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去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物的脂质微球注射液及制备方法
    技术领域 本发明涉及一种脂质微球注射液及其制备方法， 具体涉及一种含有去甲基斑蝥酸 钠磷脂复合物脂质微球注射液及其制备方法， 属医药技术领域。
     背景技术 抗癌新药去甲基斑蝥素 （Norcantharidin， NCTD） ， 由斑蝥素去除 1， 2 位甲基而得。 去甲基斑蝥酸钠为去甲斑蝥素直接水解制得的钠盐， 其仅在少数有机溶剂 （如丙酮、 乙酸乙 酯） 及热水中溶解， 在冷水及油中的溶解度很低。与斑蝥素相比， 去甲基斑蝥酸钠的泌尿系 统刺激作用大大降低， 同时具有较斑蝥素更为显著的升高白细胞作用。去甲基斑蝥酸钠为 细胞周期特异性药物， 阻断于 M 周期， 并影响其周期运行速度。临床上主要应用于肝癌、 食 道癌、 胃癌、 贲门癌等术前用药或联合化疗， 可用于白细胞降低及乙型肝炎。
     目前， 去甲基斑蝥酸钠主要以片剂和去甲基斑蝥酸钠注射剂应用于临床。去甲基 斑蝥酸钠虽然明显减轻了斑蝥素的毒性， 但并未完全消除。 动物实验研究结果显示， 给药剂 量增大到一定程度时， 肾脏和肝脏组织出现病理变化。使用剂量的严格限制也严重阻碍了 药物疗效的发挥。临床使用时部分患者在静脉给药每日超过 20mg 或口服每日超过 30mg 时 即出现不良反应， 口服不良反应主要表现为恶心、 呕吐、 头晕等症状。由于注射液为碱性溶 液， 其 pH 值约为 8， 远大于血液 pH 值 (7.35 ～ 7.45)， 因此对血管壁刺激较大， 易引起化学性 静脉炎 ； 且由于药物本身具有较强刺激性， 亦可引起血管痉挛， 血液减少， 相对局部斑蝥酸 钠浓度增大， 加重静脉炎， 且若输液速度大于血液流速， 则静脉炎的发生率明显增高。主要 不良反应表现为易引起静脉炎症， 静脉部红、 肿、 热、 痛， 沿静脉走行长条状发红， 如有渗出 则红肿成块状， 活动受限， 经热敷理疗处理好转治愈。因此在临床用于外周浅静脉输液时， 发生浅静脉炎的比例相当高， 有的病人拒绝用该药治疗， 影响药物在临床上正常使用。
     鉴于此， 为使去甲基斑蝥酸钠更好地发挥临床疗效， 研究和开发新剂型， 以新剂型 的高效、 低毒的优势充分发挥去甲基斑蝥酸钠抗肿瘤活性并降低毒副作用， 这无疑将对进 一步促进和推广去甲基斑蝥素在临床中的应用具有重要意义。
     发明内容
     本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种去甲基斑蝥酸钠磷 脂复合物脂质微球注射液， 该去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液具有低血管刺激 性和低毒性等特点。进一步， 本发明提供该去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液得 制备方法。
     本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
     一种去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液， 该注射液含有去甲基斑蝥酸钠 磷脂复合物、 脂溶性介质、 表面活性剂和水。
     所述的去甲斑蝥酸钠磷脂复合物由去甲基斑蝥酸钠和磷脂在有机溶剂中进行复 合而成。所述的去甲基斑蝥酸钠和磷脂的摩尔比为 1 ～ 1 ： 10。所述的磷脂选自天然磷脂或合成磷脂中的一种或几种。 所述天然磷脂为卵磷脂、 豆磷脂、 胆固醇、 胆酸类或壳聚糖 ； 所 述合成磷脂为磷脂酰甘油酯或二硬脂酰磷脂酰胆碱。 所述去甲基斑蝥酸钠是去甲基斑蝥素 或由去甲基斑蝥素在制剂制备过程中经过反应生成的去甲基斑蝥酸钠。 所述的有机溶剂为 乙酸乙酯、 四氢呋喃、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 丙酮、 二甲基亚砜、 正己烷、 环己烷、 甲醇、 乙醇、 异丙醇、 正丁醇。
     所述的脂溶性介质包括油相和油溶性乳化剂 ； 所述的油相包括矿物油、 植物油、 动 物油或其混合物 ； 所述的油溶性乳化剂是选自天然材料或合成材料中的一种或几种 ； 所述 的油相优选是中链脂肪酸甘油三酯、 大豆油、 红花油、 玉米油或其混合物 ； 所述的天然材料 优选是是卵磷脂、 豆磷脂、 胆固醇、 油酸类、 胆酸类或壳聚糖 ； 所述的合成材料优选是是磷脂 酰甘油酯、 二硬脂酰磷脂酰胆碱。
     所述的表面活性剂选自磷脂、 吐温、 泊洛沙姆、 油酸钠、 油酸、 胆酸、 去氧胆酸或其 混合物。所述的磷脂选自卵磷脂、 豆磷脂或其混合物 ； 所述的吐温选自吐温 20， 吐温 40， 吐 温 60， 吐温 80， 吐温 85， 或者是以上不同规格的任意比例混合物 ； 所述的泊洛沙姆为泊洛沙 姆 188。
     所述的去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液， 还可以含有等渗调节剂、 pH 调节剂和金属螯合剂。 所述等渗调节剂为甘油， 山梨醇， 甘露醇， 葡萄糖或其混合物 ； 所述 pH 调节剂为氢 氧化钠， 盐酸或缓冲盐或其混合物 ； 所述金属螯合剂为依地酸二钠， 依地酸钠钙或其混合 物。
     本发明的去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液， 以重量百分比计优选组成 为： 去甲斑蝥酸钠磷脂复合物 （以去甲基斑蝥素计） 0.01% ～ 5% ； 脂溶性介质 5% ～ 30% ； 表面活性剂 0.5% ～ 5% ； 等渗调节剂 0.5% ～ 5% ； pH 调节剂 0.01% ～ 1% ； 金属螯合剂 0% ～ 1% ； 其余为注射用水。
     更优选为 ： 去甲基斑蝥酸钠复合物 （以去甲基斑蝥素计）0.05 % ～ 0.4% ； 脂溶性介质 10% ～ 20% ； 表面活性剂 0.5% ～ 5% ； 等渗调节剂 1% ～ 3% ； pH 调节剂 0.01% ～ 1% ； 金属螯合剂 0.005% ～ 0.03% ； 其余为注射用水。
     最优选为 ： 去甲基斑蝥酸钠复合物 （以去甲基斑蝥素计）0. 2% ； 脂溶性介质 10% ；
     卵磷脂 1.2% ； 甘油 2.5% ； 油酸钠 0.03% ； 泊洛沙姆 188 0.2% ； 依地酸二钠 0.02% ； 其余为注射用水 ； 其中所述脂溶性介质为中链脂肪酸甘油三酯 （MCT） ， 大豆油， 红花油， 玉米油或其混合 物。
     本发明提供了一种去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液的制备方法， 其特 征在于包括如下步骤 ： （1） 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物的制备 ： 取去甲基斑蝥酸钠和磷脂， 将其加到有机溶剂 中， 25 ～ 70℃加热回流 0.5 ～ 3 小时， 至溶液澄清透明 ； 取出溶液进行减压旋转蒸发以除去 有机溶剂， 最后置于真空干燥机或冷冻干燥机中进行干燥 ； （2） 将处方量的去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物、 脂溶性介质在 60 ～ 80℃的条件下加热搅 拌， 直至磷脂复合物全部溶于脂溶性介质中， 得油相 ； （3） 将处方量的表面活性剂和等渗调节剂加入适量注射用水在 60 ～ 80℃的条件下加 热搅拌至全部溶解作为水相 ； （4） 利用组织捣碎机， 缓慢将水相加入油相或将油相加入水相中， 以每分钟 10， 000 ～ 20， 000 转搅拌 3 ～ 5 分钟， 即得粗乳 ； （5） 将粗乳转移至高压乳匀机中， 在 600 ～ 1200bar， 30℃～ 60℃条件下匀化 3 ～ 10 次； （6） 取上述乳剂灌封于输液瓶中， 充氮， 115℃下灭菌 30min 或 121℃灭菌 15min。
     更优选的制备方法为 ： （1） 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物的制备 ： 取去甲基斑蝥酸钠 2g， 大豆磷脂 6g， 加入 乙酸乙酯 100ml， 60 ℃复合 1 小时后， 旋转蒸发出去乙酸乙酯， 经真空干燥 12 小时以上 （20-30℃） ， 即得载药大豆磷脂复合物， 密闭包装， 放入冰箱冷藏保存 ； （2） 将处方量的去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物和大豆油 ： MCT=3 ： 1， 在 70℃的条件下加 热搅拌， 直至磷脂复合物全部溶于油相中 ； （3） 将处方量的甘油、 油酸钠、 吐温 80 和 依地酸二钠加入适量注射用水在 70℃的条件 下加热搅拌至全部溶解作为水相 ； （4） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 1， 0000 ～ 2， 0000rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （5） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 6.0 ～ 8.0， 注射用水稀释定容 至处方量， 转移至高压均质机中， 以 600 ～ 1000 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （6） 充氮气， 灌封。采用高压旋转 121℃灭菌 15 分钟。
     本发明所述甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液是一种供静脉输液用的含 去甲基斑蝥酸钠的水包油亚微乳剂， 构成水包油亚微乳剂的组合物与脂质微球注射液的组 合物相同。
     本发明所述去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液中去甲基斑蝥酸钠在油 相或油水两相的界面膜中分布应在 80％以上， 其余部分去甲基斑蝥酸钠分布于水相及油相中。 本发明所述去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液首先将去甲基斑蝥酸钠 与磷脂复合， 将在油、 水中均难溶的药物去甲基斑蝥酸钠载入磷脂层中， 去甲基斑蝥酸钠在 油水两相的界面膜和油相中的分布大大提高， 提高了药物在制剂中的包封率， 实现界面膜 载药， 提高了其脂溶性， 提高了药物在制剂中的载药量、 降低了其毒性并使其在体内能够靶 向释药。而后利用磷脂复合物制备去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液， 降低了去甲 基斑蝥酸钠的血管刺激性， 提高疗效并降低毒副作用， 因而具有一定的创新性和较强的实 用性。实验研究表明 ： 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液与注射液相比， 急性毒性明显减小。大 鼠静脉给予去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液与其溶液型注射液后， 去甲斑蝥酸钠的血药时间 曲线见图 1， 去甲斑蝥酸钠在心脏、 肝脏、 肾脏及不同时间各组织中的药物分布图见图 2- 图 7。
     附图说明
     图 1 NCTD 血药—时间曲线 1 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液 2 去甲斑蝥酸钠 溶液型注射液 图 2 NCTD 心脏中药物浓度—时间曲线 1 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液 2 去甲斑 蝥酸钠溶液型注射液 图 3 NCTD 肝中药物浓度—时间曲线 1 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液 2 去甲斑蝥 酸钠溶液型注射液 图 4 NCTD 肾中药物浓度—时间曲线 1 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液 2 去甲斑蝥 酸钠溶液型注射液 图 5 给药 0.5 小时的大鼠体内各组织药物分布图 1 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液 2 去甲斑蝥酸钠溶液型注射液 图 6 给药 6 小时的大鼠体内各组织药物分布图 1 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液 2 去甲斑蝥酸钠溶液型注射液 图 7 给药 24 h 后大鼠体内各组织 AUC 值 1 去甲斑蝥酸钠脂质微球注射液 2 去甲 斑蝥酸钠溶液型注射液。 具体实施方式 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明， 实例仅为提供解释性说明， 不意 味着以任何方式对本发明的保护范围予以限制。
     实施例 1 去甲基斑蝥酸钠原料的制备 去甲基斑蝥酸钠虽然有注射液， 但是都是从去甲斑蝥素直接水解制得钠盐水溶液。其 原料药没有生产和销售。而从去甲斑蝥素制备去甲斑蝥酸钠是一个最基本的有机反应， 因 此， 我们参照文献报道， 以去甲斑蝥素为原料， 经过水解成盐， 脱水， 洗涤， 干燥， 制得去甲斑 蝥酸钠。反应式如下 ：
     合成方法如下 ： 氢氧化钠 10-30g， 加水 100mL， 溶解后放冷， 边搅拌边加入去甲斑蝥素 10-30g， 待近全 部溶解后， 滤除少量不溶物。 将溶液减压浓缩近干， 得大量白色粉末状固体， 加乙醇 5-50mL， 抽滤， 得到白色晶体， 用乙醇多次洗涤， 每次洗后检查洗出液的 pH 值， 待洗出液 pH 值为 4-9 时， 抽滤， 真空干燥， 得白色结晶性粉末。
     精制 ： 将上述白色粉末 5-50g， 溶于 5-50mL 水中， 用 G3 垂熔漏斗过滤， 滤液加入 100-1000mL 乙醇， 放置 2-20 小时后抽滤， 真空干燥， 得白色粉末状固体。
     实施例 2 磷脂复合物的制备 【制备 1】 去甲基斑蝥酸钠 - 蛋黄卵磷脂复合物 取去甲基斑蝥酸钠 （以去甲斑蝥素计） 4g， 蛋黄卵磷脂 6g， 加入丙酮 50ml， 60 ℃复合 1 小时后， 旋转蒸发出去丙酮， 经真空干燥 12 小时以上 （20-30℃） ， 即得载药蛋黄卵磷脂复合 物， 密闭包装， 放入冰箱冷藏保存。
     【制备 2】 去甲基斑蝥酸钠 - 大豆卵磷脂复合物 取去甲基斑蝥酸钠 （以去甲斑蝥素计） 2g， 大豆磷脂 6g， 加入乙酸乙酯 100ml， 60℃复合 1 小时后， 旋转蒸发出去乙酸乙酯， 经真空干燥 12 小时以上 （20-30℃） ， 即得载药大豆磷脂 复合物， 密闭包装， 放入冰箱冷藏保存。
     【制备 3】 去甲基斑蝥酸钠 - 胆固醇复合物 取去甲基斑蝥酸钠 （以去甲斑蝥素计） 1g， 胆固醇 3g， 加入乙酸乙酯 100 ml， 60℃复合 3 小时后， 旋转蒸发出去乙酸乙酯， 经真空干燥 12 小时以上 （20-30℃） ， 即得载药胆固醇复合 物， 密闭包装， 放入冰箱冷藏保存。
     【制备 4】 去甲基斑蝥酸钠 - 磷脂酰甘油酯复合物 取去甲基斑蝥酸钠 （以去甲斑蝥素计） 0.5g， 磷脂酰甘油酯 2g， 加入丙酮 50 ml， 60℃复 合 1 小时后， 旋转蒸发出去丙酮， 经真空干燥 12 小时以上 （20-30℃） ， 即得载药磷脂酰甘油 酯复合物， 密闭包装， 放入冰箱冷藏保存。
     【制备 5】 去甲基斑蝥酸钠 - 二硬脂酰磷脂酰胆碱复合物 取去甲基斑蝥酸钠 （以去甲斑蝥素计） 0.5g， 二硬脂酰磷脂酰胆碱 2g， 加入乙酸乙酯 100 ml， 60℃复合 1 小时后， 旋转蒸发出乙酸乙酯， 经真空干燥 12 小时以上 （20-30℃） ， 即得载药 二硬脂酰磷脂酰胆碱复合物， 密闭包装， 放入冰箱冷藏保存。
     【制备 6】 去甲基斑蝥酸钠 - 二肉蔻酰磷脂酰胆碱复合物 取去甲基斑蝥酸钠 2g， 二肉蔻酰磷脂酰胆碱 6g， 加入四氢呋喃 250 ml， 60℃复合 1 小时 后， 旋转蒸发出四氢呋喃， 经真空干燥 12 小时以上 （20-30℃） ， 即得载药二肉蔻酰磷脂酰胆 碱复合物， 密闭包装， 放入冰箱冷藏保存。实施例 3 制备去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 【处方 1】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 0.5mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 大豆油 卵磷脂 甘油 油酸钠 泊洛沙姆 188 依地酸钙钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.05% 10% 1.2% 2.5% 0.03% 0.2% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 泊洛沙姆 188、 油酸钠和依地酸钙钠分散于适量注射用水中， 至磁力 搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 4】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用大豆油中， 加热至 80℃下搅 拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 1， 8000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15 min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 2】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 0.5mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=3 ： 1） 甘油 去氧胆酸钠 泊洛沙姆 188 依地酸钙钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.05% 10% 2.5% 0.03% 0.2% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 泊洛沙姆 188、 去氧胆酸钠、 依地酸钙钠分散于适量注射用水中， 至 磁力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 2】 中磷脂复合物加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的混合油相中， 加 热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 1， 8000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15 min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 3】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 1mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=3 ： 1） 豆磷脂 甘油 油酸钠 泊洛沙姆 188 依地酸钠钙 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.1% 15% 2.5% 2.5% 0.06% 0.6% 0.02% 加至 100% 制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 泊洛沙姆 188、 油酸钠、 依地酸钠钙分散于适量注射用水中， 至磁力 搅拌器中加热至 80℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 3】 中磷脂复合物、 注射用豆磷脂加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的 混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.0， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 115℃灭菌 30 min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 4】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 1mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=1 ： 1） 卵磷脂 甘露醇 油酸钠 泊洛沙姆 188 依地酸二钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.1% 20% 3% 2.5% 0.1% 0.4% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘露醇、 泊洛沙姆 188、 油酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用水中， 至磁 力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 5】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的 混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 1， 8000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15 min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 5】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 1mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=1 ： 1） 卵磷脂 甘露醇 油酸钠 泊洛沙姆 188 依地酸二钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.1% 15% 1.8% 2.5% 0.06% 0.4% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘露醇、 泊洛沙姆 188、 油酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用水中， 至磁 力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 1】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的 混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 1， 8000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15 min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 6】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 2mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=1 ： 3） 豆磷脂 甘油 油酸钠 泊洛沙姆 188 依地酸二钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.2% 20% 3% 2.5% 0.1% 0.8% 0.05% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 泊洛沙姆 188、 油酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用水中， 至磁力 搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 2】 中磷脂复合物、 注射用豆磷脂加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的 混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 1， 8000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15 min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 7】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 2mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=1 ： 1） 豆磷脂 山梨醇 去氧胆酸钠 泊洛沙姆 188 依地酸钙钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.2% 30% 4% 2.5% 0.06% 1.0% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用山梨醇、 泊洛沙姆 188、 去氧胆酸钠、 依地酸钙钠分散于适量注射用水中， 至磁力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 6】 中磷脂复合物、 注射用豆磷脂加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的 混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 注射用水稀释定容至处方 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.0， 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 8】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 4mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=1 ： 1） 卵磷脂 山梨醇 油酸钠 泊洛沙姆 188 （以去甲基斑蝥素计） 0.4% 30% 5% 2.5% 0.1% 0.4% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用山梨醇、 泊洛沙姆 188、 去氧胆酸钠、 依地酸钙钠分散于适量注射用水中， 至磁力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 6】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的 混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.0， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 9】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 4mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： MCT=1 ： 1） 卵磷脂 甘油 油酸钠 吐温 80 依地酸二钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.4% 20% 3% 2.5% 0.06% 0.4% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 吐温 80、 油酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用水中， 至磁力搅拌器 中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 6】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用 MCT、 注射用大豆油组成的 混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 10】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 0.5mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （玉米油 ： MCT=3 ： 1） 大豆磷脂 甘油 去氧胆酸钠 吐温 80 依地酸钙钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.05% 10% 1.2% 2.5% 0.03% 0.2% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 吐温 80、 去氧胆酸钠、 依地酸钙钠分散于适量注射用水中， 至磁力搅 拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 1】 中磷脂复合物、 注射用大豆磷脂加入到注射用 MCT、 注射用玉米油组成 的混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ；（3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 1， 8000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15 min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 11】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 0.5mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油 ： 红花油 =1 ： 1） 卵磷脂 甘油 油酸钠 吐温 80 依地酸二钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.05% 10% 1.5% 2.5% 0.03% 0.6% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 吐温 80、 油酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用水中， 至磁力搅拌器 中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 1】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用红花油、 注射用大豆油组成 的混合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 12】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 0.5mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油） 卵磷脂 甘油 油酸钠 吐温 80 泊洛沙姆 188 依地酸二钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.05% 10% 1.2% 2.5% 0.03% 0.2% 0.4% 0.02% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 吐温 80、 泊洛沙姆 188、 油酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用水 中， 至磁力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 1】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用大豆油中， 加热至 80℃下搅 拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 13】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 0.5mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （大豆油） （以去甲基斑蝥素计） 0.05% 20% 2.4% 2.5% 0.08% 0.3% 0.3% 0.05% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 吐温 80、 泊洛沙姆 188、 油酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用水 中， 至磁力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 1】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用大豆油中， 加热至 80℃下搅 拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； （4） 以 0.1 mol· L － 1 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15min， 冰水浴迅速降温即得。
     【处方 14】 去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 （规格 ： 0.5mg/ml）去甲基斑蝥酸钠复合物 油相 （玉米油 ： 红花油 =1:1） 大豆磷脂 甘油 去氧胆酸钠 吐温 80 泊洛沙姆 188 依地酸二钠 注射用水 （以去甲基斑蝥素计） 0.05% 20% 2.4% 2.5% 0.08% 0.3% 0.3% 0.05% 加至 100%制备方法 ： （1） 将注射用甘油、 吐温 80、 泊洛沙姆 188、 去氧胆酸钠、 依地酸二钠分散于适量注射用 水中， 至磁力搅拌器中加热至 70℃搅拌至全部溶解作为水相 ； （2） 将 【制备 1】 中磷脂复合物、 注射用卵磷脂加入到注射用玉米油、 注射用红花油的混 合油相中， 加热至 80℃下搅拌至完全溶解作为油相 ； （3） 将油相加入至水相中， 置于高速组织捣碎机中 2， 0000 rmp 搅拌 3-5 分钟 ； －1 （4） 以 0.1 mol· L 氢氧化钠或盐酸溶液调节 pH 值至 7.5， 注射用水稀释定容至处方 量， 转移至高压均质机中， 40℃下， 以 800 bar 压力均质 6 ～ 10 次 ； （5） 装瓶， 封罐氮气， 121℃灭菌 15min， 冰水浴迅速降温即得。
     处方 1-14 所制得的去甲基斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液的相关理化性质 如下 ：处方 1 处方 2 处方 3 处方 4 处方 5 处方 6 处方 7 外观 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好 粒径 nm 178.3±45.2 187.6±52.7 173.7±43.2 168.3±46.2 162.8±43.8 165.5±47.1 183.1±59.8 15 含量 100.3% 99.5% 99.1% 99.1% 99.2% 100.7% 98.9% 包封率 85.3% 82.1% 83.4% 81.1% 86.9% 87.6% 81.9% 有关物质 0.27% 0.34% 0.25% 0.29% 0.37% 0.29% 0.31%102319214 A CN 102319217 处方 8 处方 9 处方 10 处方 11 处方 12 处方 13 处方 14 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好 均一良好说明书100.8% 99.4% 97.7% 98.6% 98.7% 100.6% 98.7% 88.1% 83.4% 82.1% 86.4% 85.1% 87.0% 85.5% 0.28% 0.29% 0.35% 0.33% 0.27% 0.22% 0.26%12/14 页159.5±44.1 168.3±35.8 175.8±48.7 157.2±57.6 189.3±55.1 177.5±42.8 184.2±47.6实施例 4 去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液刺激性试验 (1) 血管刺激性实验 选用新西兰白兔 6 只， 3 只白兔于右耳耳缘静脉注射去甲基斑蝥酸钠注射液 Qs， 左耳 注射相同剂量无菌的 5% 葡萄糖注射液作为对照 ； 另 3 只白兔于右耳耳缘静脉注射去甲斑蝥 酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 Qz， 左耳注射相同剂量无菌的 5% 葡萄糖注射液作为对照。 每日一次， 连续三天， 末次给药 24 小时后， 处死白兔， 肉眼观察注射部位的反应情况， 并解 剖兔耳血管及周围组织做石蜡切片， 染色， 光镜检查。
     结果显示 ： 去甲基斑蝥酸钠注射液两种剂型血管刺激性实验肉眼观察结果表明 ： Qz 的血管刺激性弱于 Qs ； 镜检报告表明 ： Qs 组对新西兰白兔耳血管有一定程度的血管刺激 性， Qz 组对新西兰白兔耳血管未见明显刺激性。 (2) 肌肉刺激性实验 选用新西兰白兔 4 只， 每种剂型 2 只， 分别在右侧股四头肌注射 Qs 和 Qz 注射液 1ml， 左 侧股四头肌注射等量的无菌 5% 葡萄糖注射液作为对照， 注射 48 小时后， 处死白兔， 解剖取 出股四头肌， 纵向切开， 观察注射部位肌肉组织的反应情况， 确定反应级数。
     0级： 无变化。
     1级： 轻度充血， 其范围在 0.5cm×1.0cm 以下。
     2 级 : 中度充血， 其范围在 0.5cm×1.0cm 以上。
     3级： 重度充血， 伴有肌肉变性。
     4级： 出现坏死， 有褐色变性。
     5级： 出现广泛性坏死。
     然后算出 4 块股四头肌反应级数总和， 如果股四头肌反应级数的最高值和最低值 之差大于 2， 则应另取 2 只健康白兔重新实验。得到结果后， 若 4 块股四头肌反应级数总和 小于 10， 则认为供试品的局部刺激性实验符合规定。
     结果表明 ： Qz 的肌肉刺激性弱于 Qs。
     实施例 5 去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液溶血性实验 自新西兰白兔的颈总动脉取血 20 ml， 置于烧瓶内， 用玻璃棒轻轻搅动， 数分钟后， 除去 纤维蛋白， 取出血液， 加等量 5% 葡萄糖注射液， 离心， 除去上清液 ； 沉淀的红细胞再加 5% 葡 萄糖注射液清洗， 离心。如此反复直至上清液透明， 按红细胞的容量用 5% 葡萄糖注射液配 成 2% 的混悬液。
     取干净试管 7 支， 分别编号， 依次加入下表内各液， 第 6 管不加供试液作为空白对 照管， 第 7 管用蒸馏水代替 5% 葡萄糖注射液， 摇匀， 置于 37℃水浴中， 分别于 0.5 小时、 1小 时、 2 小时、 3 小时观察是否有溶血现象发生。
     结果表明 ： Qs、 Qz 都未见溶血现象发生， 两种剂型的溶血性实验都合格。
     实施例 6 去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液过敏性实验
     取健康豚鼠 8 只，Qs、 Qz 两种剂型各 4 只， 每只豚鼠腹腔注射相应供试液 0.5ml， 隔日 一次， 共三次。在首次注射后的第 14、 21 天于每只豚鼠的后脚掌外侧静脉注入相应供试药 液 1ml( 剂量折算同前 )， 进行攻击。每次静脉给药观察 2 小时， 如出现抓鼻、 竖毛、 咳嗽、 呼 吸困难中的两种或两种以上者判为阳性 ； 如有痉挛、 大小便失禁、 虚脱、 休克、 死亡现象之一 者判为阳性。一切正常为阴性。
     结果表明 ： Qs、 Qz 两种剂型都符合过敏性实验标准。
     实施例 7 去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液大鼠血浆药代动力学研究 给药方案 12 只大鼠随机分成二组， 每组 6 只， 实验前禁食一夜。甲组为对照组， 于右后股静脉注 -1 射去甲基斑蝥酸钠注射液 （2 mg·mL ） ， 乙组为受试组， 于右后股静脉注射去甲斑蝥酸钠磷 脂复合物脂质微球注射液， 分别于 10 min， 20 min， 30 min， 45 min， 1 h， 2 h， 4 h， 6 h， 8 h， 12 h， 24 h 眼眶取 0.5 mL 血， 置预先肝素化的尖底离心试管中， 离心， 精密吸取上层血浆 200 μL， 加入 20μL 注射用水， 按一定方法处理后， 取 20 μL 进样， 以当日的标准曲线计算各时 间点样品中去甲基斑蝥酸钠的浓度。
     隔室模型药物动力学参数 用 3P97 药物动力学程序处理去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液和去甲基斑蝥 酸钠注射液的平均血药浓度数据。根据 AIC 和拟合度判断两者的模型归属， 结果表明， 去甲 斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液和去甲基斑蝥酸钠注射液注射液的血药浓度数据均 符合双隔室模型。
     非隔室模型药物动力学参数 由血药浓度 - 时间实测数据描述体内过程， 计算药物动力学参数。结果显示， 主要药动 学参数 AUC0- ∞， AUMC0- ∞， AUC0-t， AUMC0-t， S2， MRT， VRT 无显著性差异， 见图 1。
     实施例 8 去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液大鼠组织分布动力学研究 给药方案 60 只大鼠随机分成二组， 每组 30 只。甲组为对照组， 于右后股静脉注射去甲基斑蝥酸 钠注射液， 乙组为受试组， 于右后股静脉注射去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液， 分 别于 0.5 h， 2 h， 6 h， 12 h， 24 h（每点 6 只大鼠， 甲、 乙组各 3 只 ） 断头处死动物， 取出心， 肝， 脾， 肺， 肾， 脑， 用生理盐水冲洗干净， 用滤纸吸干， 称取 0.5 g， 加 1 mL 生理盐水匀浆， 小 于 0.5 g 的组织直接匀浆， 离心， 取上清液， 按 “组织样品处理与测定” 项下处理后， 取 20 μL 进样， 以当日的标准曲线计算各时间点样品中 NCTD 的浓度。
     实验结果 实验动物静脉注射去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液和去甲斑蝥酸钠注射液 后实验动物各时间点各组织药物浓度的平均值与时间的关系见图 2 ～ 7。
     由大鼠体内血浆药动学试验结果显示， 去甲斑蝥酸钠磷脂复合物脂质微球注射液 在大鼠体内并无明显缓释作用。组织分布动力学考察实验结果表明， 去甲基斑蝥酸钠在肾 脏、 肝脏、 心脏及血浆中的分布较多， 而在肺、 脾及脑中几乎无分布。改变剂型后， 除肝脏中 的总分布略有改变外， 基本未改变药物体内其它组织的分布特征。
     以去甲基斑蝥酸钠注射剂为参比制剂， 测定大鼠体内的组织分布动力学特征， 结 果表明 ： 将去甲基斑蝥酸钠制备成脂质微球后静脉给药后， 未改变药物在大鼠脾、 肺、 肾、脑、 及血浆中的滞留时间及药物分布量， 在肝组织中的分布略有增加。