治疗动脉粥样硬化的N乙酰半胱氨酸复合药物制剂.pdf

本发明提供一种治疗动脉粥样硬化的N-乙酰半胱氨酸复合药物制剂，主要是由N-乙酰半胱氨酸、丹参酚酸按重量份数比制成，以NAC和丹参为主要活性成分制成复合药物制剂，治疗动脉粥样硬化，通过抗氧化作用对其进行干预，抑制MMP-2的产生，具有明显的医学疗效。

1、  一种治疗动脉粥样硬化的N-乙酰半胱氨酸复合药物制剂，主要是由以下原料按重量份数比制成的：
N-乙酰半胱氨酸10~30mg、丹参酚酸50~200mg。

2、  权利要求1所述的复合药物制剂，其特征在于主要是由以下原料按重量份数比制成的：
N-乙酰半胱氨酸15mg、丹参酚酸100mg。

3、  权利要求1或2所述的复合药物制剂为药物学上的任何剂型。

治疗动脉粥样硬化的N-乙酰半胱氨酸复合药物制剂
技术领域
本发明提供了一种治疗动脉粥样硬化的N-乙酰半胱氨酸复合药物制剂，属于中西药联合制药技术领域。
背景技术
本发明涉及的N-乙酰半胱氨酸(以下简称：NAC)，结构式如下：

分子式：C₅H₉NO₃S，分子量为163.19。
N-乙酰半胱氨酸作为药物，目前主要用于治疗呼吸系统感染，如急慢性支气管炎，慢性阻塞性肺病，肺气肿，支气管扩张症和胶稠性粘液症等，在治疗动脉粥样硬化疾病未见报道。
丹参主要用于治疗月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心绞痛。其活性成分有脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚性酸类化合物两大类，脂溶性成份有丹参酮I、丹参酮IIa、丹参酮IIb、隐丹参酮等；水溶性成份有原儿茶醛、丹参酸甲(丹参素)、丹参酸乙、镁-丹参酚性酸B(LSA-B)等。
经检索未见二者在动脉粥样硬化中联合治疗作用机制的研究。
发明内容
本发明提供一种治疗动脉粥样硬化的N-乙酰半胱氨酸复合药物制剂，用二者制备的抗动脉粥样硬化的药物包括药物学上的任何剂型。
本发明的复合药物制剂，主要是由以下原料按重量份数比制成的：
N-乙酰半胱氨酸10~30mg、丹参酚酸50~200mg；
最佳比例：
N-乙酰半胱氨酸15mg、丹参酚酸100mg。
具体制备工艺如下：
按比例称取N-乙酰半胱氨酸、丹参酚酸，依据常规的药物制剂制备工艺制成相应的药物。
以下实验表明本发明对动脉粥样硬化的治疗效果：
1实验目的
通过本发明制剂对兔动脉粥样硬化(AS)的干预治疗研究，从其抗氧化的角度，探讨二者对MMP-2、ox-LDL的作用。
2、药物
注射用丹参(冻干)哈药集团中药二厂生产，国药准字Z10970093；
丹参酚酸长春市中医中药研究所由丹参中提取得到；
NAC(富露施)           海南金晓制药公司产品；
本发明复合制剂。
3、动物
新西兰白兔40只，雌雄不分，体重2.17-2.62kg/只，由吉林大学第二医院动物实验中心提供。
4、实验方法
4.1、动物模型的建立
新西兰白兔40只，每只白兔性别不限，单笼喂养，饮水不限，全部给予高脂饮食3天，直到白兔适应高脂饮食，准备手术建立模型。测量体重，给予氯胺酮麻醉，剂量按5mg/kg，麻醉不满意，可追加2.5-5mg/kg。麻醉满意后颈前区备皮，常规消毒、铺巾，纵行切开颈部正中皮肤、皮下组织，切口上至颌下，下至胸骨剑突，分离颈前肌及右前斜角肌，见颈动脉鞘，切开动脉鞘，分离颈总动脉上至颌下，下至胸骨剑突，分离颈内及颈外动脉，在颈内动脉上端及颈总动脉下端分别预留一条3号丝线，1.0细可吸收线结扎颈外动脉远端，不剪断结扎线。拉紧颈内动脉上端及颈总动脉下端丝线，在颈外动脉上剪一小口，约管壁的1/2，提起结扎线，向心方向插入2F动脉导管(Cordis)，插入深度约4cm，向动脉导管内注入0.2ml生理盐水(压力约6-10atm)，使球囊膨胀，球囊与管径为2.5mm，向切口拉伸，持续约30秒，放出生理盐水，再次插入动脉导管，共拉伸3次，拔除动脉导管。结扎颈外动脉近端，伤口撒入青霉素1g，缝合皮肤及皮下组织，术后将白兔放入兔笼单独饲养。将白兔随机分为四组，对照组(n＝10只)只给予含1％胆固醇+5％猪油+6％蛋黄粉+88％普通饲料的兔颗粒饲料，NAC组(n＝10只)给予含1％胆固醇+5％猪油+6％蛋黄粉+88％普通饲料的兔颗粒饲料，同时给NAC治疗；丹参组(n＝10只)，在给予高脂饮食(配方同NAC组)的同时，给予丹参治疗；合用组(n＝10只)，在给予高脂饮食(配方同NAC组)的同时，给予本发明复合制剂。给予丹参粉针，皮下安置Alzet离子泵，按成人公斤体重(8mg/kg)静脉泵注6周。给予NAC的方法，在给水瓶中加入NAC，剂量为15mg/kg，给水量为200-300ml左右，为白兔一天饮水量，保证药物当天服完。四组动物均饲养三个月。
4.2、标本的留取
三个月后经所有白兔耳缘静脉取空腹血，标本离心后取血清，于-20℃保存，分别待测血清pro-MMP-2、MMP-2、ox-LDL Ab水平。三个月后处死动物，切下主动脉粥样硬化斑块标本，用10％中性甲醛固定，做石蜡切片及免疫组织化学染色。
4.3、MMPS检测
血清中MMPs检测应用SDS-Page-Zymography法。取各组白兔血清2ul加入离心管中，加入Tris-GlycineSDS Sample Buffer14μl，放入Vortex中震荡混均1分钟，Warning机离心1分钟，放入95℃水中温育10分钟，进行电泳(胶中含有10％polyacrylamide，并且含有1mg/mlGelatin，电泳液含1.5％ Tris、7.2％Glycine)，电压为120伏，时间为60分钟，电泳结束后把蛋白胶放入25％TritonX-100清洗30分钟，放入培养液中(含50mMTris-Hci、10mM Cacl₂)培养12小时后、30％甲醇、10％冰醋酸固定1h，0.05％ Colloidal Brilliant Blue-250染色4-12h，凝胶成像分析系统计算机测胶中MMPs的白色区带的亮度和面积，单位为INT·mm2。电脑自动读取每条带的密度相对定量值。
4.4、ox-LDL抗体检测
4.4.1 实验原理
血清标本与ox-LDL(与酶标孔结合)和天然LDL(与TSP板上标孔结合)自发孵育。随后抗ox-LDL抗体，从血清结合到酶标板上，使用氧化酶标记的二抗检测血清中的IgG和IgM。
4.4.2 实验材料
MTP 12条/8孔ox-LDL结合的酶标版；
TSP 天然LDL结合的TSP板；
CAL 标准品5瓶每样1瓶(>50Ul/viad)
CONTROL-阴性质空血清，含有NaN3；
CONTROL+阳性质空血清，含有NaN3；
BUPWASH 10×洗涤液10倍浓度；
DIL SPE样品缓冲液；
CONJ a(humIg(G+M))：HRP辣根过氧化酶(二抗)；
SUBS TMB TMB溶液，HRP底物；
SOLN STOP停止液(含硫酸有腐蚀性)；
4.4.3 实验步骤
自冰箱中取出待测血清，室温放置30分钟后，按1：100稀释10uL血清。在96孔酶标板中加入待测得稀释血清及标准品100uL，常温下孵育1小时，200uL洗涤液洗涤酶标板3次，排干残液，加入100uL辣根过氧化物酶结合物，常温封闭孵育30分钟，洗涤3次。加入100uL反应底物，常温暗处反应10分钟后加入100uL停止液，于450nm下测量光密度值，单位用ug/dL表示。
4.4.4 测定结果计算
(1)各测定孔OD值减空白对照孔(0ug/dL)OD值，为测试实际OD值。
(2)以标准品100、50、25、10.0、5.0、2.5、0ug/dL之OD值在半对数纸作图，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。
(3)根据每个测定样品的实际OD值在该曲线图上查得各自含量(ug/dL)。
4.5 免疫组织化学染色及图像分析
切片制备粥样斑块标本及正常组织标本取出后，盐水冲洗干净，浸泡在10％中型甲醛固定6-8小时，常规脱水透明处理后石蜡包埋，做4μm厚的连续切片，放在经多聚赖氨酸处理过的玻片上，37℃烤片过夜，4℃保存。
免疫组化染色采取两步法染色：
1.石蜡切片脱蜡和水化，用0.01MPBS液冲洗3min×3次。
2.用0.1M枸橼酸盐热修复，98℃左右5min，室温冷却。
3.加入50ul过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育10min，阻断内源性过氧化物酶活性。
4.0.01M PBS冲洗3min×3次。
5.滴加1：100稀释的一抗(鼠抗人)，4℃过夜。
6.0.01MPBS冲洗3min×3次。
7.滴加50ul的1：800稀释的用辣根过氧化酶标记的二抗(抗鼠)，室温下孵育10min。
8.0.01MPBS冲洗3min×3次。
9.滴加100ul新鲜配制的DAB显色液。
10.自来水冲洗，苏木素轻度复染，弱氨水返蓝。
11.0.01MPBS冲洗3min×3次。
12.梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封胶片，显微镜观察并摄片。
13.以PBS代替一抗作为阴性对照，重复上述方法染色。
图像分析
泡沫细胞计数方法在100倍镜下，用显微镜坐标线定位管壁厚度，计数坐标线上呈棕黄色颗粒的泡沫细胞个数，采取三个部位取平均值。
血管形态学观察石蜡切片按规定处理后，HE染色，40倍、100倍显微镜下拍照。使用计算机辅助(徐州翰林公司)的病理分析软件在40倍物镜下测量新生血管内膜面积、管壁厚度及管腔面积。
5 结果
5.1、兔血清pro-MMP-2、MMP-2水平变化
三个月后合用组血清pro-MMP-2、MMP-2水平明显低于对照组、NAC组和丹参组(P<0.05)，表明本发明制剂降低血清中pro-MMP-2、MMP-2的作用较二者单用明显。(见表1、图1、图2)。
表1.兔血清pro-MMP-2、MMP-2水平变化(x±s，INT.mm²)