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1、10申请公布号CN102335119A43申请公布日20120201CN102335119ACN102335119A21申请号201110327191922申请日20111023A61K9/00200601A61K47/34200601A61K31/337200601A61P35/0020060171申请人福建医科大学附属协和医院地址350001福建省福州市鼓楼区新权路29号72发明人陈志奎林礼务薛恩生何以敉黄静74专利代理机构福州智理专利代理有限公司35208代理人王义星54发明名称一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂57摘要本发明公开一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂。
2、，包括高分子聚合物和多西他赛，所述高分子聚合物采用聚乙二醇/聚D,L乳酸CO乙醇酸共聚物体系，共聚物体系采用聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇、聚乙二醇聚乳酸聚乙二醇、聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸或聚乙二醇/聚乳酸羟基乙酸（PEG/PLGA）接枝聚合物，其特征在于多西他赛与共聚物体系的质量百分比为120至15，采用直接溶解法、乳化溶剂挥发法或透析法制备成载多西他赛共聚物纳米胶束。本发明可适用于包括乳腺、甲状腺、肝脏、胰腺、肾脏、卵巢、腹膜后等多种肿瘤的治疗。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图3页CN102335127A1/1页21一种。
3、超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂，包括高分子聚合物和多西他赛，所述高分子聚合物采用聚乙二醇（PEG）/聚D,L乳酸CO乙醇酸PLGA共聚物体系，共聚物体系采用聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇（PEGPLGAPEG）、聚乙二醇聚乳酸聚乙二醇（PEGPLLAPEG）、聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸（PLGAPEGPLGA）或聚乙二醇/聚乳酸羟基乙酸（PEG/PLGA）接枝聚合物，其特征在于多西他赛与共聚物体系的质量百分比为120至15，采用直接溶解法、乳化溶剂挥发法或透析法制备成载多西他赛共聚物纳米胶束。2根据权利要求1所述的一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂，其特征在于。
4、所制备的载多西他赛共聚物纳米胶束的包封率达9699WT，载药率达37WT。3根据权利要求1或2所述的一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂，其特征在于所述的PLGAPEGPLGA聚合物采用开环共聚的方法合成，合成的PLGAPEGPLGA聚合物的组成为聚乳酸羟基乙酸质量百分比5075，聚乙二醇分子量介于10002000DAL，质量百分比为2550，合成聚乳酸羟基乙酸链段的丙交酯摩尔百分比为6080，乙交酯的摩尔百分比为2040；多西他赛与PLGAPEGPLGA聚合物的质量百分比为120至15。4权利要求13任一所述的一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂的制备方法，包括如下步骤1。
5、）采用开环聚合法合成PLGAPEGPLGA三嵌段共聚物分别称取相对分子质量为1500和2000的PEG，在95真空环境中干燥，然后加入丙交酯和乙交酯，继续真空干燥后，加入催化剂氯化亚锡，充入氮气，在140条件下反应，抽真空，自然冷却，得淡黄色的PLGAPEGPLGA共聚物；2）采用直接溶解法制备载药共聚物纳米胶束以双蒸水配制质量分数为5的步骤1）制备获得的PLGAPEGPLGA三嵌段共聚物溶液，加入浓度为100MG/ML的多西他赛无水乙醇溶液，涡旋震荡，超声分散，离心获得上清液，上清液即为载多西他赛共聚物纳米胶束；3）载多西他赛共聚物纳米胶束真空冷冻干燥，60CO辐照灭菌后，4环境保存。5权利。
6、要求13任一所述的肿瘤血管栓塞化疗新制剂在制备抑制肿瘤的药物中的应用。6权利要求13任一所述的一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂在制备超声介导下化疗乳腺癌的药物中的应用。权利要求书CN102335119ACN102335127A1/6页3一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂技术领域0001本发明涉及医药领域，尤其涉及采用现代药剂学技术制备一种载多西他赛的温度敏感型纳米胶束，其在超声波产生的热效应下发生相转变，从纳米级胶束转变成微米级栓塞剂，可达到肿瘤血管栓塞与化疗的双重抗肿瘤作用，操作简便，安全高效，具有广泛的临床应用前景。背景技术0002经导管动脉栓塞化疗TACE将化疗。
7、药物与栓塞剂混合在一起经导管注入肿瘤供血靶动脉，一方面使肿瘤供血动脉栓塞，造成肿瘤组织缺血坏死，另一方面提高了肿瘤局部药物浓度，延长药物与肿瘤组织的接触时间，具有栓塞与化疗的双重抗肿瘤作用，已经广泛应用于肝癌、颅脑肿瘤、妇科肿瘤等的治疗。但TACE也存在某些不足，如对于散在分布的多发肿瘤栓塞较困难，具有放射污染，单纯栓塞肿瘤动脉可能导致癌细胞残留或肿瘤侧枝循环形成肿瘤复发，且患者经济负担大等。0003多西他赛是一种高效、抗瘤谱广的抗肿瘤药物，可通过抑制细胞微管解聚，抑制DNA、RNA或蛋白质的合成，导致细胞死亡，已经广泛应用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等疾病的治疗。但多西他赛难溶于水，目前临。
8、床使用的制剂多采用表面活性剂吐温80和乙醇增溶，易导致患者发生过敏反应，化疗前后需口服大量糖皮质激素等进行预防。因此，改进多西他赛的剂型，提高药物的水溶性，可有效减少过敏反应的发生率。0004聚合物胶束系统在水溶液中自组装形成亲水性外壳和疏水内核“核壳”结构。疏水性内核包载难溶性药物如多西他赛，可增加药物溶解度，并且保护药物的稳定性。聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸（PLGAPEGPLGA）三嵌段共聚物具有温度敏感性，且生物相容性好，可生物降解，在体内最终降解成二氧化碳和水，无毒副作用。疏水嵌段PLGA构成内核，可作为微药库通过物理包埋方式结合疏水性药物如多西他赛，增加疏水性药物的水溶性。。
9、亲水性的PEG形成外壳，保护胶束免受网状内皮系统的捕获清除，延长药物在血液循环中的存在时间，还可在一定程度上避免药物的分解及肿瘤细胞对药物的识别与外排，降低药物的毒性及肿瘤细胞多药耐药性的发生。0005超声波是一种正负交替的疏密机械波，具有相对无创性，能穿透到机体的深部组织，超声频率与剂量、超声发射周期等参数可准确调控等优点。在超声波与生物组织相互作用的过程中，超声波会产生热效应、空化效应、机械效应和理化效应等，可提高肿瘤局部的血管及细胞通透性，诱导肿瘤细胞凋亡坏死等。0006乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤发病率中居第1位。全世界每年新发的乳腺癌患者约有120万，约50。
10、万妇女死于乳腺癌。三阴性乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2表达缺失的乳腺癌，约占乳腺癌的1020。三阴性乳腺癌具有特殊的生物学行为和临床病理特征，临床表现为侵袭力强、远处转移风险高和预后较差等特点。由于缺乏相应受体不能进行内分泌及生物治疗，目前这类特殊类型乳腺癌的全身治疗仅限于化疗，但单纯化疗效果欠佳，肿瘤细胞容易发生多药说明书CN102335119ACN102335127A2/6页4耐药。0007下面是本发明通过超声波辐照产生的热效应使载多西他赛的温敏型纳米胶束发生相转变，形成微米级的血管栓塞剂，使肿瘤局部血管发生栓塞，在肿瘤局部缓慢释放药物，达到栓塞与化学治疗的双重效果。
11、，此外，超声波空化效应、机械效应等可预防肿瘤细胞发生多药耐药。发明内容0008本发明的目的在于提供一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂，该制剂以高分子聚合物包载多西他赛形成纳米粒，通过超声波辐照产生的热效应使其在肿瘤局部发生相转变，形成微米级的栓塞剂，并在肿瘤局部释放药物，达到栓塞肿瘤血管与化疗的双重疗效。0009本发明的目的是这样实现的，所述的超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂，包括高分子聚合物和多西他赛，所述高分子聚合物采用聚乙二醇（PEG）/聚D,L乳酸CO乙醇酸PLGA共聚物体系，共聚物体系采用聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇（PEGPLGAPEG）、聚乙二醇聚乳酸聚乙。
12、二醇（PEGPLLAPEG）、聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸（PLGAPEGPLGA）或聚乙二醇/聚乳酸羟基乙酸（PEG/PLGA）接枝聚合物，其特征在于多西他赛与共聚物体系的质量百分比为120至15，采用直接溶解法、乳化溶剂挥发法或透析法制备成载多西他赛共聚物纳米胶束。0010所述的一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂，其特征在于所制备的载多西他赛共聚物纳米胶束的包封率达9699WT，载药率达37WT。0011本发明的高分子聚合物可以采用聚乙二醇（PEG）/聚D,L乳酸CO乙醇酸PLGA共聚物体系，包括聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇（PEGPLGAPEG）、聚乙二醇聚乳酸聚乙。
13、二醇（PEGPLLAPEG）、聚乳酸羟基乙酸聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸（PLGAPEGPLGA）或聚乙二醇/聚乳酸羟基乙酸（PEG/PLGA）接枝聚合物等，其中以PLGAPEGPLGA最为优选。PLGAPEGPLGA聚合物主要采用开环聚合的方法合成，通过调节合成材料如聚乙二醇的分子量和质量百分数、丙交酯和乙交酯的摩尔比，可以调整聚合物的相转变温度。合成聚合物的组成为聚乳酸羟基乙酸质量百分比5075，聚乙二醇分子量介于10002000DAL，质量百分比为2550，合成聚乳酸羟基乙酸链段的丙交酯摩尔百分比为6080，乙交酯的摩尔百分比为2040。0012载多西他赛纳米胶束可以采用直接溶解法、乳化溶剂挥。
14、发法、透析法等制备，其中以直接溶解法制备更优。优选方法为取双蒸水配制的PLGAPEGPLGA共聚物溶液1ML，加入多西他赛无水乙醇溶液，涡旋震荡3MIN，超声分散10MIN，10000R/MIN离心5MIN，上清液即为载多西他赛共聚物纳米胶束。载药纳米胶束真空冷冻干燥，60CO辐照灭菌后，4环境保存备用。多西他赛与PLGAPEGPLGA聚合物的质量百分比为120至15，其中以120为最佳配比，即20份的PLGAPEGPLGA聚合物中含有1份多西他赛，所制备的载药纳米胶束具有理想的载药率和包封率。采用直接溶解法制备多西他赛纳米胶束，使多西他赛纳米胶束中的多西他赛在水中的溶解度达到40MG/ML，。
15、比单纯多西他赛提高了近8000倍。多西他赛纳米胶束具有一定的缓释作用，在磷酸盐缓冲溶液中较平稳释放，无明显突释效应，68H累积释放7883WT。制备成缓释的多西他赛纳米胶束对小鼠的毒性明显降低，静脉注射说明书CN102335119ACN102335127A3/6页5的小鼠半数致死量为2735MG/KG，明显高于多西他赛的473MG/KG。载多西他赛纳米胶束具有温度敏感性，在环境温度低于385时呈透明的液体，提高温度到385度以上则变浑浊，显微镜下观察可见长约50UM，宽约15UM的“纺锤形”栓塞剂。0013本发明所述的一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂的具体制备方法，包括如下步骤1。
16、）采用开环聚合法合成PLGAPEGPLGA三嵌段共聚物分别称取相对分子质量为1500和2000的PEG，在95真空环境中干燥，然后加入丙交酯和乙交酯，继续真空干燥后，加入催化剂氯化亚锡，充入氮气，在140条件下反应，抽真空，自然冷却，得淡黄色的PLGAPEGPLGA共聚物；2）采用直接溶解法制备载药共聚物纳米胶束以双蒸水配制质量分数为5的步骤1）制备获得的PLGAPEGPLGA三嵌段共聚物溶液，加入浓度为100MG/ML的多西他赛无水乙醇溶液，涡旋震荡，超声分散，离心获得上清液，上清液即为载多西他赛共聚物纳米胶束；3）载多西他赛共聚物纳米胶束真空冷冻干燥，60CO辐照灭菌后，4环境保存。001。
17、4本发明所述的肿瘤血管栓塞化疗新制剂在制备抑制肿瘤的药物中的应用。0015本发明所述的一种超声生物效应介导下的肿瘤血管栓塞化疗新制剂在制备超声介导下化疗乳腺癌的药物中的应用。0016本发明的优点为本发明制备的多西他赛温敏型胶束通过裸鼠尾静脉注射，超声波辐照裸鼠皮下移植肿瘤，使肿瘤局部温度升高，通过血液循环到到肿瘤局部的多西他赛纳米胶束发生相转变，形成微米级的栓塞剂，栓塞肿瘤局部血管，并在局部释放药物，达到化疗与栓塞的双重效果。此外，超声波空化效应、机械效应等可预防肿瘤细胞发生多药耐药。本发明用于提高肿瘤局部温度的方法包括超声辐照、红外线等多种物理方法，其中以超声辐照为佳。本发明操作非常方便，避。
18、免了TACE的放射污染，全身毒副作用低。本发明可适用于机体大部分肿瘤，包括乳腺、甲状腺、肝脏、胰腺、肾脏、卵巢、腹膜后等多种肿瘤。附图说明0017图1为多西他赛纳米胶束的扫描电镜图（200000）。0018图2为多西他赛纳米胶束发生相转变，形成微米级栓塞剂图（40）。0019图3为本发明的多西他赛纳米胶束体外释放曲线图。0020图4A为本发明的乳腺癌栓塞化疗前的超声造影图。0021图4B为本发明的乳腺癌栓塞化疗后的超声造影图。具体实施方式0022下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明实施例1PLGAPEGPLGA的合成采用开环聚合法合成PLGAPEGPLGA三嵌段共聚物。分别称取相对分子质量。
19、为1500和2000的PEG各15G，在95真空环境中干燥3H，加入36G丙交酯、2G乙交酯，继续真空干燥30MIN，加入催化剂氯化亚锡50MG，充入氮气，在140条件下反应8H后，抽真空30MIN，自然冷却，得淡黄色的PLGAPEGPLGA共聚物。0023实施例2多西他赛纳米胶束的制备采用直接溶解法制备载药共聚物纳米胶束。以双蒸水配制质量分数为5的实施例1制说明书CN102335119ACN102335127A4/6页6备获得的PLGAPEGPLGA三嵌段共聚物溶液1ML，加入多西他赛无水乙醇溶液（质量浓度100MG/ML）25UL，涡旋震荡3MIN，超声分散10MIN，10000R/MIN。
20、离心5MIN，上清液即为载多西他赛共聚物纳米胶束。载多西他赛共聚物纳米胶束真空冷冻干燥，60CO辐照灭菌后，4环境保存备用。多西他赛与PLGAPEGPLGA聚合物的质量百分比为120。载多西他赛共聚物纳米胶束以下简称为多西他赛纳米胶束或纳米胶束或载药纳米胶束。0024实施例3多西他赛纳米胶束的表征配制多西他赛共聚物纳米胶束水溶液，充分超声分散后，滴于覆盖碳膜的铜网上，干燥后用离子镀膜仪溅金，在扫描电子显微镜下观察，可见纳米胶束分散良好，呈类球形（见图1），提高多西他赛纳米胶束溶液温度到385时，纳米胶束转变成微米级的栓塞剂（见图2）。配制实施例2制备获得的多西他赛共聚物纳米胶束水溶液3ML，充。
21、分超声分散后，用激光粒径仪测量载多西他赛纳米胶束的平均粒径为308NM，多元分散系数042。0025采用高效液相色谱检测载药纳米胶束的包封率、载药率。色谱条件C18色谱柱，柱温30，流动相甲醇/水70/30（体积比），流速10ML/MIN，进样量20L，UV检测（227NM）。精密称取多西他赛，加入甲醇溶解成浓度1MG/ML的标准贮备液。精密吸取多西他赛标准储备液005、01、025、05和10ML置于10ML量瓶中，甲醇定容得系列浓度的对照溶液。取20L标准储备液进样，以峰面积（Y）对照溶液浓度（XMG/L）进行直线回归。精密称取实施例2制备获得的载药胶束10MG于5ML离心管中，加入05M。
22、L二氯甲烷，超声破碎促使胶束溶解，再加入25ML甲醇，涡旋10MIN，5000RPM离心10MIN，取上清液20L进样。测定峰面积，代入标准曲线计算多西他赛浓度，实施例2制备获得的的载药纳米胶束的包封率达982WT，载药率达468WT。0026以002MOL/LPH72的磷酸盐缓冲液制备多西他赛纳米胶束溶液（含002WTNAN3、01WT吐温80），于37，80R/MIN恒温摇床下震荡进行体外释放，定时取样，超滤离心管（截留分子量5000DAL）4000G离心10分钟，滤液上样进行高效液相色谱测定多西他赛含量，结果显示实施例2制备获得的多西他赛纳米胶束在磷酸盐缓冲液中释放平稳，无明显突释效应，。
23、3H释放199WT，68H累积释放7883WT（图3）。0027实施例4多西他赛纳米胶束的急性毒性试验取昆明小鼠80只，雌雄各半，体质量为1822G，随机分为10组，每组8只，分别经尾静脉注射按实施例2方法制备获得的载多西他赛共聚物纳米胶束（多西他赛剂量分别为80、120、180、270、405MG/KG）和多帕菲（多帕菲剂量分别为15、23、34、51、76MG/KG）。给药后常规饲养2周，观察小鼠的活动、摄食、毛发等情况，记录小鼠死亡数量。改良寇氏法测得多帕菲静脉注射的小鼠半数致死量为473MG/KG，而载多西他赛共聚物纳米胶束的毒性明显降低，其半数致死量升高达2735MG/KG。由此可见。
24、，制备成缓释的多西他赛纳米胶束对小鼠的毒性明显降低，静脉注射的小鼠半数致死量为2735MG/KG，明显高于多西他赛的473MG/KG。0028实施例5超声热效应观察测定不同超声声强、不同辐照时间大鼠腿部肌肉温度。大鼠乙醚麻醉后将后腿部皮肤剪开暴露腿部肌肉，用电子体温计测量肌肉的基础温度，超声治疗仪输出声强1W/CM2和2W/CM2，分别辐照1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟后测量腿部肌肉温度。大鼠腿部肌肉温度随超声声强的增加和辐照时间的延长而上升（表1）。超声输出声强为1W/CM2，大鼠腿说明书CN102335119ACN102335127A5/6页7部肌肉温度3分钟缓慢上升至382。超声。
25、输出声强为2W/CM2大鼠腿部肌肉温度上升迅速，辐照1分钟温度即达到386。0029表1超声辐照大鼠腿部肌肉温度变化声强1MIN2MIN3MIN4MIN5MIN1W/CM23693713823994052W/CM238640241842425实施例6超声介导多西他赛温敏胶束栓塞肿瘤血管。0030抽取小鼠肝癌H22腹水，用生理盐水调整细胞密度为1107/L，每只昆明种小鼠右腋下接种01ML细胞悬液，建立小鼠皮下移植肝癌模型。取10只荷瘤小鼠，肿瘤最大径约15CM，随机分为对照组与超声介导实施例2制备获得的多西他赛温敏胶束栓塞组。栓塞组小鼠尾静脉注射多西他赛温敏胶束（多西他赛剂量为20MG/KG）。
26、后，肿瘤局部超声波辐照，超声辐照频率840KHZ、声强1W/CM2、时间持续3分钟。超声辐照后，小鼠尾静脉注射超声造影剂SONOVUE进行超声造影，观察肿瘤微循环灌注情况。结果见对照组小鼠肿瘤呈均匀高增强，而栓塞组小鼠肿瘤仅见周边少量增强，表明肿瘤血循环发生障碍（图3），血管栓塞。表明多西他赛温敏胶束具有明显抑制肿瘤的作用。0031实施例6超声介导下实施例2制备获得的多西他赛温敏胶束栓塞化疗裸鼠乳腺癌人乳腺癌细胞株MDAMB231细胞在含10WT胎牛血清、青霉素（100U/ML）的L15培养基中，37、饱和湿度、5WTCO2条件下传代培养。大量扩增细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞并用生理盐水调整细。
27、胞密度为1107/L，每只裸鼠右下腹乳头皮下接种01ML细胞悬液，建立荷人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。0032裸鼠皮下接种肿瘤细胞15天后，游标卡尺测量肿瘤最大长径，选取肿瘤最大径0810CM裸鼠30只，随机分为6组，每组5只，乙醚吸入麻醉后，给予相应治疗。0033模型组M未经处理。0034空白胶束组BM尾静脉注射5WT空白胶束02ML。0035多帕菲组D尾静脉注射多帕菲，多帕菲剂量为20MG/KG。0036实施例2制备获得的多西他赛胶束组DN尾静脉注射多西他赛胶束，胶束浓度为5WT，多西他赛剂量为20MG/KG。0037多帕菲超声辐照组DU尾静脉注射多帕菲，多帕菲剂量为20MG/KG；肿瘤局部。
28、超声辐照。0038实施例2制备获得的多西他赛胶束超声辐照组DNU尾静脉注射多西他赛胶束，胶束浓度为5WT，多西他赛剂量为20MG/KG；肿瘤局部超声辐照。0039裸鼠尾静脉注射给药前药物均经针头滤器过滤（02M）处理。超声辐照组于裸鼠尾静脉药物注射完毕后立即进行肿瘤局部超声辐照。治疗时将超声治疗仪探头置于治疗部位表面。超声辐照频率840KHZ、声强1W/CM2、时间持续3分钟，每周治疗1次。0040裸鼠每周采用游标卡尺测量肿瘤长径L和垂直于L径的最大横径W，按公式计算肿瘤体积瘤体积LW2/2。空白胶束组裸鼠肿瘤呈持续生长，肿瘤体积与模型组差异无统计学意义。多帕菲组、多西他赛纳米胶束组、多帕菲联。
29、合超声辐照组肿瘤生长速度较缓慢，而多西他赛纳米胶束超声辐照组肿瘤生长则明显受到抑制，与各实验组差异均有统计学意义（P005）（表2）。由图4A和图4B以及表2可知，实施例2制备获得的多西他赛胶束超说明书CN102335119ACN102335127A6/6页8声辐照组的抑瘤率是现有治疗方法疗效最佳组的2倍，效果明显。0041表2超声辐照联合多西他赛纳米胶束实验的抑瘤作用肿瘤体积（CM3）抑瘤率（）模型组162370空白胶束组155321432多帕菲组1262352222多西他赛胶束组9562084100多帕菲超声辐照组1023613704多西他赛胶束超声辐照组260528395P005，与多西他赛胶束超声辐照组比较。说明书CN102335119ACN102335127A1/3页9图1图2说明书附图CN102335119ACN102335127A2/3页10图3图4A说明书附图CN102335119ACN102335127A3/3页11图4B说明书附图CN102335119A。