丝素蛋白多孔三维材料及其制备方法.pdf

本发明涉及一种多孔材料及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，制备多孔三维材料的技术。将丝素蛋白溶液注入金属模具中，在-10～-80℃的低温条件下经1～24小时的快速冷冻，得到冷冻体；在温度为-5～-25℃的条件下保存2～60天，得到冷冻结晶体再进行解冻、干燥处理，得到丝素蛋白多孔三维材料。该材料中的丝素蛋白为丝素I型结晶结构，因此，它不溶于水，并能在一段时间内完全降解，最终降解产物为无毒性的氨基酸；材料具有孔径为10～500微米的相互贯通的孔隙，其孔隙、孔径较大，适合于细胞生长；同时，制备过程中不需要添加任何化学交联剂、发泡剂或变性剂，保持了丝素蛋白良好的生物相容性。

1.  一种丝素蛋白多孔三维材料，它以家蚕丝素蛋白为原料，其特点在于：它具有孔径为10～500微米的相互贯通的孔隙；所述丝素蛋白的结晶结构为丝素I型结晶结构，结晶度大于15％。

2.  根据权利要求1所述的一种丝素蛋白多孔三维材料，其特点在于：它的孔隙率为80％以上。

3.  一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，先将家蚕丝经脱胶、溶解、透析、浓缩后得到质量浓度为1～30％的丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的加工：
第一步：将丝素蛋白溶液注入金属模具中，在-10～-80℃的低温条件下经1～24小时的快速冷冻，得到冷冻体；
第二步：在温度为-5～-25℃的条件下将上述冷冻体低温保存2～60天，得到冷冻结晶体；
第三步：对冷冻结晶体进行解冻处理，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料，再经干燥处理，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。

4.  根据权利要求3所述的一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，其特征在于：第三步中所述的解冻处理为在室温下或水浴中进行。

5.  根据权利要求3所述的一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，其特征在于：第三步中所述的干燥处理为在室温中晾干或烘箱中烘干处理。

丝素蛋白多孔三维材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种多孔材料及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，制备多孔三维材料的技术，所制备的材料可应用于生物医学、生物技术、组织工程等技术领域。
背景技术
生物医用材料特别是组织工程支架材料、组织修复再生材料等，在要求所使用的生物材料具有良好的生物相容性的同时，还必须具备一定的生物活性、生物可降解性和三维多孔结构。
蚕丝由约75％的丝素和约25％的丝胶所组成，是相当纯的天然蛋白纤维。研究表明丝素蛋白无毒、无刺激性，具有良好的生物相容性，并具有一定的生物可降解性。近年来，通过对多种生物材料的对比研究表明，丝素蛋白具有与胶原蛋白同等的体内、体外生物相容性(Biomaterials，2003，24(3)：401-416)。因此，丝素蛋白是较理想的制造生物医学材料的原料。
丝素蛋白的结晶形态主要有丝素I和丝素II两种。其中丝素II结晶是一种伸展的反平行β—折叠结构，丝素I结晶则是介于蛋白质β—折叠结构和α—螺旋结构中间的一种曲柄型结构。蚕丝纤维中丝素蛋白的结晶形态主要是丝素II结晶，从5龄蚕的绢丝腺中得到的液态丝素蛋白不做拉伸或者化学处理，在0～40℃缓慢干燥可以得到丝素I结晶。作为生物材料使用的丝素蛋白，必然涉及到这两种主要的丝素蛋白结晶结构。蚕丝纤维的降解速度比较缓慢，这是由于反平行β—折叠结构比较规整紧密。非结晶结构的丝素蛋白的降解速度较快，但是非结晶结构的丝素蛋白可溶于水，作为材料使用时需要使用交联剂来降低其水溶性，而这样作的结果有可能会降低其良好的生物相容性。而丝素I结晶作为一种结晶结构，它是不溶于水的，不需要另外添加交联剂；但因其结构比丝素II疏松，所以具有一定的生物可降解性。其生物降解速度介于非结晶结构和丝素II结晶结构的丝素蛋白之间，可以在几个月内完全降解。因此丝素I结晶结构的丝素蛋白适合于制备需要中等降解速度的生物医用材料。
目前，常用的制备丝素蛋白多孔材料的方法有冷冻干燥法、醇类变性法和静电纺丝法等。在本发明作出之前，公开号为CN1118518C的中国发明专利中，公开了一种多孔丝素膜及其制备方法，采用的是冷冻干燥的方法，其丝素蛋白的结构主要为非结晶结构，为了降低材料的水溶性，该方法在丝素蛋白溶液中加入了交联剂，这可能影响到丝素蛋白材料的生物相容性；另外，冷冻干燥法制备的多孔材料，其能制备的材料厚度随着冷冻干燥的时间延长而增加，为膜状，因此其厚度受到有一定的限制。公开号为CN1262579C的中国发明专利“丝素蛋白海绵装状三维多孔材料制备方法”中，采用了有机醇类作为变性剂，促使丝素蛋白的结构向丝素II结晶即β—折叠结构转变，最终使丝素蛋白不溶于水。醇类变性法制备丝素蛋白多孔材料，一方面，有机溶剂有可能影响丝素蛋白材料的生物相容性；另一方面由于丝素II结晶的结构比较紧密，其降解速度比较缓慢，因此在作为生物医用材料应用时可能会受到一定的限制。公开号为CN1844509A的中国发明专利“一种丝素蛋白多孔结构材料的制备方法”中，采用静电纺丝的方法，得到一种丝素蛋白多孔纤维材料。用静电纺丝得到的纤维叠加制成的多孔材料，其孔径较小，在作为生物医用材料应用时可能会受到一定的限制。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种生物相容性好，不溶于水，孔隙、孔径适合于细胞生长，并能在较短时间内完全降解的丝素蛋白多孔三维材料及其制备方法。
为达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种丝素蛋白多孔三维材料，它以家蚕丝素蛋白为原料，其特点在于：它具有孔径为10～500微米的相互贯通的孔隙；所述丝素蛋白的结晶结构为丝素I型结晶结构，结晶度大于15％。该材料的孔隙率为80％以上。
本发明所采用的另一个技术方案是：提供一种上述丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，先将家蚕丝经脱胶、溶解、透析、浓缩后得到质量浓度为1～30％的丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的加工：
第一步：将丝素蛋白溶液注入金属模具中，在-10～-80℃的低温条件下经1～24小时的快速冷冻，得到冷冻体；
第二步：在温度为-5～-25℃的条件下将上述冷冻体低温保存2～60天，得到冷冻结晶体；
第三步：对冷冻结晶体进行解冻处理，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料，再经干燥处理，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。
第三步中所述的解冻处理为在室温下或水浴中进行；所述的干燥处理为在室温中晾干或烘箱中烘干处理。
本发明的原理是：丝素蛋白在快速冷冻形成冷冻体时主要为非结晶结构，如果此时进行解冻处理，丝素蛋白仍然易溶于水中，无法形成多孔材料。当该冷冻体在冰点以下放置时，丝素蛋白大分子的运动被冻结，但分子链段仍然可以运动，并聚集在一起以形成规整的结构来降低体系的自由能。然而，这种运动受到周围冰晶的限制，只能形成丝素I结晶结构而无法形成更加紧密的丝素II结晶结构即β—折叠结构。随着冷冻时间的延长，结晶度逐渐增加，丝素蛋白的溶失率逐渐降低，最终形成不溶于水的多孔材料。在形成丝素I结晶的过程中，丝素蛋白分子聚集在一起，水分子被排除出去，冰晶逐渐长大，形成分相结构，一旦冷冻体解冻，就得到多孔三维材料。由于形成了丝素I结晶结构，丝素蛋白在干燥过程中不容易塌缩，能够保持比较大的孔径和孔隙率。本发明所提供的制备方法，能使丝素蛋白在冷冻体中缓慢结晶形成丝素I结晶结构，结晶度达到15％以上，从而形成不溶于水的多孔三维材料。
本发明具有以下明显优点：
1.由于本发明得到的丝素蛋白多孔三维材料的结构为丝素I结晶，因此，它不溶于水，孔隙、孔径较大，适合于细胞生长，并能在一段时间内完全生物降解，最终降解产物为无毒性的氨基酸。
2.由于采用冷冻结晶法制备丝素蛋白多孔三维材料，所以制备过程中不需要添加任何化学交联剂、化学发泡剂或者化学变性剂，不会引起丝素蛋白生物相容性的降低。
3.在制备过程中，可以通过调节快速冷冻温度、时间和丝素溶液浓度，以及冷冻结晶的温度、时间等工艺参数，控制冰晶的大小、生长速度等，从而能较为方便地达到控制丝素蛋白多孔三维材料的孔结构的目的，以满足各种产品的功能需要。
附图说明
图1是按本发明实施例1技术方案制备的丝素蛋白多孔三维材料和普通丝素纤维材料的X-衍射曲线图；其中，曲线A为丝素蛋白多孔三维材料，曲线B为普通丝素纤维材料。
图2是按本发明实施例1技术方案制备的丝素蛋白多孔三维材料的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
本实施例提供的丝素蛋白多孔三维材料制备步骤如下：
1.将1公斤茧壳放入50升质量浓度为0.5％的中性皂溶液中，于98～100℃处理2小时，使茧壳脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用5升9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。
2.用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液。
3.调节丝素蛋白溶液质量浓度为5％。
4.将丝素蛋白溶液注入不锈钢盒中，在—30℃快速冷冻5小时得到丝素溶液冷冻体。
5.将此冷冻体于—20℃冰箱中保存，冷冻结晶20天。
6.将冷冻结晶后的冷冻结晶体取出，室温放置2小时解冻，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料。
7.将此湿态丝素蛋白多孔三维材料放入30℃烘箱中干燥，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。
参见附图1，它是按上述技术方案制备的丝素蛋白多孔三维材料和普通丝素纤维材料的X-衍射曲线图；其中，曲线A为丝素蛋白多孔三维材料，曲线B为普通丝素纤维材料。由图1可以看出，曲线A中的X-衍射特征吸收峰出现在2θ为12.2°、19.7°、24.7°等位置，说明该被测材料的为丝素I型结晶结构；曲线B中X-衍射特征吸收峰出现在2θ为9.1°、20.7°等位置，说明该被测材料的丝素结晶结构是β—折叠结构。从图1中得到的数据经计算可以知道，本实施例所得到的丝素蛋白多孔三维材料的结晶度约为30％。
参见附图2，它是按本实施例技术方案制备的丝素蛋白多孔三维材料的扫描电镜图。由图2可以看出，本发明所得到的丝素蛋白多孔三维材料的孔隙率比较大，约为90％，并含有比较多的孔，其中，既有直径达到300～500微米以上的大孔，在大孔的孔壁上还分布着孔径小于50微米的小孔，使大孔之间能够通透连接。
实施例2：
将1公斤生丝放入30升质量浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理2小时，使生丝脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用8升摩尔比为1：8：2的氯化钙、水、乙醇溶液，在75±5℃下加热溶解得到丝素蛋白混合溶液。
用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除氯化钙等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液。
调节丝素蛋白溶液质量浓度为2％。
将丝素蛋白溶液注入铝盒中，在—60℃快速冷冻20小时得到丝素溶液冷冻体。
将此冷冻体于—10℃冰箱中保存，冷冻结晶60天。
将冷冻结晶后的冷冻结晶体取出，水浴37℃解冻，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料。
将此湿态丝素蛋白多孔三维材料放入40℃烘箱中干燥，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。该多孔材料最小孔径10微米，最大孔径250微米，平均孔径为50微米，孔隙率为85％。
实施例3：
将100克废蚕丝放入4升质量浓度为0.05％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理0.5小时脱胶，重复处理3次，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用50毫升9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。
用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析3天，得到纯的丝素蛋白溶液。
用10％聚乙二醇溶液浓缩得到质量浓度为15％的丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液注入不锈钢盒中，在—20℃快速冷冻10小时得到丝素溶液冷冻体。
将此冷冻体于—5℃冰箱中保存，冷冻结晶10天。
将冷冻结晶后的冷冻体取出，30℃水浴解冻，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料。
将此湿态丝素蛋白多孔三维材料放入37℃烘箱中干燥，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。该多孔材料最小孔径10微米，最大孔径300微米，平均孔径为80微米，孔隙率为82％。
实施例4：
将200克茧壳放入10升质量浓度为0.3％的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理2小时，使茧壳脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用100毫升9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白溶液。
用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液。
调节丝素蛋白溶液质量浓度为7％。
将丝素蛋白溶液注入铝盒中，在—40℃快速冷冻15小时得到丝素溶液冷冻体。
将此冷冻体于—18℃冰箱中保存，冷冻结晶40天。
将冷冻结晶后的冷冻体取出，室温放置2小时解冻，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料。
将此湿态丝素蛋白多孔三维材料于空气中晾干，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。该多孔材料最小孔径50微米，最大孔径500微米，平均孔径为160微米，孔隙率为92％。
实施例5：
将40克生丝放入5升质量浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理2小时，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维300毫升9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。
将所得的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液。
调节丝素蛋白溶液质量浓度为4％；
将丝素蛋白溶液注入铝盒中，在—16℃快速冷冻15小时得到丝素溶液冷冻体。
将此冷冻体于—10℃冰箱中保存，冷冻结晶5天。
将冷冻结晶后的冷冻体取出，室温放置2小时解冻，得到湿态丝素蛋白多孔三维材料。
将此湿态丝素蛋白多孔三维材料烘箱干燥，得到干态丝素蛋白多孔三维材料。该多孔材料最小孔径70微米，最大孔径500微米，平均孔径为180微米，孔隙率为86％。