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疟疾疫苗
    本发明涉及用于治疗疟疾的稳定化的脂蛋白粒子，其制备方法，其在医药中的 应用，特别是在预防疟疾感染中的应用，包含所述粒子的组合物 / 疫苗，以及所述组合 物 / 疫苗特别是在治疗中的应用。
     疟疾，是全世界主要的健康问题之一，每年超过 2-4 百万人死于该病。 该病的 最流行的形式之一由原生动物寄生虫间日疟原虫 (P.vivax) 所引起，该间日疟原虫在热带 和亚热带地区被发现。 令人感兴趣的是，该寄生虫可以在低至 15℃的温度下完成其蚊体 周期，这使得该病在温带气候中得以蔓延。
     该病的最急性形式之一由原生动物寄生虫恶性疟原虫 (P.falciparum) 所引起，该 恶性疟原虫是导致由疟疾造成的大多数死亡的原因。
     疟原虫的生命周期是复杂的，需要两种寄主即人和蚊用于完成生命周期。 人的 感染开始于子孢子通过被感染蚊子的叮咬被接种进入血流中。 所述子孢子移到肝并感染 那里的肝细胞，其中所述子孢子经由红细胞外的胞内阶段分化成裂殖子阶段，其感染红 细胞 (RBC) 以启动在无性血内阶段中的循环复制。 该周期通过在 RBC 中许多裂殖子分 化成有性繁殖阶段的配子体而完成，所述配子体被蚊子摄入，在蚊子体内，所述配子体 在蚊子中肠内经由一系列阶段发展生成子孢子，其移到唾液腺。
     由于由间日疟原虫引起的疾病很少致命的事实，预防和治疗疟疾的努力已集中 于更加致命形式的由恶性疟原虫引起的疾病。
     尽管由间日疟原虫引起的疾病不常导致患者死亡，由于看起来日益增多的大量 的病例，对患者生命质量的显著影响，日益增加的关于该病导致贫血症和死亡的严重事 件的报导，以及经济影响，仍然需要用于该病的有效疫苗。 另外，对该病的两种病因都 能够提供防护的单一疫苗将是有利的。
     间日疟原虫的特征在于，一些虫株能够通过在进入外周循环以显现临床症状之 前在肝内保持潜伏而造成延迟感染。 因此，当例如穿过污染地区时，对象可被感染，但 是可能历时数月不表现出症状。 这是引起疾病蔓延的潜在原因，并且由于这一缘故，到 污染区域旅行的人在到该污染区域旅行之后的规定的一段时间内不允许捐赠输血。
     间日疟原虫疟疾感染在肝内保持潜伏，而所述寄生虫正经历红细胞内裂殖生长 前 (pre-erthrocytic shizogony) 阶段。如果所述寄生虫在其离开肝之前在该阶段受到控制， 在患者中观察不到疾病的临床症状。
     疟原虫的子孢子阶段被确定为是疟疾疫苗的潜在的靶标。 使用去活化 ( 经 照射的 ) 子孢子的疫苗已显示诱导对实验人类疟疾的防护 (Am.J， Trap.Med.Hyg 24 ： 297-402，1975)。 然而，根据这一方法论，采用经照射的子孢子来生产用于一般人群的 疟疾疫苗在实践中和就后勤学而言是不可能的。
     所述子孢子的主要表面蛋白被称为环子孢子蛋白 (CS 蛋白 )。 认为在子孢子从 被蚊子叮咬的最初接种位置进入循环 ( 在那里子孢子移到肝处 ) 期间，所述蛋白参与子孢 子的移动和侵入。
     疟原虫的 CS 蛋白的特征在于，侧接非重复的氨基 (N 端 ) 片段和羧基 (C 端 ) 片
     段的中央重复结构域 ( 重复区 )。 间日疟原虫的中央结构域由重复单元、通常是九个串联 氨基酸的若干区组组成。
     在某些亚洲株中，在所述中央重复区之后，存在大约 12 个氨基酸的附加序列 ( 参见 SEQ ID No 11)。 后者的功能是未知的。 然而，据一些人假设，所述氨基酸可能 与疾病临床症状的延迟发病相关联，尽管尚未对此进行考察。 认为 N 端的特征在于被称 为 I 区的 5 个氨基酸的序列 ( 参见 SEQ ID No 1)。 还认为 C 端的特征在于包括被称为 II 区的 12 个氨基酸的序列。 后者包含细胞粘附基序，其在所有的疟疾 CS 蛋白中是高度保 守的 ( 参见 SEQ ID No.2)。
     若干研究小组已提出了基于环子孢子蛋白的亚单位疫苗。 完全基于所述中央重 复区的这些疫苗中的两个在二十世纪八十年代初经历临床试验 ；一个疫苗是合成肽，另 一个疫苗是重组蛋白 (Ballou 等人，Lancet ：June 6(1987)，第 1277 页起，和 Herrington 等 人， Nature 328 ：257(1987))。 这些疫苗在刺激抗子孢子应答中获得成功。 尽管如此， 应答幅度是令人失望的，一些疫苗根本不产生应答。 另外，在随后的注射之后，抗体水 平 “加强” 的缺乏以及体外淋巴细胞增殖试验的结果暗示了，这些志愿者中大多数的 T 细胞不识别免疫显性重复 (immuno-dominant repeat)。 另外，这两个疫苗的效率勉强说得 过去，只有一个被接种的志愿者没有发展成寄生虫血症。 这些疫苗没有作进一步讨论。
     WO 93/10152 和 WO 98/05355 描述了来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的疫苗， 并且使用其中所述的方法在朝着抗恶性疟原虫的疫苗方面似乎有了一些进展，还参见， Heppner 等人，2005， Vaccine 23，2243-50。
     迄今为止，在临床上最先进的疟疾疫苗基于被称作 RTS，S 的脂蛋白粒子 ( 又名 病毒样粒子 )。 该粒子包含恶性疟原虫的 CS 蛋白的一部分，该部分实质上与恶性疟原虫 ( 虫株 NF54/3D7) 的 CS 蛋白的氨基酸 207-395 相对应，该部分通过线性接头在框架内融 合至来自乙型肝炎的 S 抗原的 N 端。 所述接头可包括来自 S- 抗原的 preS2 的一部分。 详细内容请参见以下的讨论。
     恶性疟原虫内的 CS 蛋白具有保守的中央重复区。 相比之下，间日疟原虫的 CS 蛋白的至少两种形式 ( 被称为 VK210 或 I 型以及 VK247 或 II 型 ) 是已知的。 这使得更 难以鉴定具有全部所需性质诸如免疫原性的 CS 蛋白的构建体，该构建体提供对间日疟原 虫的总体防护而与 CS 蛋白的具体类型无关，因为针对 I 型中央重复区的抗体未必识别相 应的 II 型区上的表位，反之亦然。
     就本发明人所知晓的程度，尚未提议基于间日疟原虫的单一虫株的与 RTS，S 相 当的粒子。
     杂合间日疟原虫 CS 蛋白描述于 WO 2006/088597 中。
     包含 WO 2006/088597 的杂合蛋白以及来自乙型肝炎的 S 抗原的融合蛋白 ( 本文 中被称作 CSV-S) 以及包含该融合蛋白的脂蛋白粒子描述于 PCT/EP2007/057301 中。
     包含 CSV-S、 RTS 和任选的 S 单元的脂蛋白粒子描述于 PCT/EP2007/057296 中。
     目前， RTS， S 疟疾疫苗作为冻干抗原被提供，其在递送之前不久用助剂进行重 新构成。 这是因为该抗原当储存历时相当长的时段时不稳定，特别是在助剂的存在下。 所述不稳定性自身表现为团聚和 / 或降解。到 2018/2019 年，据估计需要 8300 万剂量的疟疾疫苗。 目前的冻干 ( 冷冻干 燥 ) 方法花费约 40 小时。 因此，目前的方法不可能满足未来的需求。 有可能将生产周 期缩短到约 28 小时，但是这仍不大可能满足所述需求。 另外，进一步缩短周期时间看来 导致出现不合格产品。
     疟疾疫苗主要在基础设施 (infra-structure) 和设备贫乏的国家中用于递送，因 此，在直到给药前是稳定的疫苗提供形式是至关重要的，特别是如果提供的是液体制剂 时。
     由发明人提供的初始数据表明，在磷酸盐缓冲盐水中制备的、含有残留量的聚 山梨醇酯 80(0.0062％ w/w) 且不含其它赋形剂的、 pH 为 6.1 的 RTS， S 纯体积 (purified bulk)，在加速稳定性试验 ( 即在 37℃下储存 7 天 ) 后，显示显著的降解和氧化性聚集。 在 4℃下储存 2 个月后观察到轻微聚集和降解。
     考察了以下的选项 ：
     · pH 从 6.1 增加到 7.4 似乎降低了 S 抗原降解，但是增加 CS 蛋白降解 ；
     ·聚山梨醇酯 80( 也称为吐温 80) 浓度增加到 0.05％、0.5％和 1.0％似乎增加聚 集和降解二者，这是令人惊讶的，因为吐温 80 通常降低抗原聚集 ( 据发明人假设，这是 由在土温内存在残留的过氧化物所导致的，残留的过氧化物可能催化蛋白 / 抗原内的硫 醇基的催化氧化 - 使用本发明的还原剂似乎防止这一效果 ) ；和 · 加入蔗糖 (6.2％ w/w) 对聚集或降解没有影响。
     据假设，所述聚集过程在许多阶段中发生，并且如果这些阶段之一可被成功地 阻止的话，则可以阻止聚集和 / 或降解 ( 参见 ： ″ Minimizingprotein inactivation ″， D.B.Volkin 和 A.M.Klibanov， ″ Protein function ：apractical approach ″， T.E.Creighton 编 -IRL Press， Oxford University Press)。
     第一阶段是天然蛋白解折叠，从而暴露出其疏水性更大的区域。 该疏水性区域 的暴露导致若干蛋白组在一起。 最后阶段是所述蛋白通过二硫键的形成而发生不可逆变 性。
     还可能的是，为使所述抗原增溶而被加入的聚山梨醇酯 80 含有残留的过氧化 物，残留的过氧化物催化聚集和 / 或降解。
     本发明人尝试了许多的稳定试剂 / 稳定方法，例如，糖，多元醇，共溶剂，聚 合物，离子， pH，缓冲剂，抗氧化剂，螯合剂和表面活性剂，它们都不提供所需效果。 例如，加入抗坏血酸产生显著的聚集。 使用单独的 EDTA 或在抗氧化的存在下使用 EDTA 不阻止聚集。 另外，加入亚硫酸盐不提供所需的稳定效果。 一些常见的稳定剂与在最终 的疟疾制剂中所采用的辅助制剂不相容。 本发明人目前相信，疟原虫 CS 蛋白 ( 恶性疟 原虫和 / 或间日疟原虫 ) 的脂蛋白粒子可采用特定的稳定剂进行稳定化用于储存，例如， 包含至少一个硫醇 (-SH) 基团的还原剂，诸如硫代硫酸盐，N- 乙酰半胱氨酸，一硫代甘 油，半胱氨酸，还原型谷胱甘肽和硫代乙酸钠或其混合物，特别是 N- 乙酰半胱氨酸，一 硫代甘油，半胱氨酸，硫代乙酸钠及其混合物，特别是一硫代甘油，半胱氨酸及其混合 物。
     作为这些包含至少一个硫醇 (-SH) 基团的还原剂的替代物或者与这些还原剂相 组合，本发明使用的脂蛋白粒子可通过从它们被储存在内的容器中除去氧和 / 或使所述
     制剂避光 ( 例如通过使用褐色玻璃容器 ) 而被稳定化或进一步稳定化，可保护 / 进一步保 护所述抗原。
     因此，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含 ：
     a) 免疫原性粒子 RTS， S，和 / 或
     b) 来源于一种或多种间日疟原虫虫株的 CS 蛋白和来自乙型肝炎的 S 抗原以及任 选的未融合 S 抗原的免疫原性粒子，和 / 或
     c) 包含 RTS、 CSV-S 和任选的未融合 S 抗原的免疫原性粒子，和
     d) 包括 ( 或选自 ) 具有至少一个硫醇官能团的还原剂的稳定剂，例如，如上所述 的还原剂，诸如一硫代甘油，半胱氨酸， N- 乙酰半胱氨酸或其混合物。
     在一个方面，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含上述的 a)、 b)、 c) 和任选 的 d)，并且其中在其制备中采用诸如从容器中除去氧和 / 或通过例如使用褐色玻璃容器 使所述制剂避光的保护措施。
     有利地是，包含来自疟原虫的 CS 蛋白以及来自肝炎的 S 抗原的脂蛋白粒子抗原 可通过采用一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物和 / 或诸如从小瓶中除去氧和 / 或通过例如 使用褐色玻璃容器使所述制剂避光而被足够地稳定化。
     序列表 SEQ.ID.No.1 间日疟原虫的 N 端的 I 区 SEQ.ID.No.2 是在间日疟原虫的 C 端中的 II 区的高度保守 部分 SEQ.ID.No.3-9 间日疟原虫的 I 型 CS 蛋白的多种重复单元 SEQ.ID.No.10 间日疟原虫的 II 型 CS 蛋白的主要重复单元 SEQ.ID.No.11 在间日疟原虫的亚洲株中发现的附加氨基酸 SEQ.ID.No.12 间日疟原虫的杂合蛋白 CSV 的核苷酸序列 ( 为在大肠杆菌中表达而被优化 ) SEQ.ID.No.13 间日疟原虫的杂合蛋白 CSV 的氨基酸序列 SEQ.ID.No.14 间日疟原虫的 II 型 CS 蛋白的次要重复单元 SEQ.ID.No.15 间日疟原虫的杂合蛋白 CSV 的核苷酸序列 ( 为在酵母中表达而被优化 ) SEQ.ID.No.16 杂合融合蛋白 CSV-S 的核苷酸序列 SEQ.ID.No.17 杂合融合蛋白 CSV-S 的氨基酸序列 SEQ.ID No.18 RTS 表示盒的核苷酸序列 SEQ.ID No.19 来自 SEQ ID No.18 的预期 RTS 融合蛋白 SEQ ID Nos.20 到 25 包含 CpG 的寡核苷酸的实施例。附图说明 图 1pRIT15546 酵母游离型载体的质粒图谱 ；
     图 2 通过在将所需抗原与来自乙型肝炎的 S 抗原 “融合” 中使用的 GSK 制备的 质粒 pGF1-S2 的质粒图谱。 ( 在切除 12bp SmaI DNA 片段之后 ) 在 SmaI 位点之间的克 隆异源 DNA 序列与 S 基因产生符合读框的融合 ；
     图 3pRIT15582 的质粒图谱 ；
     用 XhoI 消化释放携带 CSV-S 表达盒加 LEU2 选择性标记的 8.5kb 的线形 DNA 片 段，用于插入所述酵母染色体内 ；
     图 4 用于整合 CSV-S 表达盒的线性 XhoI 片段的限制图谱 ；
     图 5 在虫株 Y1835 中产生的 CSV-S， S 混合粒子的电子显微照片 ；
     CSV-S， S 粒子从可溶性细胞抽提物 ( 基于 RTS， S 纯化法 ) 纯化并经历电子显 微镜分析。 在用磷钨酸进行负染色之后可见到粒子。 比例等于 100nm ；
     图 6 显示在 37℃ +/-AOT-Novex 凝胶中在非还原 ( 左 ) 和还原 ( 右 ) 条件下储 存 7 天之后，在与 AS01 混合之前 ( 上 ) 或与 AS01 在 25℃混合 24 小时之后 ( 下 ) 的 SDS page 分析，
     1.Mw
     2.PB T0
     3.PB 7 天 37℃
     4.NaCl PO47 天 37℃
     5.NaCl PO47 天 37℃ +AOT 褐色玻璃 6.NaCl PO47 天 37℃ +AOT 白色玻璃
     7.MTG 0.01％ 7 天 37℃
     8.MTG 0.01％ 7 天 37℃ +AOT 褐色玻璃
     9.MTG 0.01％ 7 天 37℃ +AOT 白色玻璃
     10.MTG 0.04％ 7 天 37℃
     11.MTG 0.04％ 7 天 37℃ +AOT 褐色玻璃
     12.MTG 0.04％ 7 天 37℃ +AOT 白色玻璃 ；
     图 7 显示在还原 ( 左 ) 和非还原 ( 右 ) 条件下在 37℃ -Novex 凝胶中储存 14 天 之后，在与 AS01 混合之前或与 AS01 混合在 25℃历时 24 小时之后的 SDS page 分析 ；
     图 8 显示在还原 ( 左 ) 和非还原 ( 右 ) 条件下在 37℃ -Novex 凝胶中储存 5 周之 后，在与 AS01 混合之前或与 AS01 混合在 25℃历时 24 小时之后的 SDS page 分析 ；
     对于图 7 图 8 ：
     1.Mw
     2.PB T0 还原
     3.RTS， S NaCl PO45 周 37℃还原
     4.RTS， S MTG 0.01％ 5 周 37℃还原
     5.RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃还原
     6.(RTS， S NaCl PO45 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃还原
     7.(RTS， S MTG 0.01％ 5 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃还原
     8.(RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃还原
     9.PB T0 非还原
     10.RTS， S NaCl PO45 周 37℃非还原
     11.RTS， S MTG 0.01％ 5 周 37℃非还原
     12.RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃非还原
     13.(RTS， S NaCl PO45 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃非还原
     14.(RTS， S MTG 001％ 5 周 37℃ )/AS01E24 小时 25℃非还原
     15.(RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃非还原
     图 9 通过混合 ELISA αCSP-α-S 显示在有或者没有一硫代甘油的液体制剂中的 RTS， S 抗原性 ；
     图 10 显示抗 CS 血清学结果 ；
     图 11 显示抗 HBS 血清学结果 ；
     图 12 显示 CS 特异性 CD4T 细胞应答 ；
     图 13 显示 HBs 特异性 CD4T 细胞应答 ；
     图 14 显示 CS 特异性 CD8T 细胞应答 ；
     图 15 显示 HBs 特异性 CD8T 细胞应答 ；
     发明详述
     采用 N- 乙酰半胱氨酸、一硫代甘油、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和硫代乙酸钠 或其混合物的本发明的方面具有另外的优点，该优点在于该实施方案提供了可行的替代 硫酸钠的生产备选方案 ( 可能希望避免硫酸钠的使用 )。
     尽管不希望束缚于理论约束，据本发明人假设，在稳定剂 / 还原剂中的硫醇官 能团与抗原中的硫醇官能团结合，从而阻断所述位点并防止该位点与不同抗原分子上的 硫醇官能团发生键合 / 相互作用。 另外，因为所述稳定剂 / 还原剂相对小，还认为在所 述抗原内的表位、特别是构象表位不被破裂，从而所述抗原的免疫原性得以被保留，并 防止发生聚集。
     替代地或另外地，吐温 (tween) 中的过氧化物被淬灭。
     在本发明的一个方面，所述稳定剂是一硫代甘油。
     在本发明的一个方面，所述稳定剂是半胱氨酸。
     在本发明的一个方面，所述稳定剂是 N- 乙酰半胱氨酸。
     所述稳定剂例如可以按如下范围的量被使用 ：0.01 到 10％ w/v，诸如 1 到 5％， 2 到 6 ％，4 到 7 ％，3 到 8 ％， 诸 如 0.01 到 1 ％，0.2 到 0.4 ％，0.1 ％ 到 0.5 ％，0.3 到 0.8％，0.6 到 0.9％，例如实质上是 0.2，0.4，0.5 和 0.8％，或者诸如 0.01 到 0.1％，0.01 到 0.02％，0.01 到 0.05％，0.01 到 0.08％，0.02 到 0.05％，0.02 到 0.08％或 0.05 到 0.08％ w/v。
     替代地，所述稳定剂例如可以按如下范围的量被使用 ：0.01 到 10％ w/w，诸如 1 到 5％，2 到 6％，4 到 7％，3 到 8％，诸如 0.01 到 1％，0.2 到 0.4％，0.1％到 0.5％， 0.3 到 0.8％，0.6 到 0.9％，例如实质上为 0.2，0.4，0.5 和 0.8％，或者诸如 0.01 到 0.1％， 0.01 到 0.02 ％，0.01 到 0.05 ％，0.01 到 0.08 ％，0.02 到 0.05 ％，0.02 到 0.08 ％或 0.05 到 0.08％ w/w。
     半胱氨酸的适合量为总制剂重量的 0.1 到 1.0％。 因此，例如，在一个 500μl 的 人用剂量中，半胱氨酸的量为 100μg 到 5000μg 范围，诸如 500μg。
     在一个方面，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含 ：
     a) 免疫原性粒子 RTS， S，和 / 或
     b) 来源于一种或多种间日疟原虫虫株的 CS 蛋白和来自乙型肝炎的 S 抗原以及任选的未融合 S 抗原的免疫原性粒子，和
     c) 稳定剂，其包括一硫代甘油。
     本发明的这一方面可进一步采用另外的保护措施，诸如从所述容器 / 小瓶除去 氧和 / 或通过例如使用褐色玻璃容器使所述制剂避光。
     一硫代甘油由式 HSCH2CH(OH)CH2OH 表示并且还被称作 3- 巯基 -1，2- 丙二醇 或 1- 硫代甘油。 用于本发明的适合量包括但不限于以下的范围 ：0.01 到 10％，诸如 0.01 到 1％或 0.01 到 0.1％，0.01 到 0.02％，0.01 到 0.05％，0.01 到 0.08％，0.02 到 0.05％， 0.02 到 0.08 ％ 或 0.05 到 0.08 ％ w/v， 例 如 0.011，0.012，0.013，0.014，0.015，0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08％ w/v。 250μl 的单一人用剂量可 含有例如 10 到 2500μg，诸如 25 到 250μg 的一硫代甘油，例如 50，125 或 200μg 的一 硫代甘油。
     替代地，用于本发明的适合量包括但不限于以下的范围 ：0.01 到 10％诸如 0.01 到 1 ％，0.01 到 0.1 ％，0.01 到 0.02 ％，0.01 到 0.05 ％，0.01 到 0.08 ％，0.02 到 0.05 ％， 0.02 到 0.08 ％或 0.05 到 0.08 ％ w/w，例如 0.011，0.012，0.013，0.014，0.015，0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08％ w/w。 有利地是，当根据本发明使用一硫代甘油时，似乎与辅助制剂例如水包油型乳 液或包含 MPL 和 / 或 QS21 的脂质体制剂相容。
     另外，一硫代甘油降低了由 MPL 和 QS21 的脂质体辅助制剂诱导的脂蛋白粒子 聚集，从而提供与制备之后不久经纯化的大体积的液体制剂相类似的液体制剂。
     在本说明书的背景下，经纯化的体积 (purified bulk) 是指在超过两个剂量的大体 积量下经纯化的抗原。
     在本说明书背景下，最终体积 (final bulk) 是指超过一个或两个剂量的经纯化的 抗原和赋形剂诸如磷酸盐缓冲盐水，不包括辅助组分。
     当使用 0.01 ％的一硫代甘油、在缺乏助剂的条件下以 50μg/ml 配制 RTS， S 时，其在 37℃储存 7 天之后具有与新鲜体积相同的特性。 0.01％一硫代甘油也足够避免 RTS， S 发生由光催化的聚集。
     尽管如此，对于疟原虫 CS 蛋白的脂蛋白粒子的、例如在 100μg/ml 的抗原和例 如最多 1.0％ w/v 诸如 0.02、0.05 或 0.08％的一硫代甘油的液体制剂而言，期待获得其约 2 或 3 年的货架寿命。
     在本发明的一个方面，所述还原剂不是二硫苏糖醇。
     所述疫苗的液体组分，包括其辅助组分，可要求在约 4℃下储存。
     本发明的所述制剂具有适于注射的 pH 和渗克分子浓度 (osmolality)。 适当地， 所述液体制剂的 pH 为约 6.5 到 7.2，诸如约 6.6、6.7、6.8、6.9、7.0 或 7.1。
     本发明的所述制剂可进一步包含防腐剂诸如硫柳汞，例如，当超过 10 个剂量被 一起提供时。 然而，在至少一个实施方案中，本文所述的制剂不含硫柳汞。
     研究显示，与 0.01 或 0.04％一硫代甘油一起储存的例如在 50μg/ml 下的 RTS， S 在 4℃或 37℃下历时 5 周之后，没有可检测的由非特异性吸收导致的抗原损失。
     另外，在加速稳定性，即在 37℃下储存 7 天、然后暴露于强光下约 15 小时 ( 在 本文被称作加速氧化试验 AOT) 之后，未观察到 RTS， S 粒度分布发生改变。
     在一个方面，本发明提供了作为单独的液体制剂的疟疾疫苗用组分以及适于加 到该单独液体制剂中的助剂，任选地作为包括每个成分 (element) 的单独的小瓶的药包 (kit) 被提供。 在该实施方案的一个方面，每个小瓶在视觉上是不同的，例如，在一个小 瓶上的卷边盖是有颜色的，从而使该小瓶与其它小瓶区分开，和 / 或一个小瓶是琥珀色 的 ( 诸如包含所述抗原的小瓶 ) 并且另一个小瓶是透明的 ( 诸如包含所述助剂的小瓶 )。
     适合的小瓶包括例如 3mL 的玻璃小瓶。
     在一个方面，本发明提供了包含抗原和稳定剂 ( 或本文所述的还原剂 ) 的冻干组 分，其然后可用液体助剂重新构成。所述冻干组分和所述液体助剂 ( 诸如 MPL 和 QS21 的 水包油型制剂或脂质体制剂 ) 可作为药包被提供。 本发明的这一方面具有以下的优点 ： 其不需要在重新构成之后立即使用，而是在储存至少 24 小时是稳定的，例如，当在混合 之后在 25℃下储存时抗原的抗原性保持至少 24 小时。 在下文详细地讨论助剂。
     在本发明的一个方面，提供了最终的液体制剂。 最终的液体制剂是指包含最多 10 个剂量诸如 1 或 2 个剂量并包含除助剂组分以外的全部赋形剂的液体制剂。
     在一个方面，所述组分或最终疫苗作为单剂量被提供。
     在本说明书背景下的疫苗是包含全部所述组分的免疫原性制剂，所述组分包括 适于注射进人体的辅助组分。 在一个方面，所述组分或最终疫苗作为双剂量被提供。 这可能是有利的 ( 例 如，当对于一个剂量而言的量较小时 )，因为提供两个剂量可以使得在重新构成和 / 或给 予所述最终制剂时重要组分的损失最小化。
     因此，疫苗例如作为 2 个小瓶制剂的双剂量形式被提供，其包含 ：
     小 瓶 1 ：500μl(2 个 剂 量 ) 的 RTS， S，2× 浓 缩 (100μg/ml)+ 一 硫 代 甘 油 (0.02、0.05 或 0.08％ )
     小瓶 2 ：500μl(2 个剂量 ) 的助剂，2× 浓缩 (AS01)
     在 重 新 构 成 之 后， 所 述 制 剂 提 供 1ml(2 个 剂 量 ) 的 在 AS01 中 的 RTS， S， +0.01、0.025 或 0.04％的一硫代甘油。
     间日疟原虫抗原
     本 发 明使 用的 CSV-S 蛋 白可包含 ：来 源于 间日 疟原 虫的 CS 蛋白 的 一部 分 (CSV)。 该 CSV 抗原可以是天然蛋白，诸如在间日疟原虫的 I 型 CS 蛋白中发现的和 / 或在间日疟原虫的 II 型蛋白中发现的。 替代地，所述 CSV 蛋白可能是包含来自所述 I 型 和 II 型 CS 蛋白的成分的杂合蛋白或嵌合 (chimeric) 蛋白。 当后者被融合至所述 S 抗原 时，这在本文中被称作杂合融合蛋白。
     CSV-S 在本文中作为通用术语被使用，用于涵盖包含来自间日疟原虫的 CS 蛋白 的序列 / 片段和来自乙型肝炎的 S- 抗原的序列的融合蛋白。
     所述杂合 / 嵌合蛋白通常包括 ：
     至少一个来源于间日疟原虫的 I 型环子孢子蛋白的中央重复区段的重复单元，以 及
     至少一个来源于间日疟原虫的 II 型环子孢子蛋白的中央重复区段的重复单元。
     通常，所述杂合蛋白还将含有来自疟原虫诸如间日疟原虫的 CS 蛋白的 N 端片 段，例如，包含 I 区诸如由 SEQ ID No.1 所示的氨基酸的片段。
     通常，所述杂合蛋白将包含来自疟原虫诸如间日疟原虫的 CS 蛋白的 C 端片段， 例如包含 II 区诸如由 SEQ ID No 2 所示的基序的片段。
     尽管不希望束缚于理论，认为所述的 N 端和 C 端片段包括若干个 T 细胞和 B 细 胞表位。
     本发明可使用任何适合的间日疟原虫虫株，包括 ：拉丁，美洲 ( 即， Sal 1， Belem)，朝鲜，中国，泰国，印度尼西亚，印度和越南。 在 SEQID No 13 中的构建体基 于朝鲜虫株 ( 更准确地说，基于南朝鲜虫株 )。
     具有 I 型 CS 蛋白的间日疟原虫比具有 II 型 CS 蛋白的间日疟原虫更普遍。 因 此，在一个方面，本发明采用了来自 I 型的 CS 蛋白。 在可供选择的方面，本发明提供了 包含来自 I 型的重复单元和来自 II 型的重复单元的杂合蛋白，例如，其中在杂合蛋白中包 含了比 II 型重复单元更多的来自 I 型的重复单元。
     更准确地说，本发明的所述杂合蛋白可包含 1 到 15 个来自 I 型的重复单元，诸 如 9 个来自 I 型的重复单元。
     来自 I 型 CS 蛋白的适合的重复单元的实例在 SEQ ID No.s 3 到 9 中给出。
     在一个实施方案中，本发明提供了具有不同的 I 型重复单元的混合物的杂合蛋 白，诸如各自在 SEQ ID No.s 3 到 9 中被列举的那些重复单元。 一个或多个重复单元可在杂合蛋白中被复制，例如， SEQ ID No 3 和 / 或 4 的两 个重复单元可被并入所述构建体中。
     a) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 3 所示单元。
     b) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 4 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a) 段中的单元组合。
     c) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 5 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a) 和 b) 段中的单元组合。
     d) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 6 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-c) 段中的一个或多个单元组合。
     f) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 7 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-d) 段中的一个或多个单元组合。
     g) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 8 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-f) 段中的一个或多个单元组合。
     h) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 9 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-g) 段中的一个或多个单元组合。
     得自 II 型 CS 蛋白的适合的组分重复单元的实例在 SEQ ID No.10 和 14 诸如 SEQ ID No.10 中被给出。
     在本发明的一个方面，提供了具有 5 个或更少的来源于 II 型的重复单元诸如例如 SEQ ID No.10 所示的一个重复单元的杂合蛋白。
     所述杂合蛋白还可包含在某些间日疟原虫的亚洲虫株中发现的在所述重复区末 端被发现的 12 氨基酸插入，例如 SEQ ID No.11 所示。
     在一个实施方案中，所述杂合蛋白包含来源于间日疟原虫 CS 蛋白的约 257 个氨 基酸。
     本发明的来源于 CSV 的抗原组分通常被融合至所述 S 蛋白的氨基端。
     据信，所述得自乙型肝炎的表面抗原的存在加强了所述 CS 蛋白部分的免疫原 性，有助于稳定性，和 / 或帮助所述蛋白的可重现生产。
     在一个实施方案中，所述杂合融合蛋白包含约 494 个氨基酸，例如其中的约 257 个氨基酸来源于间日疟原虫 CS 蛋白。
     所述杂合融合蛋白还可包含另外的来源于恶性疟原虫和 / 或间日疟原虫的 抗 原， 例 如， 其 中 所 述 抗 原 选 自 DBP， PvTRAP， PvMSP2， PvMSP4， PvMSP5， PvMSP6， PvMSP7， PvMSP8， PvMSP9， PvAMA1 和 RBP，或其片段。
     来源于恶性疟原虫的抗原的其它实例包括， PfEMP-1， Pfs 16 抗原， MSP-1， MSP-3， LSA-1， LSA-3， AMA-1 和 TRAP。 其它疟原虫抗原包括恶性疟原虫 EBA， GLURP， RAP1， RAP2，钳合蛋白 (Sequestrin)， Pf332， STARP， SALSA， PfEXPl， Pfs25， Pfs28， PFS27/25， Pfs48/45， Pfs230 以及它们的在其它的疟原虫中的类似物。
     在一个实施方案中，所述杂合融合蛋白 (CSV-S) 具有如 SEQ ID No.17 中所示的 氨基酸序列。 在所述序列中，氨基酸 6 到 262 源自于 CSV，以及氨基酸 269 到 494 源自 于 S。 剩余的氨基酸通过基因构建被引入 ( 其视具体情况而定是不同的 )。 这四种氨基 酸，即 Met、 Met Ala Pro，特别地来源于质粒 pGF1-S2( 参见图 4)。
     SEQ ID No 17 所示蛋白的核苷酸序列在 SEQ ID No 16 中给出。
     编码免疫原性 CS 多肽的多核苷酸序列可能是为哺乳动物细胞而被优化的密码 子。 这种密码子优化详细描述于 WO 05/025614 中。
     RTS， S
     被称作 RTS 的本发明的蛋白粒子的组分 ( 即，来源于恶性疟原虫 ) 可以根据 WO 93/10152 所述制备，该文献包括 RTS* 的说明 ( 来自恶性疟原虫 NF54/3D7 虫株 - 本文称 作 RTS)。
     在本发明的一个或多个实施方案中，在所述融合蛋白中采用的来源于恶性疟原 虫的抗原可实质上是其全 CS 蛋白。
     在本发明的一个实施方案中，采用了全长 S- 抗原。 在另一个实施方案中，采用 了所述 S- 抗原的片段。
     在一个实施方案中，所述来源于恶性疟原虫的抗原在中央重复区中包含至少 4 个重复单元。 更准确地说，该抗原包含含有至少 160 个氨基酸的序列，其与所述 CS 蛋白 的 C 端部分实质上同源。 所述 CS 蛋白可缺乏自 C 端起最后的 12 到 14 个 ( 诸如 12 个 ) 氨基酸。
     更准确地说，所采用的来源于恶性疟原虫的融合蛋白是由 SEQ IDNo 18 所示的 RTS 表达盒的核苷酸序列编码的融合蛋白。
     来自乙型肝炎的 S- 抗原
     适 合 的 S 抗 原 可 包 含 preS2 区。 适 合 的 血 清 型 的 实 例 是 adw(Nature280 ： 815-819，1979)。
     通常，所述来自乙型肝炎的序列将是全长 S- 抗原。 通常，所述 preS2 区将不被 包括在内。
     在一个方面，本发明的所述杂合融合蛋白包含来源于突变 S 蛋白的一部分，例如，在美国申请公开 No.2006/194196( 还作为 WO2004/113369 公开 ) 中所述的。 该文献 描述了突变标记的 HDB05。 其特别地描述了在图 1 和图 6 中的突变蛋白和野生型蛋白的 比较以及在图 4 和图 5 中描述了突变蛋白的基因。 其中的序列 12 到 22 描述了突变 S 蛋 白的特定多肽。 上述每种作为参考并入本文。
     所述融合蛋白 CSV-S 可例如采用质粒 pGFl-S2( 有关详细情形参见图 2 以及实施 例 ) 制备，当与 CSV 对应的适当的序列被插入在 SamI 克隆位点时，质粒 pGFl-S2 可在适 合的条件下产生所述融合蛋白 CSV-S。
     编码本发明蛋白的 DNA 序列可侧接转录控制元件 ( 优选来源于酵母基因 ) 并被 并入表达载体中。
     本发明所用杂合蛋白的表达盒可例如被构建为包括以下特征 ：
     · 启动子序列，例如来源于酿酒酵母 (S.cerevisiae)TDH3 基因。
     · 编码适当的融合蛋白的序列。
     · 被包含在所述序列内的转录终止序列，例如，来源于酿酒酵母 ARG3 基因。
     特定的启动子的实例是来自 Musti 等人的酿酒酵母 TDH3 基因的启动子。
     适合的质粒则因此可被采用，以将编码所述杂合融合蛋白的序列插入到适合的 合成用寄主中。 适合质粒的实例是 pRIT 15546，即 2 微米基的用于携带适合表达盒的载 体，有关详细情形参见图 1 和实施例。
     所述质粒通常包含内装标记以帮助选择，例如编码抗生素抗性或 LEU2 或 HIS 营 养缺陷型的基因。
     通常，所述寄主将具有用于所述粒子中各融合蛋白的表达盒，并且还可具有一 个或多个用于被整合到其基因组内的 S 抗原的表达盒。
     本发明还涉及使用本发明载体转化的宿主细胞。 宿主细胞可以是原核的或真 核的，但优选是酵母，例如酵母菌属 ( 例如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 诸如在 ATCC 数据库中的 DC5( 登录号 20820)，名为 RIT DC5cir(o)。 保藏人 ：Smith Kline-RIT) 和非酵母菌属酵母。 这些包括裂殖糖酵母 ( 例如粟酒裂殖糖酵母 )，克卢费氏酵母 ( 例 如，乳克卢费氏酵母 )，毕赤氏酵母 ( 例如巴斯德毕赤氏酵母 )，汉逊氏酵母 ( 例如多形 汉逊氏酵母 )，脂耶氏酵母 ( 例如解脂脂耶氏酵母 ) 和许旺氏酵母 ( 例如西方许旺氏酵 母 )。
     适合的重组酵母菌株是用于表达所述融合蛋白的 Y1834( 以及其应用构成本发明 的一部分 )，其制备参见实施例。
     本发明所使用的所述核苷酸序列或其部分 ( 诸如编码所述 CS/ 杂合蛋白的部分， 但是任选不是编码蛋白 S 的部分 ) 可为在寄主诸如酵母中表达而被优化的密码子。
     所述宿主细胞可包含来源于间日疟原虫的融合蛋白所用的表达盒，和来源于恶 性疟原虫的所述融合蛋白所用的表达盒，以及任选的 S 抗原。
     在某些寄主诸如酵母细胞中，一经表达，所述融合蛋白 ( 包含所述 S 抗原 ) 自发 组装成由所述融合蛋白的众多单体组成的蛋白结构 / 粒子。 当所述酵母表达两种不同的 融合蛋白 ( 或融合蛋白和 S 抗原 ) 时，这些被认为在粒子中进行共组装。
     当被选择的受体酵母菌株在其基因组中已携带若干乙型肝炎 S 表达盒的整合拷 贝时，则组装的所述粒子还可包含未融合 S 抗原的单体。这些粒子还可被称作病毒样粒子 (VLP)。 所述粒子还可被称作多聚体型脂蛋白 粒子，或被简称为免疫原性粒子。
     因此，提供了包含以下单体的免疫原性蛋白粒子 ：
     a. 包含来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的序列的融合蛋白 ( 诸如 CSV-S)，和 / 或
     b. 包含来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的序列的融合蛋白 ( 诸如 RTS)，和
     c. 任选的未融合 S 抗原，
     其中所述粒子与例如上文所定义的稳定剂诸如一硫代甘油、半胱氨酸或其混合 物结合使用。
     在一个方面，本发明提供包含如上所定义的单体 a) 和 / 或 b) 和 c) 的免疫原性 蛋白粒子，以及其中已从容纳所述粒子的容器或小瓶中除去氧和 / 或其中例如通过褐色 玻璃容器使所述粒子避光保护的保护措施。
     在另一个方面，本发明提供了与本文所定义的例如选自一硫代甘油、半胱氨酸 或其混合物的还原剂结合使用的包含以下各项的融合蛋白的应用 ：
     a) 来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 例如，来自 I 型和 / 或 II 型的重复区的 序列 )， b) 来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 诸如来自其重复区的序列 )，和
     c) 来自乙型肝炎的 S 抗原的序列，
     当其在适合的寄主中被表达时提供包含所述融合蛋白和任选的未融合 S 抗原的 病毒样粒子，以生成粒子。
     在另一个方面，本发明提供了在其中已除去氧和 / 或通过例如使用褐色玻璃容 器使所述蛋白 / 粒子避光保护的环境中，包含以下各项的融合蛋白的应用 ：
     a) 来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 例如，来自 I 型和 / 或 II 型的重复区的 序列 )，
     b) 来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 诸如来自其重复区的序列 )，和
     c) 来自乙型肝炎的 S 抗原的序列，
     当其在适合的寄主中被表达时提供包含所述融合蛋白和任选的未融合 S 抗原的 病毒样粒子，以生产粒子。
     因此，本发明提供了具有至少一个硫醇官能团的还原剂例如本文所述的诸如一 硫代甘油、半胱氨酸或其混合物、特别是一硫代甘油用于稳定免疫原性脂蛋白粒子形式 的包含来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的融合蛋白和 / 或来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的融 合蛋白 ( 诸如 RTS) 的蛋白粒子的应用。
     因此，本发明提供可具有至少一个硫醇官能团的还原剂，例如本文所述的诸如 一硫代甘油，用于稳定包含 CSV-S 和 / 或 RTS 单元的 VLP 的应用。 在一个方面，本发 明提供了基本上由 CSV-S 和 / 或 RTS 单元组成的粒子。 在可供选择的方面，所述生成的 粒子包含或基本上由 CSV-S 和 / 或 RTS 以及 S 单元组成。
     据假设，本发明所使用的所述脂蛋白粒子可为在体内进一步刺激对所述抗原蛋 白的免疫应答作贡献。
     据进一步假设，加入具有至少一个硫醇官能团的稳定剂例如本文所述的诸如一 硫代甘油、半胱氨酸及其混合物为每种粒子提供了内稳定化作用，从而所述试剂可在被
     给出的粒子内被结合或内在化。
     本发明还涉及包含与适合的赋形剂例如稀释剂混合的免疫保护量的本发明的稳 定化的蛋白粒子的疫苗。
     在本说明书背景下的疫苗是指包含全部所述组分 ( 包括辅助组分在内 ) 并适于注 射进人类患者的制剂。
     在本发明背景下的稳定化意欲表示其中具有至少一个硫醇官能团的稳定剂 ( 本 文中还被称作还原剂 ) 例如本文所述的诸如一硫代甘油、半胱氨酸及其混合物被省略的 相应制剂，例如当在 37 ℃下储存 7 或 14 天和 / 或当在加速稳定性条件下储存时诸如在 37℃下储存 7 天、然后在强光存在下处理约 15 小时。
     稳定性可涉及以下方面 ：粒子大小 ( 例如通过光散射技术、筛析 (SizeExclusion) 色谱法或场流分级法测量的 ) 和 / 或聚集 / 降解 ( 例如通过 SDS-page 和蛋白质印迹 (Western Blot) 测量的 ) 和 / 或抗原性 ( 例如通过 ELISA 测量的 ) 和 / 或免疫原性 ( 例如 在体内测量的 )。
     在一个方面，稳定性是指不存在聚集和降解的。
     组合物 在本说明书的背景下，赋形剂是指在药物制剂中的自身没有治疗效果的组分。 助剂是一种赋形剂，因为尽管在不存在治疗性组分诸如抗原的条件下，存在由所述助剂 产生的生理作用，但是这一生理作用是非特异性的并且其自身是非治疗性的。 稀释剂或 液体载体落入赋形剂的定义范围内。
     在本说明书的背景下，免疫原性意欲是指能够引发对所使用的融合蛋白的 CS 部 分和 / 或 S 抗原部分的特异性免疫应答的能力。 该应答可以是例如当所述脂蛋白粒子在 可能包含 / 要求适合的助剂的适当的制剂中被给药时。 可能要求包含类似于或小于初始 剂量的剂量的加强剂，以获得所需的免疫原性应答。
     本发明的所述组合物 / 药物制剂还可包含与一种或多种另外的抗原的混合物， 所述另外的抗原为诸如来源于恶性疟原虫和 / 或间日疟原虫的那些，例如其中所述抗原 选自 DBP， PvTRAP， PvMSP2， PvMSP4， PvMSP5， PvMSP6， PvMSP7， PvMSP8， PvMSP9， PvAMA1 和 RBP 或其片段。
     来源于恶性疟原虫的抗原的其它实例包括 PfEMP-1， Pfs 16 抗原， MSP-1， MSP-3， LSA-1， LSA-3， AMA-1 和 TRAP。 其它疟原虫抗原包括恶性疟原虫 EBA， GLURP，RAP1，RAP2，钳合蛋白，Pf332，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28， PFS27/25， Pfs48/45， Pfs230 以及它们的在其它的疟原虫中的类似物。
     本发明的所述组合物 / 药物制剂还可包含与含有 CSV-S 的粒子混合的 RTS， S 的粒子 ( 如 WO 93/10152 所述 )。
     在本发明的疫苗中，可直接使用所述粒子的水性溶液。 替代地，经过或未经过 先前冷冻干燥的蛋白可与助剂混合或被助剂所吸附。
     助剂
     适合的助剂是选自以下组中的那些 ：金属盐，水包油型乳液， Toll 样受体激动 剂 ( 特别是 Toll 样受体 2 激动剂， Toll 样受体 3 激动剂， Toll 样受体 4 激动剂， Toll 样受 体 7 激动剂， Toll 样受体 8 激动剂和 Toll 样受体 9 激动剂 )，皂草苷或它们的组合，前提
     条件是金属盐仅仅用于与另一种的助剂组合使用而非单独使用，除非它们以至多约 60％ 的所述抗原被吸附到所述金属盐上的方式进行配制。 在一个实施方案中，所述助剂不包 括金属盐作为唯一助剂。 在一个实施方案中，所述助剂不包括金属盐。
     在一实施方案中，所述助剂是 Toll 样受体 (TLR)4 配体，例如诸如脂质 A 衍生 物的激动剂，所述脂质 A 衍生物特别是单磷酰脂质 A 或更特别是 3- 去酰基化单磷酰脂质 A(3D-MPL)。
     3- 去 酰 基 化 单 磷 酰 脂 质 A 从 美 国 专 利 No.4,912,094 和 英 国 专 利 申 请 No.2,220,211(Ribi) 中已知并且可得自 Ribi Immunochem， Montana， USA。
     3D-MPL 由 Corixa 公司以商标 销售并且主要促进具有 IFN-g(Th1) 表型 的 CD4+T 细胞应答。 其可以根据 GB 2220211A 中所公开的方法制备。 在化学上讲，其 是 3- 去酰基化单磷酰基脂质 A 与 3、4、5 或 6 个酰基化链的混合物。 在本发明的所述组 合物中优选使用小粒子 3D-MPL。小粒子 3D-MPL 具有使得其可被无菌过滤通过 0.22μm 过滤器的粒度大小。 这种制备物描述于 WO 94/21292 中。 脂质 A 的合成衍生物是已知 的并被认为是 TLR4 激动剂，包括但不限于 ：
     OM174(2- 脱 氧 -6-O-[2- 脱 氧 -2-[(R)-3- 十 二 碳 酰 基 氧 基 十 四 碳 酰 基 氨 基 ]-4-o- 膦酰基 -β-D- 吡喃葡糖基 ]-2-[(R)-3- 羟基十四碳酰基氨基 ]-α-D- 吡喃葡糖 基磷酸二氢酯 )， (WO 95/14026) ；
     OM 294DP(3S，9R)-3-[(R)- 十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基 ]-4- 氧代 -5- 氮 杂 -9(R)-[(R)-3- 羟基十四碳酰基氨基 ] 癸烷 -1，10- 二醇，1，10- 二 ( 磷酸二氢酯 ) (WO99/64301 和 WO 00/0462) ；
     OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)- 十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基 ]-4- 氧 代 -5- 氮杂 -9-[(R)-3- 羟基十四碳酰基氨基 ] 癸烷 -1，10- 二醇，1- 磷酸二氢酯 10-(6- 氨 基己酸酯 )(WO 01/46127)。
     一般地，当使用 3D-MPL 时，所述抗原和 3D-MPL 使用明矾递送或者存在于水 包油型乳液或多相水包油型乳液中。 并入 3D-MPL 是有利的，因为其是效应器 T 细胞应 答的刺激物。
     可 使 用 的 其 它 的 TLR4 配 体 是 烷 基 氨 基 葡 糖 苷 磷 酸 酯 (AGPs)， 诸 如 在 WO 9850399 或 US 6303347 中公开的那些 ( 也公开了用于制备 AGPs 的方法 )，或如在 US 6764840 中公开的 AGPs 的药学可接受的盐。 一些 AGPs 是 TLR4 激动剂，以及一些是 TLR4 拮抗剂。 认为二者都可用作助剂。
     另一种用于本发明的免疫刺激剂是 Quil A 及其衍生物。 Quil A 是从南美树木皂 树 Quilaja Saponaria Molina 中分离的皂草苷制备物并且由 Dalsgaard 等人在 1974 首次描述 为具有助剂活性 (″ Saponin adjuvants″， Archiv.für die gesamte Virusforschung， Vol.44， Springer Verlag，Berlin，p243-254)。 Quil A 的经纯化的级分已通过 HPLC 被分离，其保 留了助剂活性而不具有与 Quil A 有关的毒性 (EP 0362278)，例如 QS7 和 QS21( 又名 QA7 和 QA21)。 QS21 是来源于皂树 Quilaja Saponaria Molina 的树皮的天然皂草苷，其诱导 CD8+ 细胞毒 T 细胞 (CTLs)、 Th1 细胞和支配性 IgG2a 抗体应答。
     特定的 QS21 制剂已有描述，其进一步包括甾醇 (WO 96/33739)。 QS21 ∶甾醇 的比率一般为 1 ∶ 100 到 1 ∶ 1 重量 / 重量级别。 通常，存在过量的甾醇，QS21 ∶甾醇的比率为至少 1 ∶ 2w/w。 一般对于人类给药而言，QS21 和甾醇在疫苗中将以每剂量约 1μg 到约 100μg、诸如每剂量约 10μg 到约 50μg 的范围存在。
     所述脂质体通常包括中性脂质，例如卵磷脂，其在室温下通常是非晶体，例如 蛋黄卵磷脂，二油酰基卵磷脂或二月桂酰基卵磷脂。 所述脂质体还可包含带电荷的脂 质，其增加了用于由饱和脂质构成的脂质体的脂质体 -QS21 结构的稳定性。 在这些情 况下，带电荷脂质的量通常是 1-20％ w/w，诸如 5-10％。 甾醇∶磷脂的比率是 1-50％ (mol/mol)，诸如 20-25％。
     这些组合物可包含 MPL(3- 去酰基化单磷酰脂质 A，又名 3D-MPL)。 3D-MPL 从 GB 2220211(Ribi) 中已知是三种类型的具有 4、5 或 6 个酰基化链的去 -O- 酰基化单磷 酰脂质 A 的混合物并且由 Ribi Immunochem， Montana 生产。
     所述皂草苷可以分别是胶束、混合胶束 ( 通常然而并非唯一地具有胆汁盐 ) 的形 式，或者可为 ISCOM 基质形式 (EP 0109942)、脂质体或相关的胶态结构的形式诸如蜗杆 样或环样多聚体复合物以及当使用胆固醇和脂质进行配制时的脂质 / 层状结构和薄片的 形式，或者为水包油型乳液的形式 ( 例如在 WO 95/17210 中 )。
     通常，所述皂草苷以脂质体制剂、 ISCOM 或水包油型乳液的形式存在。
     还可使用免疫刺激性寡核苷酸。 用于本发明的助剂或疫苗中的寡核苷酸的实例 包括含有 CpG 的寡核苷酸，通常含有被至少三个、更优选被至少六个或更多个核苷酸分 开的两个或更多个二核苷酸 CpG 基序。 CpG 基序是跟随有鸟苷酸的胞嘧啶核苷酸。 所 述 CpG 寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。 在一个实施方案中，在所述寡核苷酸中的核苷酸间 键合是二硫代磷酸酯键，或更优选是硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯键和其它的核苷酸间 键也落入本发明的范围内。 还被包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间键合的 寡核苷酸。 用于产生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于 US 5,666,153、 US 5,278,302 和 WO 95/26204 中。
     寡核苷酸的实例如下所示 ：
     TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)-SEQ ID No.20
     TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)-SEQ ID No.21
     ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG-SEQ ID No.22
     TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)-SEQ ID No.23
     TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)-SEQ ID No.24
     TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)-SEQ ID No.25
     所述序列可包含用硫代磷酸酯改性的核苷酸间键合。
     替代的 CpG 寡核苷酸可包含上述的一种或多种序列，对所述序列进行无关紧要 的缺失或附加。
     所 述 CpG 寡 核 苷 酸 可 通 过 本 领 域 已 知 的 任 何 方 法 合 成 ( 例 如， 参 见 EP 468520)。 方便地是，这种寡核苷酸可采用自动合成器来合成。
     TLR 2 激动剂的实例包括肽聚糖或脂蛋白。 咪唑并喹啉类诸如咪喹莫特和雷西 莫特是已知的 TLR7 激动剂。 单链 RNA 也是已知的 TLR 激动剂 ( 在人类中是 TLR8，在 小鼠中是 TLR7)，而双链 RNA 和聚肌胞苷酸 ( 聚肌苷酸 - 聚胞苷酸 - 病毒 RNA 的市售的 合成模拟物 ) 是 TLR 3 激动剂的示例。 3D-MPL 是 TLR4 激动剂的实例，而 CpG 是 TLR9激动剂的实例。
     免疫刺激剂可替代地或附加地被加入。 在一个实施方案中，该免疫刺激剂将是 3- 去酰基化单磷酰脂质 A(3D-MPL)。
     在一个方面，所述助剂含有 3D-MPL。
     在一个方面，所述助剂含有 QS21。
     在一个方面，所述助剂含有 CpG。
     在一个方面，所述助剂被配制为水包油型乳液。
     在一个方面，所述助剂被配制为脂质体。
     助剂组合包括 3D-MPL 和 QS21(EP 0671948B1)，包含 3D-MPL 和 QS21 的水包 油型乳液 (WO 95/17210，WO 98/56414)，在脂质体制剂中的 3D-MPL 和 QS21，或与其 它载体进行配制的 3D-MPL(EP 0689454B1)。 其它助剂系统包括 3D-MPL、QS21 和 CpG 寡核苷酸的组合，如 US6558670 和 US 6544518 所述。
     在一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的稳定化的粒子与 3D-MPL 和稀释剂组合的疫苗。 所述稀释剂一般是水包油型乳液或明矾。
     疫苗制备物通常描述于 New Trends and Developments in Vaccines， Voller 等人编 辑， University Park Press， Baltimore， Maryland， U.S.A.，1978 中。 在脂质体内的囊封 由例如 Fullerton 等人描述于美国专利 4,235,877 中。
     在每个疫苗剂量中存在的本发明的蛋白粒子的量被选择为诱导免疫保护应答而 无典型疫苗中的显著的不良副作用的量。 这种量将根据使用哪种特异性免疫原以及所 述疫苗是否采用助剂而异。 通常，可以预期每个剂量将包含 1-1000μg 的蛋白，优选 1-200μg 的蛋白，最优选 10-100μg 的蛋白。 对于特定疫苗的最佳量可通过标准研究来 确定，所述标准研究涉及观察对象中的抗体滴度以及其它应答。 在最初接种疫苗后，对 象优选在约 4 周内接受加强接种，然后只要存在感染风险，则每六个月重复进行加强接 种。 对本发明蛋白的免疫应答通过使用助剂和 / 或免疫刺激剂得以被增强。
     使用的 3D-MPL 的量通常较小，但是根据疫苗制剂的不同而异，可为每剂量 1-1000μg，例如每剂量 1-500μg，或每剂量 1 到 100μg，诸如每剂量 50 或 25μg。
     在本发明的助剂或疫苗中的 CpG 或免疫刺激性寡核苷酸的量通常较小，但是 根据疫苗制剂的不同而异，可为每剂量 1-1000μg，例如每剂量 1-500μg，诸如每剂量 1-100μg。
     在 本 发 明 的 助 剂 中 使 用 的 皂 草 苷 的 量 可 为 每 剂 量 1-1000μg， 例 如 每 剂 量 1-500μg，诸如每 1-250μg，特别是每剂量 1-100μg，尤其是每剂量 50 或 25μg。
     制剂
     本发明的制剂可用于预防性或治疗性目的。 因此，本发明提供了本文所述的疫 苗组合物，其用于医药用途，例如，用于治疗 ( 或预防 ) 疟疾 ( 或用于制备用于治疗 / 预 防疟疾的药物 )。
     本发明的另一个方面提供了制备本发明的疫苗组分和疫苗以及包含各成分的药 包的方法，该方法包括在适合的寄主例如酵母中表达编码所述蛋白的 DNA 序列，并回 收作为脂蛋白粒子的产物，并将后者与本文所定义的至少一种稳定剂、特别是一硫代甘 油、半胱氨酸及其混合物、诸如一硫代甘油混合。最终体积通常被无菌地分配在 3ml 玻璃小瓶中，然后将玻璃小瓶宽松地塞上并 转移到冷冻干燥器中经历约 40 小时的冻干循环。
     在制备所述抗原组分的过程中，所述赋形剂通常被加入并混合，以及作为最终 步骤，所述抗原 / 脂蛋白粒子将被加入。 对于该制备物，也可最后施加保护措施诸如从 小瓶中除去氧或通过使用褐色玻璃容器使所述疫苗避光，并结合使用稳定剂或作为备选 措施。
     在本发明的其中除去氧的方面中，所述制剂 / 组分 / 粒子等可在氮气下储存。
     所述助剂经常被加入到所述抗原的液体制剂 ( 或所述抗原的冻干制剂 ) 中以形成 疫苗。
     本发明的另一个方面在于通过给予如上所述的有效量的疫苗治疗容易受疟原虫 感染的患者的方法。
     在另一个方面，提供了用于本发明的治疗用的疫苗的抗原成分或疫苗 ( 或它们 在制备用于治疗 / 预防疟疾的药物的用途 )。
     本发明还包括初免加强方案，包括本文所述的各种组分中的一种或多种。
     在本说明书的背景下， “包括” 被解释为 “包含”。
     在一个方面，本发明提供了在 3mL 玻璃小瓶例如琥珀小瓶中的本文所述的稳定 化的疟疾抗原，所述小瓶任选地在填充之前用氮气吹扫以除去小瓶中的氧物质。
     使用的小瓶可以是硅化的或非硅化的。
     本发明还延伸到由或基本上由本文所述的本发明的各方面组成的单独的实施方 案，其视情况而定包括某些要素。
     显示了以下的实施例用于说明所述方法，其用于制备本发明的粒子。 实施例 实施例 1
     用于 RTS， S 疟疾疫苗的单一儿科剂量 (2 小瓶制剂 ) 的组分的处方
     组分 量
     RTS， S 25μg
     NaCl 2.25mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 125μg
     注射用水 使体积达 250μL
     以上处方的制备方法为 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸 盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液的 混合物中。 最后，调节 pH 到 7.0±0.1。
     这可作为与助剂 ( 例如，MPL 和 QS21 的脂质体制剂 ) 的单独的小瓶在一起的小 瓶被提供。
     组分 量
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 500μg
     胆固醇 125μg
     MPL 25μg
     QS21 25μg
     NaCl 2.25mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     注射用水 使体积达 250μL
     对于给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行， 然后振摇。 然后，以常规方式给予所述剂量。
     最终液体制剂的 pH 为约 6.6+/-0.1。
     实施例 1A
     本发明的最终儿科液体制剂 (1 小瓶 ) 可根据以下处方制备。
     组分 量
     RTS， S 25μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 125μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 500μg
     胆固醇 125μg
     MPL 25μg
     QS21 25μg
     注射用水 使体积达 500μL
     上述液体制剂的 pH 或者被调节到 7.0+/-0.1( 其对于抗原稳定性而言是有利的， 但是对于 MPL 的稳定性而言完全没有利 )，或者被调节到 6.1+/-0.1( 其对于 MPL 稳定性 而言是有利的，但是对于 RTS，S 稳定性而言完全没有利 )。 因此，该制剂意欲在制备后 迅速使用。
     上述制剂如下制备 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl 1500mM、磷酸盐缓 冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液的混合 物中。 然后，加入包含 MPL 与 QS21 的脂质体的预混合物，并且最后调节 pH。
     实施例 1B
     本发明的 RTS， S 的最终成人剂量 (1 小瓶制剂 ) 可如下制备 ：
     组分 量
     RTS， S 50μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 250μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 1000μg
     胆固醇 250μg
     MPL 50μg
     QS21 50μg
     注射用水 使体积达 500μL实施例 1C
     可例如在填充之前用氮气吹扫琥珀小瓶而后将实施例 1、1A 或 1B 置于该小瓶中 来制备实施例 1C。
     实施例 2
     本发明的组分还可作为用于儿科人群的二剂量 (2 小瓶制剂 ) 被提供。
     组分 量
     RTS， S 50μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 250μg
     注射用水 使体积达 500μL
     上述制剂的制备方法为 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸 盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液的 混合物中。 最后，调节 pH 到 7.0±0.1。
     这可作为与助剂 ( 例如，MPL 和 QS21 的脂质体制剂 ) 的单独的小瓶在一起的小 瓶被提供。 组分 量
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 1000μg
     胆固醇 250μg
     MPL 50μg
     QS21 50μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     注射用水 使体积达 500μL
     对于给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行， 然后振摇。 然后以常规方式吸取单一剂量 (500μL) 并给药。
     最终液体制剂的 pH 为约 6.6+/-0.1。
     实施例 2A
     本发明的最终儿科液体制剂 (1 小瓶 ) 可根据以下处方被制备为双剂量。
     组分 量
     RTS， S 50μg
     NaCl 9mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 250μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 1000μg
     胆固醇 250μg
     MPL 50μg
     QS21 50μg
     注射用水 使体积达 1000μL
     上述液体制剂的 pH 或者被调节到 7.0+/-0.1( 其对于抗原稳定性而言是有利的， 但是对于 MPL 的稳定性而言完全没有利 )，或者被调节到 6.1+/-0.1( 其对于 MPL 稳定性 而言是有利的，但是对于 RTS，S 稳定性而言完全没有利 )。 因此，该制剂意欲在制备后 迅速使用。
     上述制剂按如下方法制备 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷 酸盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液 的混合物中。 然后，加入包含 MPL 与 QS21 的脂质体的预混合物，并且最后调节 pH。
     实施例 2B
     本发明的 RTS， S 的最终成人剂量 (1 小瓶制剂 ) 可如下被制备成双剂量 ：
     组分 量
     RTS， S 100μg
     NaCl 9mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 500μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 2000μg
     胆固醇 500μg
     MP 100μg
     QS21 100μg
     注射用水 使体积达 1000μL
     实施例 2C
     可例如在填充之前用氮气吹琥珀小瓶而后将实施例 2、2A 或 2B 置于该小瓶中来 制备实施例 2C。
     实施例 3
     用于填充体积为 500μl 的 RTS， S 疟疾疫苗的单一儿科剂量 (2 小瓶制剂 ) 的组 分的处方。
     组分 量
     RTS， S 25μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 50μg 或 200μg
     注射用水 使体积达 500μL
     上述制剂按如下方法制备 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷 酸盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液 的混合物中。 最后，调节 pH 到 7.0±0.1。
     这可作为与助剂 ( 例如，填充体积为 500μl 的 MPL 和 QS21 的脂质体制剂 ) 的 单独的小瓶在一起的小瓶被提供。
     组分 量
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 500μg
     胆固醇 125μgMPL 25μg
     QS21 25μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     注射用水 使体积达 500μL
     为了给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行， 然后振摇。 然后以常规方式给药所述剂量。
     最终液体制剂的 pH 为约 6.6+/-0.1 并且注射体积为 1ml。
     实施例 4
     加速稳定性结果指示如下 ：
     · pH 和渗克分子浓度与注射相容 ；
     · 关于 RTS， S 含量 ：在 4℃或 37℃历时 5 周后，没有由非特异性吸附导致的 抗原损失 ；
     · 关于抗原完整性 ( 参见图 6、7 和 8) ：
     ·在加速稳定性之后 (37℃ ±AOT 历时 7 天，37℃历时 14 天 ) 没有显著降解 ；
     · 没有惰化 (without inerting)，要求抗氧化剂 ( 一硫代甘油 ) 以避免在加速稳定 性 (37℃ ±AOT 历时 7 天，37℃历时 14 天 ) 之后发生氧化性聚集 ；
     о 在 37℃ 0.01％足以避免聚集 ；
     о 对于在 37℃ +AOT 下的稳定性需要 0.04％ ；
     · 琥珀色玻璃确保抗原避光 ( 在 AOT 之后观察到的 ) ；
     · 在加速稳定性 (37℃历时 7 天 ) 之后 RTS， S 粒度分布不发生改变 ；
     · 关于抗原性 ( 参见图 9) ；
     · 没有惰化 (without inerting)，要求抗氧化剂 ( 一硫代甘油 ) 以避免在加速稳定 性 (37℃ ±AOT 历时 7 天 ) 之后发生氧化性聚集和抗原性增加 ；
     о0.01％允许很稳定的抗原性 (80-120％ ) ；
     о0.04％在加速稳定性之后诱导轻微的抗原性降低 (-10％ ) ；
     · 在与 AS01( 含有 MPL 和 QS21 的脂质体助剂制剂 ) 混合时 ：
     · 在混合之后 RTS， S 完整性和抗原性在 25℃保持至少 24 小时。
     在有或者没有一硫代甘油时将这些 RTS， S 液体制剂在 37℃储存 7 天、14 天， 图 8 或甚至 5 周之后，已进行了 SDS-Page 分析。
     图 6 表明
     · 在没有一硫代甘油的条件下 ：在 37℃储存 7 天之后发生轻微的 RTS， S 聚集 ( 孔 3 和 4) ；在暴露于 AOT 下之前在 37℃在白色小瓶中储存 7 天后完全聚集和轻微降解 ( 孔 6)，而琥珀色玻璃避免 RTS， S 发生由光诱导的降解和氧化性聚集 ( 孔 5) ；
     · 在有一硫代甘油 0.01％的条件下 ：该浓度足够使 RTS， S 在 37℃下储存时稳 定 7 天 ( 孔 7)，但是在加速氧化试验 (AOT) 累积下该浓度不足够 ( 孔 9)，除了与琥珀色 玻璃组合使用之外 ( 孔 8) ；
     · 在有一硫代甘油 0.04％的条件下 ：该浓度足够使 RTS， S 在 37℃下储存时稳 定 7 天 ( 孔 10)，当使用加速氧化试验累积时也是如此 ( 孔 12) ；在这种情况下，不要求填充到琥珀色玻璃小瓶中 ( 孔 11) ；
     · 与 AS01 混合对 RTS， S 特性没有影响，即使在 25℃储存 24 小时之后。
     图 7 显示需要一硫代甘油来避免 RTS， S 聚集，但是两个浓度都能够使 RTS， S 在 37℃储存时稳定至少 14 天 ( 孔 11 和 12，相对于孔 10)。
     图 8 显示在 37℃历时 5 周之后，在全部制剂中都发生 RTS，S 聚集和降解 ；AS01 在全部制剂中加重聚集。
     实施例 5
     对 于 包 含 0、0.01 ％ 或 0.04 ％ 的 一 硫 代 甘 油 的 制 剂， 通 过 混 合 ELISAαCSP-αS，在 T0(±AOT) 或在 37℃储存 7 天 (±AOT) 或 5 周时，测定 RTS， S 抗原性 ；已经在与 AS01 重新构成之前、刚刚重新构成之后和重新构成之后在 25℃ 24 小 时测量 RTS， S 抗原性。
     图 9 表明
     · 在没有一硫代甘油的条件下 ：
     о 暴露于 675W 下历时 15 小时 (AOT) 促使抗原性增加 50-60 ％ ( 这可以与在 SDS-Page 中观察到的氧化性聚集相关联 )，但是装入琥珀色玻璃小瓶将这一抗原性增加 限制到～ 20％ ；
     о 在 37℃储存 7 天促使抗原性增加～ 30-40％ ( 这也可以与在 SDS-Page 中观察 到的氧化性聚集相关联 ) ；
     о 在 37℃下 7 天到 5 周之间，抗原性降低～ 30％ ；
     о 在 25 ℃历时 24 小时之后， AS01 促使抗原性增加～ 20 ％ ( 这也可以与在 SDS-Page 中观察到的聚集增加相关联 ) ；
     · 在有 0.01％一硫代甘油的条件下 ：
     о 一硫代甘油保护 RTS， S 避免发生由于在 37℃储存 7 天、 AOT 诱导的 ( 使琥 珀色玻璃无用 ) 或与 AS01 混合所诱导的抗原性增加 ( 但是当在 AS01 中在 25℃储存 24 小 时累积到在 37℃储存 7 天时，该增加为～ 20％ ) ；
     о 在 37℃下 7 天和 5 周之间抗原性降低～ 20％ ( →不合格 (out ofspec)) ；
     · 在有 0.04％一硫代甘油的条件下 ：
     о 一硫代甘油保护 RTS， S 避免发生由 AOT 诱导的抗原性增加，使褐色玻璃无 用；
     о 在 37℃储存 7 天促使抗原性降低～ 20％ ；
     о 在 37℃下 7 天到 5 周之间不发生抗原性降低 ；
     о 在 25℃历时 24 小时之后， AS01 促使抗原性增加～ 30-40％。
     实施例 6
     为了考察一硫代甘油被固定到 RTS， S 上对单克隆抗体识别 RF1- 表位 (S) 的影 响，在使用或未使用一硫代甘油 (MTG) 进行稳定的 RTS，S 液体制剂中，在 T0( 时间 0) 或在 37℃储存 7 天之后 (7 天 )，通过 ELISA 抑制试验测定了 RTS，S 对 RF1 腹水的反应 性 ( 参见表 1)。
     表1
     在所述试验中使用的单克隆抗体对表位 RF1 如表 1 所示。
     在表 1 中，仅有两个样品具有的 RF1- 表位比其它显著更好地被识别 ：
     · 在 37℃储存 7 天的 RTS， S 经纯化的体积 ；
     · 在不包含一硫代甘油并在 37℃储存 7 天的液体制剂中的 RTS， S。
     这意味着在这些样品中发生构象变化，增加了 RF1- 表位的可达性。 这些结果 毫无疑问地被认为与混合 ELISA αCPS-αS 的结果是平行的 ( 在不含一硫代甘油的制剂 中，在 37℃储存 7 天之后， RTS， S 抗原性增加 )。
     因此，我们得出以下结论 ：
     ·一硫代甘油看来在 T0 时对 RF1- 表位的识别 / 可达性没有消极影响 ( 与在 “新 鲜的” 经纯化的体积中的水平相同 ) ；
     · 识别水平在包含一硫代甘油并在 37℃储存 7 天的 RTS， S 液体制剂中保持稳 定，表明了 RTS， S 构象被一硫代甘油所稳定。
     免疫原性数据
     实施例 7
     在小鼠中评价并比较了几种 RTS， S 制剂的免疫原性。 在这些实验中， RTS， S、AS01、50mM PO4、NaCl 100mM、pH 6.1 疫苗制剂被用作用于评价 3 种其它的 RTS， S 制剂的基准标记，所述 3 种其它的 RTS， S 制剂为 ：
     1) 甘露醇 - 蔗糖冻干的 RTS， S( 要与助剂重新构成 )，
     2) 包含 0.02％一硫代甘油的液体制剂，和
     3) 包含 0.08％一硫代甘油的液体制剂 ( 在注射前各自都要与 AS01 混合 )。
     需要注意的是，在液体 RTS， S 制剂与 AS01 混合之后，一硫代甘油的最终浓度 是 0.01％和 0.04％。
     分别在如下所述的两个不同类型的免疫原性实验中和在实施例 8 中测定了由不 同的 RTS， S 制剂引起的体液应答和细胞免疫应答。
     小鼠体液免疫应答实验
     a. 引言
     评价和比较了在用不同的 RTS，S 制剂免疫的小鼠中被引起的抗 CS 和抗 HBs 抗 体应答 ( 总免疫球蛋白 )。
     b. 实验设计
     所述试验设计遵循得自目前的 RTS， S/AS01 疫苗的体内效能测定的一种试验 设计，即， Balb/C 小鼠株，得自体内效能测定的剂量释放的单次腹膜内注射 (0.25μg RTS， S)，和通过 ELISA 测量在免疫后第 28 天血清中的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答 ( 总免 疫球蛋白 )。
     为了定义实验的样本量，使用了用与 AS01 助剂进行配制的 RTS， S 进行的体内 效能测定进行评估的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答的变异性。 基于此，统计学家确定了每组 25 只小鼠的样本量 ( 在 2 个不同的实验中 ) 将允许以具有 90.9％功效的双向方差分析检测 组平均值之间的 2 倍差异。
     c. 结果
     使用在免疫后第 28 天收集的血清进行抗 CS 血清学 ( 总 Ig)。 得自 50 只小鼠 / 组的滴度用 Log 表示并示于图 10 中。
     与抗 CS 血清学结果有关的统计分析 (Dunnett) 概括在表 4 中。
     表 4. 在多种 RTS， S 制剂之间的抗 CS GMTs 的统计比较 第1组 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo RTS， S 液体 0.02％一硫代甘油 RTS， S 液体 0.08％一硫代甘油 第2组 RTS， S 蔗糖 lyo RTS， S 蔗糖 lyo RTS， S 蔗糖 lyo 调整 Dunnet Dunnet Dunnet Prob_Adj 0.2529 0.6070 0.6025这些结果指示，由甘露醇 - 蔗糖 lyo 或液体 RT S，S 制剂引起的抗 CS 总 Ig 应答 与由被配制在 MPL 和 QS21 的脂质体助剂制剂中的 RTS， S 所诱导的抗 CS 总 Ig 应答没 有统计学不同 (92.7％的统计功效以检测 Ab 滴度的 2 倍差异 )。
     使用在免疫后 28 天收集的血清进行抗 HBs 血清学 ( 总 Ig)。 得自 50 只小鼠 / 组 的滴度用 Log 表示并示于图 11 中。
     与抗 HBs 血清学结果有关的统计分析 (Dunnett) 概括在表 5 中。
     表 5. 在单独的备选 RTS，S 制剂和目前 RTS，S 制剂之间的抗 HBsGMTs 的统计 比较
     第1组 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo RTS， S 液体 0.02％一硫代甘油第2组 RTS， S 蔗糖 yo RTS， S 蔗糖 lyo调整 Dunnet DunnetProb_Adj 0.1332 0.985727CN 102026657 A CN 102026672 A说明书Dunnet 0.110525/32 页RTS， S 液体 0.08％一硫代甘油
     RTS， S 蔗糖 lyo这些结果指示，由甘露醇 - 蔗糖 lyo 或液体 RT S， S 制剂引起的抗 HBs 总 Ig 应 答与由被配制在 MPL 和 QS21 的脂质体制剂中的 RTS，S 所诱导的抗 HBs 总 Ig 应答没有 统计学不同 (91.4％的统计功效以检测 Ab 滴度的 2 倍差异 )。
     d. 结论
     全部三种供选择的测试的 RTS， S 制剂在小鼠中都引起抗 CS 和抗 HBs 抗体应 答。 另外，统计分析指示，由甘露醇 - 蔗糖 RTS，S lyo、临时在 MPL 和 QS21 的脂质体 制剂中重新构成的液体 RTS， S 0.02％一硫代甘油或者液体 RTS， S 0.08％一硫代甘油引 起的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答，与由在 AS01 中重新构成的目前的 RTS， S 冻干制剂所诱 导的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答没有统计显著差异。 与抗 CS 和抗 HBs 抗体应答的分析有 关的功效分别至少是 92.7％和 91.4％，以显示比率为 2( 初始标度，即抗体滴度 ) 或差异 为 0.301( 对数标度 )
     实施例 8
     小鼠细胞免疫应答实验 ：
     a. 引言
     在第二种类型的实验中，使用基于流式细胞术的检测技术，测量在用覆盖 HBs 和 CS 序列的肽的混合物进行短期的离体刺激之后表达 T 细胞的细胞因子对 HBs 和 CS 抗 原的由细胞介导的免疫 (CMI) 应答。
     b. 实验设计
     供试组与上述在实施例 7 的实验中的供试组相同。 然而，该实验设计是不同 的，即，用一定剂量范围 (5μg 和 2.5μg) 的在 AS01 中的 RTS， S 抗原进行 3 次肌内注 射使 C57BL/6 小鼠免疫，根据得自先前的针对评价抗原特异性细胞免疫应答的小鼠免疫 原性研究的规程进行。 该实验进行两次，并且确定了样本量，以便收集足够的细胞以进 行基于流式细胞术的试验。 实际上，在各组中，对从 4 只小鼠收集的血细胞 ( 即，3 个收 集物 / 组 ) 进行了 CMI 分析。 这一读数被认为是探索性的，因为只使用每个实验每组中 可获得的三个值 (pools) 以及因为这种基于细胞的试验的公知的变异性，不能得出统计学 结论。
     c. 结果
     在第三次免疫后第 7 天的 CS 特异性和 HBs 特异性的 CD4 和 CD8T 细胞应答如 图 12、13、14 和 15 所示。
     各图内的每个三角形 (i) 代表在用覆盖 CS 或 HBs 序列的肽的混合物 (pools) 在 体外对外周血淋巴细胞进行再刺激之后得自 4 只小鼠的应答，和 (ii) 代表在对体外再刺激 中所使用的肽的混合物产生应答中产生 IL-2 和 / 或 IFN-γ 的 CD4 或 CD8T 细胞的百分 数。
     这些结果指示了 CS 和 HBs 特异性的 CD4T 细胞应答由全部进行试验的 RTS， S 制剂所引起。 这些抗原特异性 CD4T 细胞应答是可比较的，无论使用 RTS，S 和 AS01( 目 前的冻干制剂 )、 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo、包含 0.02％或 0.08％一硫代甘油 (MTG) 的 液体 RTS， S 用于免疫 ( 在全部试验剂量下，应答都是可比较的 )。这些结果指示了 CS 和 HBs 特异性的 CD8T 细胞应答由全部试验的 RTS，S 制剂 所引起。 这些抗原特异性 CD8T 细胞应答是可比较的，无论使用 RTS， S 和 AS01( 目前 的冻干制剂 )、 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo、包含 0.02％或 0.08％一硫代甘油 (MTG) 的液 体 RTS，S 用于免疫 ( 在全部试验剂量下，应答都是可比较的 )。 值得注意的是，对于液 体 RTS，S 制剂而言存在这样一种趋势，即在两个试验剂量 (2.5 和 5μg) 下都诱导更高百 分数的 Ag 特异性 CD8T 细胞。 然而，如上所述，这一读数被认为是探索性的，因为只使 用每个试验每组中可获得的三个值 (pools) 以及因为这种基于细胞的试验的公知变异性， 不能得出统计学结论。
     d. 结论
     由 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo、液体 RTS， S 0.02％一硫代甘油和液体 RTS， S 0.08％一硫代甘油所引起的 CS 和 HBs 特异性 CD4 和 CD8T 细胞应答，与在 AS01 中重新 构成的目前的 RTS， S 冻干制剂所引发的那些是可比较的。
     参考文献
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     序列表
     SEQ ID NO ：1
     1区
     KLKQP
     SEQ ID NO ：2
     II 区 +
     CSVTCG
     SEQ ID NO ：3
     VK210 重复单元
     GDRAAGQPA
     SEQ ID NO ：4
     VK210 重复单元
     GDRADGQPA
     SEQ ID NO ：5
     VK210 重复单元
     GDRADGQAA
     SEQ ID NO ：6
     VK210 重复单元
     GNGAGGQPA
     SEQ ID NO ：7
     VK210 重复单元
     GDGAAGQPA
     SEQ ID NO ：8
     VK210 重复单元
     GDRAA GQAA
     SEQ ID NO ：9
     VK210 重复单元
     GNGAGGQAA
     SEQ ID NO ：10
     主要 VK247 重复单元
     ANGAGNQPG
     SEQ ID NO ：11
     12 个氨基酸插入
     GGNAANKKAEDA
     SEQ ID NO ：12
     Pv-CS 核苷酸序列Acacattgcggacataatgtagatttatctaaagctataaatttaaatggtgtaaacttc aataacgtagacgctagttcactcggggctgcg cacgtaggtcagtctgctagcagggggcgcggtctcggggaaaacccagacgacgaagaa ggtgatgctaaaaagaaaaaggacg gtaaaaaagcggaaccaaaaaatccaagggaaaataaattaaaacagcccggggatcgcg cggatggtcaagcggcgggtaatggg gcggggggtcaaccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatcgcgcggct ggtcagccagcgggggatggtgc ggctggccaaccagcgggggatcgcgcggatggtcagccagcgggggatcgcgcggatgg tcaaccagccggtgatcgcgcggct ggccaagcggccggtaatggggcggggggtcaagcggccgcgaacggagcggggaaccag ccaggcggcggtaacgctgcga ataaaaaagcggaagatgcgggtggtaacgcgggcggtaatgcgggcggccaaggtcaga acaacgaaggggctaatgcaccaaa cgaaaaatctgtcaaagaatatctcgataaagtccgcgctacagtagggacagaatggac gccatgctctgtaacatgtggtgtcggggt acgcgtgcgccgccgtgtcaatgcggctaacaaaaaaccagaagatctcacgttaaatga tctcgaaacggatgtctgcaca SEQ ID NO ：13 Pv-CS 蛋白的氨基酸序列 THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGEN PDDEEGDAKKKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGG QPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDGAAGQPAGDRADGQPAGDRADG QPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKAEDAGG NAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVT CGVGVRVRRRVNAANKKPEDLTLNDLETDVCT SEQ ID NO ：14 次要 2 型重复单元 ANGAGDQPGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTGAACGGTGTTAATTTC AACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAATCTGCTTCAAGAGGT AGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAGAAGAAGAAGGACGGT AAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAACCAGGTGACAGAGCC GACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGTGACAGAGCTGCCGGT CAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGTGCCGCCGGTCAACCT GCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGACGGACAGCCAGCCGGC GATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAAGCTGCTGCTAACGGT3160 120 180 240 300 360 420 GCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCTGAAGACGCTGGTGGT AATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGTGCTAACGCTCCAAAC GAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTCGGTACTGAATGGACT CCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGAGTTAACGCCGCTAAC AAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTTTGTACT540 600 660 720 771核苷酸序列 ATGATGGCTCCCGGGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTG AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAA TCTGCTTCAAGAGGTAGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAG AAGAAGAAGGACGGTAAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAA CCAGGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGT GACAGAGCTGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGT GCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGAC GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAA GCTGCTGCTAACGGTGCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCT GAAGACGCTGGTGGTAATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGT GCTAACGCTCCAAACGAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTC GGTACTGAATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA GTTAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTT TGTACTCCCGGGCCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG CTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTA GACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAAT TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTAT CGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCT ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATC CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGG CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT ATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAA SEO ID No 17 氨基酸序列 THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGENPDDEEGDAK60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 148560 120 180 240KKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGGQPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDG
     AAGQPAGDRADGQPAGDRADGQPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKA
     EDAGGNAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVTCGVGVRVRRRVNAANKKPEDLTLNDLETDVCTMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSL300 360 420 480 494DSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLI FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPI PSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPF IPLLPIFFCLWVYI SEQ ID NOs.18 和 19 RTS 表达盒的核苷酸序列和 RTS‑HbsAg 杂合蛋白的预期翻译产物。 起源于 TDH3ATG 密码子的翻译产物如以下的 DNA 序列所示。 AAGCTTACCAGTTCTCACACGGAACACCACTAATGGACACAAATTCGAAATACTTTGACC CTATTTTCGAGGACCTTGTCACCTTGAGCCCAAGAGAGCCAAGATTTAAATTTTCCTATG ACTTGATGCAAATTCCCAAAGCTAATAACATGCAAGACACGTACGGTCAAGAAGACATAT TTGACCTCTTAACTGGTTCAGACGCGACTGCCTCATCAGTAAGACCCGTTGAAAAGAACT TACCTGAAAAAAACGAATATATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAACAAGAAGTTTA ATGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGAGTTAGAATCATTTT GAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAATTAGCCTTT TAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAAC ATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATCCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCTCGC TTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACC AACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAG GCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACAC AAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGC TCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCC CCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTGTAAATCTAT TTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCA AGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGATGGCTCCCGATCCTAATG MetMetAlaProAspProAsnA CAAATCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATG LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnA CAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnA CAAACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsna CAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATAAAAACAATCAAG LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnLysAsnAsnGlnG GTAATGGACAAGGTCACAATATGCCAAATGACCCAAACCGAAATGTAGATGAAAATGCTALyAsnGlyGlnGlyHisAsnMetProAsnAspProAsnAspProAsnArgAsnValAspGluAsnAlaA
     ATGCCAACAATGCTGTAAAAAATAATAATAACGAAGAACCAAGTGATAAGCACATAGAAC
     疟疾，是全世界主要的健康问题之一，每年超过 2-4 百万人死于该病。 该病的 最流行的形式之一由原生动物寄生虫间日疟原虫 (P.vivax) 所引起，该间日疟原虫在热带 和亚热带地区被发现。 令人感兴趣的是，该寄生虫可以在低至 15℃的温度下完成其蚊体 周期，这使得该病在温带气候中得以蔓延。
     该病的最急性形式之一由原生动物寄生虫恶性疟原虫 (P.falciparum) 所引起，该 恶性疟原虫是导致由疟疾造成的大多数死亡的原因。
     疟原虫的生命周期是复杂的，需要两种寄主即人和蚊用于完成生命周期。 人的 感染开始于子孢子通过被感染蚊子的叮咬被接种进入血流中。 所述子孢子移到肝并感染 那里的肝细胞，其中所述子孢子经由红细胞外的胞内阶段分化成裂殖子阶段，其感染红 细胞 (RBC) 以启动在无性血内阶段中的循环复制。 该周期通过在 RBC 中许多裂殖子分 化成有性繁殖阶段的配子体而完成，所述配子体被蚊子摄入，在蚊子体内，所述配子体 在蚊子中肠内经由一系列阶段发展生成子孢子，其移到唾液腺。
    由于由间日疟原虫引起的疾病很少致命的事实，预防和治疗疟疾的努力已集中 于更加致命形式的由恶性疟原虫引起的疾病。
     尽管由间日疟原虫引起的疾病不常导致患者死亡，由于看起来日益增多的大量 的病例，对患者生命质量的显著影响，日益增加的关于该病导致贫血症和死亡的严重事 件的报导，以及经济影响，仍然需要用于该病的有效疫苗。 另外，对该病的两种病因都 能够提供防护的单一疫苗将是有利的。
     间日疟原虫的特征在于，一些虫株能够通过在进入外周循环以显现临床症状之 前在肝内保持潜伏而造成延迟感染。 因此，当例如穿过污染地区时，对象可被感染，但 是可能历时数月不表现出症状。 这是引起疾病蔓延的潜在原因，并且由于这一缘故，到 污染区域旅行的人在到该污染区域旅行之后的规定的一段时间内不允许捐赠输血。
     间日疟原虫疟疾感染在肝内保持潜伏，而所述寄生虫正经历红细胞内裂殖生长 前 (pre-erthrocytic shizogony) 阶段。如果所述寄生虫在其离开肝之前在该阶段受到控制， 在患者中观察不到疾病的临床症状。
     疟原虫的子孢子阶段被确定为是疟疾疫苗的潜在的靶标。 使用去活化 ( 经 照射的 ) 子孢子的疫苗已显示诱导对实验人类疟疾的防护 (Am.J， Trap.Med.Hyg 24 ： 297-402，1975)。 然而，根据这一方法论，采用经照射的子孢子来生产用于一般人群的 疟疾疫苗在实践中和就后勤学而言是不可能的。
     所述子孢子的主要表面蛋白被称为环子孢子蛋白 (CS 蛋白 )。 认为在子孢子从 被蚊子叮咬的最初接种位置进入循环 ( 在那里子孢子移到肝处 ) 期间，所述蛋白参与子孢 子的移动和侵入。
     疟原虫的 CS 蛋白的特征在于，侧接非重复的氨基 (N 端 ) 片段和羧基 (C 端 ) 片
     尽管由间日疟原虫引起的疾病不常导致患者死亡，由于看起来日益增多的大量 的病例，对患者生命质量的显著影响，日益增加的关于该病导致贫血症和死亡的严重事 件的报导，以及经济影响，仍然需要用于该病的有效疫苗。 另外，对该病的两种病因都 能够提供防护的单一疫苗将是有利的。
     间日疟原虫的特征在于，一些虫株能够通过在进入外周循环以显现临床症状之 前在肝内保持潜伏而造成延迟感染。 因此，当例如穿过污染地区时，对象可被感染，但 是可能历时数月不表现出症状。 这是引起疾病蔓延的潜在原因，并且由于这一缘故，到 污染区域旅行的人在到该污染区域旅行之后的规定的一段时间内不允许捐赠输血。
     间日疟原虫疟疾感染在肝内保持潜伏，而所述寄生虫正经历红细胞内裂殖生长 前 (pre-erthrocytic shizogony) 阶段。如果所述寄生虫在其离开肝之前在该阶段受到控制， 在患者中观察不到疾病的临床症状。
     疟原虫的子孢子阶段被确定为是疟疾疫苗的潜在的靶标。 使用去活化 ( 经 照射的 ) 子孢子的疫苗已显示诱导对实验人类疟疾的防护 (Am.J， Trap.Med.Hyg 24 ： 297-402，1975)。 然而，根据这一方法论，采用经照射的子孢子来生产用于一般人群的 疟疾疫苗在实践中和就后勤学而言是不可能的。
     所述子孢子的主要表面蛋白被称为环子孢子蛋白 (CS 蛋白 )。 认为在子孢子从 被蚊子叮咬的最初接种位置进入循环 ( 在那里子孢子移到肝处 ) 期间，所述蛋白参与子孢 子的移动和侵入。
     疟原虫的 CS 蛋白的特征在于，侧接非重复的氨基 (N 端 ) 片段和羧基 (C 端 ) 片
     段的中央重复结构域 ( 重复区 )。 间日疟原虫的中央结构域由重复单元、通常是九个串联 氨基酸的若干区组组成。
     在某些亚洲株中，在所述中央重复区之后，存在大约 12 个氨基酸的附加序列 ( 参见 SEQ ID No 11)。 后者的功能是未知的。 然而，据一些人假设，所述氨基酸可能 与疾病临床症状的延迟发病相关联，尽管尚未对此进行考察。 认为 N 端的特征在于被称 为 I 区的 5 个氨基酸的序列 ( 参见 SEQ ID No 1)。 还认为 C 端的特征在于包括被称为 II 区的 12 个氨基酸的序列。 后者包含细胞粘附基序，其在所有的疟疾 CS 蛋白中是高度保 守的 ( 参见 SEQ ID No.2)。
     若干研究小组已提出了基于环子孢子蛋白的亚单位疫苗。 完全基于所述中央重 复区的这些疫苗中的两个在二十世纪八十年代初经历临床试验 ；一个疫苗是合成肽，另 一个疫苗是重组蛋白 (Ballou 等人，Lancet ：June 6(1987)，第 1277 页起，和 Herrington 等 人， Nature 328 ：257(1987))。 这些疫苗在刺激抗子孢子应答中获得成功。 尽管如此， 应答幅度是令人失望的，一些疫苗根本不产生应答。 另外，在随后的注射之后，抗体水 平 “加强” 的缺乏以及体外淋巴细胞增殖试验的结果暗示了，这些志愿者中大多数的 T 细胞不识别免疫显性重复 (immuno-dominant repeat)。 另外，这两个疫苗的效率勉强说得 过去，只有一个被接种的志愿者没有发展成寄生虫血症。 这些疫苗没有作进一步讨论。
     WO 93/10152 和 WO 98/05355 描述了来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的疫苗， 并且使用其中所述的方法在朝着抗恶性疟原虫的疫苗方面似乎有了一些进展，还参见， Heppner 等人，2005， Vaccine 23，2243-50。
     迄今为止，在临床上最先进的疟疾疫苗基于被称作 RTS，S 的脂蛋白粒子 ( 又名 病毒样粒子 )。 该粒子包含恶性疟原虫的 CS 蛋白的一部分，该部分实质上与恶性疟原虫 ( 虫株 NF54/3D7) 的 CS 蛋白的氨基酸 207-395 相对应，该部分通过线性接头在框架内融 合至来自乙型肝炎的 S 抗原的 N 端。 所述接头可包括来自 S- 抗原的 preS2 的一部分。 详细内容请参见以下的讨论。
     恶性疟原虫内的 CS 蛋白具有保守的中央重复区。 相比之下，间日疟原虫的 CS 蛋白的至少两种形式 ( 被称为 VK210 或 I 型以及 VK247 或 II 型 ) 是已知的。 这使得更 难以鉴定具有全部所需性质诸如免疫原性的 CS 蛋白的构建体，该构建体提供对间日疟原 虫的总体防护而与 CS 蛋白的具体类型无关，因为针对 I 型中央重复区的抗体未必识别相 应的 II 型区上的表位，反之亦然。
     就本发明人所知晓的程度，尚未提议基于间日疟原虫的单一虫株的与 RTS，S 相 当的粒子。
     杂合间日疟原虫 CS 蛋白描述于 WO 2006/088597 中。
     包含 WO 2006/088597 的杂合蛋白以及来自乙型肝炎的 S 抗原的融合蛋白 ( 本文 中被称作 CSV-S) 以及包含该融合蛋白的脂蛋白粒子描述于 PCT/EP2007/057301 中。
     包含 CSV-S、 RTS 和任选的 S 单元的脂蛋白粒子描述于 PCT/EP2007/057296 中。
     目前， RTS， S 疟疾疫苗作为冻干抗原被提供，其在递送之前不久用助剂进行重 新构成。 这是因为该抗原当储存历时相当长的时段时不稳定，特别是在助剂的存在下。 所述不稳定性自身表现为团聚和 / 或降解。到 2018/2019 年，据估计需要 8300 万剂量的疟疾疫苗。 目前的冻干 ( 冷冻干 燥 ) 方法花费约 40 小时。 因此，目前的方法不可能满足未来的需求。 有可能将生产周 期缩短到约 28 小时，但是这仍不大可能满足所述需求。 另外，进一步缩短周期时间看来 导致出现不合格产品。
     疟疾疫苗主要在基础设施 (infra-structure) 和设备贫乏的国家中用于递送，因 此，在直到给药前是稳定的疫苗提供形式是至关重要的，特别是如果提供的是液体制剂 时。
     由发明人提供的初始数据表明，在磷酸盐缓冲盐水中制备的、含有残留量的聚 山梨醇酯 80(0.0062％ w/w) 且不含其它赋形剂的、 pH 为 6.1 的 RTS， S 纯体积 (purified bulk)，在加速稳定性试验 ( 即在 37℃下储存 7 天 ) 后，显示显著的降解和氧化性聚集。 在 4℃下储存 2 个月后观察到轻微聚集和降解。
     考察了以下的选项 ：
     · pH 从 6.1 增加到 7.4 似乎降低了 S 抗原降解，但是增加 CS 蛋白降解 ；
     ·聚山梨醇酯 80( 也称为吐温 80) 浓度增加到 0.05％、0.5％和 1.0％似乎增加聚 集和降解二者，这是令人惊讶的，因为吐温 80 通常降低抗原聚集 ( 据发明人假设，这是 由在土温内存在残留的过氧化物所导致的，残留的过氧化物可能催化蛋白 / 抗原内的硫 醇基的催化氧化 - 使用本发明的还原剂似乎防止这一效果 ) ；和 · 加入蔗糖 (6.2％ w/w) 对聚集或降解没有影响。
     据假设，所述聚集过程在许多阶段中发生，并且如果这些阶段之一可被成功地 阻止的话，则可以阻止聚集和 / 或降解 ( 参见 ： ″ Minimizingprotein inactivation ″， D.B.Volkin 和 A.M.Klibanov， ″ Protein function ：apractical approach ″， T.E.Creighton 编 -IRL Press， Oxford University Press)。
     第一阶段是天然蛋白解折叠，从而暴露出其疏水性更大的区域。 该疏水性区域 的暴露导致若干蛋白组在一起。 最后阶段是所述蛋白通过二硫键的形成而发生不可逆变 性。
     还可能的是，为使所述抗原增溶而被加入的聚山梨醇酯 80 含有残留的过氧化 物，残留的过氧化物催化聚集和 / 或降解。
     本发明人尝试了许多的稳定试剂 / 稳定方法，例如，糖，多元醇，共溶剂，聚 合物，离子， pH，缓冲剂，抗氧化剂，螯合剂和表面活性剂，它们都不提供所需效果。 例如，加入抗坏血酸产生显著的聚集。 使用单独的 EDTA 或在抗氧化的存在下使用 EDTA 不阻止聚集。 另外，加入亚硫酸盐不提供所需的稳定效果。 一些常见的稳定剂与在最终 的疟疾制剂中所采用的辅助制剂不相容。 本发明人目前相信，疟原虫 CS 蛋白 ( 恶性疟 原虫和 / 或间日疟原虫 ) 的脂蛋白粒子可采用特定的稳定剂进行稳定化用于储存，例如， 包含至少一个硫醇 (-SH) 基团的还原剂，诸如硫代硫酸盐，N- 乙酰半胱氨酸，一硫代甘 油，半胱氨酸，还原型谷胱甘肽和硫代乙酸钠或其混合物，特别是 N- 乙酰半胱氨酸，一 硫代甘油，半胱氨酸，硫代乙酸钠及其混合物，特别是一硫代甘油，半胱氨酸及其混合 物。
     作为这些包含至少一个硫醇 (-SH) 基团的还原剂的替代物或者与这些还原剂相 组合，本发明使用的脂蛋白粒子可通过从它们被储存在内的容器中除去氧和 / 或使所述
     制剂避光 ( 例如通过使用褐色玻璃容器 ) 而被稳定化或进一步稳定化，可保护 / 进一步保 护所述抗原。
     因此，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含 ：
     a) 免疫原性粒子 RTS， S，和 / 或
     b) 来源于一种或多种间日疟原虫虫株的 CS 蛋白和来自乙型肝炎的 S 抗原以及任 选的未融合 S 抗原的免疫原性粒子，和 / 或
     c) 包含 RTS、 CSV-S 和任选的未融合 S 抗原的免疫原性粒子，和
     d) 包括 ( 或选自 ) 具有至少一个硫醇官能团的还原剂的稳定剂，例如，如上所述 的还原剂，诸如一硫代甘油，半胱氨酸， N- 乙酰半胱氨酸或其混合物。
     在一个方面，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含上述的 a)、 b)、 c) 和任选 的 d)，并且其中在其制备中采用诸如从容器中除去氧和 / 或通过例如使用褐色玻璃容器 使所述制剂避光的保护措施。
     有利地是，包含来自疟原虫的 CS 蛋白以及来自肝炎的 S 抗原的脂蛋白粒子抗原 可通过采用一硫代甘油、半胱氨酸或其混合物和 / 或诸如从小瓶中除去氧和 / 或通过例如 使用褐色玻璃容器使所述制剂避光而被足够地稳定化。
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    序列表 SEQ.ID.No.1 间日疟原虫的 N 端的 I 区 SEQ.ID.No.2 是在间日疟原虫的 C 端中的 II 区的高度保守 部分 SEQ.ID.No.3-9 间日疟原虫的 I 型 CS 蛋白的多种重复单元 SEQ.ID.No.10 间日疟原虫的 II 型 CS 蛋白的主要重复单元 SEQ.ID.No.11 在间日疟原虫的亚洲株中发现的附加氨基酸 SEQ.ID.No.12 间日疟原虫的杂合蛋白 CSV 的核苷酸序列 ( 为在大肠杆菌中表达而被优化 ) SEQ.ID.No.13 间日疟原虫的杂合蛋白 CSV 的氨基酸序列 SEQ.ID.No.14 间日疟原虫的 II 型 CS 蛋白的次要重复单元 SEQ.ID.No.15 间日疟原虫的杂合蛋白 CSV 的核苷酸序列 ( 为在酵母中表达而被优化 ) SEQ.ID.No.16 杂合融合蛋白 CSV-S 的核苷酸序列 SEQ.ID.No.17 杂合融合蛋白 CSV-S 的氨基酸序列 SEQ.ID No.18 RTS 表示盒的核苷酸序列 SEQ.ID No.19 来自 SEQ ID No.18 的预期 RTS 融合蛋白 SEQ ID Nos.20 到 25 包含 CpG 的寡核苷酸的实施例。附图说明 图 1pRIT15546 酵母游离型载体的质粒图谱 ；
     图 2 通过在将所需抗原与来自乙型肝炎的 S 抗原 “融合” 中使用的 GSK 制备的 质粒 pGF1-S2 的质粒图谱。 ( 在切除 12bp SmaI DNA 片段之后 ) 在 SmaI 位点之间的克 隆异源 DNA 序列与 S 基因产生符合读框的融合 ；
     图 3pRIT15582 的质粒图谱 ；
     用 XhoI 消化释放携带 CSV-S 表达盒加 LEU2 选择性标记的 8.5kb 的线形 DNA 片 段，用于插入所述酵母染色体内 ；
     图 4 用于整合 CSV-S 表达盒的线性 XhoI 片段的限制图谱 ；
     图 5 在虫株 Y1835 中产生的 CSV-S， S 混合粒子的电子显微照片 ；
     CSV-S， S 粒子从可溶性细胞抽提物 ( 基于 RTS， S 纯化法 ) 纯化并经历电子显 微镜分析。 在用磷钨酸进行负染色之后可见到粒子。 比例等于 100nm ；
     图 6 显示在 37℃ +/-AOT-Novex 凝胶中在非还原 ( 左 ) 和还原 ( 右 ) 条件下储 存 7 天之后，在与 AS01 混合之前 ( 上 ) 或与 AS01 在 25℃混合 24 小时之后 ( 下 ) 的 SDS page 分析，
     1.Mw
     2.PB T0
     3.PB 7 天 37℃
     4.NaCl PO47 天 37℃
     5.NaCl PO47 天 37℃ +AOT 褐色玻璃 6.NaCl PO47 天 37℃ +AOT 白色玻璃
     7.MTG 0.01％ 7 天 37℃
     8.MTG 0.01％ 7 天 37℃ +AOT 褐色玻璃
     9.MTG 0.01％ 7 天 37℃ +AOT 白色玻璃
     10.MTG 0.04％ 7 天 37℃
     11.MTG 0.04％ 7 天 37℃ +AOT 褐色玻璃
     12.MTG 0.04％ 7 天 37℃ +AOT 白色玻璃 ；
     图 7 显示在还原 ( 左 ) 和非还原 ( 右 ) 条件下在 37℃ -Novex 凝胶中储存 14 天 之后，在与 AS01 混合之前或与 AS01 混合在 25℃历时 24 小时之后的 SDS page 分析 ；
     图 8 显示在还原 ( 左 ) 和非还原 ( 右 ) 条件下在 37℃ -Novex 凝胶中储存 5 周之 后，在与 AS01 混合之前或与 AS01 混合在 25℃历时 24 小时之后的 SDS page 分析 ；
     对于图 7 图 8 ：
     1.Mw
     2.PB T0 还原
     3.RTS， S NaCl PO45 周 37℃还原
     4.RTS， S MTG 0.01％ 5 周 37℃还原
     5.RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃还原
     6.(RTS， S NaCl PO45 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃还原
     7.(RTS， S MTG 0.01％ 5 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃还原
     8.(RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃还原
     9.PB T0 非还原
     10.RTS， S NaCl PO45 周 37℃非还原
     11.RTS， S MTG 0.01％ 5 周 37℃非还原
     12.RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃非还原
     13.(RTS， S NaCl PO45 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃非还原
     14.(RTS， S MTG 001％ 5 周 37℃ )/AS01E24 小时 25℃非还原
     15.(RTS， S MTG 0.04％ 5 周 37℃ )/AS01E 24 小时 25℃非还原
     图 9 通过混合 ELISA αCSP-α-S 显示在有或者没有一硫代甘油的液体制剂中的 RTS， S 抗原性 ；
     图 10 显示抗 CS 血清学结果 ；
     图 11 显示抗 HBS 血清学结果 ；
     图 12 显示 CS 特异性 CD4T 细胞应答 ；
     图 13 显示 HBs 特异性 CD4T 细胞应答 ；
     图 14 显示 CS 特异性 CD8T 细胞应答 ；
     图 15 显示 HBs 特异性 CD8T 细胞应答 ；
     发明详述
     采用 N- 乙酰半胱氨酸、一硫代甘油、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和硫代乙酸钠 或其混合物的本发明的方面具有另外的优点，该优点在于该实施方案提供了可行的替代 硫酸钠的生产备选方案 ( 可能希望避免硫酸钠的使用 )。
     尽管不希望束缚于理论约束，据本发明人假设，在稳定剂 / 还原剂中的硫醇官 能团与抗原中的硫醇官能团结合，从而阻断所述位点并防止该位点与不同抗原分子上的 硫醇官能团发生键合 / 相互作用。 另外，因为所述稳定剂 / 还原剂相对小，还认为在所 述抗原内的表位、特别是构象表位不被破裂，从而所述抗原的免疫原性得以被保留，并 防止发生聚集。
     替代地或另外地，吐温 (tween) 中的过氧化物被淬灭。
     在本发明的一个方面，所述稳定剂是一硫代甘油。
     在本发明的一个方面，所述稳定剂是半胱氨酸。
     在本发明的一个方面，所述稳定剂是 N- 乙酰半胱氨酸。
     所述稳定剂例如可以按如下范围的量被使用 ：0.01 到 10％ w/v，诸如 1 到 5％， 2 到 6 ％，4 到 7 ％，3 到 8 ％， 诸 如 0.01 到 1 ％，0.2 到 0.4 ％，0.1 ％ 到 0.5 ％，0.3 到 0.8％，0.6 到 0.9％，例如实质上是 0.2，0.4，0.5 和 0.8％，或者诸如 0.01 到 0.1％，0.01 到 0.02％，0.01 到 0.05％，0.01 到 0.08％，0.02 到 0.05％，0.02 到 0.08％或 0.05 到 0.08％ w/v。
     替代地，所述稳定剂例如可以按如下范围的量被使用 ：0.01 到 10％ w/w，诸如 1 到 5％，2 到 6％，4 到 7％，3 到 8％，诸如 0.01 到 1％，0.2 到 0.4％，0.1％到 0.5％， 0.3 到 0.8％，0.6 到 0.9％，例如实质上为 0.2，0.4，0.5 和 0.8％，或者诸如 0.01 到 0.1％， 0.01 到 0.02 ％，0.01 到 0.05 ％，0.01 到 0.08 ％，0.02 到 0.05 ％，0.02 到 0.08 ％或 0.05 到 0.08％ w/w。
     半胱氨酸的适合量为总制剂重量的 0.1 到 1.0％。 因此，例如，在一个 500μl 的 人用剂量中，半胱氨酸的量为 100μg 到 5000μg 范围，诸如 500μg。
     在一个方面，本发明提供了疟疾疫苗的组分，其包含 ：
     a) 免疫原性粒子 RTS， S，和 / 或
     b) 来源于一种或多种间日疟原虫虫株的 CS 蛋白和来自乙型肝炎的 S 抗原以及任选的未融合 S 抗原的免疫原性粒子，和
     c) 稳定剂，其包括一硫代甘油。
     本发明的这一方面可进一步采用另外的保护措施，诸如从所述容器 / 小瓶除去 氧和 / 或通过例如使用褐色玻璃容器使所述制剂避光。
     一硫代甘油由式 HSCH2CH(OH)CH2OH 表示并且还被称作 3- 巯基 -1，2- 丙二醇 或 1- 硫代甘油。 用于本发明的适合量包括但不限于以下的范围 ：0.01 到 10％，诸如 0.01 到 1％或 0.01 到 0.1％，0.01 到 0.02％，0.01 到 0.05％，0.01 到 0.08％，0.02 到 0.05％， 0.02 到 0.08 ％ 或 0.05 到 0.08 ％ w/v， 例 如 0.011，0.012，0.013，0.014，0.015，0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08％ w/v。 250μl 的单一人用剂量可 含有例如 10 到 2500μg，诸如 25 到 250μg 的一硫代甘油，例如 50，125 或 200μg 的一 硫代甘油。
     替代地，用于本发明的适合量包括但不限于以下的范围 ：0.01 到 10％诸如 0.01 到 1 ％，0.01 到 0.1 ％，0.01 到 0.02 ％，0.01 到 0.05 ％，0.01 到 0.08 ％，0.02 到 0.05 ％， 0.02 到 0.08 ％或 0.05 到 0.08 ％ w/w，例如 0.011，0.012，0.013，0.014，0.015，0.016， 0.017，0.018，0.019，0.02，0.025，0.04，0.05 或 0.08％ w/w。 有利地是，当根据本发明使用一硫代甘油时，似乎与辅助制剂例如水包油型乳 液或包含 MPL 和 / 或 QS21 的脂质体制剂相容。
     另外，一硫代甘油降低了由 MPL 和 QS21 的脂质体辅助制剂诱导的脂蛋白粒子 聚集，从而提供与制备之后不久经纯化的大体积的液体制剂相类似的液体制剂。
     在本说明书的背景下，经纯化的体积 (purified bulk) 是指在超过两个剂量的大体 积量下经纯化的抗原。
     在本说明书背景下，最终体积 (final bulk) 是指超过一个或两个剂量的经纯化的 抗原和赋形剂诸如磷酸盐缓冲盐水，不包括辅助组分。
     当使用 0.01 ％的一硫代甘油、在缺乏助剂的条件下以 50μg/ml 配制 RTS， S 时，其在 37℃储存 7 天之后具有与新鲜体积相同的特性。 0.01％一硫代甘油也足够避免 RTS， S 发生由光催化的聚集。
     尽管如此，对于疟原虫 CS 蛋白的脂蛋白粒子的、例如在 100μg/ml 的抗原和例 如最多 1.0％ w/v 诸如 0.02、0.05 或 0.08％的一硫代甘油的液体制剂而言，期待获得其约 2 或 3 年的货架寿命。
     在本发明的一个方面，所述还原剂不是二硫苏糖醇。
     所述疫苗的液体组分，包括其辅助组分，可要求在约 4℃下储存。
     本发明的所述制剂具有适于注射的 pH 和渗克分子浓度 (osmolality)。 适当地， 所述液体制剂的 pH 为约 6.5 到 7.2，诸如约 6.6、6.7、6.8、6.9、7.0 或 7.1。
     本发明的所述制剂可进一步包含防腐剂诸如硫柳汞，例如，当超过 10 个剂量被 一起提供时。 然而，在至少一个实施方案中，本文所述的制剂不含硫柳汞。
     研究显示，与 0.01 或 0.04％一硫代甘油一起储存的例如在 50μg/ml 下的 RTS， S 在 4℃或 37℃下历时 5 周之后，没有可检测的由非特异性吸收导致的抗原损失。
     另外，在加速稳定性，即在 37℃下储存 7 天、然后暴露于强光下约 15 小时 ( 在 本文被称作加速氧化试验 AOT) 之后，未观察到 RTS， S 粒度分布发生改变。
     在一个方面，本发明提供了作为单独的液体制剂的疟疾疫苗用组分以及适于加 到该单独液体制剂中的助剂，任选地作为包括每个成分 (element) 的单独的小瓶的药包 (kit) 被提供。 在该实施方案的一个方面，每个小瓶在视觉上是不同的，例如，在一个小 瓶上的卷边盖是有颜色的，从而使该小瓶与其它小瓶区分开，和 / 或一个小瓶是琥珀色 的 ( 诸如包含所述抗原的小瓶 ) 并且另一个小瓶是透明的 ( 诸如包含所述助剂的小瓶 )。
     适合的小瓶包括例如 3mL 的玻璃小瓶。
     在一个方面，本发明提供了包含抗原和稳定剂 ( 或本文所述的还原剂 ) 的冻干组 分，其然后可用液体助剂重新构成。所述冻干组分和所述液体助剂 ( 诸如 MPL 和 QS21 的 水包油型制剂或脂质体制剂 ) 可作为药包被提供。 本发明的这一方面具有以下的优点 ： 其不需要在重新构成之后立即使用，而是在储存至少 24 小时是稳定的，例如，当在混合 之后在 25℃下储存时抗原的抗原性保持至少 24 小时。 在下文详细地讨论助剂。
     在本发明的一个方面，提供了最终的液体制剂。 最终的液体制剂是指包含最多 10 个剂量诸如 1 或 2 个剂量并包含除助剂组分以外的全部赋形剂的液体制剂。
     在一个方面，所述组分或最终疫苗作为单剂量被提供。
     在本说明书背景下的疫苗是包含全部所述组分的免疫原性制剂，所述组分包括 适于注射进人体的辅助组分。 在一个方面，所述组分或最终疫苗作为双剂量被提供。 这可能是有利的 ( 例 如，当对于一个剂量而言的量较小时 )，因为提供两个剂量可以使得在重新构成和 / 或给 予所述最终制剂时重要组分的损失最小化。
     因此，疫苗例如作为 2 个小瓶制剂的双剂量形式被提供，其包含 ：
     小 瓶 1 ：500μl(2 个 剂 量 ) 的 RTS， S，2× 浓 缩 (100μg/ml)+ 一 硫 代 甘 油 (0.02、0.05 或 0.08％ )
     小瓶 2 ：500μl(2 个剂量 ) 的助剂，2× 浓缩 (AS01)
     在 重 新 构 成 之 后， 所 述 制 剂 提 供 1ml(2 个 剂 量 ) 的 在 AS01 中 的 RTS， S， +0.01、0.025 或 0.04％的一硫代甘油。
     间日疟原虫抗原
     本 发 明使 用的 CSV-S 蛋 白可包含 ：来 源于 间日 疟原 虫的 CS 蛋白 的 一部 分 (CSV)。 该 CSV 抗原可以是天然蛋白，诸如在间日疟原虫的 I 型 CS 蛋白中发现的和 / 或在间日疟原虫的 II 型蛋白中发现的。 替代地，所述 CSV 蛋白可能是包含来自所述 I 型 和 II 型 CS 蛋白的成分的杂合蛋白或嵌合 (chimeric) 蛋白。 当后者被融合至所述 S 抗原 时，这在本文中被称作杂合融合蛋白。
     CSV-S 在本文中作为通用术语被使用，用于涵盖包含来自间日疟原虫的 CS 蛋白 的序列 / 片段和来自乙型肝炎的 S- 抗原的序列的融合蛋白。
     所述杂合 / 嵌合蛋白通常包括 ：
     至少一个来源于间日疟原虫的 I 型环子孢子蛋白的中央重复区段的重复单元，以 及
     至少一个来源于间日疟原虫的 II 型环子孢子蛋白的中央重复区段的重复单元。
     通常，所述杂合蛋白还将含有来自疟原虫诸如间日疟原虫的 CS 蛋白的 N 端片 段，例如，包含 I 区诸如由 SEQ ID No.1 所示的氨基酸的片段。
     通常，所述杂合蛋白将包含来自疟原虫诸如间日疟原虫的 CS 蛋白的 C 端片段， 例如包含 II 区诸如由 SEQ ID No 2 所示的基序的片段。
     尽管不希望束缚于理论，认为所述的 N 端和 C 端片段包括若干个 T 细胞和 B 细 胞表位。
     本发明可使用任何适合的间日疟原虫虫株，包括 ：拉丁，美洲 ( 即， Sal 1， Belem)，朝鲜，中国，泰国，印度尼西亚，印度和越南。 在 SEQID No 13 中的构建体基 于朝鲜虫株 ( 更准确地说，基于南朝鲜虫株 )。
     具有 I 型 CS 蛋白的间日疟原虫比具有 II 型 CS 蛋白的间日疟原虫更普遍。 因 此，在一个方面，本发明采用了来自 I 型的 CS 蛋白。 在可供选择的方面，本发明提供了 包含来自 I 型的重复单元和来自 II 型的重复单元的杂合蛋白，例如，其中在杂合蛋白中包 含了比 II 型重复单元更多的来自 I 型的重复单元。
     更准确地说，本发明的所述杂合蛋白可包含 1 到 15 个来自 I 型的重复单元，诸 如 9 个来自 I 型的重复单元。
     来自 I 型 CS 蛋白的适合的重复单元的实例在 SEQ ID No.s 3 到 9 中给出。
     在一个实施方案中，本发明提供了具有不同的 I 型重复单元的混合物的杂合蛋 白，诸如各自在 SEQ ID No.s 3 到 9 中被列举的那些重复单元。 一个或多个重复单元可在杂合蛋白中被复制，例如， SEQ ID No 3 和 / 或 4 的两 个重复单元可被并入所述构建体中。
     a) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 3 所示单元。
     b) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 4 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a) 段中的单元组合。
     c) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 5 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a) 和 b) 段中的单元组合。
     d) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 6 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-c) 段中的一个或多个单元组合。
     f) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 7 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-d) 段中的一个或多个单元组合。
     g) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 8 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-f) 段中的一个或多个单元组合。
     h) 在一个方面，所述 CS 蛋白包含 SEQ ID No 9 所示单元，任选地与上面刚刚描 述的 a)-g) 段中的一个或多个单元组合。
     得自 II 型 CS 蛋白的适合的组分重复单元的实例在 SEQ ID No.10 和 14 诸如 SEQ ID No.10 中被给出。
     在本发明的一个方面，提供了具有 5 个或更少的来源于 II 型的重复单元诸如例如 SEQ ID No.10 所示的一个重复单元的杂合蛋白。
     所述杂合蛋白还可包含在某些间日疟原虫的亚洲虫株中发现的在所述重复区末 端被发现的 12 氨基酸插入，例如 SEQ ID No.11 所示。
     在一个实施方案中，所述杂合蛋白包含来源于间日疟原虫 CS 蛋白的约 257 个氨 基酸。
     本发明的来源于 CSV 的抗原组分通常被融合至所述 S 蛋白的氨基端。
     据信，所述得自乙型肝炎的表面抗原的存在加强了所述 CS 蛋白部分的免疫原 性，有助于稳定性，和 / 或帮助所述蛋白的可重现生产。
     在一个实施方案中，所述杂合融合蛋白包含约 494 个氨基酸，例如其中的约 257 个氨基酸来源于间日疟原虫 CS 蛋白。
     所述杂合融合蛋白还可包含另外的来源于恶性疟原虫和 / 或间日疟原虫的 抗 原， 例 如， 其 中 所 述 抗 原 选 自 DBP， PvTRAP， PvMSP2， PvMSP4， PvMSP5， PvMSP6， PvMSP7， PvMSP8， PvMSP9， PvAMA1 和 RBP，或其片段。
     来源于恶性疟原虫的抗原的其它实例包括， PfEMP-1， Pfs 16 抗原， MSP-1， MSP-3， LSA-1， LSA-3， AMA-1 和 TRAP。 其它疟原虫抗原包括恶性疟原虫 EBA， GLURP， RAP1， RAP2，钳合蛋白 (Sequestrin)， Pf332， STARP， SALSA， PfEXPl， Pfs25， Pfs28， PFS27/25， Pfs48/45， Pfs230 以及它们的在其它的疟原虫中的类似物。
     在一个实施方案中，所述杂合融合蛋白 (CSV-S) 具有如 SEQ ID No.17 中所示的 氨基酸序列。 在所述序列中，氨基酸 6 到 262 源自于 CSV，以及氨基酸 269 到 494 源自 于 S。 剩余的氨基酸通过基因构建被引入 ( 其视具体情况而定是不同的 )。 这四种氨基 酸，即 Met、 Met Ala Pro，特别地来源于质粒 pGF1-S2( 参见图 4)。
     SEQ ID No 17 所示蛋白的核苷酸序列在 SEQ ID No 16 中给出。
     编码免疫原性 CS 多肽的多核苷酸序列可能是为哺乳动物细胞而被优化的密码 子。 这种密码子优化详细描述于 WO 05/025614 中。
     RTS， S
     被称作 RTS 的本发明的蛋白粒子的组分 ( 即，来源于恶性疟原虫 ) 可以根据 WO 93/10152 所述制备，该文献包括 RTS* 的说明 ( 来自恶性疟原虫 NF54/3D7 虫株 - 本文称 作 RTS)。
     在本发明的一个或多个实施方案中，在所述融合蛋白中采用的来源于恶性疟原 虫的抗原可实质上是其全 CS 蛋白。
     在本发明的一个实施方案中，采用了全长 S- 抗原。 在另一个实施方案中，采用 了所述 S- 抗原的片段。
     在一个实施方案中，所述来源于恶性疟原虫的抗原在中央重复区中包含至少 4 个重复单元。 更准确地说，该抗原包含含有至少 160 个氨基酸的序列，其与所述 CS 蛋白 的 C 端部分实质上同源。 所述 CS 蛋白可缺乏自 C 端起最后的 12 到 14 个 ( 诸如 12 个 ) 氨基酸。
     更准确地说，所采用的来源于恶性疟原虫的融合蛋白是由 SEQ IDNo 18 所示的 RTS 表达盒的核苷酸序列编码的融合蛋白。
     来自乙型肝炎的 S- 抗原
     适 合 的 S 抗 原 可 包 含 preS2 区。 适 合 的 血 清 型 的 实 例 是 adw(Nature280 ： 815-819，1979)。
     通常，所述来自乙型肝炎的序列将是全长 S- 抗原。 通常，所述 preS2 区将不被 包括在内。
     在一个方面，本发明的所述杂合融合蛋白包含来源于突变 S 蛋白的一部分，例如，在美国申请公开 No.2006/194196( 还作为 WO2004/113369 公开 ) 中所述的。 该文献 描述了突变标记的 HDB05。 其特别地描述了在图 1 和图 6 中的突变蛋白和野生型蛋白的 比较以及在图 4 和图 5 中描述了突变蛋白的基因。 其中的序列 12 到 22 描述了突变 S 蛋 白的特定多肽。 上述每种作为参考并入本文。
     所述融合蛋白 CSV-S 可例如采用质粒 pGFl-S2( 有关详细情形参见图 2 以及实施 例 ) 制备，当与 CSV 对应的适当的序列被插入在 SamI 克隆位点时，质粒 pGFl-S2 可在适 合的条件下产生所述融合蛋白 CSV-S。
     编码本发明蛋白的 DNA 序列可侧接转录控制元件 ( 优选来源于酵母基因 ) 并被 并入表达载体中。
     本发明所用杂合蛋白的表达盒可例如被构建为包括以下特征 ：
     · 启动子序列，例如来源于酿酒酵母 (S.cerevisiae)TDH3 基因。
     · 编码适当的融合蛋白的序列。
     · 被包含在所述序列内的转录终止序列，例如，来源于酿酒酵母 ARG3 基因。
     特定的启动子的实例是来自 Musti 等人的酿酒酵母 TDH3 基因的启动子。
     适合的质粒则因此可被采用，以将编码所述杂合融合蛋白的序列插入到适合的 合成用寄主中。 适合质粒的实例是 pRIT 15546，即 2 微米基的用于携带适合表达盒的载 体，有关详细情形参见图 1 和实施例。
     所述质粒通常包含内装标记以帮助选择，例如编码抗生素抗性或 LEU2 或 HIS 营 养缺陷型的基因。
     通常，所述寄主将具有用于所述粒子中各融合蛋白的表达盒，并且还可具有一 个或多个用于被整合到其基因组内的 S 抗原的表达盒。
     本发明还涉及使用本发明载体转化的宿主细胞。 宿主细胞可以是原核的或真 核的，但优选是酵母，例如酵母菌属 ( 例如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 诸如在 ATCC 数据库中的 DC5( 登录号 20820)，名为 RIT DC5cir(o)。 保藏人 ：Smith Kline-RIT) 和非酵母菌属酵母。 这些包括裂殖糖酵母 ( 例如粟酒裂殖糖酵母 )，克卢费氏酵母 ( 例 如，乳克卢费氏酵母 )，毕赤氏酵母 ( 例如巴斯德毕赤氏酵母 )，汉逊氏酵母 ( 例如多形 汉逊氏酵母 )，脂耶氏酵母 ( 例如解脂脂耶氏酵母 ) 和许旺氏酵母 ( 例如西方许旺氏酵 母 )。
     适合的重组酵母菌株是用于表达所述融合蛋白的 Y1834( 以及其应用构成本发明 的一部分 )，其制备参见实施例。
     本发明所使用的所述核苷酸序列或其部分 ( 诸如编码所述 CS/ 杂合蛋白的部分， 但是任选不是编码蛋白 S 的部分 ) 可为在寄主诸如酵母中表达而被优化的密码子。
     所述宿主细胞可包含来源于间日疟原虫的融合蛋白所用的表达盒，和来源于恶 性疟原虫的所述融合蛋白所用的表达盒，以及任选的 S 抗原。
     在某些寄主诸如酵母细胞中，一经表达，所述融合蛋白 ( 包含所述 S 抗原 ) 自发 组装成由所述融合蛋白的众多单体组成的蛋白结构 / 粒子。 当所述酵母表达两种不同的 融合蛋白 ( 或融合蛋白和 S 抗原 ) 时，这些被认为在粒子中进行共组装。
     当被选择的受体酵母菌株在其基因组中已携带若干乙型肝炎 S 表达盒的整合拷 贝时，则组装的所述粒子还可包含未融合 S 抗原的单体。这些粒子还可被称作病毒样粒子 (VLP)。 所述粒子还可被称作多聚体型脂蛋白 粒子，或被简称为免疫原性粒子。
     因此，提供了包含以下单体的免疫原性蛋白粒子 ：
     a. 包含来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的序列的融合蛋白 ( 诸如 CSV-S)，和 / 或
     b. 包含来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的序列的融合蛋白 ( 诸如 RTS)，和
     c. 任选的未融合 S 抗原，
     其中所述粒子与例如上文所定义的稳定剂诸如一硫代甘油、半胱氨酸或其混合 物结合使用。
     在一个方面，本发明提供包含如上所定义的单体 a) 和 / 或 b) 和 c) 的免疫原性 蛋白粒子，以及其中已从容纳所述粒子的容器或小瓶中除去氧和 / 或其中例如通过褐色 玻璃容器使所述粒子避光保护的保护措施。
     在另一个方面，本发明提供了与本文所定义的例如选自一硫代甘油、半胱氨酸 或其混合物的还原剂结合使用的包含以下各项的融合蛋白的应用 ：
     a) 来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 例如，来自 I 型和 / 或 II 型的重复区的 序列 )， b) 来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 诸如来自其重复区的序列 )，和
     c) 来自乙型肝炎的 S 抗原的序列，
     当其在适合的寄主中被表达时提供包含所述融合蛋白和任选的未融合 S 抗原的 病毒样粒子，以生成粒子。
     在另一个方面，本发明提供了在其中已除去氧和 / 或通过例如使用褐色玻璃容 器使所述蛋白 / 粒子避光保护的环境中，包含以下各项的融合蛋白的应用 ：
     a) 来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 例如，来自 I 型和 / 或 II 型的重复区的 序列 )，
     b) 来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的序列 ( 诸如来自其重复区的序列 )，和
     c) 来自乙型肝炎的 S 抗原的序列，
     当其在适合的寄主中被表达时提供包含所述融合蛋白和任选的未融合 S 抗原的 病毒样粒子，以生产粒子。
     因此，本发明提供了具有至少一个硫醇官能团的还原剂例如本文所述的诸如一 硫代甘油、半胱氨酸或其混合物、特别是一硫代甘油用于稳定免疫原性脂蛋白粒子形式 的包含来源于间日疟原虫的 CS 蛋白的融合蛋白和 / 或来源于恶性疟原虫的 CS 蛋白的融 合蛋白 ( 诸如 RTS) 的蛋白粒子的应用。
     因此，本发明提供可具有至少一个硫醇官能团的还原剂，例如本文所述的诸如 一硫代甘油，用于稳定包含 CSV-S 和 / 或 RTS 单元的 VLP 的应用。 在一个方面，本发 明提供了基本上由 CSV-S 和 / 或 RTS 单元组成的粒子。 在可供选择的方面，所述生成的 粒子包含或基本上由 CSV-S 和 / 或 RTS 以及 S 单元组成。
     据假设，本发明所使用的所述脂蛋白粒子可为在体内进一步刺激对所述抗原蛋 白的免疫应答作贡献。
     据进一步假设，加入具有至少一个硫醇官能团的稳定剂例如本文所述的诸如一 硫代甘油、半胱氨酸及其混合物为每种粒子提供了内稳定化作用，从而所述试剂可在被
     给出的粒子内被结合或内在化。
     本发明还涉及包含与适合的赋形剂例如稀释剂混合的免疫保护量的本发明的稳 定化的蛋白粒子的疫苗。
     在本说明书背景下的疫苗是指包含全部所述组分 ( 包括辅助组分在内 ) 并适于注 射进人类患者的制剂。
     在本发明背景下的稳定化意欲表示其中具有至少一个硫醇官能团的稳定剂 ( 本 文中还被称作还原剂 ) 例如本文所述的诸如一硫代甘油、半胱氨酸及其混合物被省略的 相应制剂，例如当在 37 ℃下储存 7 或 14 天和 / 或当在加速稳定性条件下储存时诸如在 37℃下储存 7 天、然后在强光存在下处理约 15 小时。
     稳定性可涉及以下方面 ：粒子大小 ( 例如通过光散射技术、筛析 (SizeExclusion) 色谱法或场流分级法测量的 ) 和 / 或聚集 / 降解 ( 例如通过 SDS-page 和蛋白质印迹 (Western Blot) 测量的 ) 和 / 或抗原性 ( 例如通过 ELISA 测量的 ) 和 / 或免疫原性 ( 例如 在体内测量的 )。
     在一个方面，稳定性是指不存在聚集和降解的。
     组合物 在本说明书的背景下，赋形剂是指在药物制剂中的自身没有治疗效果的组分。 助剂是一种赋形剂，因为尽管在不存在治疗性组分诸如抗原的条件下，存在由所述助剂 产生的生理作用，但是这一生理作用是非特异性的并且其自身是非治疗性的。 稀释剂或 液体载体落入赋形剂的定义范围内。
     在本说明书的背景下，免疫原性意欲是指能够引发对所使用的融合蛋白的 CS 部 分和 / 或 S 抗原部分的特异性免疫应答的能力。 该应答可以是例如当所述脂蛋白粒子在 可能包含 / 要求适合的助剂的适当的制剂中被给药时。 可能要求包含类似于或小于初始 剂量的剂量的加强剂，以获得所需的免疫原性应答。
     本发明的所述组合物 / 药物制剂还可包含与一种或多种另外的抗原的混合物， 所述另外的抗原为诸如来源于恶性疟原虫和 / 或间日疟原虫的那些，例如其中所述抗原 选自 DBP， PvTRAP， PvMSP2， PvMSP4， PvMSP5， PvMSP6， PvMSP7， PvMSP8， PvMSP9， PvAMA1 和 RBP 或其片段。
     来源于恶性疟原虫的抗原的其它实例包括 PfEMP-1， Pfs 16 抗原， MSP-1， MSP-3， LSA-1， LSA-3， AMA-1 和 TRAP。 其它疟原虫抗原包括恶性疟原虫 EBA， GLURP，RAP1，RAP2，钳合蛋白，Pf332，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28， PFS27/25， Pfs48/45， Pfs230 以及它们的在其它的疟原虫中的类似物。
     本发明的所述组合物 / 药物制剂还可包含与含有 CSV-S 的粒子混合的 RTS， S 的粒子 ( 如 WO 93/10152 所述 )。
     在本发明的疫苗中，可直接使用所述粒子的水性溶液。 替代地，经过或未经过 先前冷冻干燥的蛋白可与助剂混合或被助剂所吸附。
     助剂
     适合的助剂是选自以下组中的那些 ：金属盐，水包油型乳液， Toll 样受体激动 剂 ( 特别是 Toll 样受体 2 激动剂， Toll 样受体 3 激动剂， Toll 样受体 4 激动剂， Toll 样受 体 7 激动剂， Toll 样受体 8 激动剂和 Toll 样受体 9 激动剂 )，皂草苷或它们的组合，前提
     条件是金属盐仅仅用于与另一种的助剂组合使用而非单独使用，除非它们以至多约 60％ 的所述抗原被吸附到所述金属盐上的方式进行配制。 在一个实施方案中，所述助剂不包 括金属盐作为唯一助剂。 在一个实施方案中，所述助剂不包括金属盐。
     在一实施方案中，所述助剂是 Toll 样受体 (TLR)4 配体，例如诸如脂质 A 衍生 物的激动剂，所述脂质 A 衍生物特别是单磷酰脂质 A 或更特别是 3- 去酰基化单磷酰脂质 A(3D-MPL)。
     3- 去 酰 基 化 单 磷 酰 脂 质 A 从 美 国 专 利 No.4,912,094 和 英 国 专 利 申 请 No.2,220,211(Ribi) 中已知并且可得自 Ribi Immunochem， Montana， USA。
     3D-MPL 由 Corixa 公司以商标 销售并且主要促进具有 IFN-g(Th1) 表型 的 CD4+T 细胞应答。 其可以根据 GB 2220211A 中所公开的方法制备。 在化学上讲，其 是 3- 去酰基化单磷酰基脂质 A 与 3、4、5 或 6 个酰基化链的混合物。 在本发明的所述组 合物中优选使用小粒子 3D-MPL。小粒子 3D-MPL 具有使得其可被无菌过滤通过 0.22μm 过滤器的粒度大小。 这种制备物描述于 WO 94/21292 中。 脂质 A 的合成衍生物是已知 的并被认为是 TLR4 激动剂，包括但不限于 ：
     OM174(2- 脱 氧 -6-O-[2- 脱 氧 -2-[(R)-3- 十 二 碳 酰 基 氧 基 十 四 碳 酰 基 氨 基 ]-4-o- 膦酰基 -β-D- 吡喃葡糖基 ]-2-[(R)-3- 羟基十四碳酰基氨基 ]-α-D- 吡喃葡糖 基磷酸二氢酯 )， (WO 95/14026) ；
     OM 294DP(3S，9R)-3-[(R)- 十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基 ]-4- 氧代 -5- 氮 杂 -9(R)-[(R)-3- 羟基十四碳酰基氨基 ] 癸烷 -1，10- 二醇，1，10- 二 ( 磷酸二氢酯 ) (WO99/64301 和 WO 00/0462) ；
     OM 197MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)- 十二碳酰基氧基十四碳酰基氨基 ]-4- 氧 代 -5- 氮杂 -9-[(R)-3- 羟基十四碳酰基氨基 ] 癸烷 -1，10- 二醇，1- 磷酸二氢酯 10-(6- 氨 基己酸酯 )(WO 01/46127)。
     一般地，当使用 3D-MPL 时，所述抗原和 3D-MPL 使用明矾递送或者存在于水 包油型乳液或多相水包油型乳液中。 并入 3D-MPL 是有利的，因为其是效应器 T 细胞应 答的刺激物。
     可 使 用 的 其 它 的 TLR4 配 体 是 烷 基 氨 基 葡 糖 苷 磷 酸 酯 (AGPs)， 诸 如 在 WO 9850399 或 US 6303347 中公开的那些 ( 也公开了用于制备 AGPs 的方法 )，或如在 US 6764840 中公开的 AGPs 的药学可接受的盐。 一些 AGPs 是 TLR4 激动剂，以及一些是 TLR4 拮抗剂。 认为二者都可用作助剂。
     另一种用于本发明的免疫刺激剂是 Quil A 及其衍生物。 Quil A 是从南美树木皂 树 Quilaja Saponaria Molina 中分离的皂草苷制备物并且由 Dalsgaard 等人在 1974 首次描述 为具有助剂活性 (″ Saponin adjuvants″， Archiv.für die gesamte Virusforschung， Vol.44， Springer Verlag，Berlin，p243-254)。 Quil A 的经纯化的级分已通过 HPLC 被分离，其保 留了助剂活性而不具有与 Quil A 有关的毒性 (EP 0362278)，例如 QS7 和 QS21( 又名 QA7 和 QA21)。 QS21 是来源于皂树 Quilaja Saponaria Molina 的树皮的天然皂草苷，其诱导 CD8+ 细胞毒 T 细胞 (CTLs)、 Th1 细胞和支配性 IgG2a 抗体应答。
     特定的 QS21 制剂已有描述，其进一步包括甾醇 (WO 96/33739)。 QS21 ∶甾醇 的比率一般为 1 ∶ 100 到 1 ∶ 1 重量 / 重量级别。 通常，存在过量的甾醇，QS21 ∶甾醇的比率为至少 1 ∶ 2w/w。 一般对于人类给药而言，QS21 和甾醇在疫苗中将以每剂量约 1μg 到约 100μg、诸如每剂量约 10μg 到约 50μg 的范围存在。
     所述脂质体通常包括中性脂质，例如卵磷脂，其在室温下通常是非晶体，例如 蛋黄卵磷脂，二油酰基卵磷脂或二月桂酰基卵磷脂。 所述脂质体还可包含带电荷的脂 质，其增加了用于由饱和脂质构成的脂质体的脂质体 -QS21 结构的稳定性。 在这些情 况下，带电荷脂质的量通常是 1-20％ w/w，诸如 5-10％。 甾醇∶磷脂的比率是 1-50％ (mol/mol)，诸如 20-25％。
     这些组合物可包含 MPL(3- 去酰基化单磷酰脂质 A，又名 3D-MPL)。 3D-MPL 从 GB 2220211(Ribi) 中已知是三种类型的具有 4、5 或 6 个酰基化链的去 -O- 酰基化单磷 酰脂质 A 的混合物并且由 Ribi Immunochem， Montana 生产。
     所述皂草苷可以分别是胶束、混合胶束 ( 通常然而并非唯一地具有胆汁盐 ) 的形 式，或者可为 ISCOM 基质形式 (EP 0109942)、脂质体或相关的胶态结构的形式诸如蜗杆 样或环样多聚体复合物以及当使用胆固醇和脂质进行配制时的脂质 / 层状结构和薄片的 形式，或者为水包油型乳液的形式 ( 例如在 WO 95/17210 中 )。
     通常，所述皂草苷以脂质体制剂、 ISCOM 或水包油型乳液的形式存在。
     还可使用免疫刺激性寡核苷酸。 用于本发明的助剂或疫苗中的寡核苷酸的实例 包括含有 CpG 的寡核苷酸，通常含有被至少三个、更优选被至少六个或更多个核苷酸分 开的两个或更多个二核苷酸 CpG 基序。 CpG 基序是跟随有鸟苷酸的胞嘧啶核苷酸。 所 述 CpG 寡核苷酸一般是脱氧核苷酸。 在一个实施方案中，在所述寡核苷酸中的核苷酸间 键合是二硫代磷酸酯键，或更优选是硫代磷酸酯键，尽管磷酸二酯键和其它的核苷酸间 键也落入本发明的范围内。 还被包括在本发明的范围内的是具有混合的核苷酸间键合的 寡核苷酸。 用于产生硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于 US 5,666,153、 US 5,278,302 和 WO 95/26204 中。
     寡核苷酸的实例如下所示 ：
     TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)-SEQ ID No.20
     TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)-SEQ ID No.21
     ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG-SEQ ID No.22
     TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)-SEQ ID No.23
     TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)-SEQ ID No.24
     TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)-SEQ ID No.25
     所述序列可包含用硫代磷酸酯改性的核苷酸间键合。
     替代的 CpG 寡核苷酸可包含上述的一种或多种序列，对所述序列进行无关紧要 的缺失或附加。
     所 述 CpG 寡 核 苷 酸 可 通 过 本 领 域 已 知 的 任 何 方 法 合 成 ( 例 如， 参 见 EP 468520)。 方便地是，这种寡核苷酸可采用自动合成器来合成。
     TLR 2 激动剂的实例包括肽聚糖或脂蛋白。 咪唑并喹啉类诸如咪喹莫特和雷西 莫特是已知的 TLR7 激动剂。 单链 RNA 也是已知的 TLR 激动剂 ( 在人类中是 TLR8，在 小鼠中是 TLR7)，而双链 RNA 和聚肌胞苷酸 ( 聚肌苷酸 - 聚胞苷酸 - 病毒 RNA 的市售的 合成模拟物 ) 是 TLR 3 激动剂的示例。 3D-MPL 是 TLR4 激动剂的实例，而 CpG 是 TLR9激动剂的实例。
     免疫刺激剂可替代地或附加地被加入。 在一个实施方案中，该免疫刺激剂将是 3- 去酰基化单磷酰脂质 A(3D-MPL)。
     在一个方面，所述助剂含有 3D-MPL。
     在一个方面，所述助剂含有 QS21。
     在一个方面，所述助剂含有 CpG。
     在一个方面，所述助剂被配制为水包油型乳液。
     在一个方面，所述助剂被配制为脂质体。
     助剂组合包括 3D-MPL 和 QS21(EP 0671948B1)，包含 3D-MPL 和 QS21 的水包 油型乳液 (WO 95/17210，WO 98/56414)，在脂质体制剂中的 3D-MPL 和 QS21，或与其 它载体进行配制的 3D-MPL(EP 0689454B1)。 其它助剂系统包括 3D-MPL、QS21 和 CpG 寡核苷酸的组合，如 US6558670 和 US 6544518 所述。
     在一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的稳定化的粒子与 3D-MPL 和稀释剂组合的疫苗。 所述稀释剂一般是水包油型乳液或明矾。
     疫苗制备物通常描述于 New Trends and Developments in Vaccines， Voller 等人编 辑， University Park Press， Baltimore， Maryland， U.S.A.，1978 中。 在脂质体内的囊封 由例如 Fullerton 等人描述于美国专利 4,235,877 中。
     在每个疫苗剂量中存在的本发明的蛋白粒子的量被选择为诱导免疫保护应答而 无典型疫苗中的显著的不良副作用的量。 这种量将根据使用哪种特异性免疫原以及所 述疫苗是否采用助剂而异。 通常，可以预期每个剂量将包含 1-1000μg 的蛋白，优选 1-200μg 的蛋白，最优选 10-100μg 的蛋白。 对于特定疫苗的最佳量可通过标准研究来 确定，所述标准研究涉及观察对象中的抗体滴度以及其它应答。 在最初接种疫苗后，对 象优选在约 4 周内接受加强接种，然后只要存在感染风险，则每六个月重复进行加强接 种。 对本发明蛋白的免疫应答通过使用助剂和 / 或免疫刺激剂得以被增强。
     使用的 3D-MPL 的量通常较小，但是根据疫苗制剂的不同而异，可为每剂量 1-1000μg，例如每剂量 1-500μg，或每剂量 1 到 100μg，诸如每剂量 50 或 25μg。
     在本发明的助剂或疫苗中的 CpG 或免疫刺激性寡核苷酸的量通常较小，但是 根据疫苗制剂的不同而异，可为每剂量 1-1000μg，例如每剂量 1-500μg，诸如每剂量 1-100μg。
     在 本 发 明 的 助 剂 中 使 用 的 皂 草 苷 的 量 可 为 每 剂 量 1-1000μg， 例 如 每 剂 量 1-500μg，诸如每 1-250μg，特别是每剂量 1-100μg，尤其是每剂量 50 或 25μg。
     制剂
     本发明的制剂可用于预防性或治疗性目的。 因此，本发明提供了本文所述的疫 苗组合物，其用于医药用途，例如，用于治疗 ( 或预防 ) 疟疾 ( 或用于制备用于治疗 / 预 防疟疾的药物 )。
     本发明的另一个方面提供了制备本发明的疫苗组分和疫苗以及包含各成分的药 包的方法，该方法包括在适合的寄主例如酵母中表达编码所述蛋白的 DNA 序列，并回 收作为脂蛋白粒子的产物，并将后者与本文所定义的至少一种稳定剂、特别是一硫代甘 油、半胱氨酸及其混合物、诸如一硫代甘油混合。最终体积通常被无菌地分配在 3ml 玻璃小瓶中，然后将玻璃小瓶宽松地塞上并 转移到冷冻干燥器中经历约 40 小时的冻干循环。
     在制备所述抗原组分的过程中，所述赋形剂通常被加入并混合，以及作为最终 步骤，所述抗原 / 脂蛋白粒子将被加入。 对于该制备物，也可最后施加保护措施诸如从 小瓶中除去氧或通过使用褐色玻璃容器使所述疫苗避光，并结合使用稳定剂或作为备选 措施。
     在本发明的其中除去氧的方面中，所述制剂 / 组分 / 粒子等可在氮气下储存。
     所述助剂经常被加入到所述抗原的液体制剂 ( 或所述抗原的冻干制剂 ) 中以形成 疫苗。
     本发明的另一个方面在于通过给予如上所述的有效量的疫苗治疗容易受疟原虫 感染的患者的方法。
     在另一个方面，提供了用于本发明的治疗用的疫苗的抗原成分或疫苗 ( 或它们 在制备用于治疗 / 预防疟疾的药物的用途 )。
     本发明还包括初免加强方案，包括本文所述的各种组分中的一种或多种。
     在本说明书的背景下， “包括” 被解释为 “包含”。
     在一个方面，本发明提供了在 3mL 玻璃小瓶例如琥珀小瓶中的本文所述的稳定 化的疟疾抗原，所述小瓶任选地在填充之前用氮气吹扫以除去小瓶中的氧物质。
     使用的小瓶可以是硅化的或非硅化的。
     本发明还延伸到由或基本上由本文所述的本发明的各方面组成的单独的实施方 案，其视情况而定包括某些要素。
     显示了以下的实施例用于说明所述方法，其用于制备本发明的粒子。 实施例 实施例 1
     用于 RTS， S 疟疾疫苗的单一儿科剂量 (2 小瓶制剂 ) 的组分的处方
     组分 量
     RTS， S 25μg
     NaCl 2.25mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 125μg
     注射用水 使体积达 250μL
     以上处方的制备方法为 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸 盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液的 混合物中。 最后，调节 pH 到 7.0±0.1。
     这可作为与助剂 ( 例如，MPL 和 QS21 的脂质体制剂 ) 的单独的小瓶在一起的小 瓶被提供。
     组分 量
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 500μg
     胆固醇 125μg
     MPL 25μg
     QS21 25μg
     NaCl 2.25mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     注射用水 使体积达 250μL
     对于给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行， 然后振摇。 然后，以常规方式给予所述剂量。
     最终液体制剂的 pH 为约 6.6+/-0.1。
     实施例 1A
     本发明的最终儿科液体制剂 (1 小瓶 ) 可根据以下处方制备。
     组分 量
     RTS， S 25μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 125μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 500μg
     胆固醇 125μg
     MPL 25μg
     QS21 25μg
     注射用水 使体积达 500μL
     上述液体制剂的 pH 或者被调节到 7.0+/-0.1( 其对于抗原稳定性而言是有利的， 但是对于 MPL 的稳定性而言完全没有利 )，或者被调节到 6.1+/-0.1( 其对于 MPL 稳定性 而言是有利的，但是对于 RTS，S 稳定性而言完全没有利 )。 因此，该制剂意欲在制备后 迅速使用。
     上述制剂如下制备 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl 1500mM、磷酸盐缓 冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液的混合 物中。 然后，加入包含 MPL 与 QS21 的脂质体的预混合物，并且最后调节 pH。
     实施例 1B
     本发明的 RTS， S 的最终成人剂量 (1 小瓶制剂 ) 可如下制备 ：
     组分 量
     RTS， S 50μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 250μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 1000μg
     胆固醇 250μg
     MPL 50μg
     QS21 50μg
     注射用水 使体积达 500μL实施例 1C
     可例如在填充之前用氮气吹扫琥珀小瓶而后将实施例 1、1A 或 1B 置于该小瓶中 来制备实施例 1C。
     实施例 2
     本发明的组分还可作为用于儿科人群的二剂量 (2 小瓶制剂 ) 被提供。
     组分 量
     RTS， S 50μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 250μg
     注射用水 使体积达 500μL
     上述制剂的制备方法为 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷酸 盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液的 混合物中。 最后，调节 pH 到 7.0±0.1。
     这可作为与助剂 ( 例如，MPL 和 QS21 的脂质体制剂 ) 的单独的小瓶在一起的小 瓶被提供。 组分 量
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 1000μg
     胆固醇 250μg
     MPL 50μg
     QS21 50μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     注射用水 使体积达 500μL
     对于给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行， 然后振摇。 然后以常规方式吸取单一剂量 (500μL) 并给药。
     最终液体制剂的 pH 为约 6.6+/-0.1。
     实施例 2A
     本发明的最终儿科液体制剂 (1 小瓶 ) 可根据以下处方被制备为双剂量。
     组分 量
     RTS， S 50μg
     NaCl 9mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 250μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 1000μg
     胆固醇 250μg
     MPL 50μg
     QS21 50μg
     注射用水 使体积达 1000μL
     上述液体制剂的 pH 或者被调节到 7.0+/-0.1( 其对于抗原稳定性而言是有利的， 但是对于 MPL 的稳定性而言完全没有利 )，或者被调节到 6.1+/-0.1( 其对于 MPL 稳定性 而言是有利的，但是对于 RTS，S 稳定性而言完全没有利 )。 因此，该制剂意欲在制备后 迅速使用。
     上述制剂按如下方法制备 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷 酸盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液 的混合物中。 然后，加入包含 MPL 与 QS21 的脂质体的预混合物，并且最后调节 pH。
     实施例 2B
     本发明的 RTS， S 的最终成人剂量 (1 小瓶制剂 ) 可如下被制备成双剂量 ：
     组分 量
     RTS， S 100μg
     NaCl 9mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 500μg
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 2000μg
     胆固醇 500μg
     MP 100μg
     QS21 100μg
     注射用水 使体积达 1000μL
     实施例 2C
     可例如在填充之前用氮气吹琥珀小瓶而后将实施例 2、2A 或 2B 置于该小瓶中来 制备实施例 2C。
     实施例 3
     用于填充体积为 500μl 的 RTS， S 疟疾疫苗的单一儿科剂量 (2 小瓶制剂 ) 的组 分的处方。
     组分 量
     RTS， S 25μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     一硫代甘油 50μg 或 200μg
     注射用水 使体积达 500μL
     上述制剂按如下方法制备 ：将 RTS，S 抗原加入到注射用水、NaCl1500mM、磷 酸盐缓冲液 (Na/K2)500mM( 当稀释 50 倍时为 pH 6.8) 和一硫代甘油的 10％的水性溶液 的混合物中。 最后，调节 pH 到 7.0±0.1。
     这可作为与助剂 ( 例如，填充体积为 500μl 的 MPL 和 QS21 的脂质体制剂 ) 的 单独的小瓶在一起的小瓶被提供。
     组分 量
     1，2- 二 - 油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸胆碱 (DOPC) 500μg
     胆固醇 125μgMPL 25μg
     QS21 25μg
     NaCl 4.5mg
     磷酸盐缓冲液 (Na/K2) 10mM
     注射用水 使体积达 500μL
     为了给药，将所述助剂制剂加入到所述组分制剂中，例如，使用注射器进行， 然后振摇。 然后以常规方式给药所述剂量。
     最终液体制剂的 pH 为约 6.6+/-0.1 并且注射体积为 1ml。
     实施例 4
     加速稳定性结果指示如下 ：
     · pH 和渗克分子浓度与注射相容 ；
     · 关于 RTS， S 含量 ：在 4℃或 37℃历时 5 周后，没有由非特异性吸附导致的 抗原损失 ；
     · 关于抗原完整性 ( 参见图 6、7 和 8) ：
     ·在加速稳定性之后 (37℃ ±AOT 历时 7 天，37℃历时 14 天 ) 没有显著降解 ；
     · 没有惰化 (without inerting)，要求抗氧化剂 ( 一硫代甘油 ) 以避免在加速稳定 性 (37℃ ±AOT 历时 7 天，37℃历时 14 天 ) 之后发生氧化性聚集 ；
     о 在 37℃ 0.01％足以避免聚集 ；
     о 对于在 37℃ +AOT 下的稳定性需要 0.04％ ；
     · 琥珀色玻璃确保抗原避光 ( 在 AOT 之后观察到的 ) ；
     · 在加速稳定性 (37℃历时 7 天 ) 之后 RTS， S 粒度分布不发生改变 ；
     · 关于抗原性 ( 参见图 9) ；
     · 没有惰化 (without inerting)，要求抗氧化剂 ( 一硫代甘油 ) 以避免在加速稳定 性 (37℃ ±AOT 历时 7 天 ) 之后发生氧化性聚集和抗原性增加 ；
     о0.01％允许很稳定的抗原性 (80-120％ ) ；
     о0.04％在加速稳定性之后诱导轻微的抗原性降低 (-10％ ) ；
     · 在与 AS01( 含有 MPL 和 QS21 的脂质体助剂制剂 ) 混合时 ：
     · 在混合之后 RTS， S 完整性和抗原性在 25℃保持至少 24 小时。
     在有或者没有一硫代甘油时将这些 RTS， S 液体制剂在 37℃储存 7 天、14 天， 图 8 或甚至 5 周之后，已进行了 SDS-Page 分析。
     图 6 表明
     · 在没有一硫代甘油的条件下 ：在 37℃储存 7 天之后发生轻微的 RTS， S 聚集 ( 孔 3 和 4) ；在暴露于 AOT 下之前在 37℃在白色小瓶中储存 7 天后完全聚集和轻微降解 ( 孔 6)，而琥珀色玻璃避免 RTS， S 发生由光诱导的降解和氧化性聚集 ( 孔 5) ；
     · 在有一硫代甘油 0.01％的条件下 ：该浓度足够使 RTS， S 在 37℃下储存时稳 定 7 天 ( 孔 7)，但是在加速氧化试验 (AOT) 累积下该浓度不足够 ( 孔 9)，除了与琥珀色 玻璃组合使用之外 ( 孔 8) ；
     · 在有一硫代甘油 0.04％的条件下 ：该浓度足够使 RTS， S 在 37℃下储存时稳 定 7 天 ( 孔 10)，当使用加速氧化试验累积时也是如此 ( 孔 12) ；在这种情况下，不要求填充到琥珀色玻璃小瓶中 ( 孔 11) ；
     · 与 AS01 混合对 RTS， S 特性没有影响，即使在 25℃储存 24 小时之后。
     图 7 显示需要一硫代甘油来避免 RTS， S 聚集，但是两个浓度都能够使 RTS， S 在 37℃储存时稳定至少 14 天 ( 孔 11 和 12，相对于孔 10)。
     图 8 显示在 37℃历时 5 周之后，在全部制剂中都发生 RTS，S 聚集和降解 ；AS01 在全部制剂中加重聚集。
     实施例 5
     对 于 包 含 0、0.01 ％ 或 0.04 ％ 的 一 硫 代 甘 油 的 制 剂， 通 过 混 合 ELISAαCSP-αS，在 T0(±AOT) 或在 37℃储存 7 天 (±AOT) 或 5 周时，测定 RTS， S 抗原性 ；已经在与 AS01 重新构成之前、刚刚重新构成之后和重新构成之后在 25℃ 24 小 时测量 RTS， S 抗原性。
     图 9 表明
     · 在没有一硫代甘油的条件下 ：
     о 暴露于 675W 下历时 15 小时 (AOT) 促使抗原性增加 50-60 ％ ( 这可以与在 SDS-Page 中观察到的氧化性聚集相关联 )，但是装入琥珀色玻璃小瓶将这一抗原性增加 限制到～ 20％ ；
     о 在 37℃储存 7 天促使抗原性增加～ 30-40％ ( 这也可以与在 SDS-Page 中观察 到的氧化性聚集相关联 ) ；
     о 在 37℃下 7 天到 5 周之间，抗原性降低～ 30％ ；
     о 在 25 ℃历时 24 小时之后， AS01 促使抗原性增加～ 20 ％ ( 这也可以与在 SDS-Page 中观察到的聚集增加相关联 ) ；
     · 在有 0.01％一硫代甘油的条件下 ：
     о 一硫代甘油保护 RTS， S 避免发生由于在 37℃储存 7 天、 AOT 诱导的 ( 使琥 珀色玻璃无用 ) 或与 AS01 混合所诱导的抗原性增加 ( 但是当在 AS01 中在 25℃储存 24 小 时累积到在 37℃储存 7 天时，该增加为～ 20％ ) ；
     о 在 37℃下 7 天和 5 周之间抗原性降低～ 20％ ( →不合格 (out ofspec)) ；
     · 在有 0.04％一硫代甘油的条件下 ：
     о 一硫代甘油保护 RTS， S 避免发生由 AOT 诱导的抗原性增加，使褐色玻璃无 用；
     о 在 37℃储存 7 天促使抗原性降低～ 20％ ；
     о 在 37℃下 7 天到 5 周之间不发生抗原性降低 ；
     о 在 25℃历时 24 小时之后， AS01 促使抗原性增加～ 30-40％。
     实施例 6
     为了考察一硫代甘油被固定到 RTS， S 上对单克隆抗体识别 RF1- 表位 (S) 的影 响，在使用或未使用一硫代甘油 (MTG) 进行稳定的 RTS，S 液体制剂中，在 T0( 时间 0) 或在 37℃储存 7 天之后 (7 天 )，通过 ELISA 抑制试验测定了 RTS，S 对 RF1 腹水的反应 性 ( 参见表 1)。
     表1
     在所述试验中使用的单克隆抗体对表位 RF1 如表 1 所示。
     在表 1 中，仅有两个样品具有的 RF1- 表位比其它显著更好地被识别 ：
     · 在 37℃储存 7 天的 RTS， S 经纯化的体积 ；
     · 在不包含一硫代甘油并在 37℃储存 7 天的液体制剂中的 RTS， S。
     这意味着在这些样品中发生构象变化，增加了 RF1- 表位的可达性。 这些结果 毫无疑问地被认为与混合 ELISA αCPS-αS 的结果是平行的 ( 在不含一硫代甘油的制剂 中，在 37℃储存 7 天之后， RTS， S 抗原性增加 )。
     因此，我们得出以下结论 ：
     ·一硫代甘油看来在 T0 时对 RF1- 表位的识别 / 可达性没有消极影响 ( 与在 “新 鲜的” 经纯化的体积中的水平相同 ) ；
     · 识别水平在包含一硫代甘油并在 37℃储存 7 天的 RTS， S 液体制剂中保持稳 定，表明了 RTS， S 构象被一硫代甘油所稳定。
     免疫原性数据
     实施例 7
     在小鼠中评价并比较了几种 RTS， S 制剂的免疫原性。 在这些实验中， RTS， S、AS01、50mM PO4、NaCl 100mM、pH 6.1 疫苗制剂被用作用于评价 3 种其它的 RTS， S 制剂的基准标记，所述 3 种其它的 RTS， S 制剂为 ：
     1) 甘露醇 - 蔗糖冻干的 RTS， S( 要与助剂重新构成 )，
     2) 包含 0.02％一硫代甘油的液体制剂，和
     3) 包含 0.08％一硫代甘油的液体制剂 ( 在注射前各自都要与 AS01 混合 )。
     需要注意的是，在液体 RTS， S 制剂与 AS01 混合之后，一硫代甘油的最终浓度 是 0.01％和 0.04％。
     分别在如下所述的两个不同类型的免疫原性实验中和在实施例 8 中测定了由不 同的 RTS， S 制剂引起的体液应答和细胞免疫应答。
     小鼠体液免疫应答实验
     a. 引言
     评价和比较了在用不同的 RTS，S 制剂免疫的小鼠中被引起的抗 CS 和抗 HBs 抗 体应答 ( 总免疫球蛋白 )。
     b. 实验设计
     所述试验设计遵循得自目前的 RTS， S/AS01 疫苗的体内效能测定的一种试验 设计，即， Balb/C 小鼠株，得自体内效能测定的剂量释放的单次腹膜内注射 (0.25μg RTS， S)，和通过 ELISA 测量在免疫后第 28 天血清中的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答 ( 总免 疫球蛋白 )。
     为了定义实验的样本量，使用了用与 AS01 助剂进行配制的 RTS， S 进行的体内 效能测定进行评估的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答的变异性。 基于此，统计学家确定了每组 25 只小鼠的样本量 ( 在 2 个不同的实验中 ) 将允许以具有 90.9％功效的双向方差分析检测 组平均值之间的 2 倍差异。
     c. 结果
     使用在免疫后第 28 天收集的血清进行抗 CS 血清学 ( 总 Ig)。 得自 50 只小鼠 / 组的滴度用 Log 表示并示于图 10 中。
     与抗 CS 血清学结果有关的统计分析 (Dunnett) 概括在表 4 中。
    
    表 4. 在多种 RTS， S 制剂之间的抗 CS GMTs 的统计比较 第1组 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo RTS， S 液体 0.02％一硫代甘油 RTS， S 液体 0.08％一硫代甘油 第2组 RTS， S 蔗糖 lyo RTS， S 蔗糖 lyo RTS， S 蔗糖 lyo 调整 Dunnet Dunnet Dunnet Prob_Adj 0.2529 0.6070 0.6025这些结果指示，由甘露醇 - 蔗糖 lyo 或液体 RT S，S 制剂引起的抗 CS 总 Ig 应答 与由被配制在 MPL 和 QS21 的脂质体助剂制剂中的 RTS， S 所诱导的抗 CS 总 Ig 应答没 有统计学不同 (92.7％的统计功效以检测 Ab 滴度的 2 倍差异 )。
     使用在免疫后 28 天收集的血清进行抗 HBs 血清学 ( 总 Ig)。 得自 50 只小鼠 / 组 的滴度用 Log 表示并示于图 11 中。
     与抗 HBs 血清学结果有关的统计分析 (Dunnett) 概括在表 5 中。
     表 5. 在单独的备选 RTS，S 制剂和目前 RTS，S 制剂之间的抗 HBsGMTs 的统计 比较
    
    第1组 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo RTS， S 液体 0.02％一硫代甘油第2组 RTS， S 蔗糖 yo RTS， S 蔗糖 lyo调整 Dunnet DunnetProb_Adj 0.1332 0.985727CN 102026657 A CN 102026672 A说明书Dunnet 0.110525/32 页RTS， S 液体 0.08％一硫代甘油
    RTS， S 蔗糖 lyo这些结果指示，由甘露醇 - 蔗糖 lyo 或液体 RT S， S 制剂引起的抗 HBs 总 Ig 应 答与由被配制在 MPL 和 QS21 的脂质体制剂中的 RTS，S 所诱导的抗 HBs 总 Ig 应答没有 统计学不同 (91.4％的统计功效以检测 Ab 滴度的 2 倍差异 )。
     d. 结论
     全部三种供选择的测试的 RTS， S 制剂在小鼠中都引起抗 CS 和抗 HBs 抗体应 答。 另外，统计分析指示，由甘露醇 - 蔗糖 RTS，S lyo、临时在 MPL 和 QS21 的脂质体 制剂中重新构成的液体 RTS， S 0.02％一硫代甘油或者液体 RTS， S 0.08％一硫代甘油引 起的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答，与由在 AS01 中重新构成的目前的 RTS， S 冻干制剂所诱 导的抗 CS 和抗 HBs 抗体应答没有统计显著差异。 与抗 CS 和抗 HBs 抗体应答的分析有 关的功效分别至少是 92.7％和 91.4％，以显示比率为 2( 初始标度，即抗体滴度 ) 或差异 为 0.301( 对数标度 )
     实施例 8
     小鼠细胞免疫应答实验 ：
     a. 引言
     在第二种类型的实验中，使用基于流式细胞术的检测技术，测量在用覆盖 HBs 和 CS 序列的肽的混合物进行短期的离体刺激之后表达 T 细胞的细胞因子对 HBs 和 CS 抗 原的由细胞介导的免疫 (CMI) 应答。
     b. 实验设计
     供试组与上述在实施例 7 的实验中的供试组相同。 然而，该实验设计是不同 的，即，用一定剂量范围 (5μg 和 2.5μg) 的在 AS01 中的 RTS， S 抗原进行 3 次肌内注 射使 C57BL/6 小鼠免疫，根据得自先前的针对评价抗原特异性细胞免疫应答的小鼠免疫 原性研究的规程进行。 该实验进行两次，并且确定了样本量，以便收集足够的细胞以进 行基于流式细胞术的试验。 实际上，在各组中，对从 4 只小鼠收集的血细胞 ( 即，3 个收 集物 / 组 ) 进行了 CMI 分析。 这一读数被认为是探索性的，因为只使用每个实验每组中 可获得的三个值 (pools) 以及因为这种基于细胞的试验的公知的变异性，不能得出统计学 结论。
     c. 结果
     在第三次免疫后第 7 天的 CS 特异性和 HBs 特异性的 CD4 和 CD8T 细胞应答如 图 12、13、14 和 15 所示。
     各图内的每个三角形 (i) 代表在用覆盖 CS 或 HBs 序列的肽的混合物 (pools) 在 体外对外周血淋巴细胞进行再刺激之后得自 4 只小鼠的应答，和 (ii) 代表在对体外再刺激 中所使用的肽的混合物产生应答中产生 IL-2 和 / 或 IFN-γ 的 CD4 或 CD8T 细胞的百分 数。
     这些结果指示了 CS 和 HBs 特异性的 CD4T 细胞应答由全部进行试验的 RTS， S 制剂所引起。 这些抗原特异性 CD4T 细胞应答是可比较的，无论使用 RTS，S 和 AS01( 目 前的冻干制剂 )、 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo、包含 0.02％或 0.08％一硫代甘油 (MTG) 的 液体 RTS， S 用于免疫 ( 在全部试验剂量下，应答都是可比较的 )。这些结果指示了 CS 和 HBs 特异性的 CD8T 细胞应答由全部试验的 RTS，S 制剂 所引起。 这些抗原特异性 CD8T 细胞应答是可比较的，无论使用 RTS， S 和 AS01( 目前 的冻干制剂 )、 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo、包含 0.02％或 0.08％一硫代甘油 (MTG) 的液 体 RTS，S 用于免疫 ( 在全部试验剂量下，应答都是可比较的 )。 值得注意的是，对于液 体 RTS，S 制剂而言存在这样一种趋势，即在两个试验剂量 (2.5 和 5μg) 下都诱导更高百 分数的 Ag 特异性 CD8T 细胞。 然而，如上所述，这一读数被认为是探索性的，因为只使 用每个试验每组中可获得的三个值 (pools) 以及因为这种基于细胞的试验的公知变异性， 不能得出统计学结论。
     d. 结论
     由 RTS， S 甘露醇 - 蔗糖 lyo、液体 RTS， S 0.02％一硫代甘油和液体 RTS， S 0.08％一硫代甘油所引起的 CS 和 HBs 特异性 CD4 和 CD8T 细胞应答，与在 AS01 中重新 构成的目前的 RTS， S 冻干制剂所引发的那些是可比较的。
     参考文献
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     序列表
     SEQ ID NO ：1
     1区
     KLKQP
     SEQ ID NO ：2
     II 区 +
     CSVTCG
     SEQ ID NO ：3
     VK210 重复单元
     GDRAAGQPA
     SEQ ID NO ：4
     VK210 重复单元
     GDRADGQPA
     SEQ ID NO ：5
     VK210 重复单元
     GDRADGQAA
     SEQ ID NO ：6
     VK210 重复单元
     GNGAGGQPA
     SEQ ID NO ：7
     VK210 重复单元
     GDGAAGQPA
     SEQ ID NO ：8
     VK210 重复单元
     GDRAA GQAA
     SEQ ID NO ：9
     VK210 重复单元
     GNGAGGQAA
     SEQ ID NO ：10
     主要 VK247 重复单元
     ANGAGNQPG
     SEQ ID NO ：11
     12 个氨基酸插入
     GGNAANKKAEDA
     SEQ ID NO ：12
     Pv-CS 核苷酸序列Acacattgcggacataatgtagatttatctaaagctataaatttaaatggtgtaaacttc aataacgtagacgctagttcactcggggctgcg cacgtaggtcagtctgctagcagggggcgcggtctcggggaaaacccagacgacgaagaa ggtgatgctaaaaagaaaaaggacg gtaaaaaagcggaaccaaaaaatccaagggaaaataaattaaaacagcccggggatcgcg cggatggtcaagcggcgggtaatggg gcggggggtcaaccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatcgcgcggct ggtcagccagcgggggatggtgc ggctggccaaccagcgggggatcgcgcggatggtcagccagcgggggatcgcgcggatgg tcaaccagccggtgatcgcgcggct ggccaagcggccggtaatggggcggggggtcaagcggccgcgaacggagcggggaaccag ccaggcggcggtaacgctgcga ataaaaaagcggaagatgcgggtggtaacgcgggcggtaatgcgggcggccaaggtcaga acaacgaaggggctaatgcaccaaa cgaaaaatctgtcaaagaatatctcgataaagtccgcgctacagtagggacagaatggac gccatgctctgtaacatgtggtgtcggggt acgcgtgcgccgccgtgtcaatgcggctaacaaaaaaccagaagatctcacgttaaatga tctcgaaacggatgtctgcaca SEQ ID NO ：13 Pv-CS 蛋白的氨基酸序列 THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGEN PDDEEGDAKKKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGG QPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDGAAGQPAGDRADGQPAGDRADG QPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKAEDAGG NAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVT CGVGVRVRRRVNAANKKPEDLTLNDLETDVCT SEQ ID NO ：14 次要 2 型重复单元 ANGAGDQPGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTGAACGGTGTTAATTTC AACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAATCTGCTTCAAGAGGT AGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAGAAGAAGAAGGACGGT AAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAACCAGGTGACAGAGCC GACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGTGACAGAGCTGCCGGT CAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGTGCCGCCGGTCAACCT GCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGACGGACAGCCAGCCGGC GATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAAGCTGCTGCTAACGGT3160 120 180 240 300 360 420 GCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCTGAAGACGCTGGTGGT AATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGTGCTAACGCTCCAAAC GAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTCGGTACTGAATGGACT CCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGAGTTAACGCCGCTAAC AAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTTTGTACT540 600 660 720 771核苷酸序列 ATGATGGCTCCCGGGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTG AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAA TCTGCTTCAAGAGGTAGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAG AAGAAGAAGGACGGTAAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAA CCAGGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGT GACAGAGCTGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGT GCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGAC GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAA GCTGCTGCTAACGGTGCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCT GAAGACGCTGGTGGTAATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGT GCTAACGCTCCAAACGAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTC GGTACTGAATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA GTTAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTT TGTACTCCCGGGCCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG CTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTA GACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAAT TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTAT CGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCT ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATC CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGG CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT ATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAA SEO ID No 17 氨基酸序列 THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGENPDDEEGDAK60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 148560 120 180 240KKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGGQPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDG