N-乙二酸一酰氨基酸衍生物与N-乙二酸一酰二肽衍生物及其在制备促醒药物中的应用 【技术领域】
本发明属于药物领域，涉及N-乙二酸一酰氨基酸衍生物和N-乙二酸一酰二肽衍生物，以及它们在制备促醒药物中的应用。
背景技术
本研究组曾经从人参水提取液中首次分离鉴定出一个非蛋白氨基酸：β-N-乙二酸一酰-L-α，β-二氨基丙酸(β-N-oxalo-L-α，β-diaminopropionic acid，缩写符号为β-ODAP)及其异构体α-N-乙二酸一酰-L-α，β-二氨基丙酸(α-N-oxalo-L-α，β-diamino propionic acid，缩写符号为α-ODAP)[龙义成，北京大学博士后研究报告，1991]，并发现两种异构体在酸、碱或加热条件下可以相互转化[(1)Long，Y.-C.；Ye，F.-N.；Ye，Y.-H.；Xing，Q.-Y.Chin.Chem.Lett.1992，3，517-520.(2)Long，Y.-C.；Ye，Y.-H.；Xing，Q.-Y.Int.J.Peptide Protein Res.1996，47，42-46.]。1964年，S.L.N.Rao从山黧豆(Lathyrus sativus)中曾分离鉴定了β-ODAP[S.L.N.Rao，P.R.Sarma，Biochemistry，1964，3(3)，432]，发现它具有强烈的神经兴奋毒性，并认为它可能是食用山黧豆引起中毒的化学物质。我们的研究表明，β-ODAP既具有神经兴奋活性，也具有促醒作用。低剂量的该化合物能使脑电图中的δ(Delta)睡眠波消失。但是，β-ODAP不能作为药物使用，因为存在以下问题：①该化合物毒性较大[刘绪川，张国伟，李雅茹，王蔡香，梁兆年，中国农业科学，1989，22(5)，86]，对小白鼠腹腔注射LD50为748.86mg/kg，雏鸡腹腔注射LD50为694.93mg/kg；②β-ODAP本身不够稳定，易转化为无活性的α-ODAP。③化学合成有一定的难度，α，β-L-二氨基丙酸分子中含有手性碳，需要立体选择性的合成L-构型，另外，分子中有两个氨基，要进行区域选择性的乙二酸一酰化反应也是合成的一个难点。为此，我们设计合成了一系列氨基酸和二肽的乙二酸一酰基衍生物，从中筛选得到了毒性低，活性强，具有新药开发前景的化合物。
【发明内容】
本发明的目的在于提供具有毒性低、活性强、有望在制备促醒药物中应用的氨基酸和二肽的乙二酸一酰基衍生物。
本发明提供一种N-乙二酸一酰氨基酸衍生物，其化学结构如式I所示
式I
其中，AA1为氨基酸残基，所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、L-缬氨酸(Val)、D，L-丙氨酸或β-丙氨酸；
R1为H、C1～C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地，R1为H。
优选地，本发明所述的N-乙二酸一酰氨基酸衍生物为N-乙二酸一酰-D，L-丙氨酸、N-乙二酸一酰-L-丙氨酸、N-乙二酸一酰-β-丙氨酸、N-乙二酸一酰-L-蛋氨酸、或N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酸。
本发明提供一种N-乙二酸一酰二肽衍生物，其化学结构如式II所示
式II
其中，AA2、AA3为氨基酸残基，所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、或L-缬氨酸(Val)；
R2为H、C1～C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地，R2为H、甲基或乙基。
优选地，本发明所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯、N-乙二酸一酰-甘氨酰甘氨酸异丙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-苏氨酸甲酯或N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯。
本发明提供一种N-乙二酸一酰二肽衍生物，其化学结构如式III所示
式III
其中，AA4为氨基酸残基，所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、或L-缬氨酸(Val)；
R3为H、C1～C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地，R3为甲基或乙基。
优选地，本发明所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸异丙酯、N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯、N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯、或N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯。
本发明提供一种N-乙二酸一酰二肽衍生物，其化学结构如式IV所示
式IV
其中，AA5为氨基酸残基，所述的氨基酸为甘氨酸(Gly)、L-丙氨酸(Ala)、L-精氨酸(Arg)、L-天冬酰胺(Asn)、L-天冬氨酸(Asp)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酰胺(Gln)、L-谷氨酸(Glu)、L-组氨酸(His)、L-异亮氨酸(Ile)、L-亮氨酸(Leu)、L-赖氨酸(Lys)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-脯氨酸(Pro)、L-丝氨酸(Ser)、L-苏氨酸(Thr)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、或L-缬氨酸(Val)；
R4为H、C1～C6烷烃基、环烃基、苯基或苄基。
优选地，R4为甲基。
优选地，本发明所述的N-乙二酸一酰二肽衍生物为N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯、N-乙二酸一酰甘氨酰-L-苏氨酸甲酯或N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯。
经实验测定，本发明的N-乙二酸一酰氨基酸衍生物和N-乙二酸一酰二肽衍生物具有降低脑电波δ和σ指数，增加θ指数的作用，可应用于制备促醒药物。
本发明所述的N-乙二酸一酰氨基酸与二肽衍生物的合成均通过将相应的氨基酸(或寡肽)的酯衍生物先与乙二酸单酯单酰氯(例如，乙二酸单苄酯单酰氯或乙二酸单乙酯单酰氯)反应，生成乙二酸单酯保护的氨基酸(或寡肽)的酯衍生物；然后，脱除此衍生物的保护基，得到式I，式II，式III与式IV的目标产物。
在上述的制备过程中，大多数保护的乙二酰氨基酸和小肽衍生物容易纯化。反应的中间体-乙二酸单酯保护的氨基酸(或寡肽)的酯衍生物具有酯溶性，可用乙酸乙酯提取，然后用水洗或酸洗，碱洗除去未反应的原料，从而得到纯化的产物。
在上述制备过程中，优选以乙二酸单苄酯单酰氯与氨基酸(或寡肽)的酯衍生物反应，在得到酯保护的乙二酰氨基酸酯后，可以分两步除去两端的酯基，如先用催化氢化除去苄酯得到单酸单酯的产物再皂化得到目标产物，或者用皂化一步除去所有的酯直接得到游离酸的产物，这样可以简化目标产物的合成。
【具体实施方式】
实施例1乙二酸单乙酯单酰氯的制备
将143g(0.98mol)乙二酸二乙酯与100g(1.02mol)乙酸钾、100mL水混合，在水浴上搅拌加热，反应2.5h后溶液变清，继续反应1.5h，有固体生成，停止反应，减压浓缩使体积约为100mL，加入乙醚600mL，乙醇200mL，摇匀后放置。滤出乙二酸单酯单钾盐，用乙醚洗涤，过滤，干燥，得138g。称取乙二酸单酯单钾盐50g，放入500mL三口瓶中，加入无水乙醚200mL，冰浴冷却下滴加重蒸的SOCl2 80g，加完后自然升至室温，用油浴加热回流约13h，滤去不溶物，滤渣用乙醚洗涤，滤液经干燥后进行精馏，收集125-130℃的馏分，得产物24.5g，产率56％。
实施例2乙二酸单苄酯单酰氯的制备
安装一带有HCl吸收装置的三口反应瓶，在其中将12.7g(0.1mol，8.6mL)乙二酰氯溶于60mL无水乙醚中，室温向其中逐滴加入8.65g(0.08mol，8.3mL)的苄醇，反应体系温度有所上升，保持于20-25℃，加完后室温搅拌，用TLC检测(硅胶板，乙醚展开)至苄醇点消失，减压蒸去乙醚及过量的乙二酰氯，剩余物为黄色或更深颜色，用油泵进行减压蒸馏，收集73-75℃/0.3mmHg馏分，得无色刺激性气味的液体，重13.6g，86％。EI-MS m/z：198M+。
实施例3N-乙二酸一酰-D，L-丙氨酸(N-Oxalo-D，L-AlaOH)的制备
N-D，L-乙氧基乙二酰丙氨酸甲酯：D，L-丙氨酸甲酯盐酸盐10.0g(72mmol)悬浮于280mL二氯甲烷中，滴加三乙胺10mL，冰浴冷却至0℃后，同时滴加9.8g(72mmol)乙二酸单乙酯单酰氯在10mL二氯甲烷中的溶液与10mL的三乙胺。控制温度0～5℃，滴完后，继续反应2h。蒸去二氯甲烷，得大量白色晶体，用无水乙醚提取，滤去不溶的三乙胺盐酸盐。蒸去乙醚，得黄色油状物，用油泵进行减压蒸馏，收集114～115℃/0.45mmHg地馏分，得到无色粘稠状液体，重10.2g，产率70％。
N-乙二酸一酰-D，L-丙氨酸：
制法1：N-D，L-乙氧基乙二酰丙氨酸甲酯2.1g(10.3mmol)加12mL水溶解，冰浴下加入冷的2N NaOH 20mL，冰浴下搅拌1h，TLC检测(硅胶板，CHCl3∶CH3OH＝9∶1展开)至无原料点。将其通过一个处理好的H+型强酸阳离子交换柱，用蒸馏水洗脱，收集酸性部分，得140mL，冷却干燥得油状物，进一步用EtOAc∶CCl4＝1∶3溶液重结晶，得针状晶体。m.p.约50℃，不敏锐。研碎后，放入五氧化二磷真空干燥器中干燥三天，得白色晶体1.2g，m.p.128-130℃，产率72％。
制法2：配制浓度约为2N的盐酸和氢氧化钠溶液。用移液管取25.00mL氢氧化钠溶液，加入2滴酚酞指示剂，用上面配制的盐酸滴定至粉红色刚好褪去，用去盐酸24.30mL，计算得此HCl与NaOH溶液的相对浓度分别为1.000∶0.972。N-D，L-乙氧基乙二酰丙氨酸甲酯4.3g(21.2mmol)，加20mL水溶解，冰浴冷却下，以移液管加入上述2N NaOH 40.00mL中，冰浴下搅拌1h，TLC检测(同上)至无原料点后，用滴定管向反应液中加入2N HCl 38.88mL，此时溶液pH＝1，冷冻干燥，得白色发粘固体，用乙酸乙酯提取，过滤，不溶物(NaCl)用乙酸乙酯洗涤三次后弃去，滤液干燥后减压蒸去溶剂，浓缩至10mL，向其中逐滴加入20mLCCl4，溶液变浑，放入冰箱过夜，有晶体析出，将晶体滤出研碎，放入五氧化二磷真空干燥器中干燥三天，得白色晶体3.1g，m.p.128-130℃，产率91％，元素分析(C5H7NO5)计算值(％)C 37.26，H 4.38，N 8.69实测值C 37.01，H 4.25，N 8.32。
实施例4N-乙二酸一酰-L-丙氨酸(N-Oxalo-L-AlaOH)的制备
N-乙二酸一酰-L-丙氨酸的制备同实施例3，其最终产物用乙酸乙酯-四氯化碳重结晶，m.p.50-53℃，产率60％。FAB-MS m/z：162[M+H]+；1H-NMR(DMSO)：δppm 1.35(3H，d，-CH3)，4.26(1H，m，-CH)，8.95(1H，s，NH)；[α]D20+22.6(C＝1，EtOH)；元素分析(C5H7NO5·H2O)：计算值％C 33.52，H 5.06，N 7.81，实测值C 33.95，H 4.64，N 7.93。
实施例5N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯(N-Oxalo-Gly-Gly-OEt)的制备
苄氧基乙二酰甘氨酰甘氨酸乙酯：甘氨酰甘氨酸乙酯盐酸盐3.93g(20mmol)悬浮于120mL CH2Cl2中，加入2.76mL(20mmol)三乙胺，冰浴冷却下滴加3.96g(20mmol)乙二酸单苄酯单酰氯在10mL CH2Cl2中的溶液，同时滴加2.76mL的三乙胺，控制反应温度为0-5℃，反应2h，升至室温反应3h。减压蒸出CH2Cl2，得白色固体，用乙酸乙酯提取(120mL)，过滤，不溶物用60mL乙酸乙酯分三次洗涤后弃去，滤液合并，用100mL水洗涤两次，酯层用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，蒸去乙酸乙酯，得浅黄色固体5.8g，用乙酸乙酯(15mL)重结晶，得无色针状晶体5.2g，m.p.94-95℃，产率81％。FAB-MSm/z：323[M+H]+；1H-NMR(CD3Cl)：δ(ppm)1.25(3H，t，OCH2CH3)，3.93(2H，s，Gly-H)，3.99(2H，s，Gly-H)，4.17(2H，q，OCH2CH3)，5.31(2H，s，PhCH2O)，7.33-7.46(5H，m，Ph)；元素分析(C15H18N2O6)：计算值(％)C 55.89，H 5.63，N 8.69，测定值C55.60，H 5.56，N 8.54。
N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯：上述苄氧基乙二酰甘氨酰甘氨酸乙酯1.77g(5.5mmol)溶于120mL无水乙醇中，加入1.5g 10％Pd/C，常温常压催化氢化5h，滤去Pd/C，滤液蒸干，得白色固体，用16mL无水乙醇重结晶，得到无色针状晶体1.18g，m.p.161-163℃，产率93％。FAB-MS m/z：233[M+H]+；1H-NMR(CD3Cl)：δ(ppm)1.26(3H，t，OCH2CH3)，3.94(2H，s，Gly-H)，4.00(2H，s，Gly-H)，4.19(2H，q，OCH2CH3)；元素分析(C8H12N2O6)：计算值(％)C 41.38，H5.21，N 12.06，测定值C 40.96，H 5.12，N 11.98。
实施例6N-乙二酸一酰-β-丙氨酸(N-Oxalo-β-AlaOH)的制备
苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯：5.18g(33.7mmol)β-丙氨酸乙酯盐酸盐溶于100mL CH2Cl2中，加入4.68mL(33.7mmol)三乙胺，冰浴冷却，向其中滴加6.7g(33.7mmol)乙二酸单苄酯单酰氯在10mL CH2Cl2中的溶液，同时滴加4.68mL三乙胺，加完后，升至室温反应4h，蒸去CH2Cl2，所得固体用100mL乙酸乙酯提取，过滤，不溶物用50mL乙酸乙酯分三次洗涤后弃去，滤液合并，用100mL水洗涤两次。TLC检测酯层中只有一个点，为产物(硅胶板，CHCl3∶CH3OH＝9∶1展开，I2显色)，酯层用无水硫酸钠干燥过夜，过滤蒸去乙酸乙酯，得微黄色液体，重9.4g，产率99.8％。
皂化采用酸碱中和法，同N-乙二酸一酰-D，L-丙氨酸制法2(见实施例3)。1.63g(5.5mmol)苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯，得粗品0.8g，经乙酸乙酯-四氯化碳重结晶两次，真空干燥后得乙二酸一酰-β-丙氨酸，进行如下分析。m.p.128-129℃，FAB-MS m/z：162[M+H]+；1H-NMR(D2O)：δ(ppm)3.49(2H，t，CH2)，2.62(2H，t，CH2)；元素分析(C5H7NO5)：计算值(％)C 37.27，N 8.69，H 4.37，实测值(％)C 37.03，N 8.39，H 4.30。
实施例7N-乙二酸一酰-L-蛋氨酸(N-Oxalo-L-MetOH)的制备
苄氧基乙二酰L-蛋氨酸甲酯：反应步骤同苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯的制备，经后处理除去溶剂后得淡黄色液体。FAB-MS m/z：326[M+H]+。
N-乙二酸一酰L-蛋氨酸：3.26g(10mmol)苄氧基乙二酰-L-蛋氨酸甲酯溶于20mL甲醇中，冰浴冷却加入20mL 2NNaOH溶液，冰浴反应3h，TLC检测原料点消失后(硅胶板，CHCl3∶CH3OH＝9∶1展开)，减压除去甲醇，再用20mL乙醚提取两次(除去PhCH2OH)弃去，水层经过H+型阳离子交换树脂，蒸馏水洗脱，收集酸性部分，冻干，得无色粘稠液体，固化后，用乙酸乙酯-石油醚重结晶，得无色粒状晶体1.86g，产率84％。m.p.121-122℃；[α]D23+6.6(C＝1，EtOH)；FAB-MS m/z：222[M+H]+；1H-NMR(D2O)：δ(ppm)4.55-4.59(1H，m，Met-αH)，2.49-2.62(2H，m，Met-βH)，2.04-2.22(5H，m，-CH2-S-CH3)；元素分析(C7H11NO5S)：计算值(％)C 38.00，H 5.01，N 6.33，实测值(％)C 37.73，H 4.98，N6.19。
实施例8N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酸(N-Oxalo-L-PheOH)的制备
苄氧基乙二酰L-苯丙氨酸甲酯：合成步骤同苄氧基乙二酰-β-丙氨酸乙酯的合成，后处理得黄色油状物。FAB-MS m/z：342[M+H]+。
N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酸：脱保护步骤同N-乙二酸一酰-L-蛋氨酸，产物为白色固体，极易吸潮，产率72％。m.p.103-106℃，[α]D23+56.8(C＝1，EtOH)，FAB-MS m/z：238[M+H]+；1H-NMR(D2O)：δ(ppm)3.03-3.29(2H，m，βH)，4.67-4.70(1H，m，αH)，7.24-7.31(5H，m，Ar-H)。
实施例9N-乙二酸一酰-甘氨酰甘氨酸异丙酯(Oxalo-Gly-GlyOPri)的合成
在冰水浴冷却下，将5mL氯化亚砜滴加到10mL异丙醇中，搅拌，加入甘氨酰甘氨酸660mg(5mmol)，30min后撤去冰水浴，反应过夜，减压浓缩，抽干后加入10mL异丙醇，反复浓缩3次，用甲醇-乙醚重结晶，得白色晶体880mg(H-Gly-Gly-OPri盐酸盐)，产率83％。
H-Gly-Gly-OPri·HCl 420mg(3mmol)加入10mL二氯甲烷中，加1.05mL二异丙基乙基胺(DIEA)(6mmol)，搅拌使其溶解，30min内滴入440mg(2.2mmol)乙二酸单苄酯单酰氯的二氯甲烷溶液(15mL)，常温反应3h，除去二氯甲烷，加入30mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，依次用5％柠檬酸水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后水洗，饱和氯化钠水溶液洗，无水硫酸镁干燥。除去乙酸乙酯，硅胶柱层析纯化后的洗脱液经浓缩得油状物，放置数日后得白色晶体520mg，产率74％。
将上述产品350mg(约1mmol)溶于25mL无水甲醇中，加入100mg 10％Pd/C，常温常压氢化12h，TLC检测原料点消失后，过滤，浓缩，抽干后得白色晶体240mg，产率92％。ESI-HRMS(C9H15N2O6[M+H]+)：247.09301(计算值)，247.09270(实验值)。
实施例10N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸叔丁酯(Oxalo-Gly-GlyOBut)的合成
H-Gly-OBut 262mg(2mmol)，Fmoc-GlyOH 594mg(2mmol)，3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)600mg(2mmol)溶于10mL DMF中，加入700μL DIEA(4mmol)，搅拌，常温反应4h，加入50mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，依次用5％柠檬酸水溶液、水、5％碳酸钠水溶液洗涤，水洗，饱和氯化钠水溶液洗，无水硫酸镁干燥，除去乙酸乙酯，用乙酸乙酯-石油醚重结晶，得白色晶体630mg，产率77％。
Fmoc-Gly-GlyOBut 410mg(1mmol)溶于10mL 20％哌啶/DMF中，搅拌，常温反应20min，加入50mL水，20mL乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯层合并，无水硫酸镁干燥，除去乙酸乙酯，真空干燥，得浅黄色油状物。
将上述产品溶入5mL二氯甲烷中，加入350μL DIEA(2mmol)，搅拌，30min内滴入220mg(1.1mmol)乙二酸单苄酯单酰氯的二氯甲烷溶液(5mL)，常温反应3h，除去二氯甲烷，加入20mL水，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，依次用5％柠檬酸水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后水洗、饱和氯化钠水溶液洗，无水硫酸镁干燥。除去乙酸乙酯，硅胶柱层析，浓缩得油状物，放置后得白色晶体220mg，产率60％。
上述产品溶于25mL无水甲醇中，加入100mg 10％Pd/C，常温常压氢化12h，TLC检测原料点消失后，过滤，浓缩，抽干放置数日后得白色晶体150mg，产率91％。1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)3.99(Gly-αH，s，2H)，3.85(Gly-αH，s，2H)，1.47(But，s，9H)；ESI-HRMS(C10H16N2O6Na[M+Na]+)：283.09061(计算值)，283.09043(实验值)。
实施例11～14N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Lys-GlyOMe)，N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Phe-Gly-OMe)，N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Leu-GlyOMe)，N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯(Oxalo-L-Asp-GlyOMe)的合成
将等摩尔的Boc-L-Lys(Z)-OH(或Boc-L-Phe-OH、或Boc-L-Leu-OH、或Boc-L-Asp(OBzl)-OH)、H-GlyOMe·HCl、DEPBT溶于DMF中(5mL/mmol)，加入3倍量的DIEA，室温搅拌4h。将反应液转入分液漏斗中，加入水(10mL/mmol)，用乙酸乙酯萃取(20mL/mmol)二次，合并乙酸乙酯，分别用0.1mol/L HCl、水、5％的碳酸钠溶液洗涤一次，再用水洗涤两次，酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯，可得到保护二肽的固体或油状物。用乙酸乙酯或石油醚进行重结晶。产率60-80％。
将上述合成的保护二肽溶于三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)(v/v 1∶1)混合液中(20mL/mmol)，搅拌1h，旋转蒸发除去TFA和DCM，残留物用乙酸乙酯溶解(20mL/mmol)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤二次，用硫酸镁干燥。蒸去乙酸乙酯，将残留物溶于无水DCM中(5mL/mmol)，加入1.5倍量的DIEA，搅拌下滴加等量的乙二酰单苄酯单酰氯的DCM溶液，反应3h，旋转蒸发除去DCM，残留物用乙酸乙酯溶解(20mL/mmol)，分别用5％的碳酸钠溶液、水、0.1mol/L HCl洗涤一次，再用水洗涤两次，酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯，可得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析得到纯化合物。产率为50-70％。
将保护的乙二酰二肽衍生物溶于适量的甲醇中，加入10％的Pd/C，进行常压氢化，脱除所有的苄酯和苄基，过滤除去Pd/C，蒸去甲醇，最终得到N-乙二酸一酰二肽甲酯。产率为80-90％。
N-乙二酸一酰-L-赖氨酰甘氨酸甲酯[α]D20-2.8(C＝0.6，DMF)；1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)4.43-4.49(Lys-αH，m，1H)，3.88-3.99(Gly-αH，m，2H)，3.72(OMe，s，3H)，3.12-3.16(Lys-εH，t，1H)，2.92-2.96(Lys-εH，t，1H)，1.77-1.82(Lys-βH，m，2H)，1.42-1.72(Lys-γ，δH，m，4H)；ESI-HRMS(C11H20N3O6[M+H]+)：290.13521(计算值)，290.13506(实验值)。
N-乙二酸一酰-L-亮氨酰甘氨酸甲酯[α]D20-30.9(C＝0.3，DMF)；1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)4.50-4.54(Leu-αH，t，1H)，3.93-3.96(Gly-αH，d，2H)，3.72(OMe，s，3H)，1.69-1.70(Leu-β，γH，m，3H)，0.94-0.99(Leu-δH，m，6H)；ESI-HRMS(C11H19N2O6[M+H]+)：275.12431(计算值)，275.12404(实验值)。
N-乙二酸一酰-L-苯丙氨酰甘氨酸甲酯[α]D20-10.2(C＝0.3，DMF)；1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)7.19-7.29(Phe-ArH，m，5H)，4.69-4.72(Phe-αH，m，1H)，3.94(Gly-αH，s，2H)，3.72(OMe，s，3H)，3.22-3.27(Phe-βH，m，1H)，2.99-3.05(Phe-βH，m，1H)；ESI-HRMS(C14H16N2O6Na[M+Na]+)：331.09061(计算值)，331.09052(实验值)。
N-乙二酸一酰-L-天冬氨酰甘氨酸甲酯1H-NMR(CD3OD)：δ(ppm)4.31-4.32(Asp-αH，d，1H)，3.89(Gly-αH，s，2H)，3.72(OMe，s，3H)，2.77-2.95(Asp-βH，m，2H)；ESI-HRMS(C9H12N2O8Na[M+Na]+)：299.04914(计算值)，299.04917(实验值)。
实施例15N-乙二酸一酰甘氨酰-L-亮氨酸甲酯(Oxalo-Gly-L-LeuOMe)的合成
Boc-GlyOH(0.48g，2.74mmol)，L-LeuOCH3·HCl(0.45g，2.47mmol)悬浮于10mL的DCM，冰浴搅拌下加入Et3N(0.35mL)，最后加入HOBt(0.19g，1.41mmol)、DCC(0.52g，2.52mmol)。用TLC板检测反应情况，于室温搅拌过夜，反应24h后，滴加3滴冰乙酸，破坏未反应的DCC，继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释反应液后过滤，滤液转移至分液漏斗中。依次用5％的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸去溶剂，获得油状物和少量固体，用约10mL乙酸乙酯稀释并将其转移至50mL茄形瓶，再过滤，滤液转至25mL的茄形瓶中，旋去溶剂，出现油状物。最后用油泵抽干溶剂，获得淡黄色油状物(Boc-Gly-L-LeuOCH3)，0.44g；产率为58％。
将上述油状物溶于1.0mL DCM，冰浴下加入TFA 1.0mL，搅拌1h后，旋转蒸发除去TFA和DCM，残留物加入无水乙醚，得白色固体，0.38g，产率：84％。将此固体溶于无水DCM(5mL)中，冰浴下加入Et3N 0.13mL，搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.24mL溶于1.0mL DCM)和Et3N(0.13mL)，反应4h后，旋转蒸发除去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解(120mL)，依次用水、5％的碳酸钠溶液洗涤，酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1洗脱)得产物0.25g，产率82％。1H-NMR(CDCl3)：δ(ppm)7.80-7.36(m，5H，Ph)，6.38(d，1H，NH)，5.33(s，2H，CH2Ph)，4.65(m，1H，Leu-αH)，4.08(d，2H，Gly-αH)，3.75(s，3H，OMe)，1.65(m，2H，Leu-βH)，1.56(t，1H，Leu-γH)，0.95(s，6H，Leu-δH).
将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.1g)，常压氢化(12h)，过滤除去Pd/C，蒸去乙醇，最终得到Oxalo-Gly-L-LeuOMe0.17g，粘稠状物，产率90％。[α]D20-20.0(C＝0.1，DMF)；ESI-HRMS(C11H18N2O6Na[M+Na]+)：297.10626(计算值)，297.10611(实验值)；1H-NMR(MeOD)：δ(ppm)4.52(m，1H，Leu-αH)，4.00(d，2H，Gly-αH)，3.73(s，3H，OMe)，1.70(m，1H，Leu-γH)，1.64(m，2H，Leu-βH)，0.98(d，3H，Leu-δH)，0.94(d，3H，Leu-δH).
实施例16N-乙二酸一酰甘氨酰-L-丙氨酸叔丁酯(Oxalo-Gly-L-AlaOBut)的合成
Fmoc-GlyOH(0.74g，2.48mmol)，L-AlaOBut·HCl(0.45g，2.48mmol)悬浮于10mL的DCM中，冰浴搅拌下加入Et3N(0.35mL)，最后加入HOBt(0.19g，1.41mmol)、DCC(0.52g，2.52mmol)。用TLC板检测反应情况，于室温搅拌过夜，反应10h后，滴加3滴冰醋酸，破坏未反应的DCC，继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释后过滤，滤液转移至的分液漏斗中。滤液依次用5％的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，得白色固体(Fmoc-Gly-L-AlaOBut)1.0g，产率97％。
将上述固体溶于5.0mL DCM，冰浴下加入二乙胺5.0mL，搅拌3h后，旋转蒸发除去溶剂，残留物真空干燥后溶于无水DCM(10mL)中，冰浴下加入Et3N 0.36mL，搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.40mL溶于1.0mL DCM)，反应6h后，旋转蒸发除去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解(120mL)，依次用水、5％的碳酸钠溶液、饱和食盐水洗涤，酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1洗脱)得白色固体0.62g，产率68％。1H-NMR(CDCl3)：δ(ppm)7.74-7.36(m，5H，Ph)，6.37(d，1H，NH)，5.33(s，2H，CH2Ph)，4.83(m，1H，Ala-αH)，4.05(d，2H，Gly-αH)，1.49(s，9H，tBu)，1.41(d，3H，Ala-βH).
将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.1g)，常压氢化(12h)，过滤除去Pd/C，蒸掉乙醇，最终得到Oxalo-Gly-L-AlaOBut0.43g，粘稠状物，产率92％。[α]D20-27.0(C＝0.4，DMF)；ESI-HRMS(C11H18N2O6Na[M+Na]+)：297.10626(计算值)，297.10606(实验值)；1H-NMR(MeOD)：δ(ppm)4.31(q，1H，Ala-αH)，3.99(d，2H，Gly-αH)，1.48(s，9H，tBu)，1.38(d，3H，Ala-βH).
实施例17N-乙二酸一酰甘氨酰-L-苏氨酸甲酯(Oxalo-Gly-L-ThrOMe)的合成
Fmoc-GlyOH(0.57g，1.92mmol)，L-Thr(But)-OMe·HCl(0.43g，1.91mmol)悬浮于3.5mL的DCM中，冰浴搅拌下加入Et3N(0.27mL)，最后加入HOBt(0.15g，1.11mmol)、DCC(0.40g，1.94mmol)。用TLC板检测反应情况，于室温搅拌过夜，反应15h后，滴加3滴冰醋酸，破坏未反应的DCC，继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释后过滤，滤液转移至分液漏斗中。滤液依次用5％的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，得白色固体。此固体用硅胶柱层析纯化，石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1洗脱，得固体(Fmoc-Gly-L-Thr(But)-OMe)0.60g，产率为：66％。
将上述固体溶于5.0mL DCM，冰浴下加入二乙胺5.0mL，搅拌3h后，旋转蒸发除去溶剂，残留物真空干燥后溶于无水DCM(5mL)中，冰浴下加入Et3N 0.21mL，搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.25mL溶于1.0mLDCM)，反应6h后，旋转蒸发除去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解(120mL)，依次用水、5％的碳酸钠溶液、饱和食盐水洗涤，酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1洗脱)得粘稠状物，0.33g，产率57％。1H-NMR(CDCl3)：δ(ppm)7.75-7.37(m，5H，Ph)，6.41(d，1H，NH)，5.33(s，2H，CH2Ph)，4.51(d，1H，Thr-αH)，4.26(m，1H，Thr-βH)，4.15(m，2H，Gly-αH)，3.74(s，3H，OMe)，1.19(d，3H，Thr-γH)，1.12(s，9H，tBu).
将上述化合物溶于0.5mL DCM，冰浴下分别加入苯甲醚0.1mL，TFA1.0mL，搅拌1h后，旋转蒸发除去TFA和DCM，残留物用硅胶柱层析(DCM∶MeOH＝60∶1洗脱)得粘稠状物，0.2g，产率77％。将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.1g)，常压氢化(12h)，过滤除去Pd/C，蒸去乙醇，最终得到Oxalo-Gly-L-ThrOMe 0.15g粘稠状物，产率100％。[α]D20+5.1(C＝0.2，DMF)；ESI-HRMS(C10H16N2O7Na[M+Na]+)：299.08552(计算值)，299.08547(实验值)；1H-NMR(MeOD)：δ(ppm)4.52(d，1H，Thr-αH)，4.32(m，1H，Thr-βH)，4.07(s，2H，Gly-αH)，3.76(s，3H，OMe)，1.20(d，3H，Thr-γH).
实施例18N-乙二酸一酰甘氨酰-L-色氨酸甲酯(Oxalo-Gly-L-TrpOMe)的合成
Boc-GlyOH(0.29g，1.65mmol)，L-TrpOMe·HCl(0.42g，1.65mmol)悬浮于4mL的DCM中，冰浴搅拌下加入Et3N(0.23mL)，最后加入HOBt(0.11g，0.81mmol)、DCC(0.34g，1.65mmol)。用TLC板检测反应情况，于室温搅拌过夜，反应15h后，滴加3滴冰醋酸，破坏未反应的DCC，继续搅拌0.5h后用约40mL的乙酸乙酯稀释后过滤，用适量的乙酸乙酯洗涤反应瓶和固体，最后滤液转移至100mL的分液漏斗中。滤液依次用5％的柠檬酸溶液、水、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，得白色固体(Boc-Gly-L-TrpOMe)。
将上述白色固体溶于1.6mL DCM，冰浴下分别加入苯甲醚0.1mL，TFA1.0mL，搅拌1h后，旋转蒸发除去TFA和DCM，残留物真空干燥后为一油状物。将此油状物溶于无水DCM(5mL)中，冰浴下加入Et3N 0.24mL，搅拌下再同时滴加乙二酸单苄酯单酰氯溶液(0.29mL溶于1.0mLDCM)和Et3N(0.27mL)，反应4h后，旋转蒸发除去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解(120mL)，分别用水、5％的碳酸钠溶液洗涤，酯层用无水硫酸镁干燥。旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到保护的乙二酰二肽衍生物。用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1.5∶1洗脱)得到白色固体0.37g，产率约51％(3步)。1H-NMR(CDCl3)：δ(ppm)8.10-6.97(m，10H，Ar)，6.42(d，1H，NH)，5.31(s，2H，CH2Ph)，4.93(m，1H，Trp-αH)，3.91(d，2H，Gly-αH)，3.72(s，3H，OMe)，3.34(s，2H，Trp-βH).
将此保护的乙二酰二肽衍生物溶于乙醇(20mL)中，加入10％的Pd/C(0.1g)，常压氢化(12h)，过滤除去Pd/C，蒸去乙醇，最终得到Oxalo-Gly-L-TrpOMe0.26g，淡红色固体，产率90％。[α]D20+15.5(C＝0.2，DMF)；ESI-HRMS(C16H18N3O6[M+H]+)：348.11956(计算值)，348.11982(实验值)；1H-NMR(MeOD)：δ(ppm)7.53-7.02(m，5H，Ar)，4.77(m，1H，Trp-αH)，3.95(d，2H，Gly-αH)，3.68(s，3H，OMe)，3.33(dd，1H，Trp-βH)，3.22(dd，1H，Trp-βH).
实施例19促醒活性实验
在体重2.0-2.5千克的成年家兔(New Zealand)上，采用第三脑室注射和静脉注射两种给药途径，测定了化合物N-乙二酸一酰-L-丙氨酸(Oxalo-L-AlaOH)及N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯(Oxalo-GlyGlyOEt)对脑电波δ(delta)、σ(sigma)与θ(theta)指数的影响。实验前分别在左、右运动前区，右枕和右颞等区装置急性或慢性不锈钢电极，用单极或双极引导，脑电各波的计算机分析均以运动前区为基础。侧脑室手术根据Sawyer的图谱，笫三脑室手术根据Monnier的方法在第三脑室和大脑导水管间插入一根和侧脑室同一外径的导管。静脉注射用0.9％NaCl消毒注射液溶解样品或作对照。脑室注射用新鲜配制的类脑脊液(0.9％NaCl溶液加葡萄糖)溶解样品或作对照。脑室注射用自动连续注射装置和微量注射器进行(25微升/分)。全部实验用ND-82型笔描器记录脑电，用MF-5型频率自动分析装置进行积分计算，用DTR-1204型磁带记录器进行多道记录。
实验结果(见表1、2、3、4)表明上述化合物能够显著降低脑电波δ和σ指数(瞌睡)，和增加θ指数(觉醒)，因此具有显著的促醒活性。
表1第三脑室注射化合物对脑电波δ指数的影响
表2静脉注射化合物对脑电波δ指数的影响
表3静脉注射化合物对脑电波σ指数的影响
表4静脉注射化合物对脑电波θ指数的影响
其他的一些药理实验还表明，N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯及其同系物具有以下特点：(1)不同给药途径(脑室注射，静脉注射，腹腔注射，口服)均有效，而且口服给药途径的作用时间最长。(2)N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯的有效作用剂量较低。大鼠、家兔等实验动物的脑室有效作用剂量是10μg/兔，静脉有效作用剂量是100μg/kg，腹腔的有效作用剂量是150μg/kg，而口服的有效作用剂量为150μg/kg。(3)N-乙二酸一酰甘氨酰甘氨酸乙酯的毒性较小。以有效作用剂量50倍的剂量给药(小鼠，i.p.)或40倍的剂量给药(大鼠，p.o.)在持续观察的两周内，均未见急性毒性效应。因此，上述化合物可以被应用于制备促醒药物。