干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA，包含其的载体及其应用 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及针对肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因，具体地Atrogin-1和MuRF 1的干扰RNA，包含所述干扰RNA的载体，由所述载体转录的干扰RNA及其在制备用于预防或治疗肌肉萎缩的药物中的应用。
背景技术
“肌肉萎缩”系指骨骼肌肉体积缩小，肌纤维减少或变细甚至消失。多种因素均可导致肌肉萎缩的发生，严重的疾病如乙肝、糖尿病、艾滋病、肾衰竭等。肌肉萎缩的主要表现之一是骨骼肌蛋白分解丢失，其降解通过3类蛋白酶途径：溶酶体蛋白酶、钙依赖蛋白酶和泛素-蛋白酶，后者最为重要。Atrogin-1和MuRF 1都属于肌肉特异性E3泛素连接蛋白酶，发生肌肉萎缩时Atrogin-1和MuRF 1的表达都升高(Claved et al.2006)。Atrogin一1基因含有一个F-box功能结构域，此酶在骨骼肌中特异性地高表达。多种疾病导致的营养不良和骨骼肌萎缩都伴有Atrogin-1基因表达上调(Gomes et al.，2005)。最新的研究显示Atrogin-1的表达量在肌肉萎缩临床症状出现以前就有所提高，说明导致肌肉萎缩，首先产生Atrogin-1基因表达量升高，并使肌肉细胞中蛋白质非正常降解(Glass，2005)。Atrogin-1蛋白降解途径可以与细胞自噬途径协同作用，导致更多蛋白的降解。
为了探讨小RNA在肌肉萎缩中应用的途径，刘长梅等研究了用化学合成的针对Foxo-1基因的干扰RNA经进一步研究有抑制鼠肌肉萎缩的作用(Liu et al.，2007)。刘长梅等还研究了化学合成的针对Myostatin反义RNA对小鼠肌肉萎缩有抑制作用(Liu et al.2008)。通过大剂量的直接注射经过修饰的靶向GDF-8、FOXO-1基因的有效干扰片段，可以明显的观察到小鼠的肌肉质量的改善。由于化学合成的干扰RNA除价格昂贵外，其靶向性差，特异性较低以及作用持续时间短等因素，导致干扰效果欠佳。为了探索应用性更佳的药物施入方式，刘长梅等应用逆转录病毒系统转录的干扰RNA使GDF-8基因沉默，其治疗肌肉萎缩病的效果更好(Yang etal.2008)。
本发明的申请人针对上述问题，设计了针对肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因，具体地Atrogin-1基因和MuRF 1基因的干扰RNA序列，并将其编码DNA序列构建到腺病毒载体或小环DNA载体中，申请人的实验结果证明，本发明设计的干扰RNA序列以及包含其的载体可以有效地抑制肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因Atrogin-1基因和MuRF 1基因的表达，提高疾病发生时的肌肉质量，同时所构建的腺病毒载体转录的干扰RNA相比于化学合成的干扰RNA靶向性更好，特异性更强，具有更好的稳定性，能够克服化学合成干扰RNA的不稳定，药物作用持续时间短，吸收量少的特点，相比于逆转录病毒载体具有更好的安全性，作用效果稳定，而小环DNA系统在此基础上相比于传统的腺病毒载体和逆转录病毒载体还具有更好的安全性，药物作用持续时间长，可以多次免疫的优点。
参考文献
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发明内容：
本发明提供下列：
第一方面，提供一种用于预防和治疗肌肉萎缩的载体转录的干扰RNA。在一个实施方案中，所述干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。在一个实施方案中，所述肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-1基因(SEQ ID NO：7)或MuRF 1(SEQ ID NO：8)基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA靶向所述Atrogin-1的3’端、5’端或中间区域序列和/或所述MuRF 1基因的3’端、5’端或中间区域序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒载体是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2фC31载体。
第二方面，提供一种干扰RNA，其编码DNA序列与上述第一方面的干扰RNA的编码DNA序列相同。
第三方面，提供一种载体，其包含编码上述第一方面或第二方面的干扰RNA的DNA序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。在一个实施方案中，所述肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-1基因(SEQ ID NO：7)或MuRF 1(SEQ ID NO：8)基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA靶向所述Atrogin-1的3’端、5’端或中间区域序列和/或所述MuRF 1基因的3’端、5’端或中间区域序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒载体是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2фC31载体。
第四方面，提供一种载体，其是一种双价载体，包含分别干扰Atrogin-1和MuRF 1的干扰RNA的DNA编码序列。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒载体是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2фC31载体。在一个实施方案中，干扰Atrogin-1的干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO：1，MuRF 1的干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO：4。
第五方面，提供上述第一或第二方面的干扰RNA和/或第三或第四方面的载体在制备预防和治疗肌肉萎缩地药物中的应用。
第六方面，提供一种预防和治疗肌肉萎缩的药物，其包含第一或第二方面的干扰RNA和/或第三或第四方面的载体作为活性成分。
第七方面，提供一种干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的方法，所述方法包括下列步骤：
a)将干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA编码的DNA与载体连接；
b)用所述载体转染包含肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的细胞。在一个实施方案中，所述干扰RNA，其靶向肌特异E3泛素蛋白连接酶基因。在一个实施方案中，所述肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因为Atrogin-1基因(SEQ ID NO：7)或MuRF 1(SEQ ID NO：8)基因。在一个实施方案中，所述干扰RNA靶向所述Atrogin-1的3’端、5’端或中间区域序列和/或所述MuRF 1基因的3’端、5’端或中间区域序列。在一个实施方案中，所述干扰RNA的DNA编码序列是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6。在一个实施方案中，所述载体是病毒载体或质粒载体。在一个实施方案中，所述载体是腺病毒载体或小环DNA质粒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒载体是PDC312载体。在一个实施方案中，所述小环DNA质粒载体是P2фC31载体。
申请人分别根据肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因Atrogin-1基因和MuRF 1基因的5’端，3’端或中间区域序列设计了干扰RNA序列，并将其构建到腺病毒载体和小环DNA载体中，对细胞的转染实验结果显示，其可明显抑制Atrogin-1基因和MuRF 1基因的表达水平，提高Mygod，myosin，myogenin的表达量，对动物水平的药效学检测显示动物的腿部肌肉质量增加，对Atrogin-1基因和MuRF 1基因的表达被抑制，肌肉分化的负调控因子GDF-8表达量下降，小鼠的肌纤维大小增加，肌肉质量得到改善。
实验结果表明，本发明的载体，由载体转录的干扰RNA在降低Atrogin-1基因和MuRF 1基因表达的同时，显著提高肌肉分化因子的表达，降低分化抑制因子的表达，迅速而且高效的诱导细胞分化，抑制I型肌纤维向II型肌纤维的转化，显著提高肌肉质量，说明本发明的载体转录的干扰RNA以及包含其的载体可在肌肉萎缩的治疗和预防中起到至关重要的作用。并且本文构建的载体转录的干扰RNA明显地具有靶向性好，特异性强，更加稳定，并且药物作用效果时间长的优点。同时，观察到由分别干扰Atrogin-1和干扰MuRF 1基因构建的双价载体对预防和治疗肌肉萎缩有增强作用。
【附图说明】
图1.抑制Atrogin-1基因表达的干扰RNA的序列设计及表达载体的构建
图1A.转录载体的构建
图1B.所设计的与siRNA对应的DNA序列及其双链结构、Sal I和1Xba I的酶切位点、转录终止信号(terminal signal)及其形成的环结构(loop)。
图1C.A-3’-1siRNA重组腺病毒的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测。
图2.腺病毒载体转录的siRNA在细胞水平和动物水平对Atrogin-1表达的抑制
图2A.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Atrogin-1基因转录成的mRNA的影响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图2B.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Atrogin-1基因表达的影响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图2C.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC对Atrogin-1基因表达成为蛋白的影响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。β-actin为内参照。为了检测A-3’-1siRNA有无脱靶现象，检测了NFκ-P65，C-FOS转录因子的表达水平。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图2D.饥饿小鼠模型中siRNA对Atrogin-1基因表达成为蛋白的影响，siRNA有明显的抑制作用。β-actin为内参照。为了检测A-3’-1siRNA有无脱靶现象，检测了NFκ-P65，C-FOS转录因子的表达水平，证明无脱靶现象。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图2E.A-3’-1siRNA对饥饿小鼠模型骨骼肌中Atrogin-1表达的影响，siRNA有明显的抑制作用。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图2F.Northen blotting检测A-3’-1siRNA在饥饿小鼠模型骨骼肌中的表达。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图2G.Northen blotting检测A-3’-1siRNA在c2c 12细胞中的表达。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图3.siRNA对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
图3A.siRNA实验组，生理盐水，空载体对照组饥饿小鼠及正常饲养对照组的小鼠体重变化。实验证明，siRNA实验组较生理盐水，空载体对照组饥饿小鼠体重有所增加，饥饿小鼠体重一直处于上升的趋势，而饥饿小鼠的体重无明显变化。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图3B.siRNA对饥饿小鼠腿部肌肉重量的影响。结果显示，siRNA实验组饥饿小鼠的腿部肌肉重量与饥饿对照组小鼠相比有明显增加。Mock为正常饲养的空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图3C.siRNA实验组饥饿小鼠，Mock正常饲养的空白对照，saline生理盐水注射饥饿对照组小鼠，Control空载体腺病毒注射饥饿对照组小鼠腿部骨骼肌病理切片的H&E染色。
图3D.根据肌肉病理切片计算的小鼠模型腿部骨骼肌肌纤维横截面积的变化。注射siRNA的饥饿实验组小鼠与saline生理盐水，Control空载体腺病毒处理的饥饿小鼠对照组相比，肌纤维的面积显著增加。Mock为正常饲养的空白对照。
图3E.siRNA处理饥饿小鼠及saline生理盐水，Control空载体腺病毒对照组饥饿小鼠腿部骨骼肌病理切片的ATPase染色，Mock为正常饲养的空白对照。
图3F.小鼠腿部骨骼肌I型肌纤维横截面积的变化。siRNA实验组饥饿小鼠与saline生理盐水，Control空载体腺病毒处理的饥饿小鼠对照组相比，I型肌纤维的面积显著增加，且II型肌纤维的数目较少。Mock为正常饲养的空白对照。
图4.抑制Atrogin-1对c2c12细胞和肌萎缩小鼠生肌分化的影响
图4A.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物，myosin，myogenin，α-actin表达的影响。siRNA能够明显的提高myosin，myogenin，α-actin的表达量，从而说明siRNA能够显著的提高c2c12细胞的分化，而无关干扰RNA SiHBC，Control空载体重组腺病毒均无明显作用。β-actin为内参照。
图4B.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物myosin表达影响的定量计算。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图4C.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物α-actin表达影响的定量计算。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图4D.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对细胞分化标志物myogenin表达影响的定量计算。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图4E.A-3’-1siRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞分化水平的影响。siRNA够明显的提高小鼠骨骼肌肌细胞中myosin和α-actin的表达量，从而说明siRNA能够显著的提高小鼠骨骼肌肌细胞的分化，Mock空白对照，生理盐水，Control组均无明显作用。β-tublin为内参照。
图4F.A-3’-1siRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中myosin表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图4G.A-3’-1siRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中α-actin表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图5.c2c12细胞和肌萎缩小鼠模型中抑制Atrogin-1的表达对Myod和GDF-8基因表达的影响
图5A.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对GDF-8基因转录成的mRNA的影响，siRNA有明显的抑制作用，而无关干扰RNASiHBC无明显作用。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图5B.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Myod基因转录成的mRNA的影响，siRNA可以显著的提高Myod基因的转录，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图5C.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对GDF-8和Myod基因表达的影响。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图5D.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对GDF-8基因表达影响的定量计算。siRNA可以显著的降低GDF-8基因表达，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图5E.A-3’-1siRNA和无关干扰RNA SiHBC在细胞中对Myod基因表达影响的定量计算。siRNA可以显著的升高Myod基因表达，而无关干扰RNA SiHBC无明显作用。Control为空载体重组腺病毒、Mock为空白对照。
图5F.A-3’-1siRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中GDF-8和Myod基因表达的影响。siRNA够明显的降低小鼠骨骼肌肌细胞中GDF-8，同时提高Myod的表达量。Mock空白对照，Saline为生理盐水，Control为空载体重组腺病毒。β-tublin为内参照。
图5G.A-3’-1siRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中GDF-8基因表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图5H.A-3’-1siRNA对小鼠模型腿部骨骼肌肌细胞中Myod基因表达影响的定量计算。Mock为空白对照，saline为生理盐水，Control为空载体腺病毒。
图6pSUPER-H1载体的图谱。
图7p2фC31载体的图谱。
具体实施方式：
本发明通过下述实施例进行举例说明，所述实施例不限制在权利要求中描述的本发明的范围。
下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法(分子克隆实验指南第二版，1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社。)
实施例一、靶向Atrogin-1基因的干扰RNA序列的设计，载体构建及细胞和动物水平药效学检测。
一、抑制Atrogin-1基因表达的干扰RNA的序列设计及表达载体的构建
1、干扰RNA序列的设计
(1)、靶向Atrogin-1基因3’端的干扰RNA序列的设计
应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计靶向为Atrogin-1基因(SEQ ID NO：7)3’端的干扰RNA序列：所设计的与干扰RNA对应的DNA序列如图1B，干扰序列均为人鼠同源，转录后自身能够形成小发夹结构，以便能成功的被dicer酶识别并剪切，并导致mRNA的降解，。以
Atrogin-3’-1的序列为例，其DNA序列为：
A-3’-1：
5’GATCAAAAACGAAGGAGCGCCATGGATATTCAAGAGATATCCATGGCGCTCCTTCGTTTTT 3’(SEQ ID NO：1)
以下叙述中A-3’-1siRNA在实施例1中简称为siRNA。
(2)、靶向Atrogin-1基因5’端干扰RNA序列的设计
应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计靶向Atrogin-1基因5’端的干扰序列，设计原则同上。以A-5’-1为例，其DNA序列为：
A-5’-1
5’GATCAAAAACTAGTTGACCCACTCTTGTCCTTCAAGAGAGGACAAGAGTGGGTCAACTAGTTTTT 3’(SEQ ID NO：2)
(3)、靶向Atrogin-1基因中间区域序列的干扰RNA的设计
设计原则同上。应用干扰序列设计软件(siRNA design)设计靶向Atrogin-1基因中间区域的干扰序列，设计原则同上。其DNA序列为：
A-M-1：
5’GATCAAAAAGACATTCAGAACAGCAAAGCCGTCAAGAGAGGCTTTGCTGTTCTGAATGTCTTTTT 3’(SEQ ID NO：3)(4)为了检测所设计的靶向Atrogin-1的干扰序列的特异性，设计了靶向乙肝病毒核心抗原的干扰序列siHBC，与其干扰RNA对应的DNA序列为：SiHBC：5’GATCAAAAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGTTCAAGAGACAAGGCACAGCTTGGAGG TTTTT 3’(SEQ ID NO：9)
2、干扰RNA载体的构建
(1)、腺病毒载体的构建
将上述与干扰序列siRNA，siHBC相对应的DNA片段95℃加热10分钟后37℃退火半小时。然后根据分子克隆实验指南(第二版，1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社)和(Baer M et al，1990)，在pSUPER-H1(购自Oligoengine)载体(图6)上后面反向插入一个U6启动子获得pSUPER-H1+U6载体，将上述退火的与干扰序列siRNA相对应的DNA片段(其带有SalI和Xbal酶切位点)与所述pSUPER-H1+U6载体上的相应位点连接，得到pSUPER-H1+siRNA+U6载体，用KpnI和EcoRI切下含有H1+U6双启动子的表达盒(H1+siRNA+U6)连接PUC18载体(购自科宁公司)，得到PUC18+H1+siRNA+U6重组质粒。再由重组后的PUC18+H1+siRNA+U6载体中将H1+siRNA+U6切下并将其和PDC312载体(购自本元正阳)连接，从而将所述表达盒重组到腺病毒载体PDC312上(图1A)得到PDC312+H1+siRNA+U6。PDC312+H1+siHBC+U6的构建方法同上。PCR扩增目的片段，测定序列(奥科测序)证实其可靠性。测序检测，所合成的与干扰序列相对应的DNA片段准确插入PDC312载体的适当位点，腺病毒载体构建成功。
10％DMEM液(100μg/ml潮霉素，1μg/ml嘌呤霉素)培养M293(购自本元正阳)细胞，转染前一天，分细胞到六孔板，37℃，5％CO2培养细胞18小时，待细胞80％联会后，用fugen转染试剂(罗氏公司)，分别按质粒(重量)/转染试剂(微升)2/4的比例将腺病毒骨架质粒与所构建的PDC312+H1+siRNA+U6，PDC312+H1+siHBC+U6，PDC312+H1+U6共转染M293细胞系(转染方法：200微升opti-MEM(购自GIBCO)加入2微克重组质粒，0.2微克骨架质粒，充分混匀后，加入8微升fugen转染试剂，震荡后，室温放置15分钟，缓慢加入六孔板中)，转染一天后换液，继续培养，至病毒噬斑出现，待50％细胞漂浮，吹下细胞，将含细胞的培养液冻融3次，800G离心，取上清用PCR扩增目的片段(图1C)，并测序，上清置-70℃保存。应用225cm2培养瓶培养M293细胞，按每瓶接种1ml的剂量接种重组病毒，每种病毒接种6瓶。培养3天后，50％细胞悬浮，吹下细胞，应用腺病毒纯化试剂盒(购自吉美公司)纯化重组腺病毒，浓缩病毒至1ml，-70℃保存。
3、小环DNA载体的构建
将合成的相对应的干扰序列siRNA的DNA片段95℃加热10分钟后，37℃退火半小时。根据分子克隆实验指南(第二版，1999年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社)和(Baer M et al，1990)，在pSUPER-H1(购自oligoengine)载体上后面反向插入一个U6启动子获得pSUPER-H1+U6载体，所述重组载体经SalI和XbaI双酶切后，与上述退火的所述合成的相对应的干扰序列siRNA的DNA片段相连接构建成pSUPER-H1+siRNA+U6重组质粒，从所述pSUPER-H1+U6载体上用KpnI和SacI切下含有H1+干扰序列+U6双启动子的表达盒与KpnI和SacI双酶切的小环DNA载体(P2фC31载体)(人内皮抑素小环载体的构建及其在真核细胞的表达，中山大学学报，2006，6)(图7)(获自武汉大学分子病毒与免疫实验室)使用KpnI和SacI连接，产生重组质粒。并测定序列。经测序检测，所合成的与干扰序列相对应的DNA片段准确插入小环DNA载体的适当位点，小环DNA载体构建成功。
二、siRNA重组腺病毒在细胞水平和动物水平对Atrogin-1表达的抑制
1、siRNA重组腺病毒在细胞水平对Atrogin-1表达的抑制
应用腺病毒滴度检测试剂盒(购自本元正阳)检测重组腺病毒滴度。用含15％FBS(胎牛血清)的DMEM液(100μg/ml潮霉素，1μg/ml嘌呤霉素)培养c2c12(购自协和医学院)细胞。在转染前24小时，100微升2.5％胰酶消化所述细胞并按每孔104个细胞的数量接种于六孔板中。按细胞数/病毒数＝1∶100的比例将siRNA，siHBC，Mock(空载体腺病毒)重组腺病毒感染c2c12细胞，感染后12小时后，将培养基换为含2％马血清的DMEM液，刺激所述细胞分化24小时后，吸掉上清，将其冰浴用PBS轻轻洗涤3次，其中一板每孔各加0.5mL的RTIZOL试剂(invitrogin)，并提取细胞总RNA，用DEPC(焦碳酸二乙脂)水充分溶解后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用分光光度计测量RNA浓度。采用TAKARA公司的逆转录试剂盒，将RNA逆转录为cDNA。应用SYBgreen方法，将其在ABI7000型REAL-TIME PCR仪上进行检测，通过Ct值计算RNA水平Atrogin-1的表达。
此外，在刺激所述c2c12细胞分化24小时后，吸掉上清，冰浴用PBS轻轻洗涤3次，加入150微升细胞裂解液，待至细胞裂解完全后，吸入1.5ml离心管中，12000转/分，4℃离心10分钟。将上清转移到离心管中，应用Biorad公司的A\B液测量蛋白浓度，12％SDS-PAGE，80V电泳2小时，将所述蛋白通过半干转的方法转移至PVDF膜(Amersham)上(27mA、45min)，考马斯亮蓝染色确定转膜效率，脱色后TBST(Tris-HCI缓冲液(0.5M pH7.6)100ml NaCl 8.5～9g(0.15mol/L)，1ml/L的triton-20)洗涤3次，5％脱脂奶粉封闭过夜，TBST洗涤3次后，加入Atrogin-1抗体(1％脱脂奶粉，抗体1/1000稀释)，37℃孵育1小时，TBST洗涤3次(每次10分钟)后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(购买自中衫金桥)(1％脱脂奶粉，抗体1/3000稀释)，37℃孵育45分钟，TBST洗涤3次后(每次10分钟)，再用超敏发光液显色，压片，洗片。
荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，siRNA对c2c12细胞中Atrogin-1基因RNA水平的抑制效率达到了60％(图2A)，与蛋白表达水平的检测结果一致(图2B)同时分析了转录因子NFκ-P65，C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象(图2C)。
2、siRNA重组腺病毒在动物水平对Atrogin-1表达的抑制
本实验所采用的肌萎缩动物模型为饥饿处理的BALB/C小鼠(购自军事医学科学院)。4周龄的BALB/C雌性小鼠饲养一周(按照中国科学院实验动物管理办法)后，饥饿1天。
将饥饿处理的BALB/C雌性小鼠分为A、B、C、D四组，每组5只。A组按109/只的剂量注射siRNA重组腺病毒，B组按109/只的剂量注射Pdc312重组腺病毒，C组注射生理盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，注射后饲养一周，处死小鼠。
取一定量的小鼠肌肉组织(小鼠骨骼肌)，加RIPA(全组织)裂解液(BIOMED)，加入全蛋白酶抑制剂(罗氏公司)，于冰上匀浆，至细胞完全裂解，离心，取上清，稀释后测量蛋白浓度，即刻上样分析(方法同细胞水平一致)。动物水平的实验结果显示，在肌萎缩小鼠模型中，siRNA重组腺病毒对Atrogin-1的抑制效率达到了60％以上(图2E)，为检测有无脱靶现象，检测了c-Fos和nfkB-P65的表达情况，结果显示该转录因子的表达量并没有明显变化图(2C)。
Northen blotting检测所构建的重组腺病毒在细胞(图2F)和动物肌肉组织中(图2G)的表达情况，结果显示，在c2c12细胞和动物肌肉组织中，siRNA都有较高的表达量。
综上所述，细胞水平和动物水平检测指标显示，siRNA能够有效的降低Atrogin-1基因的表达。
3、小环DNA干扰系统在细胞水平和动物水平对Atrogin-1的抑制
将构建的含有干扰序列表达盒siRNA的小环重组质粒转化DH5a大肠杆菌，挑取单克隆，接于3ml LB液体培养基中，37℃，200RPM培养过夜，按1∶100接于200ml LB液体培养基中，培养12小时，用质粒大提试剂盒(威格拉斯)提取质粒，测浓度，应用fugen转染试剂(罗氏公司)，按质粒(重量)/转染试剂(微升)2/4的比例转染c2c12细胞，转染6小时后，将培养基由15％FBS的DMEM液中更换为含2％马血清的DMEM液中，刺激分化24小时后，进行western blot分析(方法同上)。实验结果显示，在c2c12细胞系中，转染重组小环DNA后(包含siRNA)，有效的抑制了Atrogin-1基因的表达，其抑制效率达60％以上。
将所提质粒按2～0.5微克/只的剂量注射饥饿处理1天的BALB/C小鼠，每天定时称量小鼠体重，1周后检测肌肉重量。结果显示，在肌萎缩小鼠模型中，siRNA重组小环DNA载体对Atrogin-1的抑制效率达到了50％以上。
三、siRNA对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
1、siRNA重组腺病毒对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
将饥饿处理的BALB/C雌性小鼠分为A、B、C、D四组，每组5只。A组按109/只的剂量注射siRNA重组腺病毒，B组按109/只的剂量注射Pdc312重组腺病毒，C组注射生理盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，观察小鼠体重变化(图3A)。注射后饲养一周，处死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。
处死小鼠后，称量其前大腿，和小腿，后大腿，和小腿重量。比较实验组与对照组小鼠腿部肌肉重量变化。实验结果显示，与对照组相比，注射siRNA重组腺病毒的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量与对照组相比增加20-30％(图3B)。
取小鼠后肢大腿，于液氮冷却的异戊烷中迅速冷冻，并储存于液氮中，制作石蜡切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色在光学显微镜下观察并拍照(图3C)。纤维计数和横截面积计量运用ImagePro5.0.1软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD，USA)进行分析，纤维的大小为测量的肌纤维横截面积的平均值，每个肌肉组织样品测量了大约500-700个肌纤维。结果显示，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约25％(图3D)，从而说明在降低Atrogin-1基因表达的情况下，促进肌纤维的生肌分化的同时，能够增加肌纤维的大小，提高肌肉质量。
新鲜获取的肌肉样品(小鼠腿部骨骼肌)在液氮冷却的异戊烷中冷冻，保存于液氮中。将样品在恒冷切片机中切片，随后进行三磷酸腺苷酶(ATPase)染色：切片首先孵育(37℃)在酸性预培养液中(95mM CH3COONa，99mM KCl，pH 4.2)，然后孵育在ATP培养液中(2.8mM ATP，47.5mMNaOH，65mM NaCl，52.75mM glycine，37.8mM CaCl2，pH 9.4)。肌纤维类型通过着色深浅来区分(typeI＞type II)，分析平均纤维面积和纤维类型(图3E)。纤维横截面积计量运用ImagePro 5.0.1软件(MediaCybernetics，SilverSpring，MD，USA)进行分析，纤维的大小为测量的肌纤维横截面积的平均值，每个肌肉组织样品测量了大约500个肌纤维。结果显示，一型肌纤维的横截面积没有显著差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大(图3F)。
上述实验结果说明含有siRNA干扰序列的重组腺病毒能够精确的靶向Atrogin-1基因，在降低Atrogin-1基因的表达的同时，抑制I型肌纤维向II型肌纤维的转化，增加肌纤维的大小，显著提高肌纤维的质量，从而提高肌肉的重量。
2、siRNA小环DNA载体系统对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
将所提质粒按2～0.5微克/只的剂量注射饥饿处理1天的BALB/C小鼠，每天定时称量小鼠体重，1周后检测肌肉重量，检测指标同前，结果显示，注射siRNA小环DNA载体的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量增加20-25％。，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约20％，一型肌纤维的横截面积没有显著差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
四、抑制Atrogin-1对c2c12细胞和肌萎缩小鼠生肌分化的影响
在有效抑制Atrogin-1基因的表达量的同时，western blotting检测了肌细胞分化标志物α-actin、myosin、myogenin的表达量变化(图4A)。结果显示，细胞分化标志物α-actin的表达量提高近10倍(图4B)，myosin的表达量提高了近10倍(图4C)，myogenin的表达量提高7倍以上(图4D)，从而证明在降低Atrogin-1基因的表达后，能够迅速而且高效的诱导细胞生肌分化。
在小鼠饥饿肌萎缩模型中，western blotting检测了肌细胞分化标志物α-actin、myosin的表达量变化(图4E)，检测到Atrogin-1基因的表达量下降的同时，细胞分化因子a-actin的表达量提高近30％(图4F)，myosin的表达量提高了近30％(图4G)。
五，c2c12细胞和肌萎缩小鼠模型中抑制Atrogin-1的表达对Myod和GDF-8基因表达的影响
实验结果显示，在c2c12细胞系和小鼠模型中，siRNA能够有效降低GDF-8基因和提高Myod基因的表达。在c2c 12细胞中，siRNA使GDF-8基因转录的mRNA水平降低了20％(图5A)，同时使Myod基因mRNA水平升高了30％(图5B)。在蛋白表达水平(图5C)，siRNA使细胞的生肌负调控因子GDF-8表达量下降了30％(图5D)，生肌正调控因子Myod的表达量提高了40％(图5E)。在小鼠饥饿肌萎缩模型中，检测了GDF-8和Myod基因表达量的变化(图5F)。注射siRNA重组腺病毒的实验组同对照组相比myod的表达量提高20％以上(图5G)，肌肉分化的负调控因子GDF-8表达量下降了20％(图5H)。
实施例二、靶向MuRF 1基因干扰序列的设计，载体构建及细胞和动物水平药效学检测。
一、抑制MuRF 1基因表达的干扰RNA基因表达载体的构建
1、干扰RNA序列的设计
(1)、靶向MuRF 1基因3’端的干扰RNA序列的设计
应用干扰序列设计软件设计靶向MuRF 1基因(SEQ ID NO：8)3’端的RNA干扰序列，其DNA的序列如下：
M-3’-1 5’TCGAAAAAAGGACAGATGAGGAGGAGGATCAACAG
TCCTCCTCCTCATCTGTCCTTTTT 3’(SEQ ID NO：4)
以下叙述中M-3’-1siRNA在实施例2中简称为siRNA
(2)、靶向MuRF 1基因5’端干扰RNA序列的设计
方法同实施例1。
M-5’-1：
5’GATCAAAAATGGAGAACCTGGAGAAGCATCTCTTGAATGCTTCTCCAGGTTCTCCATTTTT 3’(SEQ ID NO：5)
(3)、靶向MuRF 1基因中间区域的干扰RNA序列的设计
方法同实施例1。
M-M-1：
5’GATCAAAAAGGACAGATGAGGAGGAGGATCTCTTGAATCCTCCTCCTCATCTGTCCTTTTT 3’(SEQ ID NO：6)
2、干扰RNA载体的构建
(1)、腺病毒载体的构建
构建方法同上。
3、小环DNA载体的构建
构建方法同上。
二、siRNA重组腺病毒在细胞水平和动物水平对MuRF 1表达的抑制
1、siRNA重组腺病毒在细胞水平对MuRF 1表达的抑制
检测方法同上，荧光定量PCR结果显示：与对照组相比，siRNA对c2c12细胞中MuRF 1基因RNA水平的抑制效率达到了30％，与蛋白表达水平的检测结果一致同时分析了转录因子NFκB-P65，c-Fos的表达量变化，证明无脱靶现象。
2、siRNA重组腺病毒在动物水平对MuRF 1表达的抑制
所用小鼠模型及检测指标同上。动物水平的实验结果显示，在肌萎缩小鼠模型中，siRNA重组腺病毒对MuRF 1的抑制效率达到了30％以上，为检测有无脱靶现象，检测了c-Fos和nFκB-P65的表达情况，结果显示该转录因子的表达量并没有明显变化。
综上所述，细胞水平和动物水平检测显示，靶向MuRF 1基因的siRNA能够有效的降低MuRF 1基因的表达。
3、小环DNA干扰系统在细胞水平和动物水平对MuRF 1的抑制
含有靶向MuRF 1基因的siRNA重组小环质粒转染c2c12细胞，检测方法同上，实验结果显示，在c2c12细胞系中，转染siRNA重组小环DNA后，有效的抑制了MuRF 1基因的表达，其抑制效率达60％以上。
将所提质粒按2～0.5微克/只的剂量注射饥饿处理1天的BALB/C小鼠，每天定时称量小鼠体重，1周后检测肌肉重量。结果显示，在肌萎缩小鼠模型中，siRNA重组小环DNA载体对MuRF 1的抑制效率达到了50％以上。
三、siRNA对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
1、siRNA重组腺病毒对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
将饥饿处理的BALB/C雌性小鼠分为A、B、C、D四组，每组5只。A组按1010IU/只的剂量注射siRNA重组腺病毒，B组按1010IU/只的剂量注射Pdc312空载体重组腺病毒，C组注射生理盐水，D组注射生理盐水。A、B、C三组按5g/只的进食量饲养，D组正常饲养，观察小鼠体重变化。注射后饲养一周，处死小鼠，并取其前肢、后肢大腿和小腿。
处死小鼠后，称量其前大腿，和小腿，后大腿，和小腿重量。比较实验组与对照组小鼠腿部肌肉重量变化。实验结果显示，与对照组相比，注射siRNA重组腺病毒的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量与对照组相比增加10-15％。
伊红(H&E)染色和三磷酸腺苷酶(ATPase)染色操作同上。试验结果显示，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约10％，从而说明在降低MuRF 1基因表达的情况下，促进肌纤维的生肌分化的同时，能够增加肌纤维的大小，提高肌肉质量。同时发现一型肌纤维的横截面积没有显著差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
上述实验结果说明含有siRNA干扰序列的重组腺病毒能够精确的靶向MuRF 1基因，在降低MuRF 1基因的表达的同时，抑制I型肌纤维向II型肌纤维的转化，增加肌纤维的大小，显著提高肌纤维的质量，从而提高肌肉的重量。
2、siRNA小环DNA载体系统对实验动物肌肉重量和肌纤维质量的影响
试验操作及检测指标同前，结果显示，注射siRNA小环DNA载体的小鼠前肢大腿，后肢大腿腿部肌肉重量增加10-15％。，注射siRNA重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Mock的对照组增加约10％，一型肌纤维的横截面积没有显著差异，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
四、抑制MuRF 1对c2c12细胞和肌萎缩小鼠生肌分化的影响
在有效抑制MuRF 1基因的表达量的同时，western blotting检测到了细胞分化标志物a-actin的表达量提高近5倍，myosin的表达量提高了近5倍，myogenin的表达量提高6倍以上，从而证明在降低MuRF 1基因的表达后，能够迅速而且高效的诱导细胞生肌分化。
在小鼠饥饿肌萎缩模型中，检测到MuRF 1基因的表达量下降的同时，细胞分化因子a-actin的表达量提高近15％，myosin的表达量提高了近17％。
五，c2c12细胞和肌萎缩小鼠模型中抑制MuRF 1的表达对Myod和GDF-8基因表达的影响
实验结果显示，在c2c12细胞系中，siRNA重组腺病毒在有效降低MuRF 1的表达的同时，使细胞的生肌负调控因子GDF-8表达量下降了15％，生肌正调控因子Myod的表达量提高了20％。在小鼠饥饿肌萎缩模型中，注射siRNA重组腺病毒的实验组同对照组相比myod的表达量提高10％以上，肌肉分化的负调控因子GDF-8表达量下降了15％。
实施例三：靶向Atrogin-1和MuRF 1联合载体的构建，细胞水平及动物水平药效学检测。
1、双价干扰RNA载体的构建
将上述已经证明有效的靶向Atrogin-1基因和MuRF 1基因3’端、5’端和中间区域的干扰片段表达盒(H1+siRNA+U6)分别从重组载体PDC312+H1+siRNA+U6上切下(以A-3’-1(SEQ ID NO：1)和M-3’-1(SEQID NO：4)为例)，将表达盒分别用Klenow片段将末端补齐后，分别与合成的酶切接头XbaI、SalI，EcoRI、BamHI相连接，并连接到腺病毒PDC312载体的相应位点。送测序，腺病毒载体A-3’-1+M-3’-1构建成功。
2、干扰RNA的药效学检测
(1)、干扰RNA细胞水平的药效学检测
实验结果显示，在c2c12细胞系中，A-3’-1+M-3’-1重组腺病毒对Atrogin-1的表达抑制效率达到60％，对MuRF 1的表达抑制效率达到50％。分化标志物myosin表达量提高13倍。分析了转录因子NFκB-P65，C-FOS的表达量变化，证明无脱靶现象。
(2)、干扰RNA动物水平的药效学检测
动物水平的western blotting分析，方法同上，动物水平的实验结果显示，在肌萎缩小鼠模型中，A-3’-1+M-3’-1重组腺病毒对MuRF 1的抑制效率达到了50％左右，对Atrogin-1的抑制效率达到了60％以上。与对照组相比，注射A-3’-1+M-3’-1重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉重量增加25％。组织病理分析结果显示，注射A-3’-1+M-3’-1重组腺病毒的小鼠大腿腿部肌肉肌纤维横截面积比注射生理盐水和Pdc312的对照组增加约35％，二型肌纤维的横截面积与对照组相比明显增大。
上述实验结果说明含有A-3’-1+M-3’-1双价干扰序列的重组腺病毒能够精确的靶向Atrogin-1基因和MuRF 1基因，在降低Atrogin-1和MuRF1基因的表达的同时，能显著提高分化因子的表达，并降低分化抑制因子的表达，迅速而且高效的诱导细胞分化，抑制I型肌纤维向II型肌纤维的转化，显著提高肌肉质量，与单独抑制Atrogin-1基因或MuRF 1基因相比，能够起到更好的治疗肌肉萎缩的效果。
IB089096序列表.ST25
【序列表】
<110>中国科学院微生物研究所
<120>干扰肌肉特异E3泛素蛋白连接酶基因的干扰RNA，包含其的载体及其应用
<130>IB089096
<160>9
<170>PatentIn version 3.1
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t 61
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<211>61
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<213>人工序列
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t 61
<210>7
<211>2722
<212>DNA
<213>鼠
<400>7
ccgggataaa tactgcgctc gggcagccgc tcagcattcc cagagtcagg aggcgacctt 60
ccccaacgcc tgcgcccctg tgagtgcaag gatccccgcg cccacccagg atccgcagcc 120
ctccacacta gttgacccac tcttgtcccg gtcgccgcct gcgtcgttcc ccagcatctt 180
cccaacgcgc cgcataccct gggcaagcca ggccggttcc tggctgtcaa tccgtcccgt 240
ccgtcggtcg cgtccgcgct ctgtaccatg ccgttccttg ggcaggactg gcggtccccg 300
ggccagagct gggtgaagac ggcggacggc tggaagcgct tcttggatga gaaaagcggc 360
agcttcgtga gcgacctcag cagttactgc aacaaggagg tatacagtaa ggagaatctg 420
ttcagcagcc tgaactacga cgtcgcagcc aagaagagaa agaaagacat tcagaacagc 480
aaaaccaaaa ctcagtactt ccatcaagaa aagtggatct atgttcacaa aggaagtacg 540
aaggagcgcc atggatactg tactttgggg gaagctttca acagactgga cttctcgact 600
gccatcctgg attccagaag attcaactac gtagtaaggc tgttggagct gatagcaaag 660
tcacagctca catccctgag tggcatcgcc caaaagaact tcatgaacat tttggaaaaa 720
gtggtactga aagttcttga agaccagcaa aacataagac ttatacggga acttctccag 780
actctctaca catccttatg cacactggtg cagagagtcg gcaagtctgt gctggtgggc 840
aacattaaca tgtgggtgta tcggatggag accattctac actggcagca gcagctgaat 900
agcatccaga tcagcaggcc tgccttcaaa ggcctcacga tcaccgacct gcctgtgtgc 960
ttacaactga acatcatgca gaggctgagt gacgggcggg acctggtcag cctgggccag 1020
gcagccccag acctgcatgt gctcagtgag gaccggctac tgtggaagag actctgccag 1080
taccacttct cagagaggca gattcgcaag cgtttgatct tgtctgacaa agggcagctg 1140
gattggaaga agatgtattt taagcttgta cgatgttacc caagaagaga gcagtatggg 1200
gtcaccctgc agctttgcaa acactgccac attctctcct ggaagggcac tgaccatccg 1260
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aaccgcggtg gctcagtgtc catgtctgga ggtcgtttcc gttgcccctc gtgccgccat 240
gaagtgatca tggaccggca cggggtgtac ggcctgcaga ggaacctgct ggtggaaaac 300
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