一种快速繁育疣粒野生稻的方法 【技术领域】
本发明涉及植物组织培养技术，主要是一种快速繁育疣粒野生稻的方法。
背景技术
野生稻具有许多优异特性及其相应的优良基因，这些野生优良基因的发掘利用直接关系到水稻的生产。我国杂交水稻研制成功的决定性因子是发现并利用了普通野生稻的雄性不育胞质。在水稻上首次克隆的Xa21广谱抗白叶枯基因来源于非洲的长雄野生稻。
疣粒野生稻(O.meyeriana)是我国现存的三种野生稻之一，经鉴定它对白叶枯的抗性达到高抗接近免疫(彭绍裘，1981)，抗性持久，是最理想的抗病育种材料。疣粒野生稻染色体组型为GG组。疣粒野生稻受土壤气候环境等影响自然栽培十分困难。
疣粒野生稻在我国的云南省和海南省有零星分布。一般分布面积极其小。在海南省仅分布在中南部的9个县，如尖峰岭至雅加大山，英哥岭至黎母山大本山至五指山，吊罗山至七指岭的分支山脉背北向南的山坡上。
云南疣粒野生稻集中分布在哀牢山脉以西的滇西南，东至绿春、元江为界。澜沧江、怒江、红河、李仙江、南汀河等几条河流下游地段是主要分布区。由于疣粒野生稻为旱生，多分布在这些地段的山坡上。分布海拔为50～1000m。海南岛疣粒野生稻分布在最低海拔为50m，最高800m，大部分处在600～800m之间。疣粒野生稻常分布于山坡的灌、乔木有竹林、橡胶林、野芭蕉等。特点是旱生喜荫，生长在灌木林、竹林下，以至橡胶树林边等阳光散射不强或荫蔽山坡上，一般适应温度不低于20℃，是湿润生境下的短日照植物。与杂草共栖、丛生或散生。分布海拔要比普通野生稻及药用野生稻为高。
疣粒野生稻非常耐旱，有的灌木林地势陡峭，土壤保水力差，时有旱情，但它们在这样环境中衍生不灭。在有机质丰富、肥力高的中性土壤中，茎叶生长繁茂，而在肥力低的土壤上，植株矮小，穗短粒小。
形态特征：疣粒野生稻为多年生草本，根为须根，不发达。具地下茎，植株矮，丛状散生，株高40-110cm，一般为50-60cm，具5-9节。叶鞘长5-8厘米，短于其节间；叶呈短披针形，叶色深绿，叶片坚硬，有些类型叶片光滑无毛，叶舌长1-2毫米，叶片长5-20厘米，宽6-20毫米，基部圆形。圆锥花序简单，直立，长3-12厘米，分枝2-5，颖退化仅留痕迹；不孕外稃锥状，具1脉；孕性外稃无芒，顶端钝或有短小的3齿，表面具不则的小疣点；雄蕊6，花药黄白色；柱头2，白色。疏生小穗；小穗长圆形，颖果长3-4毫米。穗长6-11cm左右，粒数少，一般10粒左右，最多21粒，形成简单圆锥花序。结实率高，籽粒充实，小穗倒卵圆形，护颖小，颖面无毛，有不规则的疣粒突起，是其特点。颖绿色无芒。成熟后谷粒多呈紫黑色，米皮多红色，易落粒。
疣粒野生稻是我国最优秀的抗病育种资源，但因数量少野生性强限制了育种进程，疣粒野生稻原生境遭到严重破坏。原生地农民有使用治草剂的习惯，疣粒野生稻在不知情的情况下遭到严重破坏，有的地区疣粒野生稻有根治的危险。
疣粒野生稻异地栽培主要通过土壤调节和人工模拟气候的条件下生长。
因此研制一种快速繁育疣粒野生稻的新方法，为保护我国濒危的野生稻资源有非常重要的意义。
【发明内容】
本发明目的是要解决以上现有技术的缺陷，提出一种快速繁育疣粒野生稻的方法。
本发明实现上述目的所采用的技术方案。这种快速繁育疣粒野生稻的方法，其特征在于：该方法按以下步骤进行：
(1)、外植体的选取与灭菌：取疣粒野生稻的嫩芽，经表面灭菌处理，作为组培快繁用的外植体材料；
(2)、植株再生培养：在植株再生培养基中培养，形成一丛致密的不定芽；
(3)、植株壮苗培养：将这些致密的不定芽在植株壮苗培养基中培养，进一步长成4-6cm高的再生植株；
(4)、植株增殖培养：在增殖培养基进行继续培养，直到再生的疣粒野生稻植株增殖到一丛15株左右高4-6cm的再生植株；
(5)、生根培养：将一丛15株左右的疣粒野生稻植株切割成3株一丛转入生根培养基；
(6)、植株移栽：4-6cm高的再生疣粒野生稻植株移植于蛭石基质中；
其中，基本培养基：基本培养基选用NBL或1/2NBL培养基，蔗糖为20g/L或30g/L，琼脂为7-9g/L，pH 5.6-5.8；
植株再生培养基：NBL+6BA 1.5-2mg/L+2，4D 0.5-1mg/L+蔗糖为20g/L；
植株壮苗培养基：NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；
植株增殖培养基：①.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2，4-D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；②.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2，4D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；
生根培养基：1/2NBL+NAA 0.5mg/L+蔗糖为30g/L+1％活性碳。
作为优选，在所述步骤(1)之前先进行疣粒野生稻的预处理：取刚出土的疣粒野生稻嫩芽用湿毛巾包裹放置25土2℃，湿度在100％条件下暗培养4小时。
作为优选，各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为22土2℃，愈伤组织诱导培养采用暗培养，直至愈伤组织出现。愈伤组织诱导培养，愈伤组织，增殖培养，胚状体分化培养，胚状体增殖培养，植株再生培养，植株壮苗培养，植株增殖培养光照为1500-2500Lux，每天12小时光照。
本发明的有益效果是：
(1)、提出的组织培养快速繁殖方法是取疣粒野生稻的嫩芽在特定的无菌培养基直接分生出大量的不定丛生芽，高频率再生植株，既方便又高效，节约成本。
利用植物组织培养技术优势，在短期内快速大量繁殖疣粒野生稻组织培养苗，增殖速度快，生产周期短，繁殖系数高，可实现规模化生产，年组织培养生产能力培养室面积100平方米达100万苗以上，解决了疣粒野生稻资源不足的问题。为疣粒野生稻生物基因研究提供材料基础。
(2)、提出的组织培养快速大量繁殖得到的组织培养试管苗，遗传性一致，克服了常规种子繁殖后代易变异的缺点。
(3)、提出的组织培养快速繁殖方法，采用外植体材料少，可有效挽救珍稀濒危植物，有利于保护野生资源。
【具体实施方式】
通过以下实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：这种快速繁育疣粒野生稻的方法，具体步骤如下：
(1)疣粒野生稻的预处理：取刚出土的疣粒野生稻用湿毛巾包裹放置在25土2℃，湿度在100％条件下暗培养4小时；
(2)、外植体的选取与灭菌：取疣粒野生稻的嫩芽，经表面灭菌处理，作为组培快繁用的外植体材料；
(3)、植株再生培养：在植株NBL+6BA 1.5-2mg/L+2.4D 0.5-1mg/L+蔗糖为20g/L再生培养基中培养，形成一丛致密的不定芽；
(4)、植株壮苗培养：将这些致密的不定芽在：NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA0.5-1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；植株壮苗培养基中培养，进一步长成4-6cm高的再生植株；
(5)、植株增殖培养：在①.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2，4D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；②.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA0.5-1mg/L+2，4D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；增殖培养基进行继续培养，直到再生的疣粒野生稻植株增殖到一丛15株左右高4-6cm的再生植株；切割成3株一丛转入生根培养基1/2NBL+NAA 0.5mg/L+蔗糖为30g/L+1％活性碳培养生根。
(6)、植株移栽：4-6cm高的再生完整的疣粒野生稻植株移植于蛭石基质中。
该实施例中各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为22土2℃，愈伤组织诱导培养采用暗培养，直至愈伤组织出现。愈伤组织诱导培养，愈伤组织，增殖培养，胚状体分化培养，胚状体增殖培养，植株再生培养，植株壮苗培养，植株增殖培养光照为1500-2500Lux，每天12小时光照。
实施例2：这种快速繁育疣粒野生稻的方法，具体步骤如下：
(1)、疣粒野生稻的预处理：取刚出土的疣粒野生稻用湿毛巾包裹放置在25土2℃，湿度在100％条件下暗培养4小时；
(2)外植体的选取与灭菌：取疣粒野生稻的嫩芽，经表面灭菌处理，作为组培快繁用的外植体材料；
(3)、无菌苗培养：将表面灭菌处理过的疣粒野生稻嫩芽接种在无激素培养基中，培养无菌苗；
其中，基本培养基：基本培养基选用NBL或1/2NBL培养基，蔗糖为20g/L或30g/L，琼脂为7-9g/L，pH 5.6-5.8；
植株再生培养基：NBL+6BA 1.5-2mg/L+2.4D 0.5-1mg/L+蔗糖为20g/L；
植株壮苗培养基：NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；
植株增殖培养基：①.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA0.5-1mg/L+2.4D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；②.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2.4D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；
生根培养基：1/2NBL+NAA 0.5mg/L+蔗糖为30g/L+1％活性碳；
(4)、愈伤组织诱导培养：将疣粒野生稻幼嫩芽切成0.02cm左右接种在①.NBL+6BA 0.5-1mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2.4D 2-3mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L愈伤组织诱导培养基中，培养愈伤组织；
(5)、愈伤组织增殖培养：将诱导出的愈伤组织接种在NBL+6BA 0.5-1mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2.4D1-2mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L愈伤组织增殖培养基中进行增殖培养；
(6)、胚状体分化培养：将愈伤组织接种在1/2NBL+6BA 0.5-1mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2.4D1-2mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L的胚状体分化培养基中培养；
(7)、胚状体增殖培养：胚状体接种在1/2NBL+6BA 0.1-0.5mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2.4D1-2mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L胚状体增殖培养基中培养；
(8)、植株再生培养：在NBL+6BA 1.5-2mg/L+2.4D 0.5-1mg/L+蔗糖为20g/L；植株再生培养基中培养，形成一丛致密的不定芽
(9)、植株壮苗培养：将这些致密的不定芽在NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；植株壮苗培养基中培养，进一步长成4-6cm高的再生植株；
(10)、植株增殖培养：在①.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA 0.5-1mg/L+2.4D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；②.NBL+6BA 1.5-2mg/L+NAA0.5-1mg/L+2.4D 0.5mg/L水解乳蛋白1g/L+蔗糖为20g/L；增殖培养基进行继续培养，直到再生的疣粒野生稻植株增殖到一丛15株左右高4-6cm的再生植株；切割成3株一丛转入生根培养基1/2NBL+NAA 0.5mg/L+蔗糖为30g/L+1％活性碳培养生根。
(11)、植株移栽：4-6cm高的再生完整的疣粒野生稻植株移植于蛭石基质中。
该实施例中各组织培养阶段的培养条件是，培养温度为22土2℃，增殖培养，胚状体分化培养，胚状体增殖培养，植株再生培养，植株壮苗培养，植株增殖培养光照为1500-2500Lux，每天12小时光照。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采取等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。