锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺配合物及制 备方法 所属技术领域
本发明涉及到锝 -99m 标记的放射性药物化学和临床核医学技术领域， 特别是涉 及到一种锝 -99m 标记的聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 ) 配合物及其制备方法和应用。 背景技术 ASGP 受 体 (Asialoglycoprotein receptor， ASGP-R) 是 去 唾 液 酸 糖 白 蛋 白 受 体 的 简 写， 存 在 于 哺 乳 动 物 肝 细 胞 膜 上， 是介导肝脏清除血液中去唾液酸糖蛋白 (Asialoglycoprotein， ASGP) 的专一位点。 除了白蛋白之外几乎所有血浆蛋白都为糖蛋白， 在被肝脏合成并释放到血液时， 其糖链末端为唾液酸。 唾液酸与其它糖基形成较弱的连接， 在血液中并不稳定， 很易被清除。唾液酸部分被清除， 标志着这个糖蛋白寿命的结束。大部 分血浆蛋白中半乳糖结构都位于末端的第二位上， 因此当末端的糖被酶解后， 以半乳糖结 尾的糖蛋白就可以作为 ASGP 受体的作用底物。去唾液酸糖蛋白一旦在细胞表面与 ASGP 受 体结合， 所形成的配体 - 受体复合物迅速内化， 5 分钟左右进入前溶酶体囊泡后由于 pH 的作 用而解离， 受体再循环到质膜， 大部分配体经溶酶体酶的作用而被分解代谢， 小部分配体则 绕过溶酶体的降解而排入胆汁， 或穿过细胞膜返回细胞表面仍与受体相结合。这个过程可 以维持血浆糖蛋白的动态平衡。ASGP 受体可以在一定程度上反映出有效肝细胞功能， 在肝 炎、 肝硬化或肝癌等肝损伤性疾病发生时， 其数量和活性均受到损害。 肝炎疾病在世界范围 内都是一种高发疾病， 特别是肝硬化继发肝癌患者众多， 严重影响人类健康与生活质量， 其 重要性现在已经引起广泛关注突现。1984 年 Vera 等通过化学合成方法将半乳糖结构与人 血清白蛋白偶联得到新乳糖白蛋白 (galactosyl-neoglycoalbumin， NGA)， 并经 99mTc 标记
后进行肝显像研究。 1986 年 Kubota 等研制了一种 99mTc 标记 GSA(99mTc-diethylenetriamine pentaaceticacid-galactosyl-human serum albumin)， 通过增加双功能连接剂 DTPA( 二乙 烯三胺五乙酸 ) 结构， 简化了标记条件， 减少了非特异性结合。日本已经利用 ASGPR 显像剂 为核医学肝脏 SPECT 显像建立了三维肝脏模型， 该显像技术可以真实、 数字化地反映肝脏 功能， 这样既可以对肝硬化患者术前肝功能进行正确的评估， 帮助预测手术风险、 制定治疗 方案， 降低肝脏手术的围手术期死亡率。
聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 ) 化合物 (poly-N-p-vinylbenzyl-D-lactonami de) 对 ASGP 受体具有良好的亲和力， 目前主要用为一种人工合成的肝组织工程支架材料。 1994 年 Goto 等报道了用碘 -125 标记的聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 ) 化合物， 其对 ASGP 受体具有很高的亲和力， 在肝脏中有较好的浓集。锝 -99m 是目前临床使用最常见的放射性 核素， 具有良好的核素性质。目前锝 -99m 标记的 ASGP 受体显像剂如 99mTc-GSA 等采用人血 清白蛋白作为分子骨架进行修饰、 标记。但是人血清白蛋白容易变质， 不易保存。找到一种 稳定性好、 可用于锝 -99m 标记的人工聚合物开发用于肝 ASGP 受体显像的 SPECT 显像剂是 本技术领域需要解决的重要课题。发明内容 本发明的目的是提供一种具有化学稳定性强、 生物性能好、 初始摄取值及化学纯 度高、 制备简单及使用成本低， 应用在肝脏受体 SPECT 显像领域的锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯 基苄基 -D- 乳糖酰胺配合物。并且提供其制备方法。
为了达到上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 一种锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄 99m 基 -D- 乳糖酰胺配合物， 其表达式为 ： Tc-PVLA， 配体结构通式为 ：
以 99mTc 为中心核， 配体为含有 6- 肼基吡啶 -3- 甲酰胺基团 (HYNIC) 和半乳糖基 团的聚合物——聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 )-(N- 乙烯基苄基 -6- 肼基吡啶 -3- 甲酰 胺 )(p(VLA-co-VNI)) ；
式中 m 与 n 的比例为 1 ∶ 99 ～ 30 ∶ 70， 肼基选用苯甲醛 (R ＝ C6H5)、 4- 二甲氨基 苯甲醛 (R ＝ 4-NMe2-C6H4)、 苯甲醛 -2- 磺酸钠 (R ＝ 2-NaO3S-C6H4) 或 4- 羧基苯甲醛 (R ＝ 4-HO2C-C6H4) 通过成腙反应进行保护。 共配体选自 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸 (Tricine)、 N， N-(2- 羟乙基 ) 甘氨酸 (Bicine) 或 N-(2- 羟乙基 )- 亚乙基二氨三乙酸 (HEDTA) 中的 一种 ； 当使用 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸作为共配体时， 可选用三 (3- 磺酰苯基 ) 膦钠盐 (TPPTS) 或三苯基膦单磺酸单钠盐 (TPPMS) 中的一种作为协同配体。
本发明优选的配体中， m 与 n 的比例为 4 ∶ 96 ～ 15 ∶ 85。
锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺配合物的制备方法如下 ：
当不使用协同配体时， 以聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 )-(N- 乙烯基苄基 -6- 肼 基吡啶 -3- 甲酰胺 )(p(VLA-co-VNI)) 为配体， 在共配体、 还原剂的存在下反应制备得到放 射性锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺配合物， 其制备步骤为 ：
a. 将 p(VLA-co-VNI) 配体溶于缓冲液中 ； 按照配体比共配体为 1 ∶ 5 ～ 1000 的 重量比， 加入共配体 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸 (Tricine)、 N， N-(2- 羟乙基 ) 甘氨酸 (Bicine) 或 N-(2- 羟乙基 )- 亚乙基二氨三乙酸 (HEDTA) 中的一种 ；
b. 然后按还原剂比配体为 1 ∶ 1 ～ 800 的重量比称取还原剂并溶于盐酸溶液中 ；
加入到步骤 a 所得溶液中， 混合均匀， 控制其 pH 在 5.5 ～ 6.5 之间 ； 99 99m
c. 将从医用 Mo- Tc 发生器中淋洗获得的高锝酸根 99mTcO4- 淋洗液加入步骤 b 制 备的溶液中， 密封后在沸水浴条件下反应 10 ～ 100 分钟 ；
d. 将步骤 c 所得标记化合物通过凝胶色谱柱进行纯化。
上述步骤 a 中优选的 p(VLA-co-VNI) 配体的用量为 0.1mg ～ 4mg ；
上述步骤 a 中 p(VLA-co-VNI) 配体中肼基可选用苯甲醛、 4- 二甲氨基苯甲醛、 苯 甲醛 -2- 磺酸钠或 4- 羧基苯甲醛等进行保护， 以增加配体的稳定性 ； 肼基保护基团在步骤 99m c 中加热时解离， 脱保护后的肼基与 Tc 中心核配位。
上述步骤 a 中所述共配体为 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸 (Tricine)、 N， N-(2- 羟 乙基 ) 甘氨酸 (Bicine) 或 N-(2- 羟乙基 )- 亚乙基二氨三乙酸 (HEDTA) 中的一种， 其分子 结构式为 ：
共配体为锝 -99m 标记时参与配位的小分子配体， 优选的共配体用量为 ： 20mg ～ 上述步骤 a 中所述的缓冲液为 ： 0.05mol/L pH6.0 磷酸缓冲液， 用量为 0.1mL ～100mg ；
5mL ； 上述步骤 b 中所述的还原剂为 ： 将高价锝 (99mTcVIIO4-) 还原为低价锝的常规化学试 剂： 二水合氯化亚锡 (SnCl2·2H2O)， 优选的还原剂用量为 ： 0.005mg ～ 0.1mg ；
上述步骤 c 中， 配体中肼基的保护基团水解离去， 使肼基裸露出来， 从而进行标 记。
上述步骤 d 中所述的凝胶色谱柱选用填料为葡聚糖凝胶 G25(Sephadex G25) 的凝 胶柱 (HiTrap Desalting 凝胶柱 ) ；
上述制备方法中所述聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 )-(N- 乙烯基苄基 -6- 肼基 吡啶 -3- 甲酰胺 )(p(VLA-co-VNI)) 配体为自行合成， 其优选的配体用量为 0.1mg-4mg。配 体比共配体为 1 ∶ 5 ～ 1000 的重量比 ； 还原剂比配体为 1 ∶ 1 ～ 800 的重量比。
上述制备方法中所述的共配体、 缓冲液、 还原剂等试剂均以从市场购得。
当使用协同配体时， 以聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 )-(N- 乙烯基苄基 -6- 肼 基吡啶 -3- 甲酰胺 )(p(VLA-co-VNI)) 为配体， 在以 tricine 为共配体、 协同配体、 还原剂的 存在下反应制备得到放射性锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺配合物， 其制备 步骤为 ：
a. 将 p(VLA-co-VNI) 配体溶于缓冲液中 ； 按照配体比共配体为 1 ∶ 5 ～ 1000 的 重量比， 加入共配体 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸 (Tricine) ；
b. 按照协同配体比共配体为 1 ∶ 2 ～ 10 的重量比， 加入协同配体 ；
c. 然后按还原剂比配体为 1 ∶ 1 ～ 800 的重量比称取还原剂并溶于盐酸溶液中 ； 加入到步骤 b 所得溶液中， 混合均匀， 控制其 pH 在 5.5 ～ 6.5 之间 ； 99 99m
d. 将从医用 Mo- Tc 发生器中淋洗获得的 99mTcO4- 淋洗液加入步骤 c 制备的溶液 中， 密封后在沸水浴条件下反应 10 ～ 100 分钟 ；
e. 将步骤 d 所得标记化合物通过凝胶色谱柱进行纯化。
上述步骤 a 中优选的 p(VLA-co-VNI) 配体的用量为 0.1mg ～ 4mg ；
上述步骤 a 中 p(VLA-co-VNI) 配体中肼基可选用苯甲醛、 4- 二甲氨基苯甲醛、 苯甲 醛 -2- 磺酸钠或 4- 羧基苯甲醛进行保护， 以增加配体的稳定性 ； 肼基保护基团在步骤 d 中 99m 加热时解离， 脱保护后的肼基与 Tc 中心核配位。
上述步骤 a 中所述共配体为 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸 (Tricine)， 优选的共配 体用量为 ： 20mg ～ 100mg ；
上述步骤 b 中所述协同配体为三 (3- 磺酰苯基 ) 膦钠盐 (TPPTS) 或三苯基膦单磺 酸单钠盐 (TPPMS) 中的一种， 其分子结构式为 ：
协同配体为锝 -99m 标记时参与配位的小分子单齿配体， 优选的协同配体用量为 ： 1mg ～ 10mg ；
上述步骤 a 中所述的缓冲液为 ： 0.05mol/L pH6.0 磷酸缓冲液， 用量为 0.1mL ～ 5mL ；
上述步骤 c 中所述的还原剂为 ： 将高价锝 (99mTcVIIO4-) 还原为低价锝的常规化学试 剂： 二水合氯化亚锡 (SnCl2·2H2O)， 优选的原剂用量为 ： 0.005mg-0.1mg ；
上述步骤 d 中， 配体中肼基的保护基团水解离去， 使肼基裸露出来， 从而进行标 记。
上述步骤 e 中所述的凝胶色谱柱选用填料为葡聚糖凝胶 G25(Sephadex G25) 的凝 胶柱 (HiTrap Desalting 凝胶柱 ) ；
上述制备方法中所述聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 )-(N- 乙烯基苄基 -6- 肼基 吡啶 -3- 甲酰胺 )(p(VLA-co-VNI)) 配体为自行合成， 其优选的配体用量为 0.1mg ～ 4mg。 配体比共配体为 1 ∶ 5 ～ 1000 的重量比 ； 协同配体比共配体为 1 ∶ 2 ～ 10 的重量比 ； 还原 剂比配体为 1 ∶ 1 ～ 800 的重量比。
上述制备方法中所述的共配体、 协同配体、 缓冲液、 还原剂等试剂均以从市场购
得。 本发明以放射性高锝酸盐 (99mTcO4-) 与聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 )-(N- 乙 烯基苄基 -6- 肼基吡啶 -3- 甲酰胺 )(p(VLA-co-VNI)) 配体， 辅以 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘 氨酸 (Tricine)、 N， N-(2- 羟乙基 ) 甘氨酸 (Bicine) 或 N-(2- 羟乙基 )- 亚乙基二氨三乙 酸 (HEDTA) 中的一种为共配体 ； 当使用 N- 三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸作为共配体时， 可选用 三 (3- 磺酰苯基 ) 膦钠盐 (TPPTS) 或三苯基膦单磺酸单钠盐 (TPPMS) 中的一种作为协同配 体； 在还原剂 SnCl2·2H2O 的存在下， 反应制备得到一种放射性锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基 99m 苄基 -D- 乳糖酰胺配合物 ( Tc-PVLA)， 化学稳定性及生物性能好、 比活度高、 肝脏摄取值 及靶与非靶比值高、 制备简单及使用成本低， 可以用于制备新型的肝受体显像剂。
检测表明 ： 所得锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺配合物通过薄层层 析及 HPLC 鉴定， 其放射化学纯度大于 99％， 且在室温下放置 4 小时后放化纯度无变化， 有较 好的稳定性。
以实施例 1 中使用 tricine 为共配体得到的配合物 99mTc(PVLA)(tricine)2 为例， 实验表明， 锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺配合物的基本的性能如下 ：
1.99mTc(PVLA)(tricine)2 在正常小鼠体内生物分布
取 25 只 正 常 昆 明 小 白 鼠， 于 尾 静 脉 注 射 0.1mL 99mTc(PVLA)(tricine)2( 约 0.185MBq， 含 1μg PVLA)。于注射后 5、 10、 30、 60 和 120min 后断头处死。取出心、 肝、 肺、 肾、 肌肉、 骨、 血等组织， 称量并在 γ 计数器中测其放射性计数。 99m
Tc(PVLA)(tricine)2 在正常小鼠中的生物分布见表 1。 99m
在正常小鼠中的生物分布结果显示， Tc(PVLA)(tricine)2 在肝脏中有很高的初 始摄取， 注射 5min 后， 在肝脏中有 (125.33±10.99)％ ID/g 的摄取值。在心、 肺、 肾、 脾等 非靶器官的放射性浓集较低。特别是血液、 肾脏中的放射性浓集明显低于目前临床使用 99m 的 Tc-GSA， 这对于肝脏部位的定量评价具有重要的意义。基于以上生物分布实验结果， 99m Tc(PVLA)(tricine)2 表现了优良的生物性能， 有利于在未来的显像中够获得更清晰的图 像和更准确的数据。
表 1.99mTc(PVLA)(tricine)2 在正常小鼠体内生物分布数据 (％ ID/g±sd， n ＝ 5)
2.99mTc(PVLA)(tricine)2 在小鼠体内抑制实验
取同批次 5 只正常昆明小白鼠， 于尾静脉预注射 0.1mL 抑制剂 (NGA 溶于生理盐 水， 按 10mg/kg 体重的剂量注射 )， 5min 后， 于尾静脉注射 0.1mL99mTc(PVLA)(tricine)2( 约 0.185MBq， 含 1μg PVLA)。注射后 5min 后断头处死。取出心、 肝、 肺、 肾、 肌肉、 骨、 血等组 织， 称量并在锝分析仪内测其放射性计数。 99m
Tc(PVLA)(tricine)2 在正常小鼠体内抑制实验结果见表 2。
抑制实验的结果表明， 在通过预注射 NGA， 在 5min 时能够明显的抑制 99mTc(PVLA) (tricine)2 在小鼠肝脏中的摄取 (P ＜ 0.001)， 大量未进入肝脏的 99mTc(PVLA)(tricine)2 滞留在血液中， 在心、 肺、 肾等各脏器摄取也明显增加。
抑制实验的结果说明通过预注射 NGA， 可有效抑制 99mTc(PVLA)(tricine)2 在肝中 的摄取。证明 99mTc(PVLA)(tricine)2 对 ASGP 受体具有亲和性。
表 2.99mTc(PVLA)(tricine)2 在正常小鼠体内抑制实验数据
( 注药后 5min，％ ID/g±sd， n ＝ 5)
上述各项实验说明， 本发明所述的锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 配合物 ( Tc-PVLA)， 放射化学纯度大于 99％， 有很高的化学稳定性。 具有优良的生物性能， 99m 在肝脏中有较高的初始摄取 ； 与 Tc-GSA 相比有较低的非靶脏器摄取， 满足用作肝细胞受 体显像剂的条件， 能减少不必要的放射性损伤， 并且可减少对肝脏功能定量评价时的干扰， 99m 可作为新型的肝细胞去唾液酸糖蛋白受体显像剂， Tc-PVLA 作为新型配合物具有高化学 稳定性和良好的生物分布性质， 可作为肝细胞受体 SPECT 显像剂在临床上推广应用。
99m具体实施方式 ：
下面通过实施例详述本发明， 一种锝 -99m 标记的聚 N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 配合物 ：
1. 对乙烯基苯甲氨的合成
4- 氯甲基苯乙烯 15.3g(0.10mol) 和邻苯二甲酰亚胺钾 18.5g(0.10mol) 溶于 50mL DMF 中， 加热至 50℃反应 4h。旋蒸除去 DMF， 将残余物溶于氯仿， 先后用 0.2N 的氢氧化钠溶 液和水清洗， 旋干有机相后， 得到产物 N-(4- 乙烯基苄基 )- 邻苯二甲酰亚胺。于甲醇中重 结晶。mp107-108℃。
18.4g(0.07mol)N-(4- 乙烯基苄基 )- 邻苯二甲酰亚胺溶于 50mL 乙醇中， 加热回 流， 滴加入溶于 10mL 乙醇的 80％的水合肼 6.6g(0.105mol)。立即出现白色沉淀， 机械搅拌 回流 90min。过滤沉淀， 母液旋干溶剂， 将固体合并后， 溶于 KOH 溶液 (20gKOH， 120mLH2O)。 用乙醚萃取 (140mL×1， 70mL×4) 合并乙醚相用 2％的碳酸钾溶液洗 (40mL×4)， 用碳酸钾 干燥后， 除去溶剂， 加压蒸馏 (72-73℃ /3mmHg)。
2.N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 (VLA) 的制备
称取 1.27g 乳糖酸， 加入 25mL 甲醇， 分散溶解后旋蒸除去溶剂。 再加入 25mL 甲醇， 分散溶解后旋蒸除去溶剂。重复 20 次。得到乳糖酸内酯。
将乳糖内酯 1.7g(5mmol) 溶于 17mL 甲醇中回流， 将对乙烯基苯甲氨 0.7g(5mmol)溶于 3.75mL 甲醇中加入反应瓶。回流反应 120min， 冷却至室温， 产生白色晶体。过滤后， 固 体用少量的冷的甲醇洗， 真空干燥。
3.N- 乙烯基苄基 -6- 肼基吡啶 -3- 甲酰胺 (VNI) 的制备
将 6- 肼基吡啶 -3- 甲酸 (HYNIC)1g(6.5mmol) 溶于 40mLDMF 中， 加入等物质量的醛 类进行肼基保护， 室温搅拌 3h。加入琥珀酰亚胺 748mg(6.5mmol) 和 DCC2.76g(13.4mmol)， 室温反应 18h。过滤， 滤液旋干， 加入 50mL 乙酸乙酯， 加热回流 1h， 热过滤， 得到黄色粉末。
所加入的醛类可通过成腙反应对肼基进行保护， 可选用苯甲醛、 4- 二甲氨基苯甲 醛、 苯甲醛 -2- 磺酸钠或 4- 羧基苯甲醛等。保护基团在标记过程中通过加热水解离去， 使 肼基裸露从而进行配位。
将 N- 琥珀酰亚胺 -6- 肼基吡啶 -3- 甲酸和乙烯基苯甲氨按 1.2 ∶ 1 投料， 在 DMF 中室温反应 24h。旋蒸除去溶剂， 分别用乙酸乙酯和甲醇洗涤后得到浅黄色粉末。
4. 聚 (N- 乙烯基苄基 -D- 乳糖酰胺 )-(N- 乙烯基苄基 -6- 肼基吡啶 -3- 甲酰胺 ) (p(VLA-co-VNI)) 的制备
VLA 及 VNI 按 95 ∶ 5 的比例溶于 DMSO 中， 加入偶氮二异丁腈 (AIBN)( 按单体物 质的量的 0.5％ )。低温下抽真空并密封。60℃反应 16h。倒入冷的甲醇中， 出现浅黄色沉 淀。将沉淀溶于水后， 于 5000MWcut 的透析带中透析 48h， 冷冻干燥。 实施例 1 ： 99m
以 Tricine 作为共配体， Tc(PVLA)(tricine)2 的制备 ：
取 p(VLA-co-VNI)0.2mg 溶 于 0.5mL 磷 酸 缓 冲 液 (0.05mol/L pH6.0， 含 有 30mg 共配体 tricine) 中， 待全部溶解后加入 2mg/mL SnCl2·2H2O 溶液 10μL， 充分摇匀。最后 99m 加入新鲜 TcO4 洗脱液 0.5mL(37MBq)， 充分振荡， 密封后于沸水浴中反应 20min。即得到 99m Tc(PVLA)(tricine)2。
将 HiTrap 脱盐凝胶柱 (Sephadex G25) 用 25mL 淋洗液 (0.05mol/L pH 7.5 的磷酸 缓冲液 ) 平衡， 控制流速在 1 ～ 10mL/min 之间。 将 0.25mL 标记好的 99mTc(PVLA)(tricine)2 用 1mL 注射器上样， 先用 1.25mL 淋洗液淋洗后， 收集 1mL 淋洗液， 得到除去杂质、 回收率＞ 99m 95％的 Tc(PVLA)(tricine)2 溶液。
通过层析及 RP-HPLC 鉴定， 其保留时间为 11.9min， 放射化学纯度大于 99％。HPLC
条件为 ： 高效液相色谱仪 SHIMADZU(SCL-10Avp) ； Kromaisl C4 柱 250×4.6mm， 5μm ； A 相为水 ( 含 0.1％ TFA)， B 相为乙腈 ( 含 0.1％ TFA) ； 淋洗梯度为 ： 0 ～ 5min ： 5％ B 相， 5 ～ 30min ： 30％～ 70％ B 相 ； 流速 1mL/min。 实施例 2 ： 99m
以 Bicine 作为共配体， Tc(PVLA)(bicine) 的制备 ：
取 p(VLA-co-VNI)1mg 溶于 0.5mL 磷酸缓冲液 (0.05mol/L pH6.0， 含有 20mg 共配 体 bicine) 中， 待全部溶解后加入 2mg/mL SnCl2· 2H2O 溶液 5μL， 充分摇匀。最后加入新鲜 99m TcO4 洗脱液 0.5mL(37MBq)， 充分振荡， 密封后于沸水浴中反应 20min。 即得到 99mTc(PVLA) (bicine)。
将 HiTrap 脱盐凝胶柱 (Sephadex G25) 用 25mL 淋洗液 (0.05mol/L pH 7.5 的磷酸 缓冲液 ) 平衡， 控制流速在 1 ～ 10mL/min 之间。将 0.25mL 标记好的 99mTc(PVLA)(bicine) 用 1mL 注射器上样， 先用 1.25mL 淋洗液淋洗后， 收集 1mL 淋洗液， 得到除去杂质、 回收率＞
95％的 99mTc(PVLA)(bicine) 溶液。
实施例 3 ： 99m
以 HEDTA 作为共配体， Tc(PVLA)(HEDTA) 的制备 ：
取 p(VLA-co-VNI)3mg 溶于 0.5mL 磷酸缓冲液 (0.05mol/L pH6.0， 含有 50mg 共配 体 HEDTA) 中， 待全部溶解后加入 2mg/mL SnCl2· 2H2O 溶液 20μL， 充分摇匀。最后加入新鲜 99m TcO4 洗脱液 0.5mL(37MBq)， 充分振荡， 密封后于沸水浴中反应 20min。 即得到 99mTc(PVLA) (HEDTA)。
将 HiTrap 脱盐凝胶柱 (Sephadex G25) 用 25mL 淋洗液 (0.05mol/L pH 7.5 的磷 酸缓冲液 ) 平衡， 控制流速在 1 ～ 10mL/min 之间。将 0.25mL 标记好的 99mTc(PVLA)(HEDTA) 用 1mL 注射器上样， 先用 1.25mL 淋洗液淋洗后， 收集 1mL 淋洗液， 得到除去杂质、 回收率＞ 99m 95％的 Tc(PVLA)(HEDTA) 溶液。
实施例 4 ： 99m
以 Tricine 作为共配体， TPPMS 作为协同配体， Tc(PVLA)(tricine)(TPPMS) 的制 备：
取 p(VLA-co-VNI)0.1mg 溶于 0.5mL 磷酸缓冲液 (0.05mol/L pH6.0， 含有 25mg 共 配体 tricine， 5mg 协同配体 TPPMS) 中， 待全部溶解后加入 2mg/mL SnCl2·2H2O 溶液 5μL， 充分摇匀。最后加入新鲜 99mTcO4- 洗脱液 0.5mL(37MBq)， 充分振荡， 密封后于沸水浴中反应 99m 20min。即得到 Tc(PVLA)(tricine)(TPPMS)。
将 HiTrap 脱盐凝胶柱 (Sephadex G25) 用 25mL 淋洗液 (0.05mol/L pH 7.5 的磷酸 缓冲液 ) 平衡， 控制流速在 1 ～ 10mL/min 之间。将 0.25mL 标记好的 99mTc(PVLA)(tricine) (TPPMS) 用 1mL 注射器上样， 先用 1.25mL 淋洗液淋洗后， 收集 1mL 淋洗液， 得到除去杂质、 回 99m 收率＞ 95％的 Tc(PVLA)(tricine)(TPPMS) 溶液。
实施例 5 ： 99m
以 Tricine 作为共配体， TPPTS 作为协同配体， Tc(PVLA)(tricine)(TPPTS) 的制 备：
取 p(VLA-co-VNI)0.5mg 溶于 0.5mL 磷酸缓冲液 (0.05mol/L pH6.0， 含有 30mg 共 配体 tricine， 3mg 协同配体 TPPTS) 中， 待全部溶解后加入 2mg/mL SnCl2·2H2O 溶液 5μL， 99m 充分摇匀。最后加入新鲜 TcO4 洗脱液 0.5mL(37MBq)， 充分振荡， 密封后于沸水浴中反应 99m 20min。即得到 Tc(PVLA)(tricine)(TPPTS)。
将 HiTrap 脱盐凝胶柱 (Sephadex G25) 用 25mL 淋洗液 (0.05mol/L pH 7.5 的磷酸 缓冲液 ) 平衡， 控制流速在 1 ～ 10mL/min 之间。将 0.25mL 标记好的 99mTc(PVLA)(tricine) (TPPTS) 用 1mL 注射器上样， 先用 1.25mL 淋洗液淋洗后， 收集 1mL 淋洗液， 得到除去杂质、 回 99m 收率＞ 95％的 Tc(PVLA)(tricine)(TPPTS) 溶液。12