一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法.pdf

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法，是以凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)(CGMCC 1.949)为材料，可得到具有较高的生物量和抗菌活性的菌，其发酵工艺得到发酵液可用于制备防治植物病害杀菌剂。本发明具有以下三大优点：1.凝结芽孢杆菌是一类对人体有益的益生菌，其代谢产物制成的生物杀菌剂与以往杀菌剂最大区别在于其天然性和环保性。2.我们针对该菌建立的一套发酵工艺中利用豆饼粉和玉米浆粉代替牛肉膏、蛋白胨等，大大降低了生产成本。3.该菌经过发酵后，发酵产物上清液可用于制备生物杀真菌剂，离心获得的菌体可以继续利用生产益生菌制品，大大提高了经济利益。

1、  一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法，其特征在于：培养发酵方法的步骤是：
(1)斜面种子培养：取一环菌泥在营养肉汁琼脂培养基上划线接种，于40℃下培养20h；
(2)种子摇瓶培养：取一环斜面接入装有25ml MRS培养基的250ml三角瓶中，40℃，140r/min培养20h，成为一级种子液；
(3)摇瓶发酵培养：以5％接种量将一级种子液接入装有120ml发酵培养基的500ml三角瓶中，40℃，180r/min培养18h，成为二级种子液；
(4)发酵罐培养：将二级种子液以3-6％接种量接入装有发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要控制参数如下：溶氧及转速：搅拌转速100-400r/min，控制溶氧在30％～40％；温度：40℃，培养48h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞即得到发酵液。

2、  根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法，其特征在于：所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)保藏于中国普通微生物保藏管理中心CGMCC，保藏编号1.949。

3、  根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法，其特征在于：所述营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，水1.0L，pH 7.0；所述MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，吐温-801ml，柠檬酸三铵2g，K₂HPO₄ 2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，MnSO₄ 0.05g，水1.0L，pH7.0；所述发酵培养基：豆饼粉10.0g，玉米浆粉10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，K₂HPO₄，MnSO₄ 50ppm，水1.0L，pH7.0。

一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)(CGMCC 1.0949)抗真菌活性物质的培养发酵方法。
背景技术
在世界范围内，农业生产每年因病虫草害造成巨大损失，其中由真菌引起的病害占80％。长期以来，人们主要采用化学农药来控制农作物的病虫草害以保证农作物的稳产和高产。但化学农药的大量使用，不仅给土壤、水体和大气带来了污染；而且，农副产品中化学农药的残留，将直接危害人类的健康及生存。同时，由于化学农药的长期、大量和反复使用，越来越多的植物病原真菌对化学合成抗真菌剂和抗生素产生了抗性。因此，开发新型的、天然的抗真菌剂非常必要。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，过去称乳酸芽孢杆菌，是一种能进行同型乳酸发酵的芽孢杆菌。该菌除具有普通乳酸菌的一般优点外，还具有以下优良特性：(1)兼性好氧微生物，易于培养；(2)由于形成芽孢，活菌产品的保存性好，能克服普通乳酸菌产品所存在的保存性差、随保存时间延长活菌数量严重下降等难以克服的缺点；(3)耐高温、耐胃酸；(5)能在肠道内繁殖。目前该菌主要用作益生菌，对动物防病抗病和降低动物死亡率的具有显著作用。关于该菌抗病原微生物的研究，已报道该菌对大肠杆菌、志贺氏菌等肠道腐败细菌具有抑制作用。但未见该菌对真菌具有抑制作用的研究报道和利用该菌生产抗植物病害真菌的生物农药的报道。
在培养凝结芽孢杆菌等乳酸菌的培养基中，常用的氮源是蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏/粉和牛肉膏，由于这些物质成本较高，因此，如能采用价廉的氮源类物质代替以上物质，则能降低凝结芽孢杆菌等乳酸菌生产益生菌制品和生产有用代谢产物的成本，尤其对大生产来说，其意义更加重要。
我们发现凝结芽孢杆菌能产生多种代谢产物，这些代谢产物不仅具有多种化学结构，而且在农业以及食品工业上具有广泛的生物活性，如较强的抑菌活力，为天然生物农药的开发提供了新的资源。目前，对凝结芽孢杆菌产抗真菌活性物质的发酵条件和发酵物的应用的相关技术和方法的文献或专利未见报道。
发明内容
本发明的目的是以凝结芽孢杆菌CGMCC 1.0949为材料，提供一种凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)产抗真菌活性物质的培养发酵方法。
本发明的技术方案是：
一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法，培养发酵方法的步骤是：
(1)斜面种子培养：取一环菌泥在营养肉汁琼脂培养基上划线接种，于40℃下培养20h；
(2)种子摇瓶培养：取一环斜面接入装有25ml MRS培养基的250ml三角瓶中，40℃，140r/min培养20h，成为一级种子液；
(3)摇瓶发酵培养：以5％接种量将一级种子液接入装有120ml发酵培养基的500ml三角瓶中，40℃，180r/min培养18h，成为二级种子液；
(4)发酵罐培养：将二级种子液以3-6％接种量接入装有发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要控制参数如下：溶氧及转速：搅拌转速100-400r/min，控制溶氧在30％～40％；温度：40℃，培养48h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞即得到发酵液。
而且，所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)保藏于中国普通微生物保藏管理中心CGMCC，保藏编号1.949。
而且，所述营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，水1.0L，pH7.0；所述MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，吐温-801ml，柠檬酸三铵2g，K₂HPO₄2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，MnSO₄0.05g，水1.0L，pH7.0；所述发酵培养基：豆饼粉10.0g，玉米浆粉10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，K₂HPO₄，MnSO₄50ppm，水1.0L，pH7.0。
本发明的优点和积极效果是：
1.本发明所涉及的凝结芽孢杆菌是一类对人体有益的益生菌，其代谢产物制成的生物杀菌剂与以往杀菌剂最大区别在于其天然性和环保性。
2.本发明针对该菌建立的一套发酵工艺中利用豆饼粉和玉米浆粉代替牛肉膏、蛋白胨等，大大降低了生产成本。
3.本发明的产菌经过发酵后，发酵产物上清液可用于制备生物杀真菌剂，离心获得的菌体可以继续利用生产益生菌制品，大大提高了经济利益。
4.本发明的工艺能够稳定地获得凝结芽孢杆菌发酵物，所得到的菌具有较高的生物量和抗菌活性，可用于制备防治植物病害杀菌剂，且其生产成本相对较低，适于批量生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所涉及的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)保藏于中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为1.949。
实施例1：
一种凝结芽孢杆菌抗真菌活性物质的培养发酵方法，步骤是：
(1)斜面种子培养：取一环菌泥在营养肉汁琼脂培养基上划线接种，于40℃下培养20h；
(2)种子摇瓶培养：取一环斜面接入装有25ml MRS培养基的250ml三角瓶中，40℃，140r/min培养20h，成为一级种子液；
(3)摇瓶发酵培养：以5％接种量将一级种子液接入装有120ml发酵培养基的500ml三角瓶中，40℃，180r/min培养18h，成为二级种子液；
(4)5L发酵罐培养：将二级种子液以5％接种量接入装有3.5L发酵培养基的5L自动发酵罐中，设定装液量为70％，起始搅拌转速为100r/min，通气量为1：1，此时定溶氧为100％；当溶氧降至30％以下时，提高转速以控制溶氧在30％以上，温度40℃培养48h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞，即可得到发酵液。
本实施例中各培养基的构成是：
营养肉汁琼脂培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，水1.0L，pH7.0；
MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，吐温-80 1ml，柠檬酸三铵2g，K₂HPO₄2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，MnSO₄0.05g，水1.0L，pH7.0；
发酵培养基：豆饼粉10.0g，玉米浆粉10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO₄·7H₂O1.0g，K₂HPO₄，MnSO₄50ppm，水1.0L，pH7.0。
实施例2：
(1)斜面种子培养：取一环菌泥在营养肉汁琼脂培养基上划线接种，于40℃下培养20h；
(2)种子摇瓶培养：取一环斜面接入装有25mlMRS培养基的250ml三角瓶中，40℃，140r/min培养20h，成为一级种子液；
(3)摇瓶发酵培养：以5％接种量将一级种子液接入装有120ml发酵培养基的500ml三角瓶中，40℃，180r/min培养18h，成为二级种子液；
(4)30L发酵罐培养：将二级种子液以3.6％接种量接入装有21L发酵培养基的30L自动发酵罐中(装液量为70％)，起始搅拌转速为100r/min，通气量为1：0.3，此时定溶氧为100％。当溶氧降至30％以下时，提高转速以控制溶氧在30％以上，温度40℃培养48h，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞即得到发酵液。
本实施例中各培养基的构成与实施例1相同。
下面叙述本发明的离体抑菌试验(生长速率抑制法)，凝结芽孢杆菌发酵液的应用是在实施例1、2的基础上进行的：
1、将工艺中得到的发酵液进一步在14000r/min、4℃离心10min，收集上清液。
2、在融化的9ml PDA培养基中加入1ml上清液，将得到的10ml培养基倒入直径9.0cm的灭菌培养皿内，制成平板，以加无菌培养基的PDA为对照。从培养3～6d的植物病原真菌菌落边缘，用打孔器切成直径5mm的菌块，置于平板中央，于24℃培养箱培养6d，测量病原菌菌落直径；
3、从下表中可以看到：凝结芽孢杆菌发酵物上清液在100～200ml(发酵液)/L对番茄早疫菌、番茄灰霉、黄瓜疫霉菌、甜瓜枯萎菌、苹果炭疽菌的菌丝生长有较强的抑制作用，抑制率在60～100％，其中发酵物对番茄灰霉菌丝生长的抑制作用最高。