 异源的、 位于特定氨基酸序列 C 端和 / 或 N 端侧翼的氨基酸制备。获得的蛋白或多 肽可被称作 “基本含有” 特定氨基酸序列。如上所讨论的， 根据本发明， 异源氨基酸指不是
     天然发现的 ( 即不是在自然界和体内发现的 ) 位于特定氨基酸序列侧翼的氨基酸序列， 或 与特定氨基酸序列的功能不相关的氨基酸序列， 或当基因中出现位于编码特定氨基酸序列 的天然存在核酸序列的侧翼的核苷酸时， 不应由所述核苷酸编码的氨基酸序列， 条件是在 天然存在的序列中的所述核苷酸是采用衍生指定氨基酸序列的生物体所使用的标准密码 子翻译的。类似的， 术语 “基本含有” ， 当用于本文的核酸序列时， 指编码特定氨基酸序列的 核酸序列， 它侧接于编码特定氨基酸序列的核酸序列的 5′和 / 或 3′端的每端的至少一个 至约 60 个附加的异源核苷酸。 异源核苷酸不是天然发现 ( 即不是在自然界和体内发现的 ) 出现在天然基因中时位于编码特定氨基酸序列的核酸序列的侧翼， 或不编码赋予蛋白任意 额外功能或改变具有特定氨基酸序列的蛋白的功能的蛋白。
     用于本发明的肿瘤抗原可包括肿瘤抗原， 如来自肿瘤细胞的蛋白， 糖蛋白或表面 碳水化合物， 来自肿瘤抗原的表位， 全肿瘤细胞， 肿瘤细胞混合物， 及其部分 ( 例如， 溶解 物 )。 一个实施例中， 用于本发明的肿瘤抗原可从自体的肿瘤样本中分离或衍生得到。 自体 肿瘤样本来自给予了治疗性组合物的动物。因此， 癌症中将存在要诱发的免疫反应所针对 的的抗原。 一方面， 疫苗提供的肿瘤抗原从至少两个， 优选从相同组织学肿瘤类型的多个同 种异体肿瘤样本分离或衍生得到。根据本发明， 多个同种异体肿瘤样本是从同物种的两个 或多个动物中分离的相同组织学肿瘤类型的肿瘤样本， 所述动物至少在主要组织相容性复 合物 (MHC) 方面有遗传学差异， 通常在其它基因位置有遗传学差异。因此， 如果一起给予， 多个肿瘤抗原可以代表衍生出抗原的任意个体中出现的基本全部肿瘤抗原。 本发明方法的 这个实施例提供了一种疫苗， 所述疫苗补偿了个体病人在表达相同组织学肿瘤类型的肿瘤 的肿瘤抗原上的天然变异。因此， 给予这种治疗性组合物能有效诱发抗各种肿瘤抗原的免 疫反应， 因此相同的治疗性组合物可以给予各种不同的个体。 一些实施例中， 可给予动物来 自不同组织学肿瘤类型的肿瘤的抗原， 以提供一种非常广泛的疫苗。
     优选， 从中分离或衍生获得抗原的肿瘤是任意肿瘤或癌， 包括但不限于， 黑色素 瘤， 鳞状细胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢 癌， 膀胱癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤， 血管肉瘤， 肥大细胞癌， 早期肝癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠 癌， 肾细胞癌， 造血细胞瘤形成和转移癌。可用于本发明疫苗的具体癌抗原的例子， 包括但 不限于 ： MAGE( 包括但不限于 MAGE3， MAGEA6， MAGEA10)， NY-ESO-1， gp100， 酪氨酸酶， EGF-R， PSA， PMSA， CEA， HER2/neu， Muc-1， hTERT， MART1， TRP-1， TRP-2， BCR-abl， 和 p53 的突变癌基 因形式 (TP53)， p73， ras， BRAF， APC( 腺瘤结肠息肉 )， myc， VHL(von Hippel′ s Lindau 蛋 白 )， Rb-1( 视网膜母细胞瘤 )， Rb-2， BRCA1， BRCA2， AR( 雄激素受体 )， Smad4， MDR1， Flt-3。
     根据本发明， 癌抗原可包括上述任意肿瘤抗原， 以及与癌症获得或发展的可能性 相关的任意其它抗原， 或抗该抗原的免疫反应对癌症有治疗益处的任意其它抗原。 例如， 癌 抗原包括但不限于， 肿瘤抗原， 带有一个或多个突变氨基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或 刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过插入流行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达 的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以及通过调节序列的突变而被诱导表达的蛋 白。一些这种抗原也可作为其它类型疾病 ( 例如自身免疫性疾病 ) 的抗原。
     本发明的一方面， 用于本发明组合物的抗原是来自病原体 ( 包括完整病原体 ) 的 抗原， 特别是来自与传染性疾病相关联 ( 例如， 导致或促成 ) 的病原体。来自传染性疾病病 原体的抗原可包括具有被 T 细胞识别的表位的抗原， 或具有被 B 细胞识别的表位的抗原， 由病原体唯一性表达的抗原， 以及由病原体和其它细胞表达的抗原。病原体抗原可包括完整 的细胞和整个病原生物体， 及其溶解物， 提取物或其它级分。某些情况中， 抗原可包括通常 不认为是对动物致病的， 但针对它的免疫接种是需要的生物体或其部分。 抗原可包括一个， 两个或多个抗原， 它们代表了给予的疫苗所针对的传染性疾病病原体中存在的基本全部的 抗原。其它实施例中， 可使用来自相同病原体的两个或多个不同菌株的抗原或来自不同病 原体的抗原， 以增加疫苗的治疗效果和 / 或效力。
     根据本发明， 病原体抗原包括， 但不限于， 由细菌， 病毒， 寄生虫或真菌表达的抗 原。优选用于本发明方法的病原体抗原包括引起动物慢性传染性疾病的抗原。一个实施例 中， 用于本发明方法或组合物的病原体抗原包括来自病毒的抗原。用于本发明疫苗的病毒 抗原的例子包括， 但不限于， env， gag， rev， tar， tat， 免疫缺陷病毒 ( 例如 HIV， FIV) 的核衣 壳蛋白和逆转录酶 ； HBV 表面抗原和核心抗原 ； HCV 抗原 ； 流感病毒核衣壳蛋白 ； 副流感病 毒核衣壳蛋白 ； 人乳头瘤 16 型的 E6 和 E7 蛋白 ； EB 病毒 LMP-1， LMP-2 和 EBNA-2 ； 疱疹 LAA 和糖蛋白 D ； 以及来自其它病毒的类似蛋白。特别优选用于本发明的抗原包括， 但不限于， HIV-1gag， HIV-1env， HIV-1poi， HIV-1tat， HIV-1nef， HbsAG， HbcAg， 丙型肝炎核心抗原， HPV E6 和 E7， HSV 糖蛋白 D， 和炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis) 保护性抗原。
     包括在本发明组合物 ( 疫苗 ) 中的其它优选抗原包括能抑制不需要的， 或有害的 免疫反应， 如由例如变应原， 自身免疫抗原， 炎性物质引起的免疫反应的抗原 ； GVHD， 某些癌 症中涉及的抗原， 感染性休克抗原， 和移植排斥涉及的抗原。这种化合物包括， 但不限于， 抗组胺剂， 环孢菌素， 皮质激素， FK506， 与产生有害免疫反应所涉及的 T 细胞受体对应的蛋 白， Fas 配体 ( 即， 与细胞 Fas 受体的胞外区或胞质区结合， 从而诱导细胞凋亡的化合物 )， 以影响耐受或无反应性的方式递呈的适合的 MHC 复合物， T 细胞受体， 和自身免疫抗原， 优 选与能增强或抑制细胞和 / 或体液免疫的生物学反应调节剂联合。
     用于本发明的其它抗原和抗原组合对本领域技术人员是显而易见的。 本发明并不 局限于使用如上描述的抗原。
     根据本发明， 术语 “酵母载体 - 抗原复合物” 或 “酵母 - 抗原复合物” 通常用来描 述酵母载体和抗原的任意联系。这种联系包括酵母 ( 重组酵母 ) 表达抗原， 将抗原引入酵 母， 抗原与酵母的物理结合， 和将酵母和抗原一起混合在如缓冲液或其它溶液或配制剂中。 下文中详细描述了这些类型的复合物。
     一个实施例中， 用编码抗原的异源核酸分子转化用来制备酵母载体的酵母细胞， 使酵母细胞表达所述抗原。这种酵母在本文中也称作重组酵母或重组酵母载体。酵母细胞 随后作为完整细胞被装入树突细胞， 或酵母细胞被杀死， 或可衍生如形成酵母原生质球， 胞 质体， 空胞， 或亚细胞颗粒， 上述任一随后都被装入树突细胞。也可用重组核酸分子直接转 染酵母原生质球 ( 例如， 从完整的酵母制备原生质球， 然后转染 )， 以制备表达抗原的重组 原生质球。
     根据本发明， 分离的核酸分子或核酸序列是与其天然环境分离的核酸分子或核酸 序列。因此， “分离的” 不能必然地反映核酸分子的纯化程度。用于转染酵母载体的分离的 核酸分子包括 DNA， RNA， 或 DNA 或 RNA 的衍生物。分离的核酸分子可以是双链或单链。用 于本发明的分离的核酸分子包括编码蛋白或其片段的核酸分子， 只要所述片段包含至少一 个用于本发明组合物的抗原表位。转化到本发明酵母载体中的核酸分子包含编码一个或多个蛋白或其部分的核酸 序列。这种核酸分子可包括部分或全部编码区， 调节区， 或其组合。酵母菌株的一个优点是 携带许多核酸分子的能力以及能够产生许多异源蛋白。优选本发明酵母载体所产生的抗 原的数量是酵母载体所能适当产生的抗原的任意数量， 通常从至少一个到至少约 5 个或更 多， 优选从约 2 个至约 5 个化合物。
     酵母载体中的核酸分子编码的肽或蛋白可以是全长蛋白， 或是功能等价蛋白， 其 中氨基酸被删除 ( 例如截短的蛋白 )， 插入， 倒置， 取代和 / 或衍生 ( 例如乙酰化， 糖基化， 磷 酸化， 被磷脂酰甘油肌醇 (GPI) 锚定蛋白束缚 )， 使经修饰的蛋白与天然蛋白的生物学功能 基本相似 ( 或如果需要， 与天然蛋白比较， 修饰蛋白具有增强的或被抑制的功能 )。可用现 有技术中已知的技术进行修饰， 所述技术包括， 但不限于， 直接修饰蛋白或用， 例如标准或 重组 DNA 技术影响随机突变或定向诱变来修饰编码蛋白的核酸序列。用测量蛋白生物活性 的试验筛选功能等价蛋白。
     用本领域技术人员已知的技术实现本发明酵母载体中抗原的表达。简单来说， 将 编码至少一个所需抗原的核酸分子， 以核酸分子与转录控制序列可操作连接的方式插入表 达载体， 以便当转化到宿主酵母细胞时， 能够影响核酸分子的组成型表达或可调型表达。 编 码一个或多个抗原的核酸分子可以是与一个或多个转录控制序列可操作连接的一个或多 个表达载体。
     本发明的重组分子中， 核酸分子与表达载体可操作连接， 所述表达载体包含调节 序列， 如转录控制序列， 翻译控制序列， 复制起始点， 和与酵母细胞相容并控制核酸分子表 达的其它调节序列。特别是， 本发明的重组分子包括与一个或多个转录控制序列可操作连 接的核酸分子。术语 “可操作连接” 指将核酸分子与转录控制序列连接， 使得当转染 ( 即， 转化， 转导或转染 ) 到宿主细胞时， 该分子能够被表达。
     控制所产生的蛋白的量的转录控制序列包括控制转录起始， 延伸和终止的序列。 特别重要的转录控制序列是控制转录起始的序列， 如启动子和上游激活序列。任何适合 的酵母启动子都可用于本发明， 并且多种这种启动子是本领域技术人员已知的。用于在 酿酒酵母中表达的优选启动子包括， 但不限于， 编码下述酵母蛋白的基因的启动子 ： 醇脱 氢酶 I(ADH1) 或 II(ADH2)， CUP1， 磷酸甘油酸酯激酶 (PGK)， 磷酸丙糖异构酶 (TPI)， 甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH ； 也叫做 TDH3， 指磷酸丙糖脱氢酶 )， 半乳糖激酶 (GAL1)， 半乳 糖 -1- 磷酸尿苷酰转移酶 (GAL7)， UDP- 半乳糖差向异构酶 (GAL10)， 细胞色素 c 1(CYC1)， Sec7 蛋白 (SEC7)， 和酸性磷酸酶 (PHO5)， 更优选如 ADH2/GAPDH 和 CYC 1/GAL 10 的杂合 启动子， 甚至更优选当细胞中葡萄糖浓度较低 ( 如， 约 0.1％至 0.2％ ) 时被诱导的 ADH2/ GAPDH 启动子。同样， 很多上游激活序列 (UASs)， 也称作增强子， 也是已知的， 用于在酿酒酵 母中表达的优选的上游激活序列包括， 但不限于， 编码下述蛋白的基因的 UASs ： PCK1， TPI， TDH3， CYC1， ADH1， ADH2， SUC2， GAL1， GAL7 和 GAL10， 以及由 GAL4 基因产物激活的其它 UASs， 特别优选 ADH2UAS。因为 ADH2UAS 被 ADR1 基因产物激活， 当异源基因与 ADH2UAS 可操作连 接时， 优选过表达 ADR1 基因。用于在酿酒酵母中表达的优选的转录终止序列包括 α- 因 子， GAPDH 和 CYC1 基因的终止序列。在甲基营养酵母中表达基因的优选的转录控制序列包 括编码醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录控制区。
     核酸分子对本发明酵母细胞的转染可通过将核酸分子引入细胞的任意方法来实现， 所述方法包括， 但不限于， 扩散， 主动转运， 超声波浴， 电穿孔， 显微注射， 脂质转染， 吸 附， 和原生质体融合。用本领域技术人员已知的方法可以将转染的核酸分子整合到酵母染 色体中或保留在染色体外的载体上。本文详细描述了带有这种核酸分子的酵母载体的例 子。如上所述， 酵母胞质体， 酵母空胞， 和亚细胞性酵母膜提取物或其级分也可如下所述重 组制备 ： 用所需的核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球， 在其中产生抗原， 然后 用本领域技术人员已知的技术进一步处理微生物或原生质球， 以制备含有所需抗原的胞质 体， 空胞或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     制备重组酵母载体和酵母载体表达抗原的有效条件包括能培养酵母菌株的有效 培养基。通常有效培养基是含有可同化的碳水化合物源， 氮源和磷酸盐， 以及适宜的盐， 矿 物质， 金属和其它营养素， 如维生素和生长因子的含水的培养基。 培养基可包含复合营养素 或是确定的极限培养基。 本发明的酵母菌株可以培养在各种容器中， 包括但不限于， 生物反 应器， 锥形烧瓶， 试管， 微量滴定皿和培养皿 (Petri dish)。在适合酵母菌株的温度， pH 和 氧浓度条件下进行培养。 这种培养条件是本领域技术人员的专业知识 ( 参见， 例如 Guthrie 等 (eds.)， 1991， Methods in Enzymology， vol.194， Academic Press， San Diego)。
     本发明一个实施例中， 作为酵母载体重组表达抗原的另一种情况， 用酵母载体在 细胞内装载蛋白抗原或肽抗原， 或用碳水化合物或其它作为抗原的分子。 随后， 将现在细胞 内含有抗原的酵母载体给予病人或装入如树突细胞的载体 ( 下文描述 )。如本文所用， 肽 含有少于或等于约 30-50 个氨基酸的氨基酸序列， 蛋白含有超过约 30-50 个氨基酸的氨基 酸序列 ； 蛋白可以是多嵌合的。用作抗原的蛋白或肽可以如 T 细胞表位一样小 ( 即长度超 过 5 个氨基酸 )， 也可是超过包含多表位的蛋白， 蛋白片段， 全长蛋白， 嵌合蛋白或融合蛋白 长度的任意合适大小。可以天然地或合成地衍生蛋白和肽 ； 这种修饰包括， 但不限于， 糖基 化， 磷酸化， 乙酰化， 十四烷基化， 异戊二烯化， 棕榈酰化， 酰胺化和 / 或附加磷脂酰甘油肌 醇。通过本领域技术人员已知的技术可以将肽和蛋白直接插入本发明的酵母载体， 例如通 过扩散， 主动转运， 脂质融合， 电穿孔， 吞噬作用， 冻融循环和超声波浴。可直接装载肽， 蛋 白， 碳水化合物， 或其它分子的酵母载体包括在制备之后， 但在装入树突细胞之前装载了抗 原的完整酵母， 以及原生质球， 空胞或胞质体。 或者， 用装载了抗原的完整酵母， 然后由此制 备原生质球， 空胞， 胞质体或亚细胞颗粒。这个实施例中， 酵母载体中可装入任意数量的抗 原， 从至少 1， 2， 3， 4 或直至总数为数百或数千的抗原， 正如通过装载微生物， 装载哺乳动物 肿瘤细胞， 或其部分所提供。
     本发明另一个实施例中， 抗原与酵母载体物理结合。抗原与酵母载体的物理结合 可通过现有技术中任何适合的方法， 包括共价和非共价结合方法来实现， 所述共价和非共 价连接方法包括， 但不限于， 将抗原化学交联到酵母载体的外表面或通过， 例如使用抗体或 其它结合伙伴将抗原与酵母载体的外表面生物连接。化学交联可通过例如下述方法完成 ： 包括戊二醛连接， 光亲和性标记， 碳化二亚胺处理， 用能连接二硫键的化学制剂处理， 用现 有技术中其它标准交联化学制剂处理。或者， 化学制剂与酵母载体接触， 改变酵母膜脂质 双层的电荷或细胞壁的组成， 使酵母的外表面更容易与具有特定电荷特征的抗原融合或结 合。 寻靶物质， 如抗体， 结合肽， 可溶性受体， 和其它配体也可掺入抗原作为融合蛋白或者与 抗原结合来使抗原与酵母载体结合。
     另一实施例中， 通过一种较被动的， 非特异性或非共价结合机制， 如通过将酵母载体和抗原一起轻柔地混合在缓冲液或其它适合的配制剂中， 使酵母载体和抗原彼此结合。
     本发明一个实施例中， 酵母载体和抗原都在细胞内被装入， 如树突细胞和巨噬细 胞的载体， 形成本发明的治疗性组合物或疫苗。下文详细讨论了在其中进行装载两种成分 的各种形式。本文所用的术语 “装载” 及其派生词指将成分 ( 例如， 酵母载体和 / 或抗原 ) 插入， 引入或进入细胞 ( 例如， 树突细胞 )。在细胞内装载成分指将成分插入或引入细胞的 细胞内区室 ( 例如， 通过质膜并至少进入细胞浆， 吞噬体， 溶酶体， 或细胞的一些细胞内空 间 )。将成分装入细胞可参考任意技术， 通过所述技术， 成分被强制进入细胞 ( 例如通过电 穿孔 ) 或被放置在环境中 ( 例如， 与细胞接触或临近细胞 )， 在此处经过一些过程 ( 例如吞 噬作用 ) 成分将基本进入细胞。装载技术包括， 但不限于， 扩散， 主动转运， 脂质体融合， 电 穿孔， 吞噬作用， 和超声波浴。一个优选实施例中， 采用被动机制用装载了酵母载体和 / 或 抗原的树突细胞， 这种被动机制包括树突细胞对酵母载体和 / 或抗原的吞噬作用。
     本发明一个实施例中， 疫苗组合物还可包括生物反应修饰化合物， 或产生这种修 饰物的能力 ( 即， 通过用编码这种修饰物的核酸分子转染 )， 虽然这种修饰物对获得本发明 的强免疫反应不是必需的。例如， 可用至少一种抗原和至少一个生物反应修饰物转染或装 载入酵母载体。生物反应修饰物是能调节免疫反应的化合物。一些生物反应修饰物能刺激 保护性免疫反应， 而另一些能抑制有害免疫反应。一些生物反应修饰物优先增强细胞介导 的免疫反应， 而另一些优先增强体液免疫反应 ( 即能刺激免疫反应， 其中与体液免疫反应 比较， 细胞免疫水平提高， 或反之亦然 )。本领域技术人员已知许多技术来测量免疫反应的 刺激或抑制， 以及从体液免疫反应中区分细胞免疫反应。 适合的生物反应修饰物包括细胞因子， 激素， 脂质衍生物， 小分子药物和其它生 长调节剂， 例如但不限于， 白介素 2(IL-2)， 白介素 4(IL-4)， 白介素 10(IL-10)， 白介素 12(IL-12)， γ 干扰素 (IFN-γ)， 胰岛素样生长因子 I(IGF-1)， 转化生长因子 β(TGF-β)， 类固醇， 前列腺素和白三烯。酵母载体表达 ( 即产生 )， 并可能是分泌 IL-2， IL-12 和 / 或 IFN-γ 的能力优先增强细胞介导的免疫， 而酵母载体表达， 并可能是分泌 IL-4， IL-5 和 / 或 IL-10 的能力优先增强体液免疫。
     本发明的酵母载体可与广泛多种的能保护动物对抗疾病的抗原结合， 并且将酵母 载体和抗原装入树突细胞或巨噬细胞以形成本发明的疫苗能进一步增强这种能力。相应 的， 使用本发明的治疗性组合物或疫苗的方法优先诱发动物的免疫反应， 因此保护动物对 抗适用于诱发免疫反应的疾病， 包括癌症或传染性疾病。本文所用的术语 “保护对抗疾病” 本 指减轻疾病症状 ； 减少疾病发生， 和 / 或降低疾病严重性。保护动物可指当给予动物时， 发明治疗性组合物预防疾病从发生到和 / 或治愈或缓解疾病症状， 体征或起因的能力。因 此， 保护动物对抗疾病包括预防疾病发生 ( 预防性治疗或预防性疫苗 ) 和治疗患病的或正 经历疾病初期症状的动物 ( 治疗性治疗或治疗性疫苗 )。 具体的， 通过诱导有益的或保护性 免疫反应， 在某种情况中， 可能需要另外抑制 ( 例如， 减少， 抑制或阻断 ) 过度活跃的或有害 的免疫反应， 从而诱发动物的免疫反应来实现保护动物对抗疾病。术语 “疾病” 指任何偏离 动物正常健康状况的情况， 包括出现了疾病症状的状态， 以及已发生了偏离 ( 例如， 感染， 基因突变， 遗传缺陷等 ) 但症状尚未显现的情况。
     更具体的， 当通过本发明的方法给予动物时， 本文所述的疫苗优选产生以下结果， 包括缓解疾病 ( 例如， 减少至少一种疾病症状或临床表现 )， 消除疾病， 减少伴随疾病的肿
     瘤或损害， 消除伴随疾病的肿瘤或损害， 预防或缓解由原发性疾病出现导致的继发性疾病 ( 例如， 原发癌导致的转移癌 )， 预防疾病， 和刺激对抗疾病的效应细胞免疫。
     可用本发明的方法和组合物治疗或预防的癌症包括， 但不限于， 黑色素瘤， 鳞状细 胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢癌， 膀胱癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤， 血管肉瘤， 肥大细胞癌， 原发性肝癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠癌， 肾细胞 癌， 造血细胞瘤形成和转移癌。用本发明的治疗性组合物治疗的癌症特别优选包括原发性 肺癌， 肺转移癌， 原发性脑癌和转移性脑癌。 治疗的脑癌优选包括， 但不限于， 多形性成胶质 细胞瘤。治疗的肺癌优选包括， 但不限于， 非小细胞癌， 小细胞癌和腺癌。本发明的治疗性 组合物对于诱发动物的免疫反应以治疗下述癌症中形成的肿瘤， 包括恶性的和良性的肿瘤 是有用的。优选， 肿瘤抗原在患癌症的动物的组织中的表达产生下述结果 ： 缓解癌症， 减少 伴随癌症的肿瘤， 消除伴随癌症的肿瘤， 预防转移癌， 预防癌症， 和刺激对抗癌症的效应细 胞免疫。
     本发明的一个特别优点是无需将治疗性组合物与免疫促进剂， 如佐剂或载体一起 给予， 因为酵母疫苗和抗原的组合在缺少附加的佐剂时也能诱发有效的免疫反应， 将这些 成分装入树突细胞能再次增强免疫反应， 正如系列申请 US 09/991,363( 出处同上 ) 所描述 的。然而这个特点并不排除在本发明组合物中使用免疫促进剂。因此， 一个实施例中， 本发 明的组合物可包括一种或多种佐剂和 / 或载体。
     通常， 佐剂是通常增强动物对特定抗原的免疫反应的物质。 适合的佐剂包括， 但不 限于， 弗氏佐剂 ； 其它细菌细胞壁成分 ； 铝基盐 ； 钙基盐 ； 硅石 ； 多核苷酸 ； 类毒素 ； 血清蛋 白； 病毒外壳蛋白 (coat protein) ； 其它细菌衍生的制品 ； γ 干扰素 ； 嵌段共聚物佐剂， 如 TM Hunter′ s Titermax 佐剂 (CytRx ， Inc.Norcross， GA) ； Ribi 佐剂 ( 从 Ribi ImmunoChem Research， Inc.， Hamilton， MT 获 得 ) ； 和 皂 苷 及 其 衍 生 物， 如 Quil A( 从 Superfos Biosector A/S， Denmark 获得 )。
     通常， 载体是增加治疗性组合物在接受治疗动物中的半衰期的化合物。适合的载 体包括， 但不限于多聚体可控释放配制剂， 生物可降解埋植剂， 脂质体， 油， 酯和乙二醇。
     本发明的治疗性组合物还可包含一种或多种药物可接受赋形剂。本文中， 药物可 接受赋形剂指任何适于将用于本发明方法的治疗性组合物传递到体内或活体外 (ex vivo) 的适宜位置的物质。优选药物可接受赋形剂能使酵母载体 ( 或含有酵母载体的树突细胞 ) 保持一种形式， 使得直到酵母载体或细胞到达靶细胞， 组织， 或体内位置， 酵母载体 ( 与抗 原结合 ) 或树突细胞 ( 装载了酵母载体和抗原 ) 能在靶位置诱发免疫反应 ( 注意靶位置可 以是全身性的 )。 本发明适合的赋形剂包括能转运， 但不能特异性地将疫苗定向到位置 ( 本 文中也称作非寻靶载体 ) 的赋形剂或配方。药物可接受赋形剂的例子包括， 但不限于水， 生 理盐水， 磷酸盐缓冲生理盐水， 林格溶液， 葡萄糖溶液， 含血清溶液， Hank′ s 液， 其它含水 的生理平衡溶液， 油， 酯， 和乙二醇。 含水载体可包含通过， 例如提高化学稳定性和等渗性从 而接近受者生理条件所需的适宜的辅助物质。
     适合的辅助物质包括， 例如， 乙酸钠， 氯化钠， 乳酸钠， 氯化钾， 氯化钙和用于制备 磷酸盐缓冲液， Tris 缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的其它物质。辅助物质还可包括防腐剂， 如 硫柳汞， 间甲苯酚或邻甲苯酚， 福尔马林和苯甲醇。
     本发明包括将本发明组合物或疫苗传递给动物。给予过程可在活体外或体内进行。活体外给予指在患者体外进行部分调节步骤， 如将本发明组合物给予一群在将酵母载 体和抗原装入细胞的条件下， 从患者收集的细胞 ( 树突细胞 )， 并将该细胞回输给病人。可 用任意合适的给予方式将本发明治疗性组合物回输给病人， 或给予病人。
     给予包括装载了酵母载体和抗原的树突细胞的疫苗或组合物可以是全身的， 粘膜 的和 / 或临近靶位置的 ( 例如， 临近肿瘤 )。优选的给予途径对本领域技术人员是显而易 见的， 依赖于所预防的或治疗的情况类型， 所使用的抗原， 和 / 或靶细胞群或组织。优选的 给予方法包括， 但不限于， 静脉内给予， 腹膜内给予， 肌内给予， 结节内 (intranodal) 给予， 冠状动脉内给予， 动脉内给予 ( 例如， 颈动脉内 )， 皮下给予， 经皮传递， 气管内给予， 皮下给 予， 关节内给予， 心室内给予， 吸入 ( 例如气溶胶 )， 颅内， 脊柱内， 眼内， 耳内， 鼻内， 口腔， 肺 部给予， 导管注入， 和直接注射入组织。 特别优选的给予途径包括 ： 静脉内， 腹膜内， 皮下， 皮 内 (intradermal)， 结节内， 肌内， 经皮， 吸入， 鼻内， 口腔， 眼内， 关节内， 颅内和脊柱内。非 胃肠道传递可包括皮内， 肌内， 腹膜内， 胸膜内， 肺内， 静脉内， 皮下， 心房导管和静脉导管途 径。耳部传递可包括滴耳剂， 鼻内传递可包括滴鼻剂或鼻内注射， 眼内传递可包括滴眼液。 气溶胶 ( 吸入 ) 传递也可用现有技术中的标准方法进行 ( 参见， 例如 Sibling 等， ， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 189 ： 11277-11281， 1992， 全部引入本文作为参考 )。例如， 一个实施 例中， 本发明的组合物或疫苗可被配制成适于用适合的吸入装置或喷雾器喷雾传递的组合 物。 口腔传递可包括通过口腔摄取的固体和液体， 对发展粘膜免疫是有益的， 并且包含酵母 载体的组合物可以很容易地制备成口服的， 例如片剂或胶囊， 以及配制到食品和饮料产品 中。 调节粘膜免疫的其它给予途径对治疗病毒感染， 上皮癌， 免疫抑制疾病和其它影响上皮 区域的疾病是有益的。 这种途径包括支气管， 皮内， 肌内， 鼻内， 其它吸入， 直肠， 皮下， 局部， 经皮， 阴道和尿道途径。
     更优选的传递途径是将组合物或疫苗传递到呼吸系统的任意途径， 包括但不限 于， 吸入， 鼻内， 气管内， 和类似途径。如上文所讨论的和实施例中所显示的， 本发明人已证 明， 至少与皮下传递相比， 通过这种给予途径给予本发明疫苗能产生增强的结果， 并对治疗 脑癌和肺癌特别有效。
     根据本发明， 有效的给予方法 ( 即， 以有效的方式给予疫苗或治疗性组合物 ) 包括 在患有疾病或状态或可能感染疾病或状态的动物中诱发免疫反应， 优选保护动物对抗疾病 的适合的剂量参数和给予方式。 可用现有技术中的标准方法测定对特定疾病的有效剂量参 数。这种方法包括， 例如， 测定存活率， 副反应 ( 即毒性 ) 和疾病的进展或退化。具体的， 当 治疗癌症时， 本发明治疗性组合物剂量参数的有效性可通过评估应答率来测定。这种应答 率指在一群病人中接受治疗的病人有反应呈部分或完全缓解的百分数。可通过， 例如测量 肿瘤大小或显微镜检查组织样品中癌细胞的存在， 测定所述缓解。
     根据本发明， 适合的单剂量是在一段适合的时间段内给予一次或多次时， 能诱发 动物的抗原特异性免疫反应的剂量。剂量可根据所治疗的疾病或状态而变化。例如治疗癌 症时， 适合的单剂量可根据所治疗的癌症是原发性肿瘤还是转移性癌症而变化。本领域技 术人员根据动物的大小和给予途径可以轻易地确定合适的给予单剂量。
     本发明治疗性组合物或疫苗的适合的单剂量是在一段适合的时间段内给予一次 或多次时， 以足以诱发抗原特异性免疫反应的量， 将酵母载体和抗原有效的提供到指定的 细胞类型， 组织或病人体内的剂量。例如， 一个实施例中， 本发明酵母载体的单剂量是从约 1×105 至约 5×107 酵母细胞等价物 / 给予组合物的生物体的公斤体重。更优选， 本发 6 9 明酵母载体的单剂量是从约 0.1Y.U.(1×10 细胞 ) 至约 100Y.U.(1×10 细胞 )/ 剂 ( 即 每 个 生 物 体 )， 包 括 以 0.1×106 细 胞 为 增 量 的 任 意 中 间 剂 量 ( 即， 1.1×106， 1.2×106， 1.3×106......)。这种剂量范围可有效的用于任意大小的任意生物体， 包括小鼠， 猴， 人 等。当通过将酵母载体和抗原装入树突细胞来给予疫苗时， 优选本发明疫苗的单剂量是从 6 6 约 0.5×10 至约 40×10 树突细胞 / 人 / 次。优选， 单剂量从约 1×106 至约 20×106 树突 细胞 / 人， 更优选从约 1×106 至约 10×106 树突细胞 / 人。当针对抗原的免疫反应已经减 弱或需要提供针对特定抗原或抗原群的免疫反应或需要诱导针对特定抗原或抗原群的记 忆应答时， 优选给予 “加强剂量” 的治疗性组合物。可从初次给予之后的约 2 周至几年给予 加强剂量。一个实施例中， 给予时间表是在约 1 至约 6 个月内， 约 1 至约 4 次给予约 1×105 至约 5×107 酵母细胞等价物的组合物 / 生物体每公斤体重。
     本领域技术人员知道给予动物的剂量数量依赖于疾病的程度和个体病人对治疗 的反应。例如， 大肿瘤比小肿瘤需要更多剂量， 慢性疾病比急性疾病需要更多剂量。然而一 些情况中， 如果长了大肿瘤的病人比长了小肿瘤的病人对治疗性组合物的反应更好， 那么 长了大肿瘤的病人比长了小肿瘤的病人需要较少的剂量。 因此， 在本发明范围内， 适合的剂 量数量包括治疗指定疾病所需的任意数量。 本发明的另一方面， 治疗疾病或情况， 如癌症的 方法可与其它治疗方法联合以增强治疗效果。 例如， 治疗癌症时， 通过外科手术切除动物的 肿瘤之后， 再给予本发明的疫苗。另一方面， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 并且进行不 引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植之后， 再给予疫苗 ( 下文讨论 )。另一方面， 在通 过外科手术切除动物的肿瘤， 进行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植， 以及输注 同种异体的供体淋巴细胞之后， 再给予疫苗。
     本发明另一个实施例涉及一种治疗癌症病人的方法， 包括 ： (a) 用能有效建立 稳定混合的骨髓嵌合状态的不引起骨髓重度抑制的干细胞转移来治疗癌症病人， 其中干 细胞由同种异体的供体提供 ； (b) 将从同种异体的供体处获得的淋巴细胞给予病人 ； 和 (c) 在步骤 (b) 之后， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予病人。Luznik 等， (Blood101(4) ： 1645-1652， 2003) 和其它现有技术 ( 例如 Appelbaum 等， 2001， Hematology pp.62-86) 已经详细描述了通过不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植建立稳定的混 合骨髓嵌合状态的过程。 简单的说， 用非致病的， 不引起骨髓重度抑制的的全身辐射和免疫 抑制治疗病人 ( 例如， 结合辐射和化疗 )， 并给予来自同种异体供体的含有干细胞 ( 例如骨 髓 ) 的一群细胞。这种治疗将在受者病人中建立稳定的混合骨髓嵌合状态 ( 即同时存在供 体和宿主免疫细胞 )。 在 Luznik 等的方法中， 随后给受者输注供体的淋巴细胞， 然后是自体 肿瘤细胞疫苗， GM-CSF 来源和组织相容性抗原来源。这种治疗导致有显著数量的试验动物 以无肿瘤状态长时间存活。
     本发明通过结合不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植和本发明基于酵母 的疫苗的策略， 改进了不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植和肿瘤细胞免疫方法。 如实施例 5 所示， 本发明的方法在治疗肿瘤方面与 Luznik 等的方法一样有效， 但不需要使 用来自受者的自体肿瘤抗原， 也不需要使用以前方法中所提供的生物反应修饰物或其它佐 剂 ( 例如， GM-CSF 和组织相容性抗原来源 )。本发明的改良方法提供了另外的优点， 可在疫 苗中使用广泛多种的非常特异性抗原选择和组合， 能提供针对广泛范围癌症患者的疫苗，而以前使用来自受者的自体肿瘤细胞的方法， 对病人的效果有限。本发明还提供了用本发 明基于酵母的疫苗免疫接种干细胞和淋巴细胞供体， 所述疫苗与给予受者的疫苗一样， 表 达相同的或稍微不同的抗原， 并期望它能进一步增强疫苗的效力。
     本发明这个实施例中， 由同种异体的供体提供干细胞， 通过不引起骨髓重度抑制 的干细胞转移有效建立稳定混合的骨髓嵌合状态以治疗癌症病人的步骤， 如现有技术中 ( 例如 Luznik 等， 出处同上 ； Appelbaum 等， 2001， Hematology pp.62-86) 所详细描述的那样 进行。步骤 (b) 的同种异体淋巴细胞输注可用任意合适的方法， 包括通过， 如现有技术中已 知的 Ultrapheresis 技术， 从供体的外周血收集同种异体淋巴细胞并输注给受者病人。最 后， 如前文所述， 将本发明基于酵母的疫苗给予病人。这个实施例一方面， 所述方法进一步 包括在步骤 (a) 之前， 给予供体含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗。另一方面， 所述方 法包括在进行步骤 (a) 之前， 切除病人的肿瘤。
     本发明的方法中， 可将疫苗和治疗性组合物给予脊椎动物纲的任何成员， 哺乳动 物， 包括但不限于， 灵长类， 啮齿类， 家畜和家养宠物。 家畜包括用来消费的或生产有用产品 ( 例如， 生产羊毛的绵羊 ) 的哺乳动物。优选要保护的哺乳动物包括人， 狗， 猫， 小鼠， 大鼠， 山羊， 绵羊， 牛， 马， 和猪， 特别优选人。根据本发明， 术语 “病人” 可用来描述是接受本文所 述的诊断， 预防或治疗处理的任意动物。
     提供下述试验结果用来说明而不是意图限制本发明的范围。 实施例 实施例 1
     下述实施例证明了给予含有癌抗原的基于酵母的疫苗来体内治疗非小细胞肺癌 (NSCLC)。
     Ras 突变在人， 小鼠， 大鼠和仓鼠的肺部腺癌中是常见的。事实上， ras 原癌基因家 族的突变是人类癌症和试验动物肿瘤中最常见的癌基因相关突变。 本发明人检验了现在被 设计成直接针对突变蛋白特异性 ras 突变的基于酵母的疫苗， 能否诱导导致小鼠肺部腺癌 模型的肿瘤破坏的有效 (productive) 免疫反应。试验的总体目标是构建能用于对抗人类 肺癌的疫苗。
     本文所述的用于试验的模型是小鼠模型， 其中用乌拉坦 ( 氨基甲酸乙酯， 它代谢 成公知致癌代谢产物——氨基甲酸乙酯 (vinyl carbamate)) 注射 A/J 小鼠。 在约 6 周内可 看到超常增生， 8-10 周时出现良性肿瘤， 8 个月后出现恶性肿瘤的首个信号。10 个月时， 肿 瘤占据整个肺叶， 12 个月时小鼠因呼吸性窘迫而死亡。这个试验中， 肿瘤细胞中表达 K-ras 单突变， 该突变位于编码第 61 位氨基酸残基的密码子中 ( 也称作密码子 61)。
     本发明人制备了 Ras61-VAX(GlobeImmune)， 它是经改造表达具有密码子 61( 对应 于 SEQ ID NO ： 5 的 K-ras 序列 ) 突变的小鼠 K-ras 蛋白的酵母菌株， 所述蛋白是在自发诱 导的小鼠肺部肿瘤和小鼠肺部肿瘤细胞系表达的突变 K-ras 蛋白。 对用直接针对密码子 61 突变的 Ras61-VAX 免疫的动物， 检测它们在用乌拉坦诱导模式诱导后， 防止肿瘤发展或减 小肿瘤大小的能力。
     结果证明用 Ras61-VAX 免疫的动物显示出明显的对抗通过将小鼠暴露于乌拉坦 而自发诱导的原始 (pre-existing) 肺肿瘤的保护作用。与对照动物比较， 免疫动物的肿瘤
     数量和肿瘤大小都显著减小 ( 图 1)。 这些结果证明了用本发明人的表达突变 K-ras 蛋白的 基于酵母的疫苗治疗和 / 或预防癌症引起的疾病来进行治疗性介入的可行性和实用性。
     另 外， 图 2 显 示 了 一 个 试 验 结 果， 其 中 在 1， 8， 22 和 36 天， 通过皮下给予 Ras61-VAX( 只 有 Q61R) 或 通 过 鼻 内 比 较 皮 下 给 予 表 达 具 有 两 个 突 变 (RasV-VAX ； G12V+Q61R) 的突变 Ras 的酵母疫苗来免疫 C57BL/6 小鼠。 在第 29 天， 皮下给予 10,000CMT64 细胞攻击小鼠， 其中 CMT64 细胞内源性表达 12 位氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸 (G12V) 的突 变 K-ras 蛋白。图 2 显示了第 59 天时 ( 攻击 30 天后 ) 肿瘤的大小和带有肿瘤的动物数 / 动物总数的比值 ( 柱形上面 )。如图 2 所示， 给予 Ras61-VAX 再次提供了对肺肿瘤生长的最 低保护 (7 只动物中有 2 只是无肿瘤的 )， 给予 RasV-Vax 通过显著减小肿瘤体积和数量 ( 皮 下接种的 8 只动物中有 4 只是无肿瘤的， 鼻内接种的 8 只动物中有 7 只是无肿瘤的 ) 从而 提供了特异性免疫治疗性保护作用。 令人吃惊的是， 与皮下给予相同疫苗比较， 鼻内给予疫 苗的效果更好。这些结果强调了用基于酵母的疫苗产品进行分子免疫治疗的特异性。这些 研究揭示了如下需求 ： 对肿瘤生长的免疫介导抵制作用依赖于给予含有带有相应突变氨基 酸的肿瘤抗原的基于酵母的疫苗。
     实施例 2 下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗脑瘤的用途。
     在下述试验中， 用 Gag 蛋白表达疫苗 (GI-VAX) 或 PBS( 模拟注射 ) 通过皮下注射 或鼻内给予， 免疫每组的 5 只小鼠两次 ( 第 0 天和第 7 天 )， 随后在第 14 天用表达 Gag 蛋 白的肿瘤攻击。两次独立研究的结果显示， 与模拟注射小鼠比较， 并且惊人的是， 与通过皮 下途径接受疫苗的动物比较， 通过鼻内给予接受疫苗的小鼠对抗颅内肿瘤攻击的存活延长 ( 图 3)。皮下免疫确实能保护动物对抗皮下肿瘤攻击 ( 数据未显示 )。这些结果显示当鼻 内给予时， 本发明的方法可有效使用， 并且给予到呼吸道对颅内肿瘤有效， 而其它给予途径 无效。
     实施例 3
     下述实施例证明含有人类癌抗原 ( 表皮生长因子受体 ； EGFR) 的基于酵母的疫苗 在体内治疗黑色素瘤和脑瘤的用途。
     免疫治疗策略诱发保护性免疫反应的能力依赖于多种重要变量。首先， 疫苗必须 能够激活免疫系统识别靶抗原， 即提供 “佐剂” 活性。对于基于酵母的疫苗的情况， 发明人 先前已证明树突细胞对酵母的吸收上调了 MHC I 类和 II 类蛋白的表达， 并引发细胞因子 产生， 这是佐剂活性的标志 (Stubbs 等 Nature Med(2001)7， 625-629)。酵母激活 “先天的” 免疫系统的程度与使用来自细菌细胞壁的脂多糖 (LPS) 所观察到的程度相当。第二， 疫苗 必须促进靶抗原的免疫显性表位到免疫系统的表面递呈。 发明人先前已证明基于酵母的载 体能非常有效的传递抗原表位以刺激免疫系统细胞介导 (CTL) 的反应和体液 ( 抗体 ) 反应 (Stubbs 等， Nature Medicine(2001)7， 625-629)。第三， 也是最重要的， 刺激免疫系统必须 引发在体内需要处的免疫反应。 如下所示， 令人吃惊的是， 疫苗的给予途径能影响对抗在体 内不同位置发展的肿瘤的免疫反应的效力。
     为了检验 EGFR-tm VAX( 表达以 EGFR 作为癌抗原的本发明的酵母疫苗 ) 的免疫原 性， 必需修饰攻击试验所用的神经胶质瘤细胞。转染 B16 小鼠黑色素瘤细胞和 9L 大鼠神经 胶质瘤细胞以表达人 EGFR( 分别是 B16-E 细胞和 9L-E 细胞 )。随后将克隆的 9L-E 细胞系
     分成高水平， 中间水平或低水平表达 hEGFR 的细胞。因此， B16-E 细胞和 9L-E 细胞拥有包 括在酵母疫苗中的抗原 ( 即人 EGFR)， 并提供了一个恶性细胞中 EGFR 表达改变的适宜的人 神经胶质瘤替代模型。 研究目标是要证明， 基于酵母的传递载体引发保护性免疫反应， 对抗 大鼠颅内植入的致死剂量的 9L-E 神经胶质瘤细胞的攻击。
     B16-E 细胞和 9L-E 细胞克隆成同质的， 并且用流式细胞术测量显示表达人 EGFR。 为确保人 EGFR 蛋白的异源表达在不给予疫苗时不会导致肿瘤的免疫排斥， 首先确定转染 的 B16-E 能够在小鼠中形成皮下肿瘤 ( 数据未显示 )。转染的 9L-E 细胞在大鼠皮下和颅内 形成肿瘤 ( 数据未显示 )。现在建立这个状态以检验 EGFR-tm VAX 酵母疫苗保护动物对抗 B16-E 肿瘤 ( 小鼠 ) 及 9L-E 肿瘤 ( 大鼠 ) 攻击的效力。
     初步的疫苗攻击研究是设计用来确定皮下接种 EGFR-tm VAX 对保护动物对抗皮下 植入的致死剂量的 B16-E 黑色素瘤细胞攻击是否有效。这个方法代表了发明人检测有效诱 发肿瘤细胞杀灭的新的靶肿瘤抗原的实用性的标准测量方法之一。 这个研究证明与模拟免 疫动物比较 (1/6 的动物是无肿瘤的 )( 数据未显示 )， 用 EGFR-tm VAX 接种能保护动物对抗 B16-E 肿瘤的攻击 (4/6 的动物是无肿瘤的 )。这些结果证明 EGFR 可作为适合的诱发细胞 介导的免疫反应的抗原， 并且 EGFR-tm 疫苗引发抗肿瘤攻击的保护性免疫反应。因此， 下一 步是检验 EGFR-tm VAX 抗大鼠颅内 9L-E 神经胶质瘤攻击的效力。 发明人在上述试验中还证实， 当鼻内给予 (i.n) 基于酵母的疫苗时， 能提供与皮 下免疫接种抗皮下黑色素瘤攻击的疫苗相等的保护作用 ( 数据未显示 )。 因此， 接下来的试 验检验了， 已证明能诱发抗皮下 B16 黑色素瘤肿瘤攻击的保护性免疫反应的基于酵母的免 疫治疗性 EGFR-VAX 产物， 能否提供抗颅内肿瘤攻击的免疫治疗性保护作用。
     通过大鼠模型中用神经胶质瘤细胞颅内攻击进一步验证了 EGFR-tmVAX 的效力以 及给予途径的影响。在 0， 7， 21 天， 通过鼻内 (i.n.) 或皮下 (s.c) 途径， 用表达 hEGFR 的约 20,000,000 酵母细胞 (EGFR-vax) 或酵母 ( 只有载体 ) 免疫动物 ( 每组 8 只动物 )。通过 颅内给予 1,250 个未转染的大鼠 9L 神经胶质瘤 ( 只有 9L) 或表达 hEGFR 的 9L 来攻击免疫 动物。每天监测大鼠的体重， 体重减轻预示动物即将死亡。
     结果 ( 图 4) 证明， 对于表达肿瘤抗原的大鼠 9L 神经胶质瘤的致死性颅内肿瘤攻 击， 50％用 EGFR-VAX 酵母免疫的动物被完全保护， 但没有动物抵抗缺乏肿瘤抗原的肿瘤生 长 ( 即疫苗诱导了抗原特异性免疫 )。另外， 死于致死性攻击的剩余 EGFR-VAX 免疫动物还 证明， 与对照动物比较， 存活时间延长。
     此外， 与皮下免疫比较， 鼻内免疫动物的存活率的统计学上显著改善是吸引人和 惊人的， 并且再现了上述 ( 见实施例 2) 关于对抗小鼠颅内 ( 黑色素瘤 ) 肿瘤攻击的保护作 用的数据。
     因为认为这个大鼠颅内肿瘤攻击模型能最接近地反映人神经胶质瘤， 这些研究的 积极数据对进入临床试验提供了极好的临床前数据。 另外的研究可包括剂量改变， 时间表， 外科切除研究， 以及用 9L 肿瘤再次攻击 9L-E 存活者以检验免疫系统现在是否 “认知” 9L 神 经胶质瘤中的另外 ( 未知 ) 肿瘤抗原， 以及检验表达 EGFR-vIII 突变蛋白的酵母载体， 并将 建立开始制造临床级别的疫苗产品的基础。
     上述数据指出， 虽然多种免疫途径可能对破坏外周肿瘤是有效的， 本发明基于酵 母的疫苗对启动肺部独有的效应细胞特别有效。 因为基于酵母的疫苗能启动独有的效应细
     胞前体， 所以通过鼻内免疫激活的免疫细胞对穿过血脑屏障影响颅内肿瘤生长进程特别有 效。 因此， 在设计针对脑肿瘤的有效的基于酵母的疫苗时， 免疫途径是一个重要的和先前未 认识到的成分。因为基于酵母的疫苗能非常容易的用于多种免疫途径， 该疫苗必将以迄今 未被认识到的治疗某些癌症的潜力， 唯一地激发高度特异性的免疫反应。
     实施例 4
     下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗肾癌的用途。
     2001 年， 美国将诊断出约 31,800 例肾细胞癌 (RCC) 个体， 11,600 人死亡 ； 代表 了全部癌症的 2-3％， 以及所有死于肿瘤的 2％。虽然病人通常表现出血尿三联症， 腹部痞 气， 疼痛和体重减轻， 但只有较少数目前诊断出的病人具有这些症状， 因为偶然诊断的频率 提高了。很多诊断出患有疾病的病人， 虽然通过外科手术有可能治愈， 但将会复发， 因为细 胞已经到达血管系统。此外， 转移性 RCC 的治疗方法非常有限。激素疗法和化疗方法产生 ＜ 10％的反应率， 并且存活没有显著改变。 然而人们仍长期关注免疫学治疗对疾病的应用。 除了自发性消退这种罕见情况， α 干扰素和白介素 -2 都已显示出 “显著” 活性， 明显的少 数病人对治疗有反应， 一些病人完全缓解。虽然存在少量预期随机试验， 细胞因子工作组 (Cytokine Working Group) 最近的摘要证明， 与门诊病人皮下给予 IL-2/ 干扰素产生的约 50％的反应率相比， 高剂量 IL-2 产生 8％完全反应率和 25％全部反应率。总之， 虽然清楚 的显示出对 RCC 的活性， 迄今所使用的方法缺乏对疾病的特异性和效力。
     超过 60％的 RCCs 带有 VHL 失活突变， VHL 作为 RCC“看门” 基因， 类似于结肠癌中 APC 功能。 VHL 编码的蛋白是 E3 泛肽 - 连接 (SCF) 复合物的基本成分， 叫做 VHL/elonginCB/ Cul-2(VCB)， 靶向特定蛋白以通过 26S 蛋白酶体进行破坏。因为很多 VHL 突变导致错义或 移框蛋白， 所以将产生新的、 被鉴定为肿瘤特异性抗原的抗原表位。 下述试验验证了如下假 设： 引入本发明新的、 基于酵母的疫苗后， RCCs 的突变 VHL 蛋白能定向免疫反应。
     小鼠中没有可比较的突变 VHL 介导的肿瘤。因此， 本发明人使用已知的人 VHL 序 列 (SEQID NO ： 16) 和克隆的小鼠 VHL(SEQ ID NO ： 17) 来制备编码野生型或带有影响 Y98 或 R167( 对应于鼠序列 SEQ ID NO ： 17) 的两个特定突变的鼠 VHL 序列的表达构建体。这 两个位置的突变与人肿瘤中频繁发现的热点相对应。位置 98 的酪氨酸形成针对 VHL 靶， 如 HIP1α 的表面暴露的结合位点， 而位置 167 的精氨酸对稳定 α 螺旋 H1 很重要。这些残基 非常易于溶解并且易于被免疫系统识别。如下述 BLAST 对比所显示的， 人和鼠 VHL 氨基酸 序列在位置 58 至 190， 包括两个热点， 几乎是同一的。
     58 酪氨酸 98 117
     hVHL ： RPRPVLRSVNSREPSQVIFCNRSPRVVLPVWLNFDGEPQPYPTLPPGTGRRIHSYRGHLW
     mVHL ： RPRPVLRSVNSREPSQVIFCNRSPRVVLPLWLNFDGEPQPYPILPPGTGRRIHSYRGHLW
     24 83
     118 精氨酸 167 177
     hVHL ： LFRDAGTHDGLLVNQTELFVPSLNVDGQPIFANITLPVYTLKERCLQVVRSLVKPENYRR
     mVHL ： LFRDAGTHDGLLVNQTELFVPSLNVDGQPIFANITLPVYTLKERCLQVVRSLVKPENYRR
     84 143
     178 211
     hVHL ： LDIVRSLYEDLEDHPNVQKDLERLTQERIAHQRM SEQ ID NO ： 16mVHL ： LDIVRSLYEDLEDYPSVRKDIQRLSQEHLESQHL SEQ ID NO ： 17
     144 177
     因此， 由这些鼠构建体获得的结果可以合理准确地估计在人 RCC 中的效力。 Y98 很 频繁地突变成组氨酸， 而 R167 典型地突变成谷氨酰胺或色氨酸。R167 还受移框突变的影 响； R167 密码子中插入单个 G 残基将产生一个新的移框蛋白 (REPSQA)， 后面是终止密码子 (TGA)。本发明人构建了 Y98 位组氨酸错义突变 (Y98H) 和 R167 位移框突变 (R167fr) 以产 生概括了已知 VHL 突变特征的潜在的免疫原性突变 VHL 蛋白。移框 VHL 蛋白将表达一个更 长的新表位， 并可能因此更具免疫原性。单个错义 Y98H 突变是对这种方法更严格的试验， 因为必需使单个氨基酸改变。用定点突变方法和 PCR 将这些突变引入全长 VHL 序列。简单 的说， 用特异性 PCR 引物引入突变和早熟终止子产生 R133 突变。将这个突变体和野生型 (WT)VHL 克隆到用于在酵母中表达的酵母表达载体 pYEX-BX， 并克隆到用于在黑色素细胞 中转染和表达的哺乳动物表达载体 pUP。 用已证明是成功的 Clontech 的定点诱变方法产生 Y64 点突变。
     插入物克隆到酵母表达载体 YEX-BX 和哺乳动物表达载体 pUP 以便在黑色素瘤细 胞中转染和表达。为达到这个目的， 发明人改造了酵母以表达 VHL 蛋白并验证了各种疫苗 制剂在小鼠中的效力。 pYEX-BX 质粒包含一个在转化酿酒酵母之后， 可控诱导鼠 VHL 蛋白的 铜诱导性启动子。
     带有受组成型 CMV 早期启动子控制的 VHL 基因的表达载体转染到 B16 黑色素瘤细 胞中。细胞系在体外生长并且当注射到小鼠中时长成肿瘤， 这证明了突变 VHL 构建体自身 对所转染的细胞不是免疫原性的或致死性的。首次接种 / 肿瘤攻击试验由下述组成 ： 在0 6 天和第 7 天， 通过皮下注射 20×10 表达 R133 截短突变体 (VHLtrunc) 的酵母来免疫 18 只 6 周龄的 C57B6 小鼠。第 14 天， 通过如下所述的皮下注射来肿瘤攻击小鼠 ： 6 只小鼠接受 4 4 2.5×10 未转化的 B16 ； 6 只小鼠接受 2.5×10 表达 VHLwt 的 B16 ； 6 只小鼠接受 2.5×104 表达 VHLtrunc 的 B16。攻击后 21 天， 评价小鼠肿瘤生长。试验结果在下表 1 中概括。
     表1
     这些结果显示， 虽然 VHLtrunc 疫苗 ( 靶向截断前的 9 个独特的氨基酸 ) 提供对抗 B 16 VHL tMut 肿瘤攻击的保护作用， 但疫苗不能保护小鼠对抗未转染的 B16 或 B16VHLwt 的攻击。 因此， 接种方法诱导强免疫反应， 但这种反应可能仅局限于针对动物已经接种过的 抗原。然而， 因为此截短变体产生不同于野生型 VHL 的长序列， 所以有可能更加微细的突变 ( 即， 只有一个残基 ) 可产生对突变体和野生型的免疫反应。
     第 2 次免疫 / 攻击试验中 ( 表 2)， 用野生型 VHL 疫苗 (mVHLwtVAX) 或上述截短突
     变的 VHL 疫苗 (mVHLtrunc VAX) 免疫小鼠。将小鼠分组， 如上述首次试验所述， 用未转染的 B16， 表达野生型 VHL 的 B16 或表达突变 VHL 的 B16 攻击。结果再次显示， 用截短 VHL 疫苗 免疫导致对肿瘤攻击的保护作用， 并再次证实不能保护这些小鼠对抗野生型肿瘤的攻击。 用野生型肿瘤免疫的小鼠不能保护其对抗野生型肿瘤的攻击， 这表示疫苗不能破坏对野生 型蛋白的耐受。然而， 当用表达突变 VHL 的肿瘤攻击时， 50％经野生型蛋白免疫的小鼠被保 护， 预示突变 VHL 在某种程度上被鼠免疫系统识别。考虑到基于酵母的疫苗在这些试验中 的特异性和功效， 生产靶向人类中最常见突变的酵母将是一个相对简单的任务， 为将其作 为人类治疗性疫苗的潜在免疫方法铺平了道路。
     表2
     实施例 5
     下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗乳腺癌的用途。
     处于实体器官， 包括肺， 乳房和结肠的癌症早期阶段的多数病人， 可通过外科手术 切除原发性肿瘤而治愈。不幸的是， 很多病人出现了或复发了造血性转移， 除了极少数例 外， 这种造血性转移不能通过现有方式， 包括外科手术， 放射疗法， 化疗， 或同种异体干细胞 移植 (alloSCT) 而治愈。同样， 虽然新近改造的癌症疫苗对最近建立疾病的动物模型显示 出显著的效力， 但一旦肿瘤建立超过 5 天或已出现了转移， 疫苗作为单一试剂通常是无效 的 (Borello 等， 2000， Blood 95 ： 3011-3019)。 部分原因是肿瘤的建立典型地伴随着对肿瘤 抗原耐受的诱导， 必需打破这种耐受才能实现成功的治疗 (Ye 等， 1994， Proc.Natl.Acad. Sci.USA.91 ： 3916-3920 ； Staveley-O ′ Carroll 等， 1998， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 1178-1183)。在不引起骨髓重度抑制的 alloSCT 之后的免疫接种产生增加的改进， 但仍不 能影响建立超过 3 天的肿瘤 (Anderson 等， 2000， Blood 95 ： 2426-2433)。Luznik 等 ( 出处 同上， 全部引入本文作为参考 ) 最近报道了在小鼠乳腺癌模型中， 在达到稳定混合骨髓嵌 合状态的不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植 (NST) 之后的免疫接种， 产生能消除
     原发性肿瘤建立 2 周后的转移， 并且不诱发移植物抗宿主疾病 (GVHD) 的显著增强的肿瘤特 异性免疫反应。这个只涉及免疫接种或涉及自体 SCT 或完全 alloSC 之后免疫接种的策略， 其显著增强的功效依赖于建立混合嵌合状态时相互作用的宿主和供者免疫系统的作用。
     Luznik 等的试验中， 给予的疫苗由受辐射的自身肿瘤细胞混合粒细胞 - 巨噬细胞 集落刺激因子 (GM-CSF) 组成。在下面的实验中， 本发明人指出基于酵母的疫苗可取代使用 受辐射的自身肿瘤细胞混合产生 GM-CSF 的细胞， 在相同的动物模型中产生等效结果。简 单的说， 本发明人制备了基于酵母的疫苗， 含有用在 CUP 1 启动子控制下编码小鼠乳房肿 瘤病毒 (MMTV) 的 gp70 蛋白的酵母表达载体转导的酿酒酵母 (Yeast gp70-IT)。MMTV 感染 Balb/c 小鼠引发的自发性乳腺癌中表达了 gp70 蛋白。根据 Luznik 等的试验步骤， 在第 0 天， Balb/c 小鼠皮下注射 10,000 个 4T1 肿瘤细胞 ( 表达 MMTVgp70 的 Balb/c 衍生的自发 性乳腺癌细胞 )。 以 MHC 相容性 B10.D2 为供体进行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞 移植 (NST) 之前， 第 13 天切除皮下肿瘤。NST 如下组成 ： 第 13 天 200cGyTBI， 第 14 天静脉 给予 10,000,000 个供体骨髓细胞， 第 17 天腹膜内给予 200mg/kg 环磷酰胺。接受了 B10.D2 骨髓的小鼠随后 ： (a) 在第 28 天接受 20,000,000 个 B10D.2 脾细胞， 不再进一步治疗 ( 没有 疫苗 ) ； 或 (b) 在第 28 天接受 20,000,000 个 B10D.2 脾细胞， 在第 31 天接受自体肿瘤疫苗 6 5 (10 个受辐射的 4T1 肿瘤细胞混合 5×10 个分泌 GM-CSF、 MHC 阴性的旁观 (bystander) 细 胞系 B78H1/GM-CSF)， 或 (c) 在第 28 天接受 20,000,000 个 B10D.2 脾细胞， 第 31 天接受本 发明的基于酵母的 gp70-IT 疫苗。正如图 5 中所清楚显示的， 本发明基于酵母的疫苗诱导 对抗致死性肿瘤复发的保护作用， 与产生 GM-CSF 的自身肿瘤细胞诱导的保护作用没有区 别。与使用病人自体肿瘤细胞混合产生 GM-CSF 的旁观细胞系相比， 本发明基于酵母的疫苗 方法在临床上的有用性很容易评价， 并且包括但不限于如下优点， 更广泛的病人适用范围， 结果差异性降低， 设计接种抗原的能力增加， 安全性增加， 疫苗中不必包括生物学修饰物如 GM-CSF， 等等。
     实施例 6
     下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗黑色素瘤的用途。
     这个实验中， 参照表 3， 使用 5 组小鼠， 每组 5 只。组 A 中， 在肿瘤攻击前 4 周和 2 周小鼠接受 PBS 注射。在肿瘤攻击后 10 天和 17 天小鼠接受 50×106 基于酵母的 hMART-1 疫苗 ( 表达人 MART-1 的酵母载体 )。组 B 中， 在肿瘤攻击前 4 周和 2 周以及肿瘤攻击后 10 6 天和 17 天， 小鼠接受 50×10 基于酵母的 hMART-1 疫苗注射。组 C 中， 在肿瘤攻击前 4 周 和 2 周小鼠接受 PBS， 并且肿瘤攻击后不再给予。组 D 中， 在肿瘤攻击前 4 周和 2 周小鼠接 6 受 50×10 基于酵母的 hMART-1 疫苗注射， 并且肿瘤攻击后不再给予。组 E 中， 在肿瘤攻击 6 前 4 周和 2 周小鼠接受 50×10 基于酵母的 EGFR 疫苗 ( 表达 EGFR 的酵母载体 )， 并且肿瘤 攻击后不再给予。第 0 天， 所有小鼠接受皮下给予 D16 黑色素瘤细胞的肿瘤攻击。A-D 组小 鼠接受 50,000 个表达内源性小鼠 MART-1 的 D16 黑色素瘤细胞 ( 没有用人 MART-1 转染的 细胞 )， E 组小鼠接受 50,000 用 EGFR 转染的 D16 黑色素瘤细胞。
     表3
     结果如图 6 所示。组 B( 肿瘤攻击之前和之后都接受了免疫 ) 和组 D( 肿瘤攻击之 前接受了免疫 ) 的小鼠， 肿瘤负荷显著减小， 证明表达黑色素瘤抗原的酵母疫苗对黑色素 瘤肿瘤有效， 甚至跨越物种。
     实施例 7
     下述实施例证明本发明酵母载体中表达的融合蛋白的构建， 其中融合蛋白包含多 个免疫原性功能域和相同抗原的多个突变。
     多种 Ras 家族成员的核苷酸序列和氨基酸序列是现有技术中已知的。SEQ ID NO ： 2 是编码人 K-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_033360) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 2 编码本 文中 SEQ ID NO ： 3 代表的人 K-ras。SEQ IDNO ： 4 是编码鼠 K-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_021284) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 4 编码本文中 SEQ ID NO ： 5 代表的鼠 K-ras。SEQ ID NO ： 6 是编码人 H-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_005343) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 6编 码本文中 SEQ ID NO ： 7 代表的人 H-ras。SEQ ID NO ： 8 是编码鼠 H-ras( 已知 GenBank 登 录号为 NM_008284) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 8 编码本文中 SEQ ID NO ： 9 代表的鼠 H-ras。 SEQ ID NO ： 10 是编码人 N-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_002524) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 10 编码本文中 SEQ ID NO ： 11 代表的人 N-ras。SEQ ID NO ： 12 是编码鼠 N-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_010937) 的核酸序列。 SEQ ID NO ： 12 编码本文中 SEQ ID NO ： 13 代表 的鼠 N-ras。
     图 7 是示意图， 说明了含有多个抗原性 / 免疫原性功能域用于本发明基于酵母的 疫苗的融合蛋白的实例。 在这些示例性融合构建体中， 使用了 K-Ras 蛋白的 3-165 位氨基酸 (SEQ ID NO ： 3 的 3-165 位 )， 所述氨基酸在 N-Ras 和 H-Ras 中是相同的 ( 即， 可使用 N-Ras 和 H-Ras 的 3-165 位， 并可获得相同的结果 )。随后， 该序列在位置 12 突变， 以缬氨酸， 半 胱氨酸或天门冬氨酸残基取代这个位置正常存在的甘氨酸 ( 分别参见 GI-1014， GI-4015 和 GI-4016)， 在位置 61 用精氨酸取代这个位置正常存在的谷氨酸。第二个序列与这个序列 融合 ( 附加 )。第二个序列是 SEQ ID NO ： 3 的跨越 K-ras 的 56-69 位氨基酸的功能域， 包 括在位置 61 以亮氨酸取代这个位置正常存在的谷氨酸的突变。虽然这最初的三个序列中 Q61L 功能域与更长序列的 N 末端融合， 也可制备其中功能域顺序颠倒的其它构建体。编码 GI-1014 的构建体的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列分别如 SEQ ID Nos ： 14 和 15 所示。
     图 7 还显示了多 - 抗原 Ras 融合疫苗 (GI-4018)， 包含上述在位置 12 的所有三个 突变和上述在位置 61 的两个突变。融合蛋白如下构建。含有 SEQ IDNO ： 1 的合成序列后接 着包括各种 Ras 突变的 4 个多肽。图 7 所示的 4 个多肽的第一个包括 K-Ras 的 N 末端 (SEQ
     ID NO ： 3) 的 3-30 位残基， 其中对应于 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基已经突变， 以缬 氨酸取代这个位置正常存在的甘氨酸。 4 个功能域的第二个包括 SEQ ID NO ： 3 位置 3-39 的 氨基酸残基， 其中对应于 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基已经突变， 以半胱氨酸取代这 个位置正常存在的甘氨酸。4 个功能域的第三个由 SEQ IDNO ： 3 位置 3-165 的氨基酸残基 组成， 其中包含在位置 12 用天门冬氨酸取代这个位置正常存在的甘氨酸， 和在位置 61 用精 氨酸取代这个位置正常存在的谷氨酸。4 个功能域的第四个是 SEQ ID NO ： 3 的跨越 K-ras 的 56-69 位氨基酸的功能域， 包括在位置 61 的突变， 以亮氨酸取代这个位置正常存在的谷 氨酸残基。再次， 虽然功能域以这种顺序描绘在图 7 中， 应该了解功能域的顺序可根据需要 重新组织。
     这个实例只是想说明如何构建在本发明中有用的抗原构建体。 使用来自不同抗原 的功能域， 来自相同抗原的多个功能域， 或带有不同突变的重复功能域的相似策略， 可用于 其它抗原。当单个疫苗构建体中需要包含在抗原的单一位置天然发生的几个不同突变和 / 或突变组合时， 这种类型的构建体特别有用。
     本文中引用的所有参考文献全部引入本文作为参考。
     本申请是中国申请 200380109787.5 的分案申请， 该母案的国际申请日为 2003 年 12 月 6 日， 本分案采用了与该母案一致的发明名称。技术领域
     本发明涉及含有异源抗原的基于酵母的疫苗在诱发体液免疫和细胞免疫， 和一方 面预防和治疗多种动物癌症中的用途。 背景技术 导致新的、 异常生长的瘤形成或快速细胞增殖过程是许多疾病的特征， 这些疾病 可能是严重的， 并且有时是威胁生命的。 通常， 细胞和组织的瘤性生长以高于细胞的正常增 殖为特征， 其中即使诱发 (instigating) 因子 ( 例如， 肿瘤启动子， 致癌原， 病毒 ) 不再存在 之后， 细胞仍然继续生长。细胞生长往往显示出结构上缺乏组织和 / 或缺乏与正常组织的 协调， 并且通常产生一团可能是良性或恶性的组织 ( 例如， 肿瘤 )。恶性细胞生长， 或恶性 肿瘤是世界范围内死亡的最主要的原因， 研发肿瘤性疾病的有效治疗方法是大体研究的课
     题。 虽然已经提出了多种治疗和预防癌症的创新方法， 很多癌症仍然具有高死亡率， 并且可 能难以治疗或者对于常规疗法相对无反应。
     例如， 肺癌是美国第二种最普遍的癌症形式， 占全部癌症的 15％和全部癌症死亡 数的 28％。 2002 年， 估计将诊断出 177,000 例肺癌新增病例， 166,000 人将死亡， 死亡率高于 结肠直肠癌、 前列腺癌和乳腺癌的总和。80％的原发性肺部肿瘤是非小细胞肺癌 (NSCLC)。 由于多种药物治疗产生最小存活优势和严重毒性， 标准化疗联合仍然是相对无效的。
     另有一例， 多形性成胶质细胞瘤 ( 神经胶质瘤 ) 是成年人中最普遍的原发恶性脑 肿瘤。尽管应用了外科手术， 放疗和化疗， 治愈率和平均患者存活数仍没有改善。其它肿瘤 也向脑部转移， 这种情况下， 由于血脑屏障对药物传递的限制使它们对外周化疗的反应不 太好。明确地说， 需要更多的针对脑肿瘤的治疗方法。这种方法的其中之一包括免疫疗法。 一段时间以来已知在外周致敏了的淋巴细胞能通过血脑屏障并靶向脑组织。 脑肿瘤免疫疗 法的主要靶点是诱发针对在脑肿瘤细胞中特异性表达的新的或突变的抗原的免疫反应的 疫苗。 这个目标将提供一种疫苗方法， 以提供广泛的、 有力的和长效的免疫保护作用对抗颅 内肿瘤。
     疫苗广泛地用于预防疾病和治疗确定的疾病 ( 免疫治疗疫苗 )。 蛋白抗原 ( 例如， 由于重组 DNA 技术使其研制成为可能的亚单位疫苗 )， 当不与佐剂一起给予时， 诱发弱体液 ( 抗体 ) 免疫， 并因此到目前为止是令人失望的， 因为它们仅产生有限的免疫原性。亚单位 疫苗与灭活病毒和重组活病毒疫苗的另一个缺点是当与佐剂一起给予时， 虽然刺激强体液 免疫反应， 但不能诱发保护性细胞免疫。 佐剂实验性地用来刺激小鼠的有效免疫反应， 并且 希望用于人疫苗， 但只有少数佐剂被批准用于人类应用。 实际上， 在美国批准使用的唯一佐 剂是铝盐， 氢氧化铝和磷酸铝， 它们中没有一个刺激细胞介导的免疫。 铝盐制剂不能冷冻或 冻干， 并且这种佐剂不是与所有抗原都有效。另外， 多数佐剂不会导致细胞毒性 T 淋巴细胞(CTL) 的诱导。CTL 是杀死合成异常蛋白， 包括病毒蛋白和突变 “自身” 蛋白的细胞所需的。 正在大力研究刺激 CTL 的疫苗以用于对抗多种疾病， 包括所有癌症 ( 例如黑色素瘤， 前列腺 癌， 卵巢癌等 )。因此总之需要总体刺激 CTL 和细胞介导免疫的佐剂。
     酵母已用于亚单位蛋白疫苗的产生 ； 然而， 在这种情况中， 酵母用于产生蛋白， 但 是酵母细胞或其亚细胞级分实际上不能传递给患者。也有在免疫之前用酵母喂饲动物， 试 图以非特异性方式启动免疫反应 ( 例如， 刺激吞噬作用以及补体和干扰素的产生 )。结论 是不明确的， 并且这种方法不能产生保护性细胞免疫 ； 参见例如 Fattal-German 等， 1992， Dev.Biol.Stand.77， 115-120 ； Bizzini 等， 1990， FEMSMicrobiol.Immunol.2， 155-167。
     1998 年 11 月 3 日公布的 Duke 等人的美国专利 US 5,830,463， 描述了使用带有至 少一个能调节免疫反应的化合物的非致病性酵母， 并证明了这种复合物对刺激细胞介导的 免疫和刺激体液免疫都有效。具体的， US 5,830,463 证明了当给予动物后， 经遗传改造表 达异源抗原的酵母能诱发细胞介导的免疫反应和体液免疫反应。
     尽管癌症治疗和疫苗技术目前有进展， 仍然急迫需要研制安全和有效的疫苗和佐 剂， 它们是针对适用于免疫疗法的疾病， 包括瘤性转化 ( 癌 ) 导致的疾病， 特别是针对那些 对使用常规癌症疗法和普通疫苗策略的治疗特别耐受的癌症。
     发明概述
     本发明的一个实施例涉及一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或可 能发展为癌症的动物给予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状。所述疫苗包含 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工。 融合 蛋白要满足下述额外要求 ： (1) 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ； (2) 融合蛋白位 置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ； (3) 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫 氨酸 ； 和 (4) 融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。一方面， 所述肽由至 少 2-6 个与癌抗原异源的氨基酸残基组成。 另一方面， 所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基 酸序列， 其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X3 是除甲硫 氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任 意一种氨基酸 ； X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和 X6 是除甲硫氨 酸之外的任意一种氨基酸。一方面， X6 是脯氨酸。另一方面， 所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     本发明的另一个实施例涉及一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或 可能发展为癌症的动物给予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状。 所述疫苗包含 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融 合蛋白的翻译后加工。一方面， 所述酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     上述任意一个本发明的实施例， 还要考虑下述额外方面。 一方面， 融合蛋白包含至 少两种或多种癌抗原。另一方面， 融合蛋白包含一种或多种癌抗原的至少一个或多个免疫 原性功能域。 另一方面， 癌抗原是与选自以下组癌症相关的抗原 ： 黑色素瘤， 鳞状细胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢癌， 膀胱癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤 (angiosarcoma)， 血管肉瘤 (hemangiosarcoma)， 肥大细胞肿瘤， 原发性肝 癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠癌， 肾细胞癌， 造血细胞瘤形成及它们的转移性癌症。
     另一方面， 癌抗原是 ras 基因编码的野生型或突变蛋白。例如， 癌抗原可包括选自 以下组的 ras 基因编码的野生型或突变蛋白 ： K-ras， N-ras 和 H-ras 基因。一方面， ras 基 因编码带有单突变或多突变的 Ras 蛋白。另一方面， 癌抗原包含片段， 所述片段含有对应于 野生型 Ras 蛋白位置 12， 13， 59 或 61 的氨基酸的野生型 Ras 蛋白的至少 5-9 个连续氨基酸 残基， 其中位置 12， 13， 59， 或 61 的氨基酸残基相对于野生型 Ras 蛋白发生了突变。
     另一方面， 癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 其中每个功能域由 来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至少 4 个氨基 酸残基组成， 其中突变与致肿瘤性相关。 这方面， 融合蛋白构建体由至少一个与另一个突变 肿瘤抗原在阅读框内融合的肽组成， 其中所述肽选自以下组 ： (a) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 8-16 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基发生了突变 ； (b) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 9-17 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 13 的氨基酸残基发生了 突变 ； (c) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 55-63 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 59 的 氨基酸残基发生了突变 ； 和 (d) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 57-65 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 61 的氨基酸残基发生了突变。一方面， 突变的肿瘤抗原是相对于野生型 Ras 蛋白序列含有至少一个突变的 Ras 蛋白。 上述任一方法的一个实施例中， 疫苗施用到呼吸道。 另一实施例中， 以胃肠道外给 予途径给予疫苗。 另一实施例中， 疫苗进一步包含树突细胞或巨噬细胞， 其中表达融合蛋白 的酵母载体传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且将包含表达癌抗原的酵母载体的 树突细胞或巨噬细胞给予动物。这个实施例的一方面， 树突细胞或酵母载体额外装载了游 离抗原。 一方面， 疫苗作为治疗性疫苗给予。 另一方面， 疫苗作为预防性疫苗给予。 一方面， 动物已经患有或者可能发展为选自以下组的癌症 ： 脑癌， 肺癌， 乳腺癌， 黑色素瘤和肾癌。 另 一方面， 动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤之后再给予疫苗。另一方面， 动物 患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 并且进行不引起骨髓重度抑制的同种异体干 细胞移植之后再给予疫苗。另一方面， 动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 进 行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植， 以及输注同种异体的供体淋巴细胞之后再 给予疫苗。
     本发明的另一个实施例涉及一种保护动物对抗脑癌或肺癌的方法， 包括将包含酵 母载体和至少一种癌抗原的疫苗施用到已患有或可能发展为脑癌或肺癌的动物的呼吸道， 以减少或预防至少一种动物脑癌或肺癌的症状。这个实施例中， 疫苗可包括上述任意一种 融合蛋白和其它抗原。一方面， 疫苗包含至少两种或多种癌抗原。另一方面， 癌抗原是含有 至少一种或多种癌抗原的融合蛋白。另一方面， 癌抗原是含有一种或多种癌抗原的至少一 个或多个免疫原性功能域的融合蛋白。
     这个实施例的一方面， 疫苗以鼻内给予方式给予。 另一方面， 疫苗以气管内给予方 式给予。 另一实施例中， 酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且包 含酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物的呼吸道。
     一方面， 所述方法保护动物对抗脑癌， 包括但不限于原发性脑癌， 如多形性成胶质
     细胞瘤或来自另一器官的转移癌。 另一个实施例中， 所述方法保护动物对抗肺癌， 包括但不 限于原发性肺癌 ( 例如， 非小细胞癌， 小细胞癌和腺癌 ) 或来自另一器官的转移癌。 一方面， 疫苗作为治疗性疫苗给予。另一方面， 疫苗作为预防性疫苗给予。
     本发明还有一个实施例涉及一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应以及抗原 特异性细胞介导的免疫反应的方法。 所述方法包括给予动物包含下述的治疗性组合物 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种抗原 ； 和 (ii) 与抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳 定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工。 所述融合蛋白要满 足下述额外要求 ： 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ； 融合蛋白位置 2 的氨基酸残 基不是甘氨酸或脯氨酸 ； 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和融合蛋白位 置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。一方面， 所述肽由至少 6 个与抗原异源的氨 基酸残基组成。 另一方面， 所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列， 其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的 任意一种氨基酸 ； X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X5 是除甲硫氨 酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和 X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。 一 方面， X6 是脯氨酸。另一方面， 所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。一 方面， 抗原选自以下组 ： 病毒抗原， 过表达的哺乳动物细胞表面分子， 细菌抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫 (helminth) 抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一个和多个突变氨基酸 的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过插入流行病 学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以及通过调节 序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     另一实施例涉及用于如上所述方法的疫苗。
     本发明还有一个实施例涉及一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应和抗原特 异性细胞介导的免疫反应的方法， 所述方法包括给予动物包含下述的治疗性组合物 ： (a) 酵母载体 ； 和 (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 (i) 至少一种抗原 ； 和 (ii) 与该抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基 酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻 译后加工。一方面， 所述酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     本发明另一实施例涉及用于如上所述方法的疫苗。
     本发明还有一个实施例涉及一种治疗癌症病人的方法， 包括 ： (a) 用能有效建立 稳定混合的骨髓嵌合状态的不引起骨髓重度抑制的干细胞转移来治疗癌症病人， 其中干细 胞由同种异体的供体提供 ； (b) 将从同种异体的供体处获得的淋巴细胞给予病人 ； 和 (c) 在 步骤 (b) 之后， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予病人。一方面， 所述方法还包 括在步骤 (a) 之前， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予同种异体的供体。另一 实施例中， 所述方法包括在进行步骤 (a) 之前， 切除病人的肿瘤。
     该方法一方面， 疫苗包含至少两种或多种癌抗原。 另一方面， 癌抗原是含有一种或 多种癌抗原的融合蛋白。另一方面， 癌抗原是包含一种或多种癌抗原的一个或多个免疫原 性功能域的融合蛋白。另一方面， 癌抗原由包含多个功能域的融合蛋白构建体组成， 其中 每个功能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至少 4 个氨基酸残基组成， 其中突变与致肿瘤性相关。另一方面， 酵母载体表达癌抗原， 其 中癌抗原是融合蛋白， 包含 ： (a) 至少一个癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的肽， 所 述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的 表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ： 其中融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨 酸； 融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ； 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基 都不是甲硫氨酸 ； 和融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。另一方面， 酵母载体表达癌抗原， 其中癌抗原是融合蛋白， 包含 ： (a) 至少一个癌抗原 ； 和 (ii) 与该癌 抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组 成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后 加工。
     这个实施例的一方面， 疫苗以鼻内给予方式给予。 另一方面， 疫苗以胃肠道外给予 方式给予。 另一方面， 酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且包含 酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物的呼吸道。
     上述任意一种本发明的方法和组合物中， 涉及酵母载体的下述方面也包括在本 发明中。一个实施例中， 酵母载体选自以下组 ： 完整的酵母， 酵母原生质球， 酵母胞质体， 酵母空胞， 以及亚细胞性酵母膜提取物或级分。一方面， 用编码抗原的重组核酸分子转化 用来制备酵母载体的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球中重组表达 抗原。在这方面中， 重组表达抗原的酵母细胞或酵母原生质球用来制备包含酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或级分的酵母载体。一方面， 酵母载体来自非致病性 酵母。另一方面， 酵母载体来自选自以下组的酵母 ： 糖酵母 (Saccharomyces)， 裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)， 克鲁维酵母 (Kluveromyces)， 汉逊酵母 (Hansenula)， 假丝酵母 (Candida) 和毕赤酵母 (Pichia)。一方面， 酵母是酿酒酵母 (S.cerevisiae)。
     总之， 酵母和抗原可通过本文所述的任意技术结合， 一方面， 酵母载体在细胞内装 载了 (load) 癌抗原。另一方面， 癌抗原与酵母载体共价或非共价结合。另一方面， 通过混 合使酵母载体和抗原结合。另一方面， 由酵母载体或衍生出酵母载体的酵母细胞或酵母原 生质球来重组表达抗原。
     更具体地， 本发明涉及 ：
     1. 一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或可能发展为癌症的动物给 予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状， 其中所述疫苗包含 ：
     (a) 酵母载体 ； 和
     (b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种癌抗原 ； 和
     ii) 与癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     2. 项 1 的方法， 其中所述肽由至少 2-6 个与癌抗原异源的氨基酸残基组成。3. 项 1 的方法， 其中所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列 ；
     其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和
     X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。
     4. 项 3 的方法， 其中 X6 是脯氨酸。
     5. 项 1 的方法， 其中所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     6. 一种保护动物对抗癌症的方法， 包括对已患有癌症或可能发展为癌症的动物给 予疫苗， 以减少或预防动物癌症的至少一种症状， 其中所述疫苗包含 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种癌抗原 ； 和
     ii) 与该癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个 至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达 的融合蛋白的翻译后加工。
     7. 项 6 的方法， 其中酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     8. 项 1 或 6 的方法， 其中融合蛋白包含至少两种或多种癌抗原。
     9. 项 1 或 6 的方法， 其中融合蛋白包含一种或多种癌抗原的至少一个或多个免疫 原性功能域。
     10. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原是与选自以下组癌症相关的抗原 ： 黑色素瘤， 鳞 状细胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢癌， 膀胱 癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤， 血管肉瘤， 肥大细胞肿瘤， 原发性肝癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠癌， 肾细胞癌， 造血细胞瘤形成及它们的转移性癌症。
     11. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原是 ras 基因编码的野生型或突变型蛋白。
     12. 项 11 的方法， 其中癌抗原是由选自 K-ras， N-ras 或 H-ras 基因的 ras 基因编 码的野生型或突变型蛋白。
     13. 项 11 的方法， 其中 ras 基因编码带有单突变或多突变的 Ras 蛋白。
     14. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原包含片段， 所述片段含有对应于野生型 Ras 蛋白 第 12， 13， 59 或 61 位的氨基酸的野生型 Ras 蛋白至少 5-9 个连续氨基酸残基， 其中第 12， 13， 59， 或 61 位的氨基酸残基相对于野生型 Ras 蛋白发生了突变。
     15. 项 1 或 6 的方法， 其中癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 其中 每个功能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由所述蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一 侧的至少 4 个氨基酸残基组成， 所述突变与致肿瘤性相关。
     16. 项 15 的方法， 其中融合蛋白构建体由至少一种肽组成， 其中所述肽与另一突 变肿瘤抗原在阅读框内融合， 该肽选自以下组 ：
     a) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 8-16， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 12 的 氨基酸残基发生了突变 ；
     b) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 9-17， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 13 的氨基酸残基发生了突变 ；
     c) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 55-63， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 59 的氨基酸残基发生了突变 ； 和
     d) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 的位置 57-65， 其中 SEQ ID NO ： 3 的位置 61 的氨基酸残基发生了突变。
     17. 项 16 的方法， 其中突变的肿瘤抗原是相对于野生型 Ras 蛋白序列包含至少一 个突变的 Ras 蛋白。
     18. 项 1 或 6 的方法， 其中酵母载体选自以下组 ： 完整酵母， 酵母原生质球， 酵母胞 质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     19. 项 1 或 6 的方法， 其中用编码所述癌抗原的重组核酸分子转化用于制备酵母载 体的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球重组表达该癌抗原。
     20. 项 19 的方法， 其中重组表达所述癌抗原的酵母细胞或酵母原生质球用于制备 包含酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分的酵母载体。
     21. 项 1 或 6 的方法， 其中酵母载体来自非致病性酵母。
     22. 项 1 或 6 的 方 法， 其中酵母载体来自选自以下组的酵母： 糖酵母 (Saccharomyces)， 裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)， 克鲁维酵母 (Kluveromyces)， 汉逊 酵母 (Hansenula)， 假丝酵母 (Candida) 或毕赤酵母 (Pichia)。 23. 项 1 或 6 的方法， 其中糖酵母是酿酒酵母 (S.Cerevisiae)。
     24. 项 1 或 6 的方法， 其中将疫苗施用到呼吸道。
     25. 项 1 或 6 的方法， 其中以胃肠道外给予方式给予疫苗。
     26. 项 1 或 6 的方法， 其中疫苗进一步包含树突细胞或巨噬细胞， 其中将表达融合 蛋白的酵母载体传递到来自体内的树突细胞或巨噬细胞， 并且将包含表达癌抗原的酵母载 体的树突细胞或巨噬细胞给予动物。
     27. 项 26 的方法， 其中树突细胞或酵母载体额外装载了游离抗原。
     28. 项 1 或 6 的方法， 其中疫苗作为治疗性疫苗给予。
     29. 项 1 或 6 的方法， 其中疫苗作为预防性疫苗给予。
     30. 项 1 或 6 的方法， 其中动物已经患有或者可能发展为选自以下组的癌症 ： 脑 癌， 肺癌， 乳腺癌， 黑色素瘤或肾癌。
     31. 项 1 或 6 的方法， 其中动物患有癌症， 并且在通过外科手术切除动物的肿瘤之 后再给予疫苗。
     32. 项 1 或 6 的方法， 其中动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 并且进 行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植之后再给予疫苗。
     33. 项 1 或 6 的方法， 其中动物患有癌症， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 进行不 引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植， 以及输注同种异体的供体淋巴细胞之后再给予 疫苗。
     34. 一种保护动物对抗脑癌或肺癌的方法， 包括将包含酵母载体和至少一种癌抗 原的疫苗施用到已患有或可能发展为脑癌或肺癌的动物的呼吸道， 以减少或预防动物脑癌 或肺癌的至少一种症状。
     35. 项 34 的方法， 其中疫苗包含至少两种或多种癌抗原。
     36. 项 34 的方法， 其中癌抗原是含有至少一种或多种癌抗原的融合蛋白。
     37. 项 34 的方法， 其中癌抗原是含有一种或多种癌抗原的至少一个或多个免疫原 性功能域的融合蛋白。
     38. 项 34 的方法， 其中癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 每个功 能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由所述蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至 少 4 个氨基酸残基组成， 所述突变与致肿瘤性相关。
     39. 项 34 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合 蛋白 ：
     a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与癌抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
    40. 项 34 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合蛋白 ： a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个 至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达 的融合蛋白的翻译后加工。
     41. 项 34 的方法， 其中酵母载体选自以下组 ： 完整酵母， 酵母原生质球， 酵母胞质 体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     42. 项 34 的方法， 其中用编码所述癌抗原的重组核酸分子转化用于制备酵母载体 的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球重组表达所述癌抗原。
     43. 项 42 的方法， 其中重组表达癌抗原的酵母细胞或酵母原生质球用于制备包含 酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分的酵母载体。
     44. 项 34 的方法， 其中酵母载体在细胞内装载癌抗原。
     45. 项 34 的方法， 其中癌抗原与酵母载体共价或非共价结合。
     46. 项 34 的方法， 其中通过混合使酵母载体与癌抗原结合。
     47. 项 34 的方法， 其中以鼻内给予方式给予疫苗。
     48. 项 34 的方法， 其中以气管内给予方式给予疫苗。
     49. 项 34 的方法， 其中将酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细 胞， 并且将包含酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物呼吸道。
     50. 项 34 的方法， 其中所述方法保护动物对抗脑癌。
     51. 项 50 的方法， 其中脑癌是原发性脑癌。
     52. 项 50 的方法， 其中脑癌是多形性成胶质细胞瘤。
     53. 项 50 的方法， 其中脑癌是来自另一器官的转移癌。
     54. 项 34 的方法， 其中所述方法保护动物对抗肺癌。
     55. 项 54 的方法， 其中肺癌是原发性肺癌。
     56. 项 54 的方法， 其中肺癌选自非小细胞癌， 小细胞癌和腺癌。
     57. 项 54 的方法， 其中肺癌是来自另一器官的转移癌。
     58. 项 34 的方法， 其中疫苗作为治疗性疫苗给予。
     59. 项 34 的方法， 其中疫苗作为预防性疫苗给予。
     60. 项 34 的方法， 其中酵母载体来自非致病性酵母。
     61. 项 34 的方法， 其中酵母载体来自选自以下组的酵母 ： 糖酵母， 裂殖酵母， 克鲁 维酵母， 汉逊酵母， 假丝酵母或毕赤酵母。
     62. 项 34 的方法， 其中糖酵母是酿酒酵母。
     63. 一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应和抗原特异性细胞介导的免疫反应 的方法， 所述方法包括给予动物包含下述物质的治疗性组合物 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与该抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ； 其中融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     64. 项 63 的方法， 其中所述肽由至少 6 个与所述抗原异源的氨基酸残基组成。
     65. 项 63 的方法， 其中所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列 ；
     其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和
     X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。
     66. 项 65 的方法， 其中 X6 是脯氨酸。
     67. 项 63 的方法， 其中所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     68. 项 63 的方法， 其中抗原选自以下组 ： 病毒抗原， 过表达的哺乳动物细胞表面分 子， 细菌抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一个或多个 突变氨基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过 插入流行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以 及通过调节序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     69. 一种诱发动物的抗原特异性体液免疫反应和抗原特异性细胞介导的免疫反应 的方法， 所述方法包括给予动物包含下述物质的治疗性组合物 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2- 约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达 的融合蛋白的翻译后加工。
     70. 项 69 的方法， 其中酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     71. 一种疫苗， 含有 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与该抗原异源的氨基酸残基组 成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加工 ；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     72. 项 71 的疫苗， 其中所述肽由至少 6 个与该抗原异源的氨基酸残基组成。
     73. 项 71 的疫苗， 其中所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列 ；
     其中 X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ；
     X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和
     X6 是除甲硫氨酸之外的任意一种氨基酸。
     74. 项 73 的疫苗， 其中 X6 是脯氨酸。
     75. 项 73 的疫苗， 其中所述肽包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的氨基酸序列。
     76. 项 73 的疫苗， 其中抗原选自以下组 ： 病毒抗原， 哺乳动物细胞表面分子， 细菌 抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一个或多个突变氨 基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过插入流 行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以及通过 调节序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     77. 项 73 的疫苗， 其中抗原是癌抗原。
     78. 一种疫苗， 包含 ：
     a) 酵母载体 ； 和
     b) 酵母载体表达的融合蛋白， 所述融合蛋白包含 ：
     i) 至少一种抗原 ； 和
     ii) 与该抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表 达的融合蛋白的翻译后加工。
     79. 项 78 的疫苗， 其中酵母蛋白包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体表位。
     80. 一种治疗癌症病人的方法， 包括 ：
     a) 用能有效建立稳定混合的骨髓嵌合状态且不引起骨髓重度抑制的干细胞转移来治疗癌症病人， 其中干细胞由同种异体的供体提供 ；
     b) 将从同种异体的供体获得的淋巴细胞给予病人 ； 和
     c) 在步骤 (b) 之后， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予病人。
     81. 项 80 的方法， 进一步包括在步骤 (a) 之前， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原 的疫苗给予同种异体的供体。
     82. 项 80 的方法， 进一步包括在步骤 (a) 之前， 切除病人的肿瘤。
     83. 项 80 的方法， 其中疫苗包含至少两种或多种癌抗原。
     84. 项 80 的方法， 其中癌抗原是包含一种或多种癌抗原的融合蛋白。
     85. 项 80 的方法， 其中癌抗原是含有一种或多种癌抗原的一个或多个免疫原性功 能域的融合蛋白。
     86. 项 80 的方法， 其中癌抗原由含有多个功能域的融合蛋白构建体组成， 每个功 能域由来自癌蛋白的肽组成， 所述肽由所述蛋白中所发现的突变氨基酸及其任意一侧的至 少 4 个氨基酸残基组成， 所述突变与致肿瘤性相关。
     87. 项 80 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合 蛋白 ：
     a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与该癌抗原 N- 末端连接的肽， 所述肽由至少两个与该癌抗原异源的氨基酸残 基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加 工；
     其中， 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ；
     融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ；
     融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ； 和
     融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸。
     88. 项 80 的方法， 其中酵母载体表达癌抗原， 所述癌抗原是包含下述物质的融合 蛋白 ：
     a) 至少一种癌抗原 ； 和
     b) 与该癌抗原 N- 末端连接的酵母蛋白， 其中所述酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成， 且所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表 达的融合蛋白的翻译后加工。
     89. 项 80 的方法， 其中酵母载体选自以下组 ： 完整酵母， 酵母原生质球， 酵母胞质 体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     90. 项 80 的方法， 其中用编码所述癌抗原的重组核酸分子转化用于制备酵母载体 的酵母细胞或酵母原生质球， 使酵母细胞或酵母原生质球重组表达所述癌抗原。
     91. 项 90 的方法， 其中重组表达癌抗原的酵母细胞或酵母原生质球用于制备包含 酵母胞质体， 酵母空胞， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分的酵母载体。
     92. 项 80 的方法， 其中酵母载体在细胞内装载癌抗原。
     93. 项 80 的方法， 其中癌抗原与酵母载体共价或非共价结合。
     94. 项 80 的方法， 其中通过混合使酵母载体与癌抗原结合。
     95. 项 80 的方法， 其中以鼻内给予方式给予疫苗。96. 项 80 的方法， 其中以胃肠道外给予方式给予疫苗。
     97. 项 80 的方法， 其中将酵母载体和癌抗原传递到来自体内的树突细胞或巨噬细 胞， 并且将包含酵母载体和癌抗原的树突细胞或巨噬细胞施用到动物呼吸道。
     98. 项 80 的方法， 其中酵母载体来自非致病性酵母。
     99. 项 80 的方法， 其中酵母载体来自选自以下组的酵母 ： 糖酵母， 裂殖酵母， 克鲁 维酵母， 汉逊酵母， 假丝酵母或毕赤酵母。
     100. 项 80 的方法， 其中糖酵母是酿酒酵母。
     附图简述
     图 1 是柱形图， 显示基于酵母的 Ras61-VAX 疫苗在体外控制预先存在的乌拉坦 (urethane) 诱导的肺部肿瘤。
     图 2 是柱形图， 显示当经皮下和鼻内途径给予时， 基于酵母的 RasV-VAX 疫苗提供 对抗肺部肿瘤生长的特异性保护。
     图 3 是柱形图， 显示当以鼻内给予方式而不是皮下给予方式给予时， 表达 Gag 的基 于酵母的疫苗能防护颅内肿瘤。
     图 4 是存活曲线图， 显示当经皮下和鼻内给予时， 表达 EGFR 的基于酵母的疫苗 (EGFR-tm VAX) 能防护表达 EGFR 的颅内肿瘤的攻击。 图 5 是柱形图， 显示接种表达乳腺肿瘤抗原的基于酵母的疫苗联合不引起骨髓重 度抑制的同种异体干细胞移植能防护肿瘤攻击。
     图 6 是柱形图， 显示接种表达黑色素瘤抗原的基于酵母的疫苗能防护表达该抗原 的黑色素瘤的肿瘤攻击。
     图 7 是用于本发明基于酵母的疫苗的各种突变 Ras 融合蛋白的构建示意图。
    发明内容 本发明涉及治疗和 / 或预防多种适用于免疫疗法的疾病和状态的组合物和方法， 一个具体实施例涉及治疗和 / 或预防动物癌症的组合物和方法。本发明包括使用包含酵母 载体和选择用来诱发动物抗原特异性细胞免疫反应和体液免疫反应的抗原的基于酵母的 疫苗， 用于预防性和 / 或治疗性接种以及预防和 / 或治疗多种疾病和状态。特别是， 发明人 在此描述了使用基于酵母的疫苗以在体内减小 (reduce) 多种不同形式癌症中的肿瘤， 包 括肺癌， 脑癌， 乳腺癌和肾癌。 本文还描述了对用于癌症治疗和各种免疫治疗方法和组合物 的基于酵母的疫苗的改进。
     发明人以前描述过能诱导有效的细胞介导免疫， 包括细胞毒性 T 细胞 (CTL) 反应 的疫苗技术。所述疫苗技术包括使用酵母及其衍生物作为疫苗载体， 其中酵母被改造成表 达相关抗原或者装载了相关抗原， 来诱发抗该抗原的免疫反应。US 5,830,463 概括描述了 这种技术并且全部引入本文作为参考。本发明采用了 US 5,830,463 中描述的现有酵母疫 苗技术， 并提供了对以下内容的具体改进 ： 一种使用酵母载体和挑选的癌抗原减轻癌症方 法， 包含具有提高的稳定性的新蛋白的新酵母疫苗， 和使用新酵母疫苗治疗任意疾病或状 态的方法， 对于这些疾病或状态诱发免疫反应可能具有治疗益处。对可用于本发明各个实 施例中的酵母疫苗的概括描述在未审结的系列申请 US09/991,363 中也有描述， 全部引入 本文作为参考。
     特别是， 本发明人发现虽然多种免疫途径对于在外周破坏肿瘤可能效果相当， 而 本发明所使用的基于酵母的疫苗能够致敏肺部独特的效应细胞。因此， 虽然其它给予途径 仍然有效， 将酵母疫苗经过呼吸道 ( 如鼻内， 吸入， 气管内 ) 给予能产生惊人的强免疫反应 和抗肿瘤效果， 这是迄今所研究的其它给予途径不能实现的。 特别是， 本发明人发现将酵母 疫苗施用到呼吸道对减小肺癌肿瘤的效果明显好于将该疫苗施用到外周的效果。 可能在脑 肿瘤中获得的结果甚至更惊人， 当将酵母疫苗施用到呼吸道时， 能在迄今所研究的全部试 验模型中诱导有效的抗肿瘤反应， 外周 ( 皮下 ) 给予疫苗对于诱导脑部抗肿瘤反应不太有 效， 并且在至少一个脑癌的试验模型中， 外周给予没能在脑部产生明显的抗肿瘤效果。因 此， 本发明的基于酵母的疫苗能致敏肺部独特的免疫效应细胞前体， 这种免疫细胞能特别 有效地通过血脑屏障， 影响颅内肿瘤的生长进程。 不被理论束缚， 本发明人相信免疫途径可 能是设计针对至少是脑部肿瘤和肺部肿瘤的有效疫苗的一个重要因素。 因为本发明的基于 酵母的疫苗能非常容易的应用于多种免疫途径， 所以该疫苗必将以迄今未被认识到的治疗 某些癌症的潜力， 唯一地激发高度特异性的免疫反应。
     本发明人还发现， 在 Luznik 等， (Blood 101(4) ： 1645-1652， 2003 ； 全部引入本文 作为参考 ) 先前描述的混合同种异体骨髓嵌合的一种新修改方案中使用本发明的酵母疫 苗， 能在体内极好地诱导治疗性免疫和抗肿瘤反应。 重要的是， 不需使用来自受者的全部肿 瘤制备物， 不需用生物学反应改良剂， 如粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 加强疫 苗， 不需使用常规的佐剂， 也能获得该结果。另外， 使用本发明的酵母载体在选择抗原和抗 原组合方面有极大的灵活性， 并能显著增强针对抗原的细胞免疫。 此外， 通过用本发明的酵 母疫苗以可控的、 选择性的方式免疫供体， 产生了额外的增强作用。 另外， 本发明人利用能稳定异源蛋白在酵母载体中的表达和 / 或防止所表达的异 源蛋白的翻译后加工的新的融合蛋白改进了基于酵母的疫苗技术。具体的， 本发明人在 此描述了一种在酵母中表达异源抗原的新构建体， 其中所需抗原性蛋白或肽的氨基末端 与下述物质融合 ： (a) 合成肽 ； 或 (b) 内源性酵母蛋白的至少一部分， 其中任一融合伙伴 (partner) 能显著增加蛋白在酵母中表达的稳定性和 / 或防止酵母细胞对蛋白的翻译后加 工。 融合肽还提供了设计用来为选择性物质， 如抗体识别的表位， 并且不会消极影响针对构 建体中的接种抗原的免疫反应。这种物质适用于鉴定、 筛选和纯化用于本发明的蛋白。
     另外， 本发明预计使用与抗原构建体 C 末端融合的肽， 特别用于筛选和鉴别蛋白。 这种肽包括， 但不限于任何合成的或天然的肽， 如肽标记 ( 如 6×His)， 或任何其它短表位 标记。根据本发明的附加在抗原 C 末端的肽， 可在添加或不添加如上所述 N 末端肽的情况 下使用。
     最后， 本发明人在此描述了用于提供来自相同构建体中一个或多个抗原的多个免 疫原性功能域的基于酵母的疫苗中的新融合蛋白抗原。 当希望在单一疫苗构建体中包含在 抗原的一个或几个位置天然发生的几个不同的突变和 / 或突变组合时， 这种融合蛋白特别 有用。例如， 已知 ras 基因家族的癌基因中有几个与天然肿瘤细胞表现型相关的不同突变。 发现在 78％的胰腺癌， 34％的结肠直肠癌， 27％的非小细胞肺癌和 24％的卵巢癌中， 编码 Ras 蛋白 12 位氨基酸的密码子发生突变。还发现多种癌症中在 13 位， 59 位和 61 位有不同 的突变。本发明人在此描述了采用基于酵母的疫苗的方法制备融合蛋白， 包括但不限于基 于 ras 突变的融合蛋白， 使得在相同的抗原疫苗内， 在相同的位置有几个突变和 / 或在一个
     以上的位置有不同的突变组合。
     作为本发明所使用的方法和组合物的概括描述， 此处所述的疫苗和方法将使 T 细胞高效活化的有效抗原传递整合在一个不需要附加的佐剂成分或生物调节剂的强效疫 苗制剂中。本文所述的疫苗具有许多使其成为理想疫苗候选物的其它属性， 包括但不限 于容易构建， 大批制备时费用低， 生物学稳定和安全。对小鼠， 大鼠， 兔， 豚尾猴 (Macaca nemestrina)， 猕猴或免疫缺陷 CB.17scid 小鼠， 以完整酵母进行初次免疫或重复给予时， 没有出现严重的不良反应 ( 观察结果未公布 )。此外， 如系列申请 US 09/991,363( 出处同 上 ) 所述， 酵母抗原复合物使树突细胞成熟为有效的抗原递呈细胞 (APCs)， 同时将抗原有 效传递到 MHC I 类和 MHC Ⅱ类加工途径的能力表明， 基于酵母的疫苗载体将提供一种有效 的诱导对抗多种传染性疾病和癌症靶的细胞介导免疫的有效策略。实际上， 本文所述的数 据以及基于酵母的疫苗技术的进步也证明了这个一般原则， 同时提供了对以前未被重视的 技术的重要改进。
     根据本发明， 酵母载体是可与本发明的疫苗或治疗性组合物中的抗原联合使用的 或作为佐剂使用的任意酵母细胞 ( 如全部的或完整的细胞 ) 或其衍生物 ( 见下文 )。因此 酵母载体包括， 但不限于， 活的完整的酵母微生物 ( 即， 具有其全部成分包括细胞壁的酵母 细胞 )， 灭活的 ( 死的 ) 完整的酵母微生物， 或其衍生物， 包括 ： 酵母原生质球 ( 即缺少细胞 壁的酵母细胞 )， 酵母胞质体 ( 即缺少细胞壁和细胞核的酵母细胞 )， 酵母空胞 ( 即缺少细 胞壁、 细胞核和细胞质的酵母细胞 )， 或亚细胞性酵母膜提取物或其级分 ( 以前也称作亚细 胞酵母颗粒 )。
     通常， 通过酶消化酵母细胞壁制备酵母原生质球。例如 Franzusoff 等， 1991， Meth.Enzymol.194， 662-674 描述了这种方法， 并全部引入本文作为参考。 通常， 通过从酵母 细胞摘除细胞核制备酵母胞质体。 例如 Coon， 1978， Natl.Cancer Inst.Monogr.48， 45-55 描 述了这种方法， 并全部引入本文作为参考。 通常如下制备酵母空胞， 重新密封经透化处理的 或溶解了的细胞， 并可以包含但不是必需包含该细胞的至少一些细胞器。例如 Franzusoff 等， 1983， J.Biol.Chem.258， 3608-3614 和 Bussey 等， 1979， Bioclaim.Biophys.Acta 553， 185-196 描述了这种方法， 每一个都全部引入本文作为参考。 亚细胞性酵母膜提取物或其级 分指缺少天然细胞核或细胞浆的酵母膜。该颗粒可以是任意大小， 包括从天然酵母膜的大 小到微颗粒的大小， 所述微颗粒是用超声处理或本领域技术人员已知的其它膜破裂方法， 随后重新密封制备的。制备亚细胞性酵母膜提取物的方法如 Franzusoff 等， 1991， Meth. Enzymol.194， 662-674 所述。还可使用酵母膜提取物级分， 它含有部分酵母膜， 并且在酵母 重组表达抗原时在制备酵母膜提取物之前含有目标抗原。
     可用任意酵母菌株制备本发明的酵母载体。酵母是单细胞微生物， 属于下述 三纲之一： 子 囊 菌 纲 (Ascomycetes)， 担 子 菌 纲 (Basidiomycetes) 和 半 知 菌 (Fungi Imperfecti)。虽然致病酵母菌株或其非致病突变体都可用于本发明， 但优选非致病 酵母菌株。优选酵母菌株的属包括糖酵母属， 假丝酵母属 ( 可能是致病的 )， 隐球菌属 (Cryptococcus)， 汉逊酵母属， 克鲁维酵母属， 毕赤酵母属， 红酵母属 (Rhodotorula)， 裂 殖酵母属和西洋蓍霉 (Yarrowia)， 更优选糖酵母属， 假丝酵母属， 汉逊酵母属， 毕赤酵母 属和裂殖酵母属， 特别优选糖酵母属。优选酵母菌株的种包括酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)， 卡 氏 酵 母 (Saccharomyces carlsbergensis)， 白 色 假 丝 酵 母 (Candidaalbicans)， 乳酒假丝酵母 (Candida kefyr)， 热带假丝酵母 (Candida tropicalis)， 罗伦 隐球菌 (Cryptococcus laurentii)， 新生隐球菌 (Cryptococcus neoformans)， 异常汉逊 酵母 (Hansenula anomala)， 多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)， 脆壁克鲁维酵母 (Kluyveromycesfragilis)， 乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)， 马克斯克鲁维酵母 乳酸变体 (Kluyveromyces marxianus var.lactis)， 巴氏毕赤酵母 (Pichia pastoris)， 深 红类酵母 (Rhodotorula rubra)， 栗酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) 和 Yarrowia lipolytica。应该知道许多这些菌种包括属于上述种的多种亚种， 型， 亚型等。更优选的 酵母种包括酿酒酵母， 白色假丝酵母 (C.albicans)， 多形汉逊酵母 (H.polymorpha)， 巴氏 毕赤酵母 (P.pastors) 和栗酒裂殖酵母 (S.pombe)。特别优选酿酒酵母， 因为它相对来说 容易操作并且用作食品添加剂 “通常被认为是安全的” (“GRAS” )(GRAS， FDA 提出的规则 62FR18938， 4 月 17， 1997)。本发明的一个实施例是能使质粒复制到相当高的拷贝数的酵母 株， 如酿酒酵母 cir° (S.cerevisiae cir) 株。
     一个实施例中， 本发明优选的酵母载体能与该酵母载体和抗原被传递到的细胞 ( 如树突细胞或巨噬细胞 ) 融合， 从而显著影响酵母载体的有效传递， 在很多实施例中是显 著影响酵母载体将抗原有效传递到细胞。本文中， 酵母载体与靶细胞的融合是指酵母细胞 膜， 或其颗粒与靶细胞 ( 如树突细胞或巨噬细胞 ) 膜融合， 形成合胞体的能力。本文中， 合 胞体是细胞合并产生的原生质多核团 (mass)。各种病毒表面蛋白 ( 包括免疫缺陷病毒， 如 HIV， 流感病毒， 脊髓灰质炎病毒和腺病毒的表面蛋白 ) 和其它促融剂 ( 如卵子和精子融合 时涉及的促融剂 ) 能影响两个膜之间的融合 ( 即病毒和哺乳动物细胞膜之间的融合或哺乳 动物细胞膜之间的融合 )。例如， 在其表面上产生 HIVgp120/gp41 异种抗原的酵母载体能 与 CD4+T- 淋巴细胞融合。然而要注意， 虽然在某些情况下需要将寻靶部分掺入到酵母载体 中， 但这不是必需的。本发明人以前证明了本发明的酵母载体很容易被树突细胞 ( 以及其 它细胞， 如巨噬细胞 ) 摄入。
     利用本领域技术人员已知的许多技术， 可以将酵母载体配制到本发明的组合物 中， 包括直接给予病人的制品或首先装入 (load) 载体中 ( 如树突细胞 ) 的制品。例如， 将 酵母载体暴露于液氮或干冰， 通过冻干或冷冻干燥酵母载体。 将酵母包装成块状或片状， 正 如将酵母用于烘焙或酿造操作时所做的， 也可制备含有酵母载体的配制剂。 另外， 在装入树 突细胞之前， 或与抗原以其它类型给予方式给予之前， 酵母载体可与药物可接受赋形剂， 如 宿主细胞耐受的等渗缓冲液混合。 这种赋形剂包括， 例如水， 盐水， 林格 (Ringer′ s) 溶液， 葡萄糖 (dextrose) 溶液， Hank′ s 液， 以及其它的含水生理平衡盐溶液。也可使用非水介 质， 如不挥发油， 芝麻油， 油酸乙酯， 或甘油三酯。其它的有用制剂包括含有增稠剂， 如羧甲 基纤维素钠， 山梨醇， 甘油或葡聚糖的悬液。赋形剂还可包含少量添加剂， 如增加等渗性和 化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液， 碳酸盐缓冲液和 Tris 缓冲液， 防腐 剂的例子包括硫柳汞， 间 (m-) 甲苯酚或邻 (o-) 甲苯酚， 福尔马林和苯甲醇。标准的配制剂 是可注射的液体或是能用合适的液体溶解为注射用悬液或溶液的固体。因此， 在非液体配 制剂中， 赋形剂包括， 例如葡萄糖， 人血清白蛋白， 和 / 或防腐剂， 在给予之前加入无菌水或 无菌盐水。
     本发明的治疗性组合物或疫苗的一个成分包括至少一种免疫接种动物的抗原。 所 述组合物或疫苗可根据需要包括， 一， 二， 几个， 一些或大量抗原， 所述抗原包括一个或多个抗原的一个或多个免疫原性功能域。根据本发明， 本文通常使用的术语 “抗原” 指天然存在 的或合成衍生的蛋白的任意部分 ( 肽， 部分蛋白， 全长蛋白 )， 细胞成分 ( 完整的细胞， 细胞 溶解物或破裂的细胞 )， 生物体 ( 完整生物体， 溶解的或破裂的细胞 ) 或碳水化合物或其它 分子， 或其部分， 其中抗原诱发抗原特异性免疫反应 ( 体液和 / 或细胞免疫反应 )， 或作为耐 受原， 针对在给予所述抗原的动物的细胞和组织内碰到的相同或相似抗原。
     本发明的一个实施例中， 当需要刺激免疫反应时， 术语 “抗原” 可与术语 “免疫原” 交换使用， 并用来描述诱发体液和 / 或细胞免疫反应的 ( 即， 是抗原性的 ) 蛋白， 肽， 细胞成 分， 生物体或其它分子， 因此给予动物免疫原 ( 例如， 通过本发明的疫苗 ) 可产生针对动物 组织中碰到的相同或相似抗原的抗原特异性免疫反应。 因此， 一个实施例中， 接种动物以对 抗特定抗原意味着给予该抗原的结果是诱发抗所述抗原的免疫反应。 优选免疫接种产生保 护效果或治疗效果， 其中随后暴露于抗原 ( 或抗原来源 ) 将诱发抗所述抗原的 ( 或来源的 ) 减轻或防止动物的疾病或状态的免疫反应。免疫接种的概念是本领域已知的。通过给予本 发明的治疗性组合物诱发的免疫反应可以是， 与不给予疫苗时比较， 免疫反应的任意方面 的任意可检测的变化 ( 例如， 细胞反应， 体液反应， 细胞因子的产生 )。
     另一实施例中， 当需要抑制抗指定抗原的免疫反应时， 抗原可包括耐受原。 根据本 发明， 耐受原用来描述以减轻或改变针对抗原的免疫反应的给予形式， 给予量或给予途径 提供的蛋白， 肽， 细胞成分， 生物体或其它分子， 优选与耐受原或表达或递呈这种耐受原的 细胞接触时， 基本无应答， 无反应性， 其它失活作用或清除免疫系统细胞。
     “接种抗原” 可以是免疫原或耐受原， 它是疫苗中所用的抗原， 诱发抗接种抗原的 生物学反应 ( 免疫反应的诱发， 耐受 )。
     指定抗原的免疫原性功能域可以是当给予动物时作为免疫原的包含至少一个表 位的抗原的任意部分 ( 即， 肽片段或亚单位 )。例如， 单个蛋白可包含多个不同的免疫原性 功能域。
     本文中表位定义为指定抗原中足够诱发免疫反应的单个免疫原性位置， 或指定抗 原中足够抑制， 消除或灭活免疫反应的单个耐受性位置。本领域技术人员知道 T 细胞表位 在大小和组成上与 B 细胞表位不同， 通过 MHC I 类途径递呈的表位不同于通过 MHC II 类途 径递呈的表位。抗原可以如单个表位一样小， 或稍大， 可包含多个表位。因此， 抗原的大小 可以是约 5-12 个氨基酸 ( 如， 肽 ) 一样小， 或像全长蛋白， 包括多体和融合蛋白， 嵌合蛋白， 完整细胞， 完整微生物或其部分 ( 如完整细胞的溶解物或微生物提取物 ) 一样大。另外， 抗 原包括可装入酵母载体或本发明的组合物的碳水化合物， 如癌细胞表达的碳水化合物。一 些实施例中 ( 即， 当酵母载体从重组核酸分子表达抗原时 )， 抗原是蛋白， 融合蛋白， 嵌合 蛋白， 或其片段， 而不是全细胞或微生物。一个优选实施例中， 抗原选自肿瘤抗原或传染性 疾病病原体抗原 ( 即病原体抗原 )。一个实施例中， 抗原选自病毒抗原， 过表达哺乳动物细 胞表面分子， 细菌抗原， 真菌抗原， 原生动物抗原， 蠕虫抗原， 外寄生虫抗原， 癌抗原， 带有一 个或多个突变氨基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋 白， 通过插入流行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的 蛋白， 以及通过调节序列的突变而被诱导表达的蛋白。
     根据本发明， 适合用在本发明组合物或疫苗的抗原可包括来自相同抗原的两个或 多个免疫原性功能域或表位， 来自相同细胞， 组织或生物体的两个或多个抗原免疫原性功能域或表位， 或来自不同细胞， 组织或生物体的两个或多个不同抗原， 免疫原性功能域或表 位。优选抗原是与酵母菌株异源的 ( 即， 并非是在不进行遗传或生物学操作时， 酵母菌株天 然产生的蛋白 )。
     本发明的一个实施例涉及用作本发明疫苗的抗原的几个改良的蛋白。具体的， 本 发明提供了能稳定异源蛋白在酵母载体中的表达和 / 或防止所表达的异源蛋白的翻译后 加工的新的融合蛋白构建体。通常， 这些融合蛋白多数由酵母载体以重组蛋白的形式表达 ( 例如， 通过完整的酵母或酵母原生质球， 它任选的进一步处理成酵母胞质体， 酵母空胞或 酵母膜提取物或其片段 )， 一个或多个这种融合蛋白可以装入酵母载体或与上述构成本发 明疫苗的酵母载体复合或混合， 这只是本发明的一个实施例。
     用于本发明的一个这种融合构建体是融合蛋白， 包含 ： (a) 至少一种抗原 ( 包括全 长抗原的免疫原性功能域和抗原表位， 以及本文其它部分所描述的各种融合蛋白和多抗原 构建体 ) ； 和 (b) 合成肽。所述合成肽优选与癌抗原的 N 末端连接。该肽由至少两个与癌 抗原异源的氨基酸残基组成， 且所述肽能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的 融合蛋白的翻译后加工。合成肽和抗原的 N 末端部分一起形成满足下列要求的融合蛋白 ： (1) 融合蛋白位置 1 的氨基酸残基是甲硫氨酸 ( 即合成肽的第一个氨基酸是甲硫氨酸 ) ； (2) 融合蛋白位置 2 的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸 ( 即合成肽的第二个氨基酸不是甘 氨酸或脯氨酸 ) ； (3) 融合蛋白位置 2-6 的氨基酸残基都不是甲硫氨酸 ( 即所述蛋白或合成 肽的一部分的位置 2-6 的氨基酸， 条件是合成肽少于 6 个氨基酸， 都不包括甲硫氨酸 ) ； (4) 融合蛋白位置 2-5 的氨基酸残基都不是赖氨酸或精氨酸 ( 即所述蛋白或合成肽的一部分的 位置 2-5 的氨基酸， 条件是所述合成肽少于 5 个氨基酸， 都不包括赖氨酸或精氨酸 )。合成 肽可以只有两个氨基酸， 但更优选至少有 2-6 个氨基酸 ( 包括 3， 4， 5 个氨基酸 )， 可以比 6 个氨基酸长， 总长直至约 200 个氨基酸。
     一个实施例中， 所述肽包含 M-X2-X3-X4-X5-X6 的氨基酸序列， 其中 M 是甲硫氨酸 ； X2 是除甘氨酸， 脯氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X3 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和 精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X4 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； X5 是除甲硫氨酸， 赖氨酸和精氨酸之外的任意一种氨基酸 ； 和 X6 是除甲硫氨酸之外的任意 一种氨基酸。一个实施例中， X6 残基是脯氨酸。增强抗原在酵母细胞中表达的稳定性和 / 或防止蛋白在酵母中的翻译后加工的示例性合成序列包含 M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO ： 1) 的 序列。除了增强表达产物的稳定性， 本发明人相信这个融合伙伴不会消极影响抗构建体中 接种抗原的免疫反应。 此外， 合成的融合蛋白可被设计成提供为选择性物质， 如抗体识别的 表位。
     根据本发明， “异源氨基酸” 指不是天然发现的 ( 即不是在自然界和体内发现的 ) 特定氨基酸序列侧翼的氨基酸序列， 或与特定氨基酸序列的功能不相关的氨基酸序列， 或 当基因中出现位于编码特定氨基酸序列的天然存在核酸序列的侧翼的核苷酸时， 不应由该 核苷酸编码的氨基酸序列， 条件是在天然存在的序列中的此核苷酸是采用衍生指定氨基酸 序列的生物体所使用的标准密码子翻译的。因此， 与癌抗原异源的至少两个氨基酸残基是 任意两个不天然存在于癌抗原侧翼的氨基酸残基。
     本发明的另一个实施例涉及一种融合蛋白， 包含 (a) 至少一种抗原 ( 包括全长抗 原的免疫原性功能域和表位， 以及本文其它部分所描述的各种融合蛋白和多抗原构建体 )，并与 (b) 内源酵母蛋白的至少一部分融合。内源酵母蛋白优选与癌抗原的 N 末端融合， 并 显著增强蛋白在酵母中表达的稳定性和 / 或防止酵母细胞对蛋白的翻译后加工。另外， 内 源酵母抗原与合成肽的这种融合伙伴不会消极影响抗构建体中接种抗原的免疫反应。 已能 获得或很容易制备选择性结合内源抗原的抗体。最后， 如果需要将蛋白定位到具体的细胞 位置 ( 例如， 进入分泌途径， 进入线粒体， 进入细胞核 )， 那么构建体可使用酵母蛋白的内源 信号， 以确保细胞结构最适于传递系统。
     内源酵母蛋白由内源酵母蛋白的约 2 个至约 200 个氨基酸组成 ( 或最多 22kDa)， 所述酵母蛋白能稳定酵母载体中融合蛋白的表达或防止所表达的融合蛋白的翻译后加 工。任何适合的内源酵母蛋白都可用于这个实施例， 特别优选包括但不限于下述的蛋白， SUC2( 酵母转化酶 ； 这是一个良好的候选物， 因为它能在胞质 (cytosolically) 表达蛋白或 将蛋白引入来自相同启动子的分泌途径， 但依赖于培养基的碳源 ) ； α 因子信号前导序列 ； SEC7 ； CPY ； 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 PCK1 ； 磷酸甘油激酶 PGK 和磷酸丙糖异构酶 TPI 基因产 物， 因为在葡萄糖中的抑制性表达和胞质定位 ； Cwp2p， 因为它在细胞壁中分布和贮留 ； 热 休克蛋白 SSA1， SSA3， SSA4， SSC1 和 KAR2， 对细胞进行热处理能诱导这些蛋白的表达并使这 些蛋白更加耐热 ； 线粒体蛋白 CYC1， 因为它能进入线粒体 ； BUD 基因， 因为在子细胞形成的 初始期， 它位于酵母细胞芽 ； ACT1， 因为它锚定在肌动蛋白束上。
     一个实施例中， 内源酵母蛋白 / 肽或合成肽包含用于鉴定和纯化融合蛋白的抗体 表位。优选， 获得或制备可选择性结合融合伙伴的抗体。根据本发明， 术语 “选择性结合” 指 本发明的抗体， 抗体结合片段或结合伙伴优先结合特定蛋白的能力。更具体的， 术语 “选择 性结合” 指一个蛋白与另一个蛋白 ( 例如针对抗原的抗体， 其片段， 或结合伙伴 ) 的特异性 结合， 当通过任何标准试验 ( 例如， 免疫测定法 ) 测量时， 其结合水平统计学上显著高于试 验的背景对照。例如， 当进行免疫测定时， 对照通常包括含有抗体或仅仅抗原结合片段 ( 即 缺少抗原 ) 的反应孔 / 反应试管， 其中缺少抗原时抗体或其抗原结合片段的反应量 ( 例如， 与孔的非特异性结合 ) 作为背景。测量结合可采用各种现有技术中的标准化方法， 包括酶 免疫测定 ( 例如， ELISA)， 免疫印迹测定， 等。
     抗体的特征是含有免疫球蛋白功能域， 并因此是蛋白的免疫球蛋白超家族的成 员。本发明的分离的抗体可包括含有这种抗体的血清， 或已纯化到不同程度的抗体。本发 明的完整抗体可以是多克隆的或单克隆的。 或者， 本发明还可使用完整抗体的功能等价体， 如其中一个或多个抗体功能域被截短或缺失的抗原结合片段， ( 例如， Fv， Fab， Fab′， 或 F(ab)2 片段 )， 以及遗传改造的抗体或其抗原结合片段， 包括单链抗体或与超过一个表位结 合的抗体 ( 例如双特异性抗体 )， 或与一个或多个不同抗原结合的抗体 ( 例如， 双特异性或 多特异性抗体 )。
     通常， 制备抗体时， 将合适的试验动物， 例如但不限于， 兔， 绵羊， 仓鼠， 荷兰猪， 小 鼠， 大鼠， 或鸡暴露于所需抗体针对的抗原。通常， 用有效量的注射到动物内的抗原免疫动 物。抗原的有效量指诱导动物产生抗体所需的量。动物的免疫系统随后经过一段预设时间 后发生反应。可以重复进行免疫过程直到发现免疫系统制备针对抗原的抗体。为了获得抗 原特异性多克隆抗体， 从动物收集含有所需抗体的血清 ( 或如果动物是鸡的情况时， 可从 蛋中收集抗体 )。 这种血清可用作试剂。 通过， 例如用硫酸铵处理血清， 可以从血清 ( 或蛋 ) 进一步纯化多克隆抗体。单克隆抗体可根据 Kohler 和 Milstein(Nature 256 ： 495-497， 1975) 的方法制备。 例如， 从免疫动物脾脏 ( 或任何合适组织 ) 收集 B 淋巴细胞， 然后与骨髓瘤细胞融合， 获得 在适合培养基中能连续生长的杂交瘤细胞群。 通过检测杂交瘤所产生的抗体与所需抗原结 合的能力， 来筛选产生所需抗体的杂交瘤。
     本发明还扩展到有时称作结合伙伴的非抗体多肽， 它被设计成特异性结合本发明 的蛋白， 并且根据需要激活或抑制本发明的蛋白。具有规定的配体特异性的这种多肽的设 计实例见 Beste 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.96 ： 1898-1903， 1999)， 全部引入本文作为参考。
     本发明另一个实施例中， 疫苗的抗原部分制备成含有两个或多个抗原的融合蛋 白。一方面， 融合蛋白可包含一个或多个抗原的两个或多个免疫原性功能域或两个或多个 表位。 在一个特别优选的实施例中， 融合蛋白包含抗原的两个或多个免疫原性功能域， 优选 多个功能域， 其中多个功能域共同拥有在抗原的一个或几个位置天然发生的几个不同突变 和 / 或突变组合。这对提供一种针对非常特异性抗原的疫苗特别有利， 已知所述抗原在多 种病人中发生不定的突变。这种疫苗可对广泛范围的病人提供抗原特异性免疫。例如， 用 于本发明的多个功能域融合蛋白可具有多个功能域， 其中每个功能域由来自特定蛋白的肽 组成， 所述肽由蛋白任意一侧的至少 4 个氨基酸残基组成， 并包括所述蛋白中发现的突变 氨基酸组成， 所述突变与特定疾病 ( 例如， 癌症 ) 相关联。 Ras 是癌基因的一个实例， 已知其中的一些突变发生在特定位置并且与一种或多 种类型癌症的发展相关联。因此， 可以购建由含有已知在某种癌症中发生突变的特定残基 的肽组成的融合蛋白， 其中每个功能域包含在那个位置的不同突变以便涵盖那个位置已知 的几个或全部突变。 例如， 关于 Ras， 可以提供含有任意一侧至少 4 个氨基酸， 包括 12 位的氨 基酸的免疫原性功能域， 其中每个功能域具有非突变 Ras 蛋白中正常发生的对甘氨酸的不 同取代。 一个实施例中， 癌抗原包含片段， 所述片段含有对应于野生型 Ras 蛋白位置 12， 13， 59， 或 61 的氨基酸的野生型 Ras 蛋白的至少 5-9 个连续氨基酸残基， 其中位置 12， 13， 59， 或 61 的氨基酸残基相对于野生型 Ras 蛋白发生了突变。一方面， 融合蛋白构建体由至少一个 与其它突变肿瘤抗原在阅读框内融合的肽组成 ( 例如， 含有至少一个相对于野生型 Ras 蛋 白序列的突变的 Ras 蛋白 )， 其中所述肽选自以下组 ： (a) 一种肽， 其至少含有 SEQ IDNO ： 3 位置 8-16 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基发生了突变 ； (b) 一种肽， 其至少含 有 SEQ ID NO ： 3 位置 9-17 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 13 的氨基酸残基发生了突变 ； (c) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 55-63 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 59 的氨基酸残 基发生了突变 ； 和 (d) 一种肽， 其至少含有 SEQ ID NO ： 3 位置 57-65 的肽， 其中 SEQ ID NO ： 3 位置 61 的氨基酸残基发生了突变。注意， 这些位置也对应于 SEQ ID Nos ： 5， 7， 9， 11 或 13 的任一， 因为人和小鼠的序列在蛋白的这个区域是同一的， 并且 K-Ras， H-Ras 和 N-Ras 在这 个区域也是同一的。
     特别适用于本发明这种策略的其它抗原对本领域技术人员是显而易见的， 包括但 不限于 ： 任意癌基因， TP53( 也称作 p53)， p73， BRAF， APC， Rb-1， Rb-2， VHL， BRCA1， BRCA2， AR( 雄激素受体 )， Smad4， MDR1， 和 / 或 Flt-3。
     本发明的一个实施例中， 本文所描述的任一氨基酸序列可从至少一个至约 20 个 附加的、 异源的、 位于特定氨基酸序列 C 端和 / 或 N 端侧翼的氨基酸制备。获得的蛋白或多 肽可被称作 “基本含有” 特定氨基酸序列。如上所讨论的， 根据本发明， 异源氨基酸指不是
     天然发现的 ( 即不是在自然界和体内发现的 ) 位于特定氨基酸序列侧翼的氨基酸序列， 或 与特定氨基酸序列的功能不相关的氨基酸序列， 或当基因中出现位于编码特定氨基酸序列 的天然存在核酸序列的侧翼的核苷酸时， 不应由所述核苷酸编码的氨基酸序列， 条件是在 天然存在的序列中的所述核苷酸是采用衍生指定氨基酸序列的生物体所使用的标准密码 子翻译的。类似的， 术语 “基本含有” ， 当用于本文的核酸序列时， 指编码特定氨基酸序列的 核酸序列， 它侧接于编码特定氨基酸序列的核酸序列的 5′和 / 或 3′端的每端的至少一个 至约 60 个附加的异源核苷酸。 异源核苷酸不是天然发现 ( 即不是在自然界和体内发现的 ) 出现在天然基因中时位于编码特定氨基酸序列的核酸序列的侧翼， 或不编码赋予蛋白任意 额外功能或改变具有特定氨基酸序列的蛋白的功能的蛋白。
     用于本发明的肿瘤抗原可包括肿瘤抗原， 如来自肿瘤细胞的蛋白， 糖蛋白或表面 碳水化合物， 来自肿瘤抗原的表位， 全肿瘤细胞， 肿瘤细胞混合物， 及其部分 ( 例如， 溶解 物 )。 一个实施例中， 用于本发明的肿瘤抗原可从自体的肿瘤样本中分离或衍生得到。 自体 肿瘤样本来自给予了治疗性组合物的动物。因此， 癌症中将存在要诱发的免疫反应所针对 的的抗原。 一方面， 疫苗提供的肿瘤抗原从至少两个， 优选从相同组织学肿瘤类型的多个同 种异体肿瘤样本分离或衍生得到。根据本发明， 多个同种异体肿瘤样本是从同物种的两个 或多个动物中分离的相同组织学肿瘤类型的肿瘤样本， 所述动物至少在主要组织相容性复 合物 (MHC) 方面有遗传学差异， 通常在其它基因位置有遗传学差异。因此， 如果一起给予， 多个肿瘤抗原可以代表衍生出抗原的任意个体中出现的基本全部肿瘤抗原。 本发明方法的 这个实施例提供了一种疫苗， 所述疫苗补偿了个体病人在表达相同组织学肿瘤类型的肿瘤 的肿瘤抗原上的天然变异。因此， 给予这种治疗性组合物能有效诱发抗各种肿瘤抗原的免 疫反应， 因此相同的治疗性组合物可以给予各种不同的个体。 一些实施例中， 可给予动物来 自不同组织学肿瘤类型的肿瘤的抗原， 以提供一种非常广泛的疫苗。
     优选， 从中分离或衍生获得抗原的肿瘤是任意肿瘤或癌， 包括但不限于， 黑色素 瘤， 鳞状细胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢 癌， 膀胱癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤， 血管肉瘤， 肥大细胞癌， 早期肝癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠 癌， 肾细胞癌， 造血细胞瘤形成和转移癌。可用于本发明疫苗的具体癌抗原的例子， 包括但 不限于 ： MAGE( 包括但不限于 MAGE3， MAGEA6， MAGEA10)， NY-ESO-1， gp100， 酪氨酸酶， EGF-R， PSA， PMSA， CEA， HER2/neu， Muc-1， hTERT， MART1， TRP-1， TRP-2， BCR-abl， 和 p53 的突变癌基 因形式 (TP53)， p73， ras， BRAF， APC( 腺瘤结肠息肉 )， myc， VHL(von Hippel′ s Lindau 蛋 白 )， Rb-1( 视网膜母细胞瘤 )， Rb-2， BRCA1， BRCA2， AR( 雄激素受体 )， Smad4， MDR1， Flt-3。
     根据本发明， 癌抗原可包括上述任意肿瘤抗原， 以及与癌症获得或发展的可能性 相关的任意其它抗原， 或抗该抗原的免疫反应对癌症有治疗益处的任意其它抗原。 例如， 癌 抗原包括但不限于， 肿瘤抗原， 带有一个或多个突变氨基酸的哺乳动物细胞分子， 出生前或 刚出生时哺乳动物细胞正常表达的蛋白， 通过插入流行病学因子 ( 如病毒 ) 而被诱导表达 的蛋白， 通过基因易位而被诱导表达的蛋白， 以及通过调节序列的突变而被诱导表达的蛋 白。一些这种抗原也可作为其它类型疾病 ( 例如自身免疫性疾病 ) 的抗原。
     本发明的一方面， 用于本发明组合物的抗原是来自病原体 ( 包括完整病原体 ) 的 抗原， 特别是来自与传染性疾病相关联 ( 例如， 导致或促成 ) 的病原体。来自传染性疾病病 原体的抗原可包括具有被 T 细胞识别的表位的抗原， 或具有被 B 细胞识别的表位的抗原， 由病原体唯一性表达的抗原， 以及由病原体和其它细胞表达的抗原。病原体抗原可包括完整 的细胞和整个病原生物体， 及其溶解物， 提取物或其它级分。某些情况中， 抗原可包括通常 不认为是对动物致病的， 但针对它的免疫接种是需要的生物体或其部分。 抗原可包括一个， 两个或多个抗原， 它们代表了给予的疫苗所针对的传染性疾病病原体中存在的基本全部的 抗原。其它实施例中， 可使用来自相同病原体的两个或多个不同菌株的抗原或来自不同病 原体的抗原， 以增加疫苗的治疗效果和 / 或效力。
     根据本发明， 病原体抗原包括， 但不限于， 由细菌， 病毒， 寄生虫或真菌表达的抗 原。优选用于本发明方法的病原体抗原包括引起动物慢性传染性疾病的抗原。一个实施例 中， 用于本发明方法或组合物的病原体抗原包括来自病毒的抗原。用于本发明疫苗的病毒 抗原的例子包括， 但不限于， env， gag， rev， tar， tat， 免疫缺陷病毒 ( 例如 HIV， FIV) 的核衣 壳蛋白和逆转录酶 ； HBV 表面抗原和核心抗原 ； HCV 抗原 ； 流感病毒核衣壳蛋白 ； 副流感病 毒核衣壳蛋白 ； 人乳头瘤 16 型的 E6 和 E7 蛋白 ； EB 病毒 LMP-1， LMP-2 和 EBNA-2 ； 疱疹 LAA 和糖蛋白 D ； 以及来自其它病毒的类似蛋白。特别优选用于本发明的抗原包括， 但不限于， HIV-1gag， HIV-1env， HIV-1poi， HIV-1tat， HIV-1nef， HbsAG， HbcAg， 丙型肝炎核心抗原， HPV E6 和 E7， HSV 糖蛋白 D， 和炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis) 保护性抗原。
     包括在本发明组合物 ( 疫苗 ) 中的其它优选抗原包括能抑制不需要的， 或有害的 免疫反应， 如由例如变应原， 自身免疫抗原， 炎性物质引起的免疫反应的抗原 ； GVHD， 某些癌 症中涉及的抗原， 感染性休克抗原， 和移植排斥涉及的抗原。这种化合物包括， 但不限于， 抗组胺剂， 环孢菌素， 皮质激素， FK506， 与产生有害免疫反应所涉及的 T 细胞受体对应的蛋 白， Fas 配体 ( 即， 与细胞 Fas 受体的胞外区或胞质区结合， 从而诱导细胞凋亡的化合物 )， 以影响耐受或无反应性的方式递呈的适合的 MHC 复合物， T 细胞受体， 和自身免疫抗原， 优 选与能增强或抑制细胞和 / 或体液免疫的生物学反应调节剂联合。
     用于本发明的其它抗原和抗原组合对本领域技术人员是显而易见的。 本发明并不 局限于使用如上描述的抗原。
     根据本发明， 术语 “酵母载体 - 抗原复合物” 或 “酵母 - 抗原复合物” 通常用来描 述酵母载体和抗原的任意联系。这种联系包括酵母 ( 重组酵母 ) 表达抗原， 将抗原引入酵 母， 抗原与酵母的物理结合， 和将酵母和抗原一起混合在如缓冲液或其它溶液或配制剂中。 下文中详细描述了这些类型的复合物。
     一个实施例中， 用编码抗原的异源核酸分子转化用来制备酵母载体的酵母细胞， 使酵母细胞表达所述抗原。这种酵母在本文中也称作重组酵母或重组酵母载体。酵母细胞 随后作为完整细胞被装入树突细胞， 或酵母细胞被杀死， 或可衍生如形成酵母原生质球， 胞 质体， 空胞， 或亚细胞颗粒， 上述任一随后都被装入树突细胞。也可用重组核酸分子直接转 染酵母原生质球 ( 例如， 从完整的酵母制备原生质球， 然后转染 )， 以制备表达抗原的重组 原生质球。
     根据本发明， 分离的核酸分子或核酸序列是与其天然环境分离的核酸分子或核酸 序列。因此， “分离的” 不能必然地反映核酸分子的纯化程度。用于转染酵母载体的分离的 核酸分子包括 DNA， RNA， 或 DNA 或 RNA 的衍生物。分离的核酸分子可以是双链或单链。用 于本发明的分离的核酸分子包括编码蛋白或其片段的核酸分子， 只要所述片段包含至少一 个用于本发明组合物的抗原表位。转化到本发明酵母载体中的核酸分子包含编码一个或多个蛋白或其部分的核酸 序列。这种核酸分子可包括部分或全部编码区， 调节区， 或其组合。酵母菌株的一个优点是 携带许多核酸分子的能力以及能够产生许多异源蛋白。优选本发明酵母载体所产生的抗 原的数量是酵母载体所能适当产生的抗原的任意数量， 通常从至少一个到至少约 5 个或更 多， 优选从约 2 个至约 5 个化合物。
     酵母载体中的核酸分子编码的肽或蛋白可以是全长蛋白， 或是功能等价蛋白， 其 中氨基酸被删除 ( 例如截短的蛋白 )， 插入， 倒置， 取代和 / 或衍生 ( 例如乙酰化， 糖基化， 磷 酸化， 被磷脂酰甘油肌醇 (GPI) 锚定蛋白束缚 )， 使经修饰的蛋白与天然蛋白的生物学功能 基本相似 ( 或如果需要， 与天然蛋白比较， 修饰蛋白具有增强的或被抑制的功能 )。可用现 有技术中已知的技术进行修饰， 所述技术包括， 但不限于， 直接修饰蛋白或用， 例如标准或 重组 DNA 技术影响随机突变或定向诱变来修饰编码蛋白的核酸序列。用测量蛋白生物活性 的试验筛选功能等价蛋白。
     用本领域技术人员已知的技术实现本发明酵母载体中抗原的表达。简单来说， 将 编码至少一个所需抗原的核酸分子， 以核酸分子与转录控制序列可操作连接的方式插入表 达载体， 以便当转化到宿主酵母细胞时， 能够影响核酸分子的组成型表达或可调型表达。 编 码一个或多个抗原的核酸分子可以是与一个或多个转录控制序列可操作连接的一个或多 个表达载体。
     本发明的重组分子中， 核酸分子与表达载体可操作连接， 所述表达载体包含调节 序列， 如转录控制序列， 翻译控制序列， 复制起始点， 和与酵母细胞相容并控制核酸分子表 达的其它调节序列。特别是， 本发明的重组分子包括与一个或多个转录控制序列可操作连 接的核酸分子。术语 “可操作连接” 指将核酸分子与转录控制序列连接， 使得当转染 ( 即， 转化， 转导或转染 ) 到宿主细胞时， 该分子能够被表达。
     控制所产生的蛋白的量的转录控制序列包括控制转录起始， 延伸和终止的序列。 特别重要的转录控制序列是控制转录起始的序列， 如启动子和上游激活序列。任何适合 的酵母启动子都可用于本发明， 并且多种这种启动子是本领域技术人员已知的。用于在 酿酒酵母中表达的优选启动子包括， 但不限于， 编码下述酵母蛋白的基因的启动子 ： 醇脱 氢酶 I(ADH1) 或 II(ADH2)， CUP1， 磷酸甘油酸酯激酶 (PGK)， 磷酸丙糖异构酶 (TPI)， 甘油 醛 -3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH ； 也叫做 TDH3， 指磷酸丙糖脱氢酶 )， 半乳糖激酶 (GAL1)， 半乳 糖 -1- 磷酸尿苷酰转移酶 (GAL7)， UDP- 半乳糖差向异构酶 (GAL10)， 细胞色素 c 1(CYC1)， Sec7 蛋白 (SEC7)， 和酸性磷酸酶 (PHO5)， 更优选如 ADH2/GAPDH 和 CYC 1/GAL 10 的杂合 启动子， 甚至更优选当细胞中葡萄糖浓度较低 ( 如， 约 0.1％至 0.2％ ) 时被诱导的 ADH2/ GAPDH 启动子。同样， 很多上游激活序列 (UASs)， 也称作增强子， 也是已知的， 用于在酿酒酵 母中表达的优选的上游激活序列包括， 但不限于， 编码下述蛋白的基因的 UASs ： PCK1， TPI， TDH3， CYC1， ADH1， ADH2， SUC2， GAL1， GAL7 和 GAL10， 以及由 GAL4 基因产物激活的其它 UASs， 特别优选 ADH2UAS。因为 ADH2UAS 被 ADR1 基因产物激活， 当异源基因与 ADH2UAS 可操作连 接时， 优选过表达 ADR1 基因。用于在酿酒酵母中表达的优选的转录终止序列包括 α- 因 子， GAPDH 和 CYC1 基因的终止序列。在甲基营养酵母中表达基因的优选的转录控制序列包 括编码醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录控制区。
     核酸分子对本发明酵母细胞的转染可通过将核酸分子引入细胞的任意方法来实现， 所述方法包括， 但不限于， 扩散， 主动转运， 超声波浴， 电穿孔， 显微注射， 脂质转染， 吸 附， 和原生质体融合。用本领域技术人员已知的方法可以将转染的核酸分子整合到酵母染 色体中或保留在染色体外的载体上。本文详细描述了带有这种核酸分子的酵母载体的例 子。如上所述， 酵母胞质体， 酵母空胞， 和亚细胞性酵母膜提取物或其级分也可如下所述重 组制备 ： 用所需的核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球， 在其中产生抗原， 然后 用本领域技术人员已知的技术进一步处理微生物或原生质球， 以制备含有所需抗原的胞质 体， 空胞或亚细胞性酵母膜提取物或其级分。
     制备重组酵母载体和酵母载体表达抗原的有效条件包括能培养酵母菌株的有效 培养基。通常有效培养基是含有可同化的碳水化合物源， 氮源和磷酸盐， 以及适宜的盐， 矿 物质， 金属和其它营养素， 如维生素和生长因子的含水的培养基。 培养基可包含复合营养素 或是确定的极限培养基。 本发明的酵母菌株可以培养在各种容器中， 包括但不限于， 生物反 应器， 锥形烧瓶， 试管， 微量滴定皿和培养皿 (Petri dish)。在适合酵母菌株的温度， pH 和 氧浓度条件下进行培养。 这种培养条件是本领域技术人员的专业知识 ( 参见， 例如 Guthrie 等 (eds.)， 1991， Methods in Enzymology， vol.194， Academic Press， San Diego)。
     本发明一个实施例中， 作为酵母载体重组表达抗原的另一种情况， 用酵母载体在 细胞内装载蛋白抗原或肽抗原， 或用碳水化合物或其它作为抗原的分子。 随后， 将现在细胞 内含有抗原的酵母载体给予病人或装入如树突细胞的载体 ( 下文描述 )。如本文所用， 肽 含有少于或等于约 30-50 个氨基酸的氨基酸序列， 蛋白含有超过约 30-50 个氨基酸的氨基 酸序列 ； 蛋白可以是多嵌合的。用作抗原的蛋白或肽可以如 T 细胞表位一样小 ( 即长度超 过 5 个氨基酸 )， 也可是超过包含多表位的蛋白， 蛋白片段， 全长蛋白， 嵌合蛋白或融合蛋白 长度的任意合适大小。可以天然地或合成地衍生蛋白和肽 ； 这种修饰包括， 但不限于， 糖基 化， 磷酸化， 乙酰化， 十四烷基化， 异戊二烯化， 棕榈酰化， 酰胺化和 / 或附加磷脂酰甘油肌 醇。通过本领域技术人员已知的技术可以将肽和蛋白直接插入本发明的酵母载体， 例如通 过扩散， 主动转运， 脂质融合， 电穿孔， 吞噬作用， 冻融循环和超声波浴。可直接装载肽， 蛋 白， 碳水化合物， 或其它分子的酵母载体包括在制备之后， 但在装入树突细胞之前装载了抗 原的完整酵母， 以及原生质球， 空胞或胞质体。 或者， 用装载了抗原的完整酵母， 然后由此制 备原生质球， 空胞， 胞质体或亚细胞颗粒。这个实施例中， 酵母载体中可装入任意数量的抗 原， 从至少 1， 2， 3， 4 或直至总数为数百或数千的抗原， 正如通过装载微生物， 装载哺乳动物 肿瘤细胞， 或其部分所提供。
     本发明另一个实施例中， 抗原与酵母载体物理结合。抗原与酵母载体的物理结合 可通过现有技术中任何适合的方法， 包括共价和非共价结合方法来实现， 所述共价和非共 价连接方法包括， 但不限于， 将抗原化学交联到酵母载体的外表面或通过， 例如使用抗体或 其它结合伙伴将抗原与酵母载体的外表面生物连接。化学交联可通过例如下述方法完成 ： 包括戊二醛连接， 光亲和性标记， 碳化二亚胺处理， 用能连接二硫键的化学制剂处理， 用现 有技术中其它标准交联化学制剂处理。或者， 化学制剂与酵母载体接触， 改变酵母膜脂质 双层的电荷或细胞壁的组成， 使酵母的外表面更容易与具有特定电荷特征的抗原融合或结 合。 寻靶物质， 如抗体， 结合肽， 可溶性受体， 和其它配体也可掺入抗原作为融合蛋白或者与 抗原结合来使抗原与酵母载体结合。
     另一实施例中， 通过一种较被动的， 非特异性或非共价结合机制， 如通过将酵母载体和抗原一起轻柔地混合在缓冲液或其它适合的配制剂中， 使酵母载体和抗原彼此结合。
     本发明一个实施例中， 酵母载体和抗原都在细胞内被装入， 如树突细胞和巨噬细 胞的载体， 形成本发明的治疗性组合物或疫苗。下文详细讨论了在其中进行装载两种成分 的各种形式。本文所用的术语 “装载” 及其派生词指将成分 ( 例如， 酵母载体和 / 或抗原 ) 插入， 引入或进入细胞 ( 例如， 树突细胞 )。在细胞内装载成分指将成分插入或引入细胞的 细胞内区室 ( 例如， 通过质膜并至少进入细胞浆， 吞噬体， 溶酶体， 或细胞的一些细胞内空 间 )。将成分装入细胞可参考任意技术， 通过所述技术， 成分被强制进入细胞 ( 例如通过电 穿孔 ) 或被放置在环境中 ( 例如， 与细胞接触或临近细胞 )， 在此处经过一些过程 ( 例如吞 噬作用 ) 成分将基本进入细胞。装载技术包括， 但不限于， 扩散， 主动转运， 脂质体融合， 电 穿孔， 吞噬作用， 和超声波浴。一个优选实施例中， 采用被动机制用装载了酵母载体和 / 或 抗原的树突细胞， 这种被动机制包括树突细胞对酵母载体和 / 或抗原的吞噬作用。
     本发明一个实施例中， 疫苗组合物还可包括生物反应修饰化合物， 或产生这种修 饰物的能力 ( 即， 通过用编码这种修饰物的核酸分子转染 )， 虽然这种修饰物对获得本发明 的强免疫反应不是必需的。例如， 可用至少一种抗原和至少一个生物反应修饰物转染或装 载入酵母载体。生物反应修饰物是能调节免疫反应的化合物。一些生物反应修饰物能刺激 保护性免疫反应， 而另一些能抑制有害免疫反应。一些生物反应修饰物优先增强细胞介导 的免疫反应， 而另一些优先增强体液免疫反应 ( 即能刺激免疫反应， 其中与体液免疫反应 比较， 细胞免疫水平提高， 或反之亦然 )。本领域技术人员已知许多技术来测量免疫反应的 刺激或抑制， 以及从体液免疫反应中区分细胞免疫反应。 适合的生物反应修饰物包括细胞因子， 激素， 脂质衍生物， 小分子药物和其它生 长调节剂， 例如但不限于， 白介素 2(IL-2)， 白介素 4(IL-4)， 白介素 10(IL-10)， 白介素 12(IL-12)， γ 干扰素 (IFN-γ)， 胰岛素样生长因子 I(IGF-1)， 转化生长因子 β(TGF-β)， 类固醇， 前列腺素和白三烯。酵母载体表达 ( 即产生 )， 并可能是分泌 IL-2， IL-12 和 / 或 IFN-γ 的能力优先增强细胞介导的免疫， 而酵母载体表达， 并可能是分泌 IL-4， IL-5 和 / 或 IL-10 的能力优先增强体液免疫。
     本发明的酵母载体可与广泛多种的能保护动物对抗疾病的抗原结合， 并且将酵母 载体和抗原装入树突细胞或巨噬细胞以形成本发明的疫苗能进一步增强这种能力。相应 的， 使用本发明的治疗性组合物或疫苗的方法优先诱发动物的免疫反应， 因此保护动物对 抗适用于诱发免疫反应的疾病， 包括癌症或传染性疾病。本文所用的术语 “保护对抗疾病” 本 指减轻疾病症状 ； 减少疾病发生， 和 / 或降低疾病严重性。保护动物可指当给予动物时， 发明治疗性组合物预防疾病从发生到和 / 或治愈或缓解疾病症状， 体征或起因的能力。因 此， 保护动物对抗疾病包括预防疾病发生 ( 预防性治疗或预防性疫苗 ) 和治疗患病的或正 经历疾病初期症状的动物 ( 治疗性治疗或治疗性疫苗 )。 具体的， 通过诱导有益的或保护性 免疫反应， 在某种情况中， 可能需要另外抑制 ( 例如， 减少， 抑制或阻断 ) 过度活跃的或有害 的免疫反应， 从而诱发动物的免疫反应来实现保护动物对抗疾病。术语 “疾病” 指任何偏离 动物正常健康状况的情况， 包括出现了疾病症状的状态， 以及已发生了偏离 ( 例如， 感染， 基因突变， 遗传缺陷等 ) 但症状尚未显现的情况。
     更具体的， 当通过本发明的方法给予动物时， 本文所述的疫苗优选产生以下结果， 包括缓解疾病 ( 例如， 减少至少一种疾病症状或临床表现 )， 消除疾病， 减少伴随疾病的肿
     瘤或损害， 消除伴随疾病的肿瘤或损害， 预防或缓解由原发性疾病出现导致的继发性疾病 ( 例如， 原发癌导致的转移癌 )， 预防疾病， 和刺激对抗疾病的效应细胞免疫。
     可用本发明的方法和组合物治疗或预防的癌症包括， 但不限于， 黑色素瘤， 鳞状细 胞癌， 乳腺癌， 头颈癌， 甲状腺癌， 软组织肉瘤， 骨肉瘤， 睾丸癌， 前列腺癌， 卵巢癌， 膀胱癌， 皮肤癌， 脑癌， 脉管肉瘤， 血管肉瘤， 肥大细胞癌， 原发性肝癌， 肺癌， 胰腺癌， 胃肠癌， 肾细胞 癌， 造血细胞瘤形成和转移癌。用本发明的治疗性组合物治疗的癌症特别优选包括原发性 肺癌， 肺转移癌， 原发性脑癌和转移性脑癌。 治疗的脑癌优选包括， 但不限于， 多形性成胶质 细胞瘤。治疗的肺癌优选包括， 但不限于， 非小细胞癌， 小细胞癌和腺癌。本发明的治疗性 组合物对于诱发动物的免疫反应以治疗下述癌症中形成的肿瘤， 包括恶性的和良性的肿瘤 是有用的。优选， 肿瘤抗原在患癌症的动物的组织中的表达产生下述结果 ： 缓解癌症， 减少 伴随癌症的肿瘤， 消除伴随癌症的肿瘤， 预防转移癌， 预防癌症， 和刺激对抗癌症的效应细 胞免疫。
     本发明的一个特别优点是无需将治疗性组合物与免疫促进剂， 如佐剂或载体一起 给予， 因为酵母疫苗和抗原的组合在缺少附加的佐剂时也能诱发有效的免疫反应， 将这些 成分装入树突细胞能再次增强免疫反应， 正如系列申请 US 09/991,363( 出处同上 ) 所描述 的。然而这个特点并不排除在本发明组合物中使用免疫促进剂。因此， 一个实施例中， 本发 明的组合物可包括一种或多种佐剂和 / 或载体。
     通常， 佐剂是通常增强动物对特定抗原的免疫反应的物质。 适合的佐剂包括， 但不 限于， 弗氏佐剂 ； 其它细菌细胞壁成分 ； 铝基盐 ； 钙基盐 ； 硅石 ； 多核苷酸 ； 类毒素 ； 血清蛋 白； 病毒外壳蛋白 (coat protein) ； 其它细菌衍生的制品 ； γ 干扰素 ； 嵌段共聚物佐剂， 如 TM Hunter′ s Titermax 佐剂 (CytRx ， Inc.Norcross， GA) ； Ribi 佐剂 ( 从 Ribi ImmunoChem Research， Inc.， Hamilton， MT 获 得 ) ； 和 皂 苷 及 其 衍 生 物， 如 Quil A( 从 Superfos Biosector A/S， Denmark 获得 )。
     通常， 载体是增加治疗性组合物在接受治疗动物中的半衰期的化合物。适合的载 体包括， 但不限于多聚体可控释放配制剂， 生物可降解埋植剂， 脂质体， 油， 酯和乙二醇。
     本发明的治疗性组合物还可包含一种或多种药物可接受赋形剂。本文中， 药物可 接受赋形剂指任何适于将用于本发明方法的治疗性组合物传递到体内或活体外 (ex vivo) 的适宜位置的物质。优选药物可接受赋形剂能使酵母载体 ( 或含有酵母载体的树突细胞 ) 保持一种形式， 使得直到酵母载体或细胞到达靶细胞， 组织， 或体内位置， 酵母载体 ( 与抗 原结合 ) 或树突细胞 ( 装载了酵母载体和抗原 ) 能在靶位置诱发免疫反应 ( 注意靶位置可 以是全身性的 )。 本发明适合的赋形剂包括能转运， 但不能特异性地将疫苗定向到位置 ( 本 文中也称作非寻靶载体 ) 的赋形剂或配方。药物可接受赋形剂的例子包括， 但不限于水， 生 理盐水， 磷酸盐缓冲生理盐水， 林格溶液， 葡萄糖溶液， 含血清溶液， Hank′ s 液， 其它含水 的生理平衡溶液， 油， 酯， 和乙二醇。 含水载体可包含通过， 例如提高化学稳定性和等渗性从 而接近受者生理条件所需的适宜的辅助物质。
     适合的辅助物质包括， 例如， 乙酸钠， 氯化钠， 乳酸钠， 氯化钾， 氯化钙和用于制备 磷酸盐缓冲液， Tris 缓冲液和碳酸氢盐缓冲液的其它物质。辅助物质还可包括防腐剂， 如 硫柳汞， 间甲苯酚或邻甲苯酚， 福尔马林和苯甲醇。
     本发明包括将本发明组合物或疫苗传递给动物。给予过程可在活体外或体内进行。活体外给予指在患者体外进行部分调节步骤， 如将本发明组合物给予一群在将酵母载 体和抗原装入细胞的条件下， 从患者收集的细胞 ( 树突细胞 )， 并将该细胞回输给病人。可 用任意合适的给予方式将本发明治疗性组合物回输给病人， 或给予病人。
     给予包括装载了酵母载体和抗原的树突细胞的疫苗或组合物可以是全身的， 粘膜 的和 / 或临近靶位置的 ( 例如， 临近肿瘤 )。优选的给予途径对本领域技术人员是显而易 见的， 依赖于所预防的或治疗的情况类型， 所使用的抗原， 和 / 或靶细胞群或组织。优选的 给予方法包括， 但不限于， 静脉内给予， 腹膜内给予， 肌内给予， 结节内 (intranodal) 给予， 冠状动脉内给予， 动脉内给予 ( 例如， 颈动脉内 )， 皮下给予， 经皮传递， 气管内给予， 皮下给 予， 关节内给予， 心室内给予， 吸入 ( 例如气溶胶 )， 颅内， 脊柱内， 眼内， 耳内， 鼻内， 口腔， 肺 部给予， 导管注入， 和直接注射入组织。 特别优选的给予途径包括 ： 静脉内， 腹膜内， 皮下， 皮 内 (intradermal)， 结节内， 肌内， 经皮， 吸入， 鼻内， 口腔， 眼内， 关节内， 颅内和脊柱内。非 胃肠道传递可包括皮内， 肌内， 腹膜内， 胸膜内， 肺内， 静脉内， 皮下， 心房导管和静脉导管途 径。耳部传递可包括滴耳剂， 鼻内传递可包括滴鼻剂或鼻内注射， 眼内传递可包括滴眼液。 气溶胶 ( 吸入 ) 传递也可用现有技术中的标准方法进行 ( 参见， 例如 Sibling 等， ， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 189 ： 11277-11281， 1992， 全部引入本文作为参考 )。例如， 一个实施 例中， 本发明的组合物或疫苗可被配制成适于用适合的吸入装置或喷雾器喷雾传递的组合 物。 口腔传递可包括通过口腔摄取的固体和液体， 对发展粘膜免疫是有益的， 并且包含酵母 载体的组合物可以很容易地制备成口服的， 例如片剂或胶囊， 以及配制到食品和饮料产品 中。 调节粘膜免疫的其它给予途径对治疗病毒感染， 上皮癌， 免疫抑制疾病和其它影响上皮 区域的疾病是有益的。 这种途径包括支气管， 皮内， 肌内， 鼻内， 其它吸入， 直肠， 皮下， 局部， 经皮， 阴道和尿道途径。
     更优选的传递途径是将组合物或疫苗传递到呼吸系统的任意途径， 包括但不限 于， 吸入， 鼻内， 气管内， 和类似途径。如上文所讨论的和实施例中所显示的， 本发明人已证 明， 至少与皮下传递相比， 通过这种给予途径给予本发明疫苗能产生增强的结果， 并对治疗 脑癌和肺癌特别有效。
     根据本发明， 有效的给予方法 ( 即， 以有效的方式给予疫苗或治疗性组合物 ) 包括 在患有疾病或状态或可能感染疾病或状态的动物中诱发免疫反应， 优选保护动物对抗疾病 的适合的剂量参数和给予方式。 可用现有技术中的标准方法测定对特定疾病的有效剂量参 数。这种方法包括， 例如， 测定存活率， 副反应 ( 即毒性 ) 和疾病的进展或退化。具体的， 当 治疗癌症时， 本发明治疗性组合物剂量参数的有效性可通过评估应答率来测定。这种应答 率指在一群病人中接受治疗的病人有反应呈部分或完全缓解的百分数。可通过， 例如测量 肿瘤大小或显微镜检查组织样品中癌细胞的存在， 测定所述缓解。
     根据本发明， 适合的单剂量是在一段适合的时间段内给予一次或多次时， 能诱发 动物的抗原特异性免疫反应的剂量。剂量可根据所治疗的疾病或状态而变化。例如治疗癌 症时， 适合的单剂量可根据所治疗的癌症是原发性肿瘤还是转移性癌症而变化。本领域技 术人员根据动物的大小和给予途径可以轻易地确定合适的给予单剂量。
     本发明治疗性组合物或疫苗的适合的单剂量是在一段适合的时间段内给予一次 或多次时， 以足以诱发抗原特异性免疫反应的量， 将酵母载体和抗原有效的提供到指定的 细胞类型， 组织或病人体内的剂量。例如， 一个实施例中， 本发明酵母载体的单剂量是从约 1×105 至约 5×107 酵母细胞等价物 / 给予组合物的生物体的公斤体重。更优选， 本发 6 9 明酵母载体的单剂量是从约 0.1Y.U.(1×10 细胞 ) 至约 100Y.U.(1×10 细胞 )/ 剂 ( 即 每 个 生 物 体 )， 包 括 以 0.1×106 细 胞 为 增 量 的 任 意 中 间 剂 量 ( 即， 1.1×106， 1.2×106， 1.3×106......)。这种剂量范围可有效的用于任意大小的任意生物体， 包括小鼠， 猴， 人 等。当通过将酵母载体和抗原装入树突细胞来给予疫苗时， 优选本发明疫苗的单剂量是从 6 6 约 0.5×10 至约 40×10 树突细胞 / 人 / 次。优选， 单剂量从约 1×106 至约 20×106 树突 细胞 / 人， 更优选从约 1×106 至约 10×106 树突细胞 / 人。当针对抗原的免疫反应已经减 弱或需要提供针对特定抗原或抗原群的免疫反应或需要诱导针对特定抗原或抗原群的记 忆应答时， 优选给予 “加强剂量” 的治疗性组合物。可从初次给予之后的约 2 周至几年给予 加强剂量。一个实施例中， 给予时间表是在约 1 至约 6 个月内， 约 1 至约 4 次给予约 1×105 至约 5×107 酵母细胞等价物的组合物 / 生物体每公斤体重。
     本领域技术人员知道给予动物的剂量数量依赖于疾病的程度和个体病人对治疗 的反应。例如， 大肿瘤比小肿瘤需要更多剂量， 慢性疾病比急性疾病需要更多剂量。然而一 些情况中， 如果长了大肿瘤的病人比长了小肿瘤的病人对治疗性组合物的反应更好， 那么 长了大肿瘤的病人比长了小肿瘤的病人需要较少的剂量。 因此， 在本发明范围内， 适合的剂 量数量包括治疗指定疾病所需的任意数量。 本发明的另一方面， 治疗疾病或情况， 如癌症的 方法可与其它治疗方法联合以增强治疗效果。 例如， 治疗癌症时， 通过外科手术切除动物的 肿瘤之后， 再给予本发明的疫苗。另一方面， 在通过外科手术切除动物的肿瘤， 并且进行不 引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植之后， 再给予疫苗 ( 下文讨论 )。另一方面， 在通 过外科手术切除动物的肿瘤， 进行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植， 以及输注 同种异体的供体淋巴细胞之后， 再给予疫苗。
     本发明另一个实施例涉及一种治疗癌症病人的方法， 包括 ： (a) 用能有效建立 稳定混合的骨髓嵌合状态的不引起骨髓重度抑制的干细胞转移来治疗癌症病人， 其中干 细胞由同种异体的供体提供 ； (b) 将从同种异体的供体处获得的淋巴细胞给予病人 ； 和 (c) 在步骤 (b) 之后， 将含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗给予病人。Luznik 等， (Blood101(4) ： 1645-1652， 2003) 和其它现有技术 ( 例如 Appelbaum 等， 2001， Hematology pp.62-86) 已经详细描述了通过不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植建立稳定的混 合骨髓嵌合状态的过程。 简单的说， 用非致病的， 不引起骨髓重度抑制的的全身辐射和免疫 抑制治疗病人 ( 例如， 结合辐射和化疗 )， 并给予来自同种异体供体的含有干细胞 ( 例如骨 髓 ) 的一群细胞。这种治疗将在受者病人中建立稳定的混合骨髓嵌合状态 ( 即同时存在供 体和宿主免疫细胞 )。 在 Luznik 等的方法中， 随后给受者输注供体的淋巴细胞， 然后是自体 肿瘤细胞疫苗， GM-CSF 来源和组织相容性抗原来源。这种治疗导致有显著数量的试验动物 以无肿瘤状态长时间存活。
     本发明通过结合不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植和本发明基于酵母 的疫苗的策略， 改进了不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植和肿瘤细胞免疫方法。 如实施例 5 所示， 本发明的方法在治疗肿瘤方面与 Luznik 等的方法一样有效， 但不需要使 用来自受者的自体肿瘤抗原， 也不需要使用以前方法中所提供的生物反应修饰物或其它佐 剂 ( 例如， GM-CSF 和组织相容性抗原来源 )。本发明的改良方法提供了另外的优点， 可在疫 苗中使用广泛多种的非常特异性抗原选择和组合， 能提供针对广泛范围癌症患者的疫苗，而以前使用来自受者的自体肿瘤细胞的方法， 对病人的效果有限。本发明还提供了用本发 明基于酵母的疫苗免疫接种干细胞和淋巴细胞供体， 所述疫苗与给予受者的疫苗一样， 表 达相同的或稍微不同的抗原， 并期望它能进一步增强疫苗的效力。
     本发明这个实施例中， 由同种异体的供体提供干细胞， 通过不引起骨髓重度抑制 的干细胞转移有效建立稳定混合的骨髓嵌合状态以治疗癌症病人的步骤， 如现有技术中 ( 例如 Luznik 等， 出处同上 ； Appelbaum 等， 2001， Hematology pp.62-86) 所详细描述的那样 进行。步骤 (b) 的同种异体淋巴细胞输注可用任意合适的方法， 包括通过， 如现有技术中已 知的 Ultrapheresis 技术， 从供体的外周血收集同种异体淋巴细胞并输注给受者病人。最 后， 如前文所述， 将本发明基于酵母的疫苗给予病人。这个实施例一方面， 所述方法进一步 包括在步骤 (a) 之前， 给予供体含有酵母载体和至少一种癌抗原的疫苗。另一方面， 所述方 法包括在进行步骤 (a) 之前， 切除病人的肿瘤。
     本发明的方法中， 可将疫苗和治疗性组合物给予脊椎动物纲的任何成员， 哺乳动 物， 包括但不限于， 灵长类， 啮齿类， 家畜和家养宠物。 家畜包括用来消费的或生产有用产品 ( 例如， 生产羊毛的绵羊 ) 的哺乳动物。优选要保护的哺乳动物包括人， 狗， 猫， 小鼠， 大鼠， 山羊， 绵羊， 牛， 马， 和猪， 特别优选人。根据本发明， 术语 “病人” 可用来描述是接受本文所 述的诊断， 预防或治疗处理的任意动物。
     提供下述试验结果用来说明而不是意图限制本发明的范围。 实施例 实施例 1
     下述实施例证明了给予含有癌抗原的基于酵母的疫苗来体内治疗非小细胞肺癌 (NSCLC)。
     Ras 突变在人， 小鼠， 大鼠和仓鼠的肺部腺癌中是常见的。事实上， ras 原癌基因家 族的突变是人类癌症和试验动物肿瘤中最常见的癌基因相关突变。 本发明人检验了现在被 设计成直接针对突变蛋白特异性 ras 突变的基于酵母的疫苗， 能否诱导导致小鼠肺部腺癌 模型的肿瘤破坏的有效 (productive) 免疫反应。试验的总体目标是构建能用于对抗人类 肺癌的疫苗。
     本文所述的用于试验的模型是小鼠模型， 其中用乌拉坦 ( 氨基甲酸乙酯， 它代谢 成公知致癌代谢产物——氨基甲酸乙酯 (vinyl carbamate)) 注射 A/J 小鼠。 在约 6 周内可 看到超常增生， 8-10 周时出现良性肿瘤， 8 个月后出现恶性肿瘤的首个信号。10 个月时， 肿 瘤占据整个肺叶， 12 个月时小鼠因呼吸性窘迫而死亡。这个试验中， 肿瘤细胞中表达 K-ras 单突变， 该突变位于编码第 61 位氨基酸残基的密码子中 ( 也称作密码子 61)。
     本发明人制备了 Ras61-VAX(GlobeImmune)， 它是经改造表达具有密码子 61( 对应 于 SEQ ID NO ： 5 的 K-ras 序列 ) 突变的小鼠 K-ras 蛋白的酵母菌株， 所述蛋白是在自发诱 导的小鼠肺部肿瘤和小鼠肺部肿瘤细胞系表达的突变 K-ras 蛋白。 对用直接针对密码子 61 突变的 Ras61-VAX 免疫的动物， 检测它们在用乌拉坦诱导模式诱导后， 防止肿瘤发展或减 小肿瘤大小的能力。
     结果证明用 Ras61-VAX 免疫的动物显示出明显的对抗通过将小鼠暴露于乌拉坦 而自发诱导的原始 (pre-existing) 肺肿瘤的保护作用。与对照动物比较， 免疫动物的肿瘤
     数量和肿瘤大小都显著减小 ( 图 1)。 这些结果证明了用本发明人的表达突变 K-ras 蛋白的 基于酵母的疫苗治疗和 / 或预防癌症引起的疾病来进行治疗性介入的可行性和实用性。
     另 外， 图 2 显 示 了 一 个 试 验 结 果， 其 中 在 1， 8， 22 和 36 天， 通过皮下给予 Ras61-VAX( 只 有 Q61R) 或 通 过 鼻 内 比 较 皮 下 给 予 表 达 具 有 两 个 突 变 (RasV-VAX ； G12V+Q61R) 的突变 Ras 的酵母疫苗来免疫 C57BL/6 小鼠。 在第 29 天， 皮下给予 10,000CMT64 细胞攻击小鼠， 其中 CMT64 细胞内源性表达 12 位氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸 (G12V) 的突 变 K-ras 蛋白。图 2 显示了第 59 天时 ( 攻击 30 天后 ) 肿瘤的大小和带有肿瘤的动物数 / 动物总数的比值 ( 柱形上面 )。如图 2 所示， 给予 Ras61-VAX 再次提供了对肺肿瘤生长的最 低保护 (7 只动物中有 2 只是无肿瘤的 )， 给予 RasV-Vax 通过显著减小肿瘤体积和数量 ( 皮 下接种的 8 只动物中有 4 只是无肿瘤的， 鼻内接种的 8 只动物中有 7 只是无肿瘤的 ) 从而 提供了特异性免疫治疗性保护作用。 令人吃惊的是， 与皮下给予相同疫苗比较， 鼻内给予疫 苗的效果更好。这些结果强调了用基于酵母的疫苗产品进行分子免疫治疗的特异性。这些 研究揭示了如下需求 ： 对肿瘤生长的免疫介导抵制作用依赖于给予含有带有相应突变氨基 酸的肿瘤抗原的基于酵母的疫苗。
     实施例 2 下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗脑瘤的用途。
     在下述试验中， 用 Gag 蛋白表达疫苗 (GI-VAX) 或 PBS( 模拟注射 ) 通过皮下注射 或鼻内给予， 免疫每组的 5 只小鼠两次 ( 第 0 天和第 7 天 )， 随后在第 14 天用表达 Gag 蛋 白的肿瘤攻击。两次独立研究的结果显示， 与模拟注射小鼠比较， 并且惊人的是， 与通过皮 下途径接受疫苗的动物比较， 通过鼻内给予接受疫苗的小鼠对抗颅内肿瘤攻击的存活延长 ( 图 3)。皮下免疫确实能保护动物对抗皮下肿瘤攻击 ( 数据未显示 )。这些结果显示当鼻 内给予时， 本发明的方法可有效使用， 并且给予到呼吸道对颅内肿瘤有效， 而其它给予途径 无效。
     实施例 3
     下述实施例证明含有人类癌抗原 ( 表皮生长因子受体 ； EGFR) 的基于酵母的疫苗 在体内治疗黑色素瘤和脑瘤的用途。
     免疫治疗策略诱发保护性免疫反应的能力依赖于多种重要变量。首先， 疫苗必须 能够激活免疫系统识别靶抗原， 即提供 “佐剂” 活性。对于基于酵母的疫苗的情况， 发明人 先前已证明树突细胞对酵母的吸收上调了 MHC I 类和 II 类蛋白的表达， 并引发细胞因子 产生， 这是佐剂活性的标志 (Stubbs 等 Nature Med(2001)7， 625-629)。酵母激活 “先天的” 免疫系统的程度与使用来自细菌细胞壁的脂多糖 (LPS) 所观察到的程度相当。第二， 疫苗 必须促进靶抗原的免疫显性表位到免疫系统的表面递呈。 发明人先前已证明基于酵母的载 体能非常有效的传递抗原表位以刺激免疫系统细胞介导 (CTL) 的反应和体液 ( 抗体 ) 反应 (Stubbs 等， Nature Medicine(2001)7， 625-629)。第三， 也是最重要的， 刺激免疫系统必须 引发在体内需要处的免疫反应。 如下所示， 令人吃惊的是， 疫苗的给予途径能影响对抗在体 内不同位置发展的肿瘤的免疫反应的效力。
     为了检验 EGFR-tm VAX( 表达以 EGFR 作为癌抗原的本发明的酵母疫苗 ) 的免疫原 性， 必需修饰攻击试验所用的神经胶质瘤细胞。转染 B16 小鼠黑色素瘤细胞和 9L 大鼠神经 胶质瘤细胞以表达人 EGFR( 分别是 B16-E 细胞和 9L-E 细胞 )。随后将克隆的 9L-E 细胞系
     分成高水平， 中间水平或低水平表达 hEGFR 的细胞。因此， B16-E 细胞和 9L-E 细胞拥有包 括在酵母疫苗中的抗原 ( 即人 EGFR)， 并提供了一个恶性细胞中 EGFR 表达改变的适宜的人 神经胶质瘤替代模型。 研究目标是要证明， 基于酵母的传递载体引发保护性免疫反应， 对抗 大鼠颅内植入的致死剂量的 9L-E 神经胶质瘤细胞的攻击。
     B16-E 细胞和 9L-E 细胞克隆成同质的， 并且用流式细胞术测量显示表达人 EGFR。 为确保人 EGFR 蛋白的异源表达在不给予疫苗时不会导致肿瘤的免疫排斥， 首先确定转染 的 B16-E 能够在小鼠中形成皮下肿瘤 ( 数据未显示 )。转染的 9L-E 细胞在大鼠皮下和颅内 形成肿瘤 ( 数据未显示 )。现在建立这个状态以检验 EGFR-tm VAX 酵母疫苗保护动物对抗 B16-E 肿瘤 ( 小鼠 ) 及 9L-E 肿瘤 ( 大鼠 ) 攻击的效力。
     初步的疫苗攻击研究是设计用来确定皮下接种 EGFR-tm VAX 对保护动物对抗皮下 植入的致死剂量的 B16-E 黑色素瘤细胞攻击是否有效。这个方法代表了发明人检测有效诱 发肿瘤细胞杀灭的新的靶肿瘤抗原的实用性的标准测量方法之一。 这个研究证明与模拟免 疫动物比较 (1/6 的动物是无肿瘤的 )( 数据未显示 )， 用 EGFR-tm VAX 接种能保护动物对抗 B16-E 肿瘤的攻击 (4/6 的动物是无肿瘤的 )。这些结果证明 EGFR 可作为适合的诱发细胞 介导的免疫反应的抗原， 并且 EGFR-tm 疫苗引发抗肿瘤攻击的保护性免疫反应。因此， 下一 步是检验 EGFR-tm VAX 抗大鼠颅内 9L-E 神经胶质瘤攻击的效力。 发明人在上述试验中还证实， 当鼻内给予 (i.n) 基于酵母的疫苗时， 能提供与皮 下免疫接种抗皮下黑色素瘤攻击的疫苗相等的保护作用 ( 数据未显示 )。 因此， 接下来的试 验检验了， 已证明能诱发抗皮下 B16 黑色素瘤肿瘤攻击的保护性免疫反应的基于酵母的免 疫治疗性 EGFR-VAX 产物， 能否提供抗颅内肿瘤攻击的免疫治疗性保护作用。
     通过大鼠模型中用神经胶质瘤细胞颅内攻击进一步验证了 EGFR-tmVAX 的效力以 及给予途径的影响。在 0， 7， 21 天， 通过鼻内 (i.n.) 或皮下 (s.c) 途径， 用表达 hEGFR 的约 20,000,000 酵母细胞 (EGFR-vax) 或酵母 ( 只有载体 ) 免疫动物 ( 每组 8 只动物 )。通过 颅内给予 1,250 个未转染的大鼠 9L 神经胶质瘤 ( 只有 9L) 或表达 hEGFR 的 9L 来攻击免疫 动物。每天监测大鼠的体重， 体重减轻预示动物即将死亡。
     结果 ( 图 4) 证明， 对于表达肿瘤抗原的大鼠 9L 神经胶质瘤的致死性颅内肿瘤攻 击， 50％用 EGFR-VAX 酵母免疫的动物被完全保护， 但没有动物抵抗缺乏肿瘤抗原的肿瘤生 长 ( 即疫苗诱导了抗原特异性免疫 )。另外， 死于致死性攻击的剩余 EGFR-VAX 免疫动物还 证明， 与对照动物比较， 存活时间延长。
     此外， 与皮下免疫比较， 鼻内免疫动物的存活率的统计学上显著改善是吸引人和 惊人的， 并且再现了上述 ( 见实施例 2) 关于对抗小鼠颅内 ( 黑色素瘤 ) 肿瘤攻击的保护作 用的数据。
     因为认为这个大鼠颅内肿瘤攻击模型能最接近地反映人神经胶质瘤， 这些研究的 积极数据对进入临床试验提供了极好的临床前数据。 另外的研究可包括剂量改变， 时间表， 外科切除研究， 以及用 9L 肿瘤再次攻击 9L-E 存活者以检验免疫系统现在是否 “认知” 9L 神 经胶质瘤中的另外 ( 未知 ) 肿瘤抗原， 以及检验表达 EGFR-vIII 突变蛋白的酵母载体， 并将 建立开始制造临床级别的疫苗产品的基础。
    上述数据指出， 虽然多种免疫途径可能对破坏外周肿瘤是有效的， 本发明基于酵 母的疫苗对启动肺部独有的效应细胞特别有效。 因为基于酵母的疫苗能启动独有的效应细
     胞前体， 所以通过鼻内免疫激活的免疫细胞对穿过血脑屏障影响颅内肿瘤生长进程特别有 效。 因此， 在设计针对脑肿瘤的有效的基于酵母的疫苗时， 免疫途径是一个重要的和先前未 认识到的成分。因为基于酵母的疫苗能非常容易的用于多种免疫途径， 该疫苗必将以迄今 未被认识到的治疗某些癌症的潜力， 唯一地激发高度特异性的免疫反应。
     实施例 4
     下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗肾癌的用途。
     2001 年， 美国将诊断出约 31,800 例肾细胞癌 (RCC) 个体， 11,600 人死亡 ； 代表 了全部癌症的 2-3％， 以及所有死于肿瘤的 2％。虽然病人通常表现出血尿三联症， 腹部痞 气， 疼痛和体重减轻， 但只有较少数目前诊断出的病人具有这些症状， 因为偶然诊断的频率 提高了。很多诊断出患有疾病的病人， 虽然通过外科手术有可能治愈， 但将会复发， 因为细 胞已经到达血管系统。此外， 转移性 RCC 的治疗方法非常有限。激素疗法和化疗方法产生 ＜ 10％的反应率， 并且存活没有显著改变。 然而人们仍长期关注免疫学治疗对疾病的应用。 除了自发性消退这种罕见情况， α 干扰素和白介素 -2 都已显示出 “显著” 活性， 明显的少 数病人对治疗有反应， 一些病人完全缓解。虽然存在少量预期随机试验， 细胞因子工作组 (Cytokine Working Group) 最近的摘要证明， 与门诊病人皮下给予 IL-2/ 干扰素产生的约 50％的反应率相比， 高剂量 IL-2 产生 8％完全反应率和 25％全部反应率。总之， 虽然清楚 的显示出对 RCC 的活性， 迄今所使用的方法缺乏对疾病的特异性和效力。
     超过 60％的 RCCs 带有 VHL 失活突变， VHL 作为 RCC“看门” 基因， 类似于结肠癌中 APC 功能。 VHL 编码的蛋白是 E3 泛肽 - 连接 (SCF) 复合物的基本成分， 叫做 VHL/elonginCB/ Cul-2(VCB)， 靶向特定蛋白以通过 26S 蛋白酶体进行破坏。因为很多 VHL 突变导致错义或 移框蛋白， 所以将产生新的、 被鉴定为肿瘤特异性抗原的抗原表位。 下述试验验证了如下假 设： 引入本发明新的、 基于酵母的疫苗后， RCCs 的突变 VHL 蛋白能定向免疫反应。
     小鼠中没有可比较的突变 VHL 介导的肿瘤。因此， 本发明人使用已知的人 VHL 序 列 (SEQID NO ： 16) 和克隆的小鼠 VHL(SEQ ID NO ： 17) 来制备编码野生型或带有影响 Y98 或 R167( 对应于鼠序列 SEQ ID NO ： 17) 的两个特定突变的鼠 VHL 序列的表达构建体。这 两个位置的突变与人肿瘤中频繁发现的热点相对应。位置 98 的酪氨酸形成针对 VHL 靶， 如 HIP1α 的表面暴露的结合位点， 而位置 167 的精氨酸对稳定 α 螺旋 H1 很重要。这些残基 非常易于溶解并且易于被免疫系统识别。如下述 BLAST 对比所显示的， 人和鼠 VHL 氨基酸 序列在位置 58 至 190， 包括两个热点， 几乎是同一的。
     58 酪氨酸 98 117
     hVHL ： RPRPVLRSVNSREPSQVIFCNRSPRVVLPVWLNFDGEPQPYPTLPPGTGRRIHSYRGHLW
     mVHL ： RPRPVLRSVNSREPSQVIFCNRSPRVVLPLWLNFDGEPQPYPILPPGTGRRIHSYRGHLW
     24 83
     118 精氨酸 167 177
     hVHL ： LFRDAGTHDGLLVNQTELFVPSLNVDGQPIFANITLPVYTLKERCLQVVRSLVKPENYRR
     mVHL ： LFRDAGTHDGLLVNQTELFVPSLNVDGQPIFANITLPVYTLKERCLQVVRSLVKPENYRR
     84 143
     178 211
     hVHL ： LDIVRSLYEDLEDHPNVQKDLERLTQERIAHQRM SEQ ID NO ： 16mVHL ： LDIVRSLYEDLEDYPSVRKDIQRLSQEHLESQHL SEQ ID NO ： 17
     144 177
     因此， 由这些鼠构建体获得的结果可以合理准确地估计在人 RCC 中的效力。 Y98 很 频繁地突变成组氨酸， 而 R167 典型地突变成谷氨酰胺或色氨酸。R167 还受移框突变的影 响； R167 密码子中插入单个 G 残基将产生一个新的移框蛋白 (REPSQA)， 后面是终止密码子 (TGA)。本发明人构建了 Y98 位组氨酸错义突变 (Y98H) 和 R167 位移框突变 (R167fr) 以产 生概括了已知 VHL 突变特征的潜在的免疫原性突变 VHL 蛋白。移框 VHL 蛋白将表达一个更 长的新表位， 并可能因此更具免疫原性。单个错义 Y98H 突变是对这种方法更严格的试验， 因为必需使单个氨基酸改变。用定点突变方法和 PCR 将这些突变引入全长 VHL 序列。简单 的说， 用特异性 PCR 引物引入突变和早熟终止子产生 R133 突变。将这个突变体和野生型 (WT)VHL 克隆到用于在酵母中表达的酵母表达载体 pYEX-BX， 并克隆到用于在黑色素细胞 中转染和表达的哺乳动物表达载体 pUP。 用已证明是成功的 Clontech 的定点诱变方法产生 Y64 点突变。
     插入物克隆到酵母表达载体 YEX-BX 和哺乳动物表达载体 pUP 以便在黑色素瘤细 胞中转染和表达。为达到这个目的， 发明人改造了酵母以表达 VHL 蛋白并验证了各种疫苗 制剂在小鼠中的效力。 pYEX-BX 质粒包含一个在转化酿酒酵母之后， 可控诱导鼠 VHL 蛋白的 铜诱导性启动子。
     带有受组成型 CMV 早期启动子控制的 VHL 基因的表达载体转染到 B16 黑色素瘤细 胞中。细胞系在体外生长并且当注射到小鼠中时长成肿瘤， 这证明了突变 VHL 构建体自身 对所转染的细胞不是免疫原性的或致死性的。首次接种 / 肿瘤攻击试验由下述组成 ： 在0 6 天和第 7 天， 通过皮下注射 20×10 表达 R133 截短突变体 (VHLtrunc) 的酵母来免疫 18 只 6 周龄的 C57B6 小鼠。第 14 天， 通过如下所述的皮下注射来肿瘤攻击小鼠 ： 6 只小鼠接受 4 4 2.5×10 未转化的 B16 ； 6 只小鼠接受 2.5×10 表达 VHLwt 的 B16 ； 6 只小鼠接受 2.5×104 表达 VHLtrunc 的 B16。攻击后 21 天， 评价小鼠肿瘤生长。试验结果在下表 1 中概括。
     表1
    这些结果显示， 虽然 VHLtrunc 疫苗 ( 靶向截断前的 9 个独特的氨基酸 ) 提供对抗 B 16 VHL tMut 肿瘤攻击的保护作用， 但疫苗不能保护小鼠对抗未转染的 B16 或 B16VHLwt 的攻击。 因此， 接种方法诱导强免疫反应， 但这种反应可能仅局限于针对动物已经接种过的 抗原。然而， 因为此截短变体产生不同于野生型 VHL 的长序列， 所以有可能更加微细的突变 ( 即， 只有一个残基 ) 可产生对突变体和野生型的免疫反应。
     第 2 次免疫 / 攻击试验中 ( 表 2)， 用野生型 VHL 疫苗 (mVHLwtVAX) 或上述截短突
     变的 VHL 疫苗 (mVHLtrunc VAX) 免疫小鼠。将小鼠分组， 如上述首次试验所述， 用未转染的 B16， 表达野生型 VHL 的 B16 或表达突变 VHL 的 B16 攻击。结果再次显示， 用截短 VHL 疫苗 免疫导致对肿瘤攻击的保护作用， 并再次证实不能保护这些小鼠对抗野生型肿瘤的攻击。 用野生型肿瘤免疫的小鼠不能保护其对抗野生型肿瘤的攻击， 这表示疫苗不能破坏对野生 型蛋白的耐受。然而， 当用表达突变 VHL 的肿瘤攻击时， 50％经野生型蛋白免疫的小鼠被保 护， 预示突变 VHL 在某种程度上被鼠免疫系统识别。考虑到基于酵母的疫苗在这些试验中 的特异性和功效， 生产靶向人类中最常见突变的酵母将是一个相对简单的任务， 为将其作 为人类治疗性疫苗的潜在免疫方法铺平了道路。
     表2
    实施例 5
     下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗乳腺癌的用途。
     处于实体器官， 包括肺， 乳房和结肠的癌症早期阶段的多数病人， 可通过外科手术 切除原发性肿瘤而治愈。不幸的是， 很多病人出现了或复发了造血性转移， 除了极少数例 外， 这种造血性转移不能通过现有方式， 包括外科手术， 放射疗法， 化疗， 或同种异体干细胞 移植 (alloSCT) 而治愈。同样， 虽然新近改造的癌症疫苗对最近建立疾病的动物模型显示 出显著的效力， 但一旦肿瘤建立超过 5 天或已出现了转移， 疫苗作为单一试剂通常是无效 的 (Borello 等， 2000， Blood 95 ： 3011-3019)。 部分原因是肿瘤的建立典型地伴随着对肿瘤 抗原耐受的诱导， 必需打破这种耐受才能实现成功的治疗 (Ye 等， 1994， Proc.Natl.Acad. Sci.USA.91 ： 3916-3920 ； Staveley-O ′ Carroll 等， 1998， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 ： 1178-1183)。在不引起骨髓重度抑制的 alloSCT 之后的免疫接种产生增加的改进， 但仍不 能影响建立超过 3 天的肿瘤 (Anderson 等， 2000， Blood 95 ： 2426-2433)。Luznik 等 ( 出处 同上， 全部引入本文作为参考 ) 最近报道了在小鼠乳腺癌模型中， 在达到稳定混合骨髓嵌 合状态的不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞移植 (NST) 之后的免疫接种， 产生能消除
     原发性肿瘤建立 2 周后的转移， 并且不诱发移植物抗宿主疾病 (GVHD) 的显著增强的肿瘤特 异性免疫反应。这个只涉及免疫接种或涉及自体 SCT 或完全 alloSC 之后免疫接种的策略， 其显著增强的功效依赖于建立混合嵌合状态时相互作用的宿主和供者免疫系统的作用。
     Luznik 等的试验中， 给予的疫苗由受辐射的自身肿瘤细胞混合粒细胞 - 巨噬细胞 集落刺激因子 (GM-CSF) 组成。在下面的实验中， 本发明人指出基于酵母的疫苗可取代使用 受辐射的自身肿瘤细胞混合产生 GM-CSF 的细胞， 在相同的动物模型中产生等效结果。简 单的说， 本发明人制备了基于酵母的疫苗， 含有用在 CUP 1 启动子控制下编码小鼠乳房肿 瘤病毒 (MMTV) 的 gp70 蛋白的酵母表达载体转导的酿酒酵母 (Yeast gp70-IT)。MMTV 感染 Balb/c 小鼠引发的自发性乳腺癌中表达了 gp70 蛋白。根据 Luznik 等的试验步骤， 在第 0 天， Balb/c 小鼠皮下注射 10,000 个 4T1 肿瘤细胞 ( 表达 MMTVgp70 的 Balb/c 衍生的自发 性乳腺癌细胞 )。 以 MHC 相容性 B10.D2 为供体进行不引起骨髓重度抑制的同种异体干细胞 移植 (NST) 之前， 第 13 天切除皮下肿瘤。NST 如下组成 ： 第 13 天 200cGyTBI， 第 14 天静脉 给予 10,000,000 个供体骨髓细胞， 第 17 天腹膜内给予 200mg/kg 环磷酰胺。接受了 B10.D2 骨髓的小鼠随后 ： (a) 在第 28 天接受 20,000,000 个 B10D.2 脾细胞， 不再进一步治疗 ( 没有 疫苗 ) ； 或 (b) 在第 28 天接受 20,000,000 个 B10D.2 脾细胞， 在第 31 天接受自体肿瘤疫苗 6 5 (10 个受辐射的 4T1 肿瘤细胞混合 5×10 个分泌 GM-CSF、 MHC 阴性的旁观 (bystander) 细 胞系 B78H1/GM-CSF)， 或 (c) 在第 28 天接受 20,000,000 个 B10D.2 脾细胞， 第 31 天接受本 发明的基于酵母的 gp70-IT 疫苗。正如图 5 中所清楚显示的， 本发明基于酵母的疫苗诱导 对抗致死性肿瘤复发的保护作用， 与产生 GM-CSF 的自身肿瘤细胞诱导的保护作用没有区 别。与使用病人自体肿瘤细胞混合产生 GM-CSF 的旁观细胞系相比， 本发明基于酵母的疫苗 方法在临床上的有用性很容易评价， 并且包括但不限于如下优点， 更广泛的病人适用范围， 结果差异性降低， 设计接种抗原的能力增加， 安全性增加， 疫苗中不必包括生物学修饰物如 GM-CSF， 等等。
     实施例 6
     下述实施例证明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在体内治疗黑色素瘤的用途。
     这个实验中， 参照表 3， 使用 5 组小鼠， 每组 5 只。组 A 中， 在肿瘤攻击前 4 周和 2 周小鼠接受 PBS 注射。在肿瘤攻击后 10 天和 17 天小鼠接受 50×106 基于酵母的 hMART-1 疫苗 ( 表达人 MART-1 的酵母载体 )。组 B 中， 在肿瘤攻击前 4 周和 2 周以及肿瘤攻击后 10 6 天和 17 天， 小鼠接受 50×10 基于酵母的 hMART-1 疫苗注射。组 C 中， 在肿瘤攻击前 4 周 和 2 周小鼠接受 PBS， 并且肿瘤攻击后不再给予。组 D 中， 在肿瘤攻击前 4 周和 2 周小鼠接 6 受 50×10 基于酵母的 hMART-1 疫苗注射， 并且肿瘤攻击后不再给予。组 E 中， 在肿瘤攻击 6 前 4 周和 2 周小鼠接受 50×10 基于酵母的 EGFR 疫苗 ( 表达 EGFR 的酵母载体 )， 并且肿瘤 攻击后不再给予。第 0 天， 所有小鼠接受皮下给予 D16 黑色素瘤细胞的肿瘤攻击。A-D 组小 鼠接受 50,000 个表达内源性小鼠 MART-1 的 D16 黑色素瘤细胞 ( 没有用人 MART-1 转染的 细胞 )， E 组小鼠接受 50,000 用 EGFR 转染的 D16 黑色素瘤细胞。
     表3
    结果如图 6 所示。组 B( 肿瘤攻击之前和之后都接受了免疫 ) 和组 D( 肿瘤攻击之 前接受了免疫 ) 的小鼠， 肿瘤负荷显著减小， 证明表达黑色素瘤抗原的酵母疫苗对黑色素 瘤肿瘤有效， 甚至跨越物种。
     实施例 7
     下述实施例证明本发明酵母载体中表达的融合蛋白的构建， 其中融合蛋白包含多 个免疫原性功能域和相同抗原的多个突变。
    多种 Ras 家族成员的核苷酸序列和氨基酸序列是现有技术中已知的。SEQ ID NO ： 2 是编码人 K-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_033360) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 2 编码本 文中 SEQ ID NO ： 3 代表的人 K-ras。SEQ IDNO ： 4 是编码鼠 K-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_021284) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 4 编码本文中 SEQ ID NO ： 5 代表的鼠 K-ras。SEQ ID NO ： 6 是编码人 H-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_005343) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 6编 码本文中 SEQ ID NO ： 7 代表的人 H-ras。SEQ ID NO ： 8 是编码鼠 H-ras( 已知 GenBank 登 录号为 NM_008284) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 8 编码本文中 SEQ ID NO ： 9 代表的鼠 H-ras。 SEQ ID NO ： 10 是编码人 N-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_002524) 的核酸序列。SEQ ID NO ： 10 编码本文中 SEQ ID NO ： 11 代表的人 N-ras。SEQ ID NO ： 12 是编码鼠 N-ras( 已知 GenBank 登录号为 NM_010937) 的核酸序列。 SEQ ID NO ： 12 编码本文中 SEQ ID NO ： 13 代表 的鼠 N-ras。
     图 7 是示意图， 说明了含有多个抗原性 / 免疫原性功能域用于本发明基于酵母的 疫苗的融合蛋白的实例。 在这些示例性融合构建体中， 使用了 K-Ras 蛋白的 3-165 位氨基酸 (SEQ ID NO ： 3 的 3-165 位 )， 所述氨基酸在 N-Ras 和 H-Ras 中是相同的 ( 即， 可使用 N-Ras 和 H-Ras 的 3-165 位， 并可获得相同的结果 )。随后， 该序列在位置 12 突变， 以缬氨酸， 半 胱氨酸或天门冬氨酸残基取代这个位置正常存在的甘氨酸 ( 分别参见 GI-1014， GI-4015 和 GI-4016)， 在位置 61 用精氨酸取代这个位置正常存在的谷氨酸。第二个序列与这个序列 融合 ( 附加 )。第二个序列是 SEQ ID NO ： 3 的跨越 K-ras 的 56-69 位氨基酸的功能域， 包 括在位置 61 以亮氨酸取代这个位置正常存在的谷氨酸的突变。虽然这最初的三个序列中 Q61L 功能域与更长序列的 N 末端融合， 也可制备其中功能域顺序颠倒的其它构建体。编码 GI-1014 的构建体的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列分别如 SEQ ID Nos ： 14 和 15 所示。
     图 7 还显示了多 - 抗原 Ras 融合疫苗 (GI-4018)， 包含上述在位置 12 的所有三个 突变和上述在位置 61 的两个突变。融合蛋白如下构建。含有 SEQ IDNO ： 1 的合成序列后接 着包括各种 Ras 突变的 4 个多肽。图 7 所示的 4 个多肽的第一个包括 K-Ras 的 N 末端 (SEQ
     ID NO ： 3) 的 3-30 位残基， 其中对应于 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基已经突变， 以缬 氨酸取代这个位置正常存在的甘氨酸。 4 个功能域的第二个包括 SEQ ID NO ： 3 位置 3-39 的 氨基酸残基， 其中对应于 SEQ ID NO ： 3 位置 12 的氨基酸残基已经突变， 以半胱氨酸取代这 个位置正常存在的甘氨酸。4 个功能域的第三个由 SEQ IDNO ： 3 位置 3-165 的氨基酸残基 组成， 其中包含在位置 12 用天门冬氨酸取代这个位置正常存在的甘氨酸， 和在位置 61 用精 氨酸取代这个位置正常存在的谷氨酸。4 个功能域的第四个是 SEQ ID NO ： 3 的跨越 K-ras 的 56-69 位氨基酸的功能域， 包括在位置 61 的突变， 以亮氨酸取代这个位置正常存在的谷 氨酸残基。再次， 虽然功能域以这种顺序描绘在图 7 中， 应该了解功能域的顺序可根据需要 重新组织。
     这个实例只是想说明如何构建在本发明中有用的抗原构建体。 使用来自不同抗原 的功能域， 来自相同抗原的多个功能域， 或带有不同突变的重复功能域的相似策略， 可用于 其它抗原。当单个疫苗构建体中需要包含在抗原的单一位置天然发生的几个不同突变和 / 或突变组合时， 这种类型的构建体特别有用。
     本文中引用的所有参考文献全部引入本文作为参考。
     虽然详细描述了本发明的各种实施例， 显然本领域技术人员会对这些实施例进行 修饰和改进。然而， 应该清楚的知道， 这种修饰和改进在本发明的范围内， 如同下述权利要 求所要求保护的。39102370974 A CN 102370975
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