一种冬虫夏草 DNA 指纹高分辨率的显带检测方法 技术领域 本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及一种用于名贵濒危药用植物冬虫夏草 DNA 指纹高分辨率的显带检测方法。
背景技术 虫草属 Cordyceps(Fr.)Link 是一大类昆虫病原真菌， 其特定的菌感染特定的昆 虫后具有重要的药用价值的冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.] 是我国名贵药 材。 冬虫夏草性味甘、 平， 入肺、 肾经， 能益肺肾、 止咳、 补虚损、 益精气、 抗衰老、 抗癌症， 具有 增强人体免疫功能和调节生殖的作用。天然冬虫夏草主产于西藏、 云南、 四川和青藏等地， 种质资源丰富。但目前充斥市场的同属伪品种类繁多， 品质高低各异。
目前， 药用真菌冬虫夏草鉴定及鉴别方法亟待提高， 传统的生药学鉴别方法多根 据表观结构特征直接分辨和鉴定， 常用的化学分析方法不够精确、 高效， 所需检测的样品量 大从而对珍贵濒危中药造成浪费。 DNA 指纹检测现已广泛用于中药原料的质量检测和鉴定， 但现有的 DNA 指纹检测方法中采用的放射显带方法和荧光显带方法均有一定局限性， 放射 显带方法对环境和实验人员均有高污染的风险， 而荧光显带方法所用的仪器昂贵， 难以普 及， 而低污染而应用普遍的传统聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 银染显带方法操作时间长、 步 骤多、 采用试剂繁多， 易造成现代的背景色浓、 分辨率低、 条带模糊， 导致显带结果不准确。 同时， 冬虫夏草 DNA 指纹多态性丰富， 对显带的操作要求甚为严格， 现有技术很难得到高效 准确的冬虫夏草高分辨率 PAGE 显带， 从而难以为冬虫夏草性状指标 - 化学 - 分子系统提供 可靠高效的评价体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了解决现有冬虫夏草鉴定及鉴别方法中用量大、 不够精确高效， 放射显带方法和荧光显带方法存在诸多缺陷， 建立能完全适应冬虫夏草 DNA 指纹高分辨率的显带检测方法。
为此， 本发明公开了一种冬虫夏草 DNA 指纹高分辨率的显带检测方法， 包括冬虫 夏草 DNA 的 PAGE 胶电泳步骤、 胶固定步骤、 胶染色步骤、 胶显色步骤， 其特征在于所述胶固 定步骤中固定液为 0.5％乙酸， 所述胶染色步骤中染色液为 0.1％ -0.3％ AgNO3， 所述胶显 色步骤中显影液为 1％ -4％强碱和 0.5％甲醛溶液。
在一些实施方式中， 所述冬虫夏草 DNA 的 PAGE 胶电泳步骤中 PAGE 胶为 3％ -6％ 的 PAGE 胶， 以利于冬虫夏草 DNA 的多态性的展现。
在一优选实施方式中， 所述染色液为 0.3％ AgNO3， DNA 指纹多态性效果为 60-80 条 带， 显带更为清晰， 背景适中， 多态性丰富。
在一些实施方式中， 所述强碱可为 NaOH 或 KOH， 其中优选 1％ -2％ NaOH。
该发明建立了一种冬虫夏草 DNA 指纹高分辨率的显带检测方法。由于采用了 DNA 分子指纹方法和 PAGE 显带检测方法鉴别， 冬虫夏草样品用量仅需 50ng， 大大节省了濒危植物药材用量， 同时避免了放射显带方法和荧光显带方法的高污染性和昂贵等局限性， 并将 传统的 4 步 ( 固定、 染色、 显色、 终止 ) 银染法省掉了终止反应的过程， 在提高特异性的前提 下缩短了时间。本发明所述显带检测方法减少药品污染， 其强碱低浓度的策略可以较好降 低冬虫夏草 DNA 指纹图谱 PAGE 显带的背景色， 提高了分辨率， 克服了弱碱耗时耗费等特点， 同时， 采用的另外， 本发明省去了硫代硫酸钠和醋酸溶液， 使得操作无需在通风橱中进行， 使检测方法更为安全和经济。 本发明为冬虫夏草的鉴定分辨等研究提供一种现代分子生物 学技术的高分辨率显带检测方法。 本发明缩短了研究时间， 提高了研究效率和准确性， 更切 合冬虫夏草鉴定和鉴别的实际要求， 得到高效准确的冬虫夏草高分辨率 PAGE 显带， 从而为 建立珍贵濒危中药材 - 冬虫夏草资源可持续发展系统奠定分子分析基础， 为冬虫夏草性状 指标 - 化学 - 分子系统提供可靠高效的评价体系。 具体实施方式
以下结合具体实施例， 进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件或按 照制造厂商所建议的条件。除非另行定义， 文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟 练人员所熟悉的意义相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明配置液体的比例和操作的具体步骤为 ： 实施例 1 (1) 冬虫夏草 DNA 的 PAGE 胶电泳步骤 ： 用 3％ -6％的 PAGE 胶检测冬虫夏草 DNA 指 表1 聚丙烯酰胺凝胶浓度表纹图谱。
按照上表配制不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶， 参照常规方法抽提冬虫夏草 DNA、 进行 PAGE 胶电泳。
(2) 胶 固 定 过 程 ： 其 目 的 是 使 核 酸 能 更 好 的 和 Ag+ 特 异 性 结 合， 固定时间 15-30min， 固定液浓度不用乙醇 10％， 而直接用 0.5％乙酸， 明显提高特异性。
(3) 染色液采用 0.1％ -0.4％ AgNO3 溶液配方。将 PAGE 胶板取下并分离， 将有冬 虫夏草 DNA 指纹的 PAGE 胶的一侧放入 ddH20(2000ml) 中漂洗 3-6s 再将 PAGE 板放入盛有 染色液的容器中进行 DNA 指纹染色， 染色过程为在摇床上摇动 10-15min， 结果如下表 2 ：
表 2 不同染色浓度 DNA 指纹多态性效果表
AgNO 浓 度 (％ ) 0.1 0.2DNA 指纹多态性效果50-60 条， 清晰， 条带略浅 60-70 条， 更为清晰， 小分子量 DNA 未能完全显 示 60-80 条， 更为清晰， 背景适中， 多态性丰富 Smear， 条带较多不太容易识读0.3 0.4(4) 显影液采用 1％ -4％ NaOH 溶液配方和 0.5％甲醛溶液。将染色后的 PAGE 板 浸入 ddH2O 中， 漂洗 2 次， 每次 3-6s， 再放入显色液中进行 DNA 指纹显影。DNA 指纹带全部 出现后， 立刻用 ddH20 清晰 2 次， 每次 3-6s。
(5) 清洁 PAGE 板并干胶。
表 3 常见几种方法显带结果比较
方法 方法一主要步骤 染色 + 显色耗时 (min) 15-30背景 浅操作程序 简单液体保存 现配先用显带效果 小分子量 条带不易 分辨方法二固定 + 染色 + 显色 + 终止55-70深繁琐现配先用大分子量 条带浑浊本发明方 法
固定 + 染色 + 显色25-35适中较简单反复利用多态性佳本发明为一种优化的冬虫夏草 DNA 指纹高分辨率的 PAGE 显带检测方法。 其原理是 利用了银离子和核苷酸结合， 银离子在碱性环境下遇甲醛还原， 从而显现凝胶中的 DNA 指 纹片段。与同位素显带法相比， 该方法减少了同位素的危害。费用昂贵的荧光染色法相比， 该法节约了时间和成本， 且易推广普及。 同时， 该发明和传统的四步法相比， 减少了时间， 提 高了效率， 与二步法 ( 比起合并固定与染色为一步骤的方法 )， 该发明能够检测到冬虫夏草 小分子量的多态性， 得到了高分辨率的冬虫夏草 DNA 指纹。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制， 所述实施方案只作为阐明本发明各 个方面的单个例子， 本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。 实际上， 除了本文所述的 内容外， 本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所 述改进也落入所附权利要求书的范围之内。 上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为 参考。6